NL8302587A - Werkwijze voor het immobiliseren van biologische materialen; samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal; werkwijze voor het produceren van aspartinezuur; werkwijze voor het produceren van tryptofan; werkwijze voor het produceren van l-fenylalanine. - Google Patents

Description

I V < ί i -1- VO 4908

Werkwijze voor het immobiliseren, van biologische materialen; samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal; werkwijze voor het produceren van aspartinezuur; werkwijze voor het produceren van tryptofan; werkwijze voor het produceren van L-fenylalanine.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het immobiliseren van biologische materialen. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op de immobilisatie van biologische materialen, waarbij de materialen worden geabsorbeerd door vermiculietdeeltjes, 5 die vervolgens met een polymeer worden bekleed.

Biologischematerialen, zoals enzymen of enzymproducerende micro-organismen of cellen, worden vaak als katalysatoren gebruikt voor synthetische reakties en voor analytische technieken. Dergelijke katalysatoren zijn gewenst, omdat zij onder in het algemeen milde reaktie-10 omstandigheden met hoge specificiteit en hoog rendement werken.

Omdat enzymen en andere biokatalysatoren in het algemeen in water oplosbaar zijn, zijn zij geschikt voor gebruik in reaktiesystemen van het ladingsgewijze type. Hernieuwd gebruik . van dergelijke enzymen en andere biokatalysatoren is beperkt in verband met moeilijkheden bij 15 het terugwinnen van die materialen uit het gebruikte reaktiemedium in actieve of bruikbare vorm. Bovendien neigen de materialen in het bereide produkt als verontreinigingen achter te blijven. Teneinde deze problemen te' vermijden, zijn methoden ontwikkeld om biologische materialen,die katalytische werkzaamheid vertonen, op onoplosbare vaste dragers te 20 immobiliseren. Door immobilisatie wordt het verkrijgen van een gestabiliseerd biologisch materiaal nagestreefd, dat tegen de belasting van herhaald of continu gebruik bestand is.

Verscheidene immobilisatiesystemen voor biologische materialen zijn beschreven. Enzymen zijn geïmmobiliseerd door absorptie op onop-25 losbare materialen, zoals houtskool, glas, cellulose, calciumfosfaat gel, montmorilloniet, organische ionenuitwisselingsharsen en andere materialen. Immobilisatie is ook gerealiseerd door invangen binnen zetmeel en acrylamidegels, covalente binding tussen enzymen en onoplosbare organische polymeren, alsmede covalente binding tussen enzym-30 moleculen onderling.

De werkwijzen volgens de stand van de techniek leidden vaak tot produkten met een verminderde biologische werkzaamheid, vergeleken met de werkzaamheid van het overeenkomstige niet-gebonden biologische materiaal. Het is bekend, dat deze biologische materialen gevoelig zijn 8302587 * ·» -2- voor thermische en, chemische denaturering of inactivering. Het verlies van biologische werkzaamheid treedt vaak op wanneer immobilisatiebe-werkingen worden uitgevoerd onder harde omstandigheden, die bijzonder problematisch kunnen zijn wanneer polymeercondensatiereakties plaats-5 vinden. Verder zijn de uit de bekende methoden resulterende produkten vaak nadelig met betrekking tot hun hydrofiele karakter, sterkte, duurzaamheid, en poreusheid.

Doel van de onderhavige uitvinding is derhalve om een methode te ontwikkelen voor het immobiliseren, van biologische materialen, waar-10 door de biologische werkzaamheid van de produkten niet wordt verminderd.

Een ander doel van de uitvinding is om een methode te ontwikkelen· voor het immobiliseren van biologische materialen, waarbij de verkregen produkten een uitstekende sterkte, duurzaamheid, poreusheid, een biologische stabiliteit vertonen- Weer een ander doel van de uit-15 vinding is om een methode te verschaffen voor het immobiliseren van een grote hoeveelheid biologisch, materiaal per volumeeenheid van de uiteindelijke'drager (hoge dichtheid).

Thans is gevonden, dat biologische materialen op een eenvoudige en zeer economische wijze kunnen worden geïmmobiliseerd, terwijl hun 20 katalytische werkzaamheid in hoge mate kan worden gehandhaafd. De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding leidt tot een samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal, dat biologisch materiaal bevat, ingevangen binnen met een polymeer beklede vermiculietdeeltjes. Afhankelijk van het gekozen polymeer en de aard van het in het vermiculiet 25 ingevangen biologische materiaal kan het voordelig zijn om het polymeer te verknopen of te condenseren. Er treedt zeer weinig activiteitsverlies op wanneer het samengestelde materiaal wordt bereid, en dergelijke samengestelde materialen vertonen een uitstekende sterkte en duurzaamheid. Verder kan het hydrofiele karakter van deze materialen, in 30 het geval het polymeer verknoopt of gecondenseerd wordt, worden ingesteld door de mate van verknoping of condensatie te variëren. De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding leidt tot een samengesteld materiaal, dat door eenvoudige filtratie van reaktiemengsels kan worden afgescheiden, of in continue reaktieprocessen kan worden gebruikt, zoals die 35 waarin een reagerend substraat door een gepakte kolomreaktor vloeit.

Volgens de onderhavige werkwijze worden vermiculietdeeltjes in con- 8302587 -3- tact gebracht met het biologisch materiaal, zoals hele natte vellen, die uit een fermentatiebron zijn geoogst. -Het biologische materiaal wordt in de vermiculietdeeltjes geabsorbeerd. Aan het vermiculiet wordt een polymeer bekledingsmateriaal toegevoegd, om de deeltjes te bekleden.

5 Verscheidene verknopingsmiddelen, condensatiemiddelen en geleringsmidde-len kunnen: daarna worden toegevoegd tot verknoping en versterking van het polymeer en/of het biologisch materiaal, teneinde een harde permeabele bekleding te vormen. Het polymeer kan desgewenst worden gecombineerd met een polycarbonzuur om een in water oplosbaar prepolymeer te 10 vormen, voordat met het vermiculiet wordt gemengd. Deze procedure leidt tot de vorming van een samengesteld biologisch materiaal, waarin het biologische materiaal binnen het met polymeer beklede vermiculiet is geïmmobiliseerd.

Immobilisatie van biologisch materiaal binnen het vermiculiet 15 kan geschieden door fysisch invangen, door covalent binden van het polymeer via het verknopingsmiddel of condensatiemiddel en. reaktieve groepen op het biologische materiaal, of door verknoping binnen de vermiculietdeeltjes via een geschikt verknopingsmateriaal. Wanneer het polymeer een polyalkyleenimine is, kan het biologisch materiaal bijv. door cova-20 lente koppeling worden geïmmobiliseerd, omdat amine ..en. carbonzuurgroepen van het biologisch materiaal in de plaats kunnen komen van hetzij een aminegroep op het polyalkyleenimine, hetzij een carbonzuurgroep op een polycarbonzuur, dat aan het beklede vermiculiet. kan worden toegevoegd. Covalente koppeling aan het polymeer geschiedt iiteindelijk door 25 een condensatiemiddel.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding maakt de bereiding mogelijk van een ruime-verscheidenheid van samengestelde biologische materialen. Het biologisch materiaal kan enzymen, microbiële cellen, antigenen, antilichamen, antibiotica, coenzymen, plantencellen, dier-30 lijke cellen, bacteriën, gisten, fungi, weefselculturen of mengsels daarvan omvauten. 3iologische materialen worden bij voorkeur aan het vermiculiet in w^.cerige vormen toegevoegd.

Gevonden is, dat vermiculiet een uitstekende drager voor het immobiliseren van biologisch materiaal vormt. Vermiculietdeeltjes zijn in 35 staat om zeer grote hoeveelheden biologische materialen te absorberen, zodat een belading met hoge dichtheid wordt verkregen. Vermiculiet is 8 3 ö 2 5 8 7 -4- ook zeer goedkoop en gemakkelijk verkrijgbaar, waardoor het zeer geschikt is om als drager in produktie op grote schaal van produkten te worden gebruikt. Tenslotte is de immobilisatiedrager, die bij deze werkwijze voor het immobiliseren van biologisch materiaal wordt ver-5 kregen, stijf en zeer actief.

Vastgesteld is, dat de deeltjesgrootte van het vexmiculiet, dat in de immobilisatiewerkwijze volgens de uitvinding wordt gebruikt, in sterke mate kan variëren·- Bijv. kan de deeltjesgrootte van het ver-miculiet variëren van een fijn poeder tot ongeveer 1 cm, bij voorkeur 10 ongeveer 0,5-1 mm. De aan het vermiculiet toegevoegde hoeveelheid biologisch materiaal kan variëren afhankelijk van de specifieke eindtoe-passing van het samengestelde biologische materiaal. In het algemeen varieert de hoeveelheid van ongeveer 0,001 tot 2 g (op basis van het droge gewicht) per gram toegepast vermiculiet, bij voorkeur van onge-15 veer 0,01 tot ongeveer 1 g per gram vermiculiet.

De met de werkwijze volgens de uitvinding bereide samengestelde bilogische materialen kunnen sterk verschillen in hydrofiel karakter, sterkte, duurzaamheid en poreusheid. Verlaging van de mate, waarin het voor het bekleden van het vermiculiet toegepaste polymeer verknoopt 20 of gecondenseerd is, kan leiden tot een samengesteld materiaal met een sterker hydrofiel karakter. De toevoeging van multifunktionele ver-knopingsmiddelen kan leiden tot een verhoging van de sterkte en de duurzaamheid van het samengestelde polymeer-vermiculiet-biologische materiaal, waarin de additionele funktionele groepen een verdere conden-25 satie van het polymeer geven en een meer hydrofoob samengesteld materiaal veroorzaken.

De totale poreusheid van de matrix kan worden vergroot door de toevoeging van een in water oplosbaar deeltjes vormig materiaal aan het polymeer mengsel, voordat dit volledig gecondenseerd, wordt. Het droge ma-30 teriaal wordt vervolgens door de toevoeging van water na condensatie verwijderd, waardoor de vastestof wordt opgelost. Het deel van het samengestelde materiaal, dat voordien door de vastestoffen werd ingenomen, blijft leeg achter, waardoor de poreusheid van de matrix wordt vergroot. Elk in water oplosbaar deeltjesvormig materiaal, dat niet in significante 35 mate een nadelige invloed uitoefent op het polymeer, vermiculiet of biologisch materiaal, kan worden, gebruikt om de poreusheid van het mengsel te verhogen. In water oplosbare polycarbonzuren, zoals cHe, welke met de 8302587 • % -5- niet-gecondenseerde polymeren hebben gereageerd, zijn bijzonder geschikt om de poreusheid van de matrix te verhogen, omdat voor het verhogen van de poreusheid toegepaste overmatige hoeveelheden de condensa-tiereakties niet in aanzienlijke mate storen.

5 De in de werkwijze en samengestelde materialen volgens de onder havige uitvinding toegepaste polymeren variëren in het algemeen in molecuülgewicht, afhankelijk van de reaktieomstandigheden en hebben bij voorkeur een vertakte ketenstructuur. Een verscheidenheid van poly-rnere materialen kan in de werkwijze volgens de uitvinding worden toege-10 past, met inbegrip van polyalkyleeniminen, polysacchariden, polyacrylamide, polyurethan, alginaat, en carageen. Polymeren, die de voorkeur * hebben, zijn de polyalkyleeniminen.

Polyalkyleeniminen kunnen worden bereid door de met zuur gekatalyseerde additiepolymerisatie van alkyleeniminemonomeren. Een gepre-15 fereerd polyalkyleenimine is polyethyleenimine (ΡΞΙ), omdat het momenteel gemakkelijk tegen betrekkelijk lage kosten verkrijgbaar is, en goed funktioneert in de condensatiereakties, die in de onderhavige werkwijze worden toegepast. Polyethyleenimine wordt, bereid door polymerisatie met ringopening van ethyleenimine in tegenwoordigheid van 20 katalysatoren, zoals anorganische zuren. Het polymeer is sterk vertakt en bevat primaire, secundaire en tertiaire aminogroepen. PEI is in water oplosbaar, en bij verknoping of condensatie van de polymeerketens resulteert een in water onoplosbaar produkt.

Het polyethyleenimine kan worden verknoopt met een amineverknopings-25 middel om additionele stabiliteit en sterkte te verlenen. Deze behandeling leidt tot ingevangen biologisch materiaal, met enige verknoping tussen het polyalkyleenimine en vrije aminegroepen van het biologische materiaal. Verknopingsmiddelen omvatten glutaarzuurdialdehyde, diiso-cyanaten, polyisocyanaten, 2,4,6-trichloro-s-triazine, bisoxiran, 30 bisimidaat, divinylsulfon, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeen, en dergelijke. Glutaarsuurdialdehyde heeft voor dit doel de voorkeur.

Het in het algemeen gekozen polymeer wordt aan het samengestelde materiaal toegevoegd in een voldoende hoeveelheid om de vermiculiet-deeltjes in hoge mate te bekleden en deze hoeveelheid zal afhankelijk 35 van de deeltjesgrootte van het vermiculiet, de aard van de biologische materialen en de gewenste fysische eigenschappen, sterk variëren. In het algemeen kan de hoeveelheid polymeer variëren van ongeveer 0,5 tot 8302587 w -6- ongeveer 25 gew.% van het samengestelde materiaal, en varieert hij bij voorkeur van ongeveer 2 tot ongeveer 15 gew.% van het samengestelde materiaal. De toegepaste hoeveelheid verknopingsmiddel en/of condensa-tiemiddel is zoals onderstaand zal worden besproken, gerelateerd aan de 5 hoeveelheid polymeer.

Wanneer het polymeer polyethyleenimine is, wordt in een zeer efficiënte condensatiemethode gebruik gemaakt van een polycarbonzuur (PCA) om bruggen te vormen tussen aminegroepen op naastgelegen PBI-ketens. Condensatiemiddelen, bij voorkeur carbodiimiden, bewerken de 10 condensatie gemakkelijk. De bij het maken van het gecondenseerde polyethyleenimine volgens de onderhavige uitvinding optredende reakties. worden op het formuleblad getoond.

Reaktie (1) toont de polymerisatie van ethyleenimine onder vorming van PEI met een vertakte ketenstructuur,, waarin n en n’ gehele 15 getallen groter dan 0 zijn en n" gelijk aan 0 (hetwelk betekent, dat de [CH2CH2NH]-groep afwezig is) of groter dan 0 kan zijn. Reaktie (2) toont de vorming van een zout van de aminegroepen van PEI met een polycarbonzuur, waarin R een gesubstitueerde of niet-gesübstitueerde koolwaterstof groep voorstelt, terwijl de reaktie (3) ..en (4) de conden-20 satie van het PEI en polycarbonzuur tonen, waarbij een carbodiimide- condensatiemiddel wordt gebruikt. R en R‘ zijn koolwaterstofgroepen, die samen met andere reaktiecomponenten en omstandigheden van de getoonde reaktie onderstaand nader worden beschreven.

In het algemeen kunnen voor gebruik in de onderhavige uitvinding 25 geschikte polycarbonzuren gesubstitueerde of niet-gesubstitueerde car-bonzuren met tenminste twee carbonzuurgroepen zijn. Bij voorkeur zijn de polycarbonzuren oplosbaar in. water, zodat zij gebruikt kunnen worden om de poreusheid van het samengestelde materiaal te verhogen, alsmede voor het condenseren van het polyalkyleenimine. Voorbeelden van poly-30 carbonzuren, die in de werkwijzen en samengestelde materialen volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt, omvatten adipinezuur, azelainezuur, 1,11-undecaandizuur, 1,12-dodecaandizuur, traumatinezuur, pentadecaandizuur, hexadecaandizuur, sebacinezuur, suberinezuur, glutaar-zuur, malonzuur, pimellinezuur, bamsteenzuur, appelzuur, maleïnezuur, 35 glutaminezuur, aspartinezuur, oxaalzuur, fumaarzuur, polyaspartinezuur, en dergelijke. Dicarbonzuren hebben voor gebruik in de onderhavige uitvinding de voorkeur en omvatten maleïnezuur, bamsteenzuur, glutaarzuur 8302587 * * -7- en adipinezuur. Hogere polycarbonzuren kunnen die stoffen zijn, die twee of meer carbonzuurgroepen bevatten, en polymere materialen met hoog molecuulgewicht omvatten, zoals polyaspartinezuur, met een molecuulge-wicht van 5000-50.000. De condensatiereakties zijn in het algemeen 5 exotherm, weshalve de reaktiemengsels bij voorkeur worden gekoeld op een temperatuur, die niet schadelijk is voor het te immobiliseren biologische materiaal, bijv. ongeveer 37°C of lager.

De molverhouding van polycarbonzuur tot polyalkyleenimine (PCA: PAI) kan sterk variëren vanwege de variatie in molecuulgewicht in de 10 reaktiecomponenten. In het algemeen varieert een dergelijke verhouding van 1:20 tot 1:0,0005. Wanneer polycarbonzuur wordt toegevoegd om de poreusheid van het samengestelde materiaal volgens de onderhavige uitvinding. te verhogen, wordt vaak een aanzienlijke molaire overmaat polycarbonzuur toegepast.

15 Het polycarbonzuur kan in een voor condensatie voldoende hoeveel heid worden toegevoegd aan het polyalkyleenimine onder prepolymerisatie-omstandigheden, teneinde een in water oplosbaar prepolymeer te vormen. Het prepolymeer is in het algemeen een visceuse vloeistof, waaraan het vexmiculiet, dat het geïmmobiliseerde biologische materiaal bevat, op 20 geschikte wijze kan worden toegevoegd en gedurende de condensatiereaktie in een suspensie kan worden gehouden. Het condensatiemiddel wordt daarna toegevoegd om condensatie en vastworden van het samengestelde prepolymeer-vermiculiet materiaal te bewerken. De pH van het reaktiemengsel wordt op een niveau gehouden, waarbij het biologische materiaal niet sterk ge-25 inactiveerd of nadelig beinvloed wordt. De pH kan variëren van ongeveer 2 tot ongeveer 12 en varieert bij voorkeur van ongeveer 5 tot ongeveer 10.

Zoals bovenstaand opgemerkt, wordt voor het bewerken van condensatie van polyalkyleenimineketens door middel van polycarbonzuren, bij voorkeur 30 een condensatiemiddel toegepast. In het algemeen kan elk condensatiemiddel, dat de reakties van amines en carbonzuren katalyseert of bevordert, worden toegepast. Voorbeelden van dergelijke condensatiemiddelen omvatten N-ethyI-5-fenyI-isoazolium-3-sulfonaat, n-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihyörochinoline, en verscheidene carbodiimiden. Carbodiimide-35 condensatiemiddelen, die in de samenstelling volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt, hebben de formule R*-N=C=N-R", waarin 3302587 9 -8- R' en R" hydrocarbylgroepen met 3.tot ongeveer 20 koolstof atomen, bij voorkeur ongeveer 5 tot ongeveer 12 koolstofatomen zijn. Dergelijke condensatiemiddelen omvatten l-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiimide, dicyclohexylcarbodiimide, 1-cylohexy1-3-(2-morfolinoethyl} carbodiimide-5 metho-p-tolueensulfonaat of zouten daarvan- Carbodiimidecondensatie-middeln worden aan het reaktiemengsel toegevoegd in een voor condensatie voldoende hoeveelheid, die in het algemeen in hoofdzaak een stoechio-metrische hoeveelheid is; bijv. van ongeveer 0,2-3 keer, bij voorkeur ongeveer 0,5-1,5 keer de stoechiometrische hoeveelheid. Elk carbodiimide-10 molecuul reageert met een enkele zuurgroep van het polycarbonzuur. Bijv. worden in het algemeen carbodiimide tot dicarbonzuurmolverhoudingen van ongeveer 2:1 gebruikt in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding. Bij toevoeging van het condensatiemiddel bij kamertemperatuur resulteert binnen 30 seconden een merkbare polymerisatie, en deze is in 15 het algemeen binnen ongeveer 2 uur volledig.

Wanneer het polyethyleenimine door de toevoeging van een condensatiemiddel onoplosbaar is gemaakt, omvat een optionele nabehandelings-stap een verknoping van het gecondenseerde, beklede vermiculiet met een amineverknopingsmiddel, bijv. glutaarzuurdialdehyde, zoals bovenstaand 20 beschreven, om extra sterkte en stabiliteit aan het uiteindelijke samengestelde materiaal te verlenen.

Afhankelijk van het gekozen type polymeer kan een verscheidenheid van condensatiemiddelen en verknopingsmiddelen worden geselecteerd uit de bekende middelen om het samengestelde materiaal te versterken. Door 25 het gebruik van de beschreven werkwijzen volgens de onderhavige uitvinding is het mogelijk om een ruime verscheidenheid van biologsiche materialen te immobiliseren, teneinde nieuwe samengestelde biokatalytische materialen te verschaffen. In de volgende voorbeelden worden de immobi-lisatieprocedures in nader detail beschreven. Voorbeelden tonen ver-30 scheidene uitvoeringsvormen van de uitvinding en dienen niet beperkend te worden opgevat.

Voorbeeld I

Men bereidde uit verse aspartasebevattende Ξ,coli 80 g van een aspartasebevattende E.coli celpasta, die ongeveer 75 gew.% water be-35 vatte. Voor het maken van de pasta werd het fermentatiemedium geprepareerd door in een liter water 24 g gistextract, 30 g fumaarzuur, 2 g natriumcarbonaat, 2mM magnesiumsulfaat, en 0,lmM calaciumchloride op te 8302587

W

-9- lossen, en de pH werd met ammoniumhydroxyde op ongeveer 7,2 ingesteld.

Dit medium werd geent met 1 ml van een cultuur van E.coli (ATCC No.

31976), die gedurende 12-16 uur bij 37°C was geincubeerd in een pepton-medium, dat 0,5% mononatriumglutamaat bevatte. Het geënte medium werd 5 gedurende 12-14 uur bij 37°C geincubeerd. De cellen werden door centrifugeren gedurende 30 minuten bij 5000 omwentelingen per minuut geoogst.

Men voegde de 80 g aspartasebevattende E.coli toe aan 20 g vermi-culietdeeltjes. Nadat men de celpasta had laten absorberen in het vermi-culiet, werden 10 g polyethyleenimine aan het mengsel toegevoegd en werd 10 geroerd totdat een gelijkmatige verdeling was bereid. Daarna werd glu-taarzuurdialdehyde (20 g van een 25%'s oplossing in water) toegevoegd en gemengd, totdat harde deeltjes waren verkregen. Een tweede lading materiaal werd volgens dezelfde procedure bereid. Beide ladingen van materiaal liet men gedurende een nacht drogen.

15 Het materiaal werd in een kolom gepakt met een uiteindelijk bed- volume van 353 cm^. De kolom werd vervolgens gebruikt om ammoniumfuma-raat om te zetten in L-aspartinezuur. Men voerde een 1,5 M oplossing van ammoniumfumaraat met ImM magnesiumsulfaat, pH 8,5, bij 37°C door de kolom met 360 cm^/uur (1,0 sv*1-1 ‘). Men onderzocht de aspartasewerk-20 zaamheid van het effluent door het verdwijnen van fumaarzuur op een specbofotomeeter bij 240 nm. te meten. De kolom was gedurende 151 dagen in continu gebruik. In deze tijd werden monsters van het kolomeffluent geanalyseerd om de procentuele omzetting van het substraat vast te stellen. De resultaten staan in tabel A.

25 TABEL· A

dag % omzetting van 1,5M ammoniumfumaraat _ (1 doorgang bij 1 SV/h) 1 98,2 6 99,2 30 16 "'4 25 99,2 37 99,0 55 98,7 90 98,2 35 120 91,0 151 91,3 8302587 -10-

Voorbeeld IX

De algemene procedure van voorbeeld I werd gevolgd, waarbij 120 g celpasta en 15 g polyethyleenimine werd gebruikt. Een lading van geïmmobiliseerd materiaal werd gepakt in een kolomreaktor met een bedvolu-5 me van 173 cm^. De kolom was succesvol in het omzetten van 99% van een 1,8 M ammoniumfumaraatoplossing bij 360 cm^/uur {2,08 SV*1 *). De productiviteit van deze kolom werd berekend bij 493 g L-aspartine zuur geprodu-ceerd/liter bedvolume geïmmobiliseerde cellen/uur bij 37°C (3,7 mol/l/uur). Voorbeeld III

10 Tien ladingen van geïmmobiliseerde E. coli cellen (100 g vermi- culiet/lading) werden volgens de algemene procedure van voorbeeld IX bereid.

Daarna werd de biokatalysator verpakt in een kolom met een bedvolume van 12,5 1« Men voerde 1,8 M ammoniumfumaraat bij 37°C door de 15 kolom met verschillende stroomsnelheden, en men analyseerde het effluent op de omzetting van ammoniumfumaraat als in voorbeeld I. Tabel B toont de resultaten van de test.

TABEL B

stroomsnelheid % omzetting kg/uur mol/l/uur n (1/uur) (fumaarzuur) (L-aspar tine - (L-aspartinezuur) zuur) 12.50 99,1 2,97 1,79 18,75 97,5 4,38 2,63 25,00 95,0 5,69 3,42 62.50 56,00 8,38 5,04

Voorbeeld IV

De algemene procedure van voorbeeld III werd herhaald met een verse lading van E.coli cellen met deze uitzondering, dat de verse cellen 29% meer activiteit bezaten dan de vorige- lading had. Wanneer het substraat door de kolom geleid werd met 62,5 1/uur (zoals in voorbeeld III) bedroeg de geproduceerde hoeveelheid aspartinezuur 10,36 kg/uur (6,35 mol/l/uur). Dit is een 27% toename in productiviteit ten opzichte van voorbeeld III.

Voorbeeld V

22 Het enzymtryptofansynthetase kan worden gebruikt in de werkwijze volgens de uitvinding, om de omzetting van indool en serine in tryptofan te katalyseren. Vermiculietdeeltjes (2 g) en 4 ml ruwe tryptofansynthetase- 8302587 -11- extractoplossing van E.coli cellen werden met elkaar gemengd. Het extract liet men in het vermiculiet absorberen. Daarna werd 1 g polyethyleen-imine aan het mengsel toegevoegd om de vermiculietdeeltjes te bekleden. Vervolgens werd 2 ml van een 25%'s oplossing in water van glutaarzuur-5 dialdehyde toegevoegd en gemengd totdat harde beklede deeltjes waren verkregen. De gehele hoeveelheid materiaal werd daarna in een kolom gebracht en gewassen met een substraatoplossing, bestaande tit Q,05M serine, Q,05M indool, 0,005 M glutathion, 0,005M dibasisch kaliumfosfaat en 200 mg pyridoxal-5-fosfaat/liter, met een op 7,8 ingestelde pH. Ver-10 volgens werd de kolom terhaalde malen gebruikt in een ladingsgewijs

recirculatiesysteem, waarbij in 24 uur 80 mg L-tryptofan werd geproduceerd. Voorbeeld VI

Men mengde 9 g hele gistcellen R. rubra, die het enzym fenylalanine ammoniak-lyase bevatte, in 3 g vermiculietdeeltjes, en gaf de gelegen-15 heid voor absorptie in en grondige bekleding van de deeltjes, waarna tot 10°C werd gekoeld. Men bereidde een polysaccharide-bekledingsoplos-sing door 0,8 g Kelco polysaccharide (K9A5Q) poeder toe te voegen aan 100 ml gedeioniseerd water bij 80°C en gedurende 10 minuten te roeren.

Het poeder loste op en er werd 1 g kaliumchloride aan de oplossing toe-20 gevoegd. Men liet de oplossing afkoelen tot 50°C (waarbij hij in oplossing bleef). De warmte oplossing werd daarna over het koude vermiculiet-materiaal gegoten, terwijl gemengd werd. Het polysaccharide vormde zeer snel een gel, welke de vermiculietdeeltjes bekleedde, die R.rubra bevatten. De deeltjes werden in 100 ml 0,1 M kaliumfosfaatbuffer, 25 pH 7,0 gebracht en onder roeren grondig gewassen. De deeltjes werden uit de bufferoplossing verwijderd. De oplossing vertoonde geen tekenen van troebeling of wazigheid en was praktisch vrij van gistcellen, hetwelk aangaf, dat de immobilisatie succesvol was. De deeltjes werden in 50 ml Q,1M ammoniumcinnamaat bij een pH 9,3 gebracht en de oplossing werd 30 op PAL activiteit getest door de productie van L-fenylalanine te volgen.

Het geïmmobiliseerde celmateriaal was succesvol in de produktie van L-fenylalanine; met de tijd werden toenemende hoeveelheden L-fenylalanine in de reaktieoplossing waar genome n.

35 6302587

Claims (36)

1. Werkwijze voor het immobiliseren van biologische materialen door een samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal te bereiden, omvattende de stappen: 5 a) toevoeging van vermiculietdeeltjes aan een waterig medium van biologisch, materiaal,· b) laten absorberen van het waterige medium van biologisch materiaal in het vermiculiet; en c) bekleden van het vermiculiet met een polymeer.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het beklede vermiculiet- van stap c) verknoopt wordt met een verknopingsmiddel of gecondenseerd wordt met een condensatiemiddel.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarin het polymeer gekozen is uit de groep, bestaande uit polyalkyleeniminen, polysacchariden, 15 polyacrylamide, polyurethan, alginaat en carageen.

4. Werkwijze voor het immobiliseren van biologische materialen door een samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal te bereiden, omvattende de stappen: a) toevoeging van vermiculietdeeltjes aan een waterig medium van bio-20 logisch materiaal; b) laten absorberen van het waterige medium van biologisch materiaal in het vermiculiet; c) bekleding van het vermiculiet met een polyalkyleeniminepolymeer; en 25 d) verknoping van het beklede vermiculiet met een amineverknopingsmiddel of condensatie met een condensatiemiddel.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin het met polymeer beklede vermiculiet wordt gemengd met een voor verknoping voldoende hoeveelheid van een amineverknopingsmiddel om biologisch materiaal binnen het beklede 30 vermiculiet te immobiliseren..

6. Werkwijze volgens conclusie. 4, waarin het. polyalkyleeniminepolymeer wordt gemengd met een voor condensatie voldoende hoeveelheid van een polycarbonzuur om een partieel gepolymeriseerd geprecondenseerd in water oplosbaar polymeer te vormen voordat het met genoemd vermiculiet 35 wordt gemengd.

7. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin het beklede vermiculiet 8302587 * · -13- wordt gecondenseerd door een voor condensatie voldoende hoeveelheid toe te voegen van een carbodiimidecondensatiemiddel onder condensatie-omstandigheden.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, waarin het beklede vermiculiet 5 wordt gecondenseerd door toevoeging van een voor condensatie voldoende hoevedieid van een carbodimidecondensatiemiddel onder condensatie-omstandigheden.

9. Werkwijze volgens conclusie 7 of 8, verder omvattende een modificatie van het samengestelde onoplosbaar gemaakte biologische ina- 10 teriaal door nabehandeling met een amineverknopingsmiddel om additionele sterkte en stabiliteit aan het samengestelde materiaal te verlenen.

10. Werkwijze volgens een van de conclusies 4-8, waarin het polyalkyleeniminepolymeer wordt gekozen uit de groep, bestaande uit polyethyleenimine, polypropyleenimine, polybutyleenimine en polypen- 15 tyleenimine.

11. Werkwijze volgens een van de conclusies 4-8, waarin het polyalkyleeniminepolymeer polyethyleenimine is.

12. Werkwijze volgens conclusie 6 of 8, waarin het polycarbonzuur gekozen wordt uit de groep, bestaande uit maleïnezuur, bamsteenzuur 20 en adipinezuur.

13. Werkwijze volgens conclusie 7 of 8, waarin het cazbodiimide-r condensatiemiddel wordt gekozen uit de groep, bestaande uit 1-ethyl- 3,3-dimethylaminopropylcarbodiimidehydrochloride, dicyclohexyIcarbo-diimide, en l-cyclohexyl-3-(2-morfolinoethyl)carbodiimidemetho-p- 25 tolueensulfonaat en zouten daarvan.

14. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, waarin het amineverknopingsmiddel gekozen wordt uit de groep, bestaande uit glutaarzuurdi-aldehyde, diisocyanaten, polyisocyanaten, 2,4,6-trichloro-5-triazine, bisoxiran, bisimidaat, divinyl-sulfon, en 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeen.

15. Werkwijze volgens conclusie 1 of 4, waarin de hoeveelheid van het aan het vermiculiet toegevoegde biologische materiaal ongeveer 0,001 tot ongeveer 2 g, op basis van het droge gewicht, per gram vermiculiet bedraagt.

16. Werkwijze volgens conclusie 6, waarin de molverhouding van 35 polyalkyleenimine tot polycarbonzuur ongeveer 1:20 tot 1:0,0005 bedraagt.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, waarin het carbodiimide wordt 3302587 -14- gebruikt in een hoeveelheid, variërend van ongeveer 0,2 tot 3 keer de stoechiometrische hoeveelheid, betrokken op het polycarbonzuur.

18. Werkwijze volgens conclusie 16, waarin het carbodiimide wordt gebruikt in een hoeveelheid, die varieert van ongeveer 0,5-1,5 keer . 5 de stoechiometrische hoeveelheid, betrokken op het polycarbonzuur.

19. Werkwijze volgens conclusie 1 of 4, waarin het geimmobiliseerde biologische materiaal, gekozen is uit de groep, bestaande uit enzymen, microbiële cellen, antigenen, antilichamen, antibiotica, co-enzymen, bacteriën, gist, fungi, plantencellen, dierlijke cellen, 10 en weefselculturen.

20. Werkwijze volgens conclusie 1 of 4, waarin het biologische materiaal microbio geproduceerd aspartase is.

21. Werkwijze volgens conclusie 1 of 4, waarin het enzym tryptofansynthetase is.

22. Samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal, omvat tende een biologisch, actief materiaal, geadsorbeerd in deeltjes van vermiculiet, die binnen een polymeer zijn geïmmobiliseerd.

23. Samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal, omvattende een biologisch actief materiaal, geadsorbeerd binnen deeltjes 20 van vermiculiet, die binnen een polymeer zijn geïmmobiliseerd, waarbij het polymeer verknoopt is met een verknopingsmiddel.

24. Samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal volgens conclusie 23, waarin het polymeer een polyalkyleenimine is en het verknopingsmiddel een amineverknopingsmiddel is.

25. Samengesteld materiaal volgens conclusie 24, waarin het amine verknopingsmiddel gekozen is uit de groep, bestaande uit glutaarzuur-dialdehyde, isocyanaten, polyisocyanaten, 2,4,6-trichloro-S-triazine, bisoxiran, bisimidaat, divinylsulfon, en l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeen.

26. Samengesteld materiaal volgens conclusie 24, waarin het aminever- 30 knopingsmiddel glutaarzuurdialdehyde is.

27. Samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal, omvattende een biologisch actief materiaal, geadosrbeerd in deeltjes van vermiculiet, die binnen een polymeer zijn geïmmobiliseerd, waarbij het polymeer gecondenseerd is met een condensatiemiddel.

28. Samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal volgens conclusie 27, waarin het polymeer een polyalkyleenimine is en het con- 8302 5 87 -15- dens atiemiddel een carbodi.imidecondensatiexniddel is.

29. Samengesteld materiaal volgens conclusie 28, waarin het condensatiemiddel gekozen is uit de groep, bestaande uit 1-e.thyl- 3,3-dimethylaminopropylcarbodiimidehydrochloride, dicyclohexylcarbo-5 diimide, en l-cyclohexyl-3-(2-morfolinoethyl)-carbodiimide-metho-p-tolueensulfonaat en zouten daarvan.

30. Samengesteld materiaal volgens conclusie 24, of 26, waarin het polyalkyleeniminepolymeer gekozen is uit de groep, bestaande uit polyethyleenimine, polypropyleenimine, polybutyleenimine, en poly- 10 pentyleenimine.

31. Samengesteld materiaal volgens een van de conclusies 22, 23, 24, 2.7, of 28, waarin het biologisch actieve materiaal gekozen is uit de groep bestaande uit enzymen, microbiële cellen, antigenen, anti— lichamen', antibiotica, coenzymen, plantencellen, dierlijke: cellen, 15 bacteriën, gist, fungi en weefselculturen.

32. Samengesteld materiaal volgens een van de conclusies 22, 23, 24, 27 of 28, waarin het biologische actieve materiaal aspartase is.

, 33. Samengesteld materiaal volgens een van de conclusies 22, 20 23, 24, 27 of 28, waarin het biologisch actieve, materiaal tryptofan- synthetase is.

34. Werkwijze voor het produceren van aspartinezuur, omvattende het in contact brengen onder aspartinezuurproducerende omstandigheden van een substraat, dat ammoniumfumaraat bevat met een samengesteld on-25 oplosbaar gemaakt biologisch materiaal van aspartase of aspartase-bevattende microbiële cellen, geadsorbeerd in vermiculietdeeltjes en geïmmobiliseerd binnen een polymeer, waarbij het geïmmobiliseerde vermiculiet verknoopt is met een verknopingsmiddel of gecondenseerd is met een condensatiemiddel.

35. Werkwijze voor het produceren van tryptofan, omvattende het onder tryptofan producerende omstandigheden in contact brengen van een substraat, dat indool en serine bevat met een samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal, van. tryptofansynthetase of tryptofan-synthetase bevattende microbiële cellen,geabsorbeerd in.vermiculiet-35 deeltjes en geïmmobiliseerd binnen een polymeer, waarbij het geïmmobiliseerde vermiculiet verknoopt is met een verknopingsmiddel of gecondenseerd is met een condensatiemiddel. 8302587 -16-

36. Werkwijze voor het produceren van L-fenylalanine, omvattende het onder L-fenylalanine producerende omstandigheden in contact brengen van een substraat, dat ammoniumcinnamaat bevat, met een samengesteld onoplosbaar gemaakt biologisch materiaal van fenylalanine-ammoniak-2 lyase of fenylalaniner-ammoniaklyase-bevattende microbiële cellen, geabsorbeerd in vermiculietdeeltjes en geïmmobiliseerd binnen een polymeer. 8302587