JPH082311B2 - ポリアゼチジンポリマー固定化微生物細胞による有用物質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はポリアゼチジンポリマー固定化微
生物細胞による有用物質の製造方法に係る。本発明は特
に、Ｌ−アスパルターゼ活性を含有する固定化微生物細
胞、特に大腸菌（Escherichia coli）細胞を用いたＬ−
アスパラギン酸を製造する改良方法に係る。しかしなが
ら、他の細胞の固定化及び使用もまた考えられる。

【０００２】Ｌ−アスパラギン酸の製造に使用する大腸
菌もしくは他の微生物細胞の固定化に関するかなりの量
の先行技術がある。例えば、米国特許第3,791,926 号
（Chibata 他）には、大腸菌ＡＴＣＣ 11303の如きアス
パルターゼ−産生微生物を含有する水性懸濁液中で、ア
クリルアミド，Ｎ，Ｎ′−低級アルキレン−ビス（アク
リルアミド）およびビス（アクリルアミドメチル）エー
テルから選択されるモノマーの重合を伴なうＬ−アスパ
ラギン酸の製造方法が記載されている。得られたアスパ
ルターゼ−産生固定化微生物を、酵素反応によりＬ−ア
スパラギン酸を付与するフマル酸アンモニウム又はフマ
ル酸もしくはその塩と無機のアンモニウム塩との混合物
で処理する。

【０００３】アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細胞
の固定化及び得られた固定化細胞のＬ−アスパラギン酸
製造用の使用はまた、Fusee 他によりApplied and Envi
ronmental Microbiology, ４２巻，４号，６７２〜６７
６頁（１９８１年１０月）にも記載されている。Fusee
他によると、細胞は、イソシアナート基をキャップした
液体状ポリウレタンプレポリマー（ハイポール（登録商
標）（ＨＹＰＯＬ（登録商標））と細胞懸濁液との混合
により固定化され、そうして固定化細胞を含有する“フ
ォーム（foam）”を形成する。

【０００４】Ｓａｔｏ他（Biochimica et Bipphysica A
cta, 570， 179〜186 ページ，1979年）は、アスパルタ
ーゼ活性を含有する大腸菌細胞のκ−カラジーナン（κ
−carrageenan ）による固定化及びＬ−アスパラギン酸
を生産するための固定化生成物の使用について発表し
た。

【０００５】ウレタンプレポリマー，ポリウレタンもし
くは類似物中での微生物細胞の固定化について記載した
ほかの文献発表は、以下のことを含む： （ａ） ポリウレタンマトリックス中での微生物細胞の
固定化、Ｋｌｅｉｎ他によるBiotechnology Letters,３
巻，２号，６５〜７０ページ（1981年）； （ｂ） 親水性ウレタンプレポリマー：酵素包括 （entrapment）用に便利な物質、Biotechnology and Bi
oengineering, ２０巻，1465〜1469ページ（1978年）； （ｃ） 有機溶媒中でゲル内に包括された細胞によるス
テロイドの転換，Ｏｍａｔａ他によるEuropean J. Appl
ied Microbiology and Biotechnology, 8, 143〜155 ペ
ージ（1979年）； （ｄ） 親水性ウレタンプレポリマーを用いた微生物細
胞とオルガネラの包括、Ｔａｎａｋａ他によるEuropean
J. Applied Microbiology and Biotechnology,7, 351
〜354 （1979）。

【０００６】固定化微生物細胞を用いてＬ−アスパラギ
ン酸を製造する上記の方法には、種々の不便がある。例
えばＦｕｓｅｅ他及びＳａｔｏ他により発表された如き
Ｋ−カラジーナンガム及びポリウレタン“フォーム”
は、比較的柔軟で且つ圧縮性である。したがってこれら
の固定化細胞組成物は、フマル酸アンモニウムがアンモ
ニウムアスパルターゼへの変換のために通るカラム中で
使用されるとき、該細胞組成物は、特に高流速および／
もしくは比較的長めのカラムを使用する場合、圧縮され
そして詰まる。

【０００７】本発明の主な目的は、Ｌ−アスパルターゼ
活性微生物細胞好ましくは大腸菌細胞を用いてＬ−アス
パラギン酸を製造する改良方法を提供することであり、
該微生物細胞は特別な方法で固定化され、それによって
得られた組成物はＬ−アスパラギン酸のバッチ式もしく
は連続式製造に極めて有用である。

【０００８】更に特別の目的は、比較的長期間最適なＬ
−アスパルターゼ活性を保持する固定化大腸菌細胞を用
いて、フマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン酸を
製造する改良方法の提供を含む。本発明の他の特別の目
的は、固定化細胞の使用を含む先行技術で当面する問題
を取り除く、Ｌ−アスパラギン酸製造の使用に適した新
規な固定化微生物システムを提供することである。他の
目的はまた、以下で明らかとなるであろう。

【０００９】本発明の一態様によると、Ｌ−アスパルタ
ーゼ活性を含有する大腸菌ＡＴＣＣ11303 細胞もしくは
同等の細胞を含む固定化微生物細胞組成物とフマル酸ア
ンモニウムもしくは同等のものとの接触によるＬ−アス
パラギン酸の製造方法が提供され、該細胞は、硬化性ポ
リアゼチジンプレポリマー物質の硬化により得られる固
定化不溶性架橋ポリマーによって固定化され、該プレポ
リマー物質は微生物細胞のＬ−アスパルターゼ活性が著
しく減弱する温度より低い温度で硬化され、該細胞／架
橋ポリマー組成物は固体状不活性支持体上の被膜を構成
する。固定化細胞／架橋ポリマー被膜の支持体上への適
用は、Ｌ−アスパラギン酸製造に使用するためのすこぶ
る有利な形態の細胞／ポリマー組成物を提供する。本発
明の細胞／ポリマーシステムが、Ｌ−アスパルターゼ活
性の著しい損失なしに支持体上の乾燥被膜として提供さ
れ得ることは、特に有利な特徴である。

【００１０】概して本発明は、Ｌ−アスパルターゼ活性
を有することが知られており、それゆえ、細胞を固定す
るため上で説明したように特別な架橋ポリマーシステム
を用いて新規で有用な構造体（configuration ）でフマ
ル酸アンモニウムの変換によりＬ−アスパラギン酸（も
しくはそのアンモニウム塩）を産生できる、固定化大腸
菌特に大腸菌ＡＴＣＣ 11303の全細胞もしくはその同等
物に依存している。

【００１１】示したプレポリマーシステムは、４０℃よ
り低い温度で、細胞のＬ−アスパルターゼ活性を著しく
低下させることなく大腸菌を含有する比較的多量の水の
存在下で架橋され得る。このような水性架橋条件が、た
とえ細胞が不溶性架橋ポリマー網目構造中に固定化され
ても、Ｌ−アスパルターゼ活性を有する大腸菌細胞とし
得ることは、本発明の驚くべき特徴である。

【００１２】本発明の他のすばらしい特徴は、ポリマー
水溶液中の大腸菌細胞の湿分散体（wet dispersion）
が、驚くべきことに固定化細胞が依然としてそのもとの
Ｌ−アスパルターゼ活性をほとんど保持しながら、乾燥
され得ることである。該乾燥工程は、Ｌ−アスパルター
ゼ活性を保持している細胞を高濃度で有している被膜，
膜，粒子等の形態で、強力な，良く架橋した，不溶性組
成物を提供する利点を有している。

【００１３】ここに記載の新規な固定化Ｌ−アスパルタ
ーゼ細胞組成物は、例えばＦｕｓｅｅ他およびＳａｔｏ
他により前記の文献中に報告された固定化Ｌ−アスパル
ターゼ活性大腸菌細胞組成物より性能がすぐれているこ
とが判明した。

【００１４】本発明の大腸菌細胞の固定化用の架橋ポリ
マー網目構造を提供するための使用に適したプレポリマ
ー物質は、以下に示すものである。

【００１５】水溶液中で＝ＮＨ，−ＳＨ，−ＯＨ，−Ｃ
ＯＯＨとの反応により架橋され得るポリアゼチジンプレ
ポリマー；又はＨ₂ Ｏ除去、加熱もしくはより塩基性ｐ
Ｈへの変化により架橋され得る他のポリアゼチジン。本
方法に使用できるポリカップ（登録商標）１７２（ Pol
ycup（登録商標） 172）（ハーキュレス社）の如き代表
的ポリアゼチジンの理想的構造は、次の通りであり、式
中Ｒは典型的には−（ＣＨ₂ ）₄ −である：

【００１６】

【化１】

【００１７】前記のポリマーシステムは、種々の異なる
形態(form)及び形（shape ）を有する細胞／ポリマー組
成物を提供するＬ−アスパルターゼ活性大腸菌の固定化
に使用され得る。例えば、固定化細胞／ポリマー組成物
は、膜，フィラメント（filament），繊維（fiber ），
管，ビーズもしくは類似物の形態で製造され得る。本発
明の特に重要な実施態様は、適当な形の支持体上の被膜
として固定化細胞／ポリマー組成物を提供することを含
み、該支持体は、有利には、必ずしもその必要はないけ
れども、不活性固体状の有機もしくは無機の多孔性もし
くは非多孔性物質の固体または網状ビーズまたは粒子の
形態である。上記に記載したように、本発明の組成物
は、細胞のＬ−アスパルターゼ活性に本質的な影響を及
ぼさずに硬化且つ乾燥され得、その結果として該組成物
は、乾燥被膜ビーズあるいは他の粒子状物質（particul
ate material）の形態に製造でき、且つ使用に必要とな
るまで貯蔵できる。典型的には、本発明の固定化細胞／
架橋ポリマー組成物用に使用しうる支持体もしくは担体
は，ビーズもしくは粒子状の形態の次のものを含む： モレキュラーシーブ イオン交換樹脂 ア ル ミ ナ シリカ及びシリカゲル 有孔虫の骨格 ポリマーラテックス 金 属 本発明で使用されるポリマーシステムの有用な性質は、
該システムがＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞
と水中で接触もしくは混合でき、次いで大腸菌細胞を保
持もしくは固定化する不溶性で比較的固定性のポリマー
マトリックスを形成するように架橋（もしくは硬化）で
きることである。使用される必要な架橋条件は充分に温
和であり、そのため大腸菌突然変異細胞のＬ−アスパル
ターゼ活性が保持されるということは特に有利である。

【００１８】上記に示したように、本発明の特に所望の
組成物は、Ｌ−アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細
胞と固定化ポリマーを、被膜としてかたい無機もしくは
有機ポリマービーズ上に適用することにより得られる。
これらの比較的非圧縮性組成物を用いると、固定床もし
くは流動床に於いて高生産量が可能なＬ−アスパルター
ゼ活性触媒ベッドが可能である。上に記載したように、
比較的柔軟で圧縮性であるκ−カラジーナンガム又はポ
リウレタンフォームを使用する、従来の文献に記載され
たＬ−アスパルターゼ活性固定化細胞組成物にあって
は、圧縮性であるため、高流速および／又は長いカラム
（ベッド）の場合、詰まる傾向があったのである。

【００１９】本発明によれば、種々の方法が、硬化もし
くは架橋された形態のプレポリマーとの組み合わせによ
り、Ｌ−アスパルターゼ活性を保持しながら、大腸菌Ａ
ＴＣＣ１１３０３細胞の固定化のために利用され得る。
すなわち、ポリアゼチジンプレポリマーの場合、大腸菌
ＡＴＣＣ１１３０３細胞は、プレポリマーの水溶液と有
利に混合され、そうして均質混合物が得られ、その後で
ポリアゼチジンは次のいずれかの方法により不溶性Ｌ−
アスパルターゼ活性組成物を付与するために硬化もしく
は架橋され得る： 水の一部もしくはほとんど全部を60℃より低い温度（通
常は40℃と０℃の間）で且つ 760〜1.0 Torrの圧力下で
除去すること； 7.5 以上にpHを上昇させること； 大腸菌／ポリアゼチジン混合物をポリアミンにさらすこ
と（例えば、１〜２重量部（parts ／weight）のポリエ
チレンイミン，ポリアミノイオン交換樹脂，ジエチレン
トリアミン，エチレンジアミン等の各々に対し組成物10
0 部を使用する）。

【００２０】本発明の固定化細胞／ポリマー組成物は、
バッチ式もしくは連続式の両方法によりアスパラギン酸
を作るのに使用され得る。しかしながら、これらの組成
物は、特にビーズもしくは他の粒子状支持体（particul
ate support)上に被覆される場合には、次式にしたがう
フマル酸アンモニウム水溶液のＬ−アスパラギン酸アン
モニウムへの連続変換に特に有効である：

【００２１】

【化２】

【００２２】本発明のＬ−アスパラギン酸もしくはＬ−
アスパラギン酸アンモニウムの製造に使用し得る方法の
実例としては、次の通りである： (i) 触媒組成物が、0.1 乃至5.0 モル（好ましくは
0.5乃至 2.0モル）のフマル酸アンモニウムの水溶液中
で、pH5.0 乃至10.0（好ましくはpH7.5 乃至9.5)で、1.
0 乃至100 時間（好ましくは８乃至48時間）、50℃より
低い温度（好ましくは20乃至40℃）で撹拌されるバッチ
式工程。広くは0.05乃至50ｇの好ましくは1.0 乃至15ｇ
の固定化細胞を、出発フマル酸アンモニウム１モル当た
りに使用する。変換後、触媒組成物は、濾過もしくは同
等の方法により、フマル酸塩溶液を変換する新しいバッ
チでの再使用のために除去され得る。生成物溶液は、Ｌ
−アスパラギン酸を単離するための普通の工程（酸性
化，沈殿，濾過，洗浄，再結晶，乾燥）に適した形態で
得られる。

【００２３】(ii) 触媒組成物例えば被覆ビーズをカラ
ム内に置き、そしてフマル酸アンモニウム溶液（濃度，
pH，温度はバッチ式工程に記載のものと同じである）
を、上からもしくは下から（流動床方式）のどちらかか
ら触媒ベット内を通過させる連続式工程。これらのフマ
ル酸塩溶液の通過速度は、0.1 乃至1000空間速度／時で
変化し得る。例えば、１時間当たり5.0 リットルの溶液
が、1.0 リットルの触媒ベットを通り、これは１時間当
たり5.0 空間速度（Ｓ．Ｖ．）と表わされる。好ましく
は、フマル酸塩からＬ−アスパラギン酸塩への本質的に
100 ％の変換が生じるフマル酸塩溶液の流速は、0.5 乃
至20.0Ｓ．Ｖ．／時に一致する。これらの触媒ベットカ
ラムからの溶出液は、Ｌ−アスパラギン酸を単離するた
めの通常の工程（上記のバッチ式工程に於いて概略を述
べたように）に適している。

【００２４】本発明を、以下の実施例及び比較例により
詳細に説明する。

【００２５】実施例１ ポリアゼチジンゲルで固定化したＬ−アスパルターゼを
含有する大腸菌の製造 a) ポリアゼチジン水溶液2.0 ｇ（ヘルクレスポリカッ
プ（登録商標）172 、Ｈ₂ Ｏ中に12％の固体を有する如
き）と大腸菌ＡＴＣＣ11303 ペースト2.0 ｇとの混合物
を、均質分散を確実にするために、25℃で５分間磁気撹
拌棒で迅速に撹拌した。次いでこの混合物を、25℃で16
時間乾燥させるために、ポリスチレンの表面上に注い
だ。得られた２インチ×２インチ×1/16インチの厚さの
屈曲できる膜を、前記表面から取り除き、すると0.7 ｇ
の重さであった。このフィルムをＬ−アスパルターゼの
測定（第１表参照）に使用し、大腸菌細胞（水和状態）
2.0 ｇを含有すると概算された。

【００２６】b) 2.0 ｇのポリカップ（登録商標）172
と2.0 ｇの大腸菌ＡＴＣＣ11303 の均質混合物を、30ｇ
の水和した５オングストローム、８〜１２メッシュのモ
レキュラーシーブビーズ上に、25℃で５乃至20 Torr で
45分間回転させることにより分布させた。25℃で開放さ
れた空気中でさらに16時間乾燥の後、得られた被覆ビー
ズは30.4ｇの重さであった。これらの被覆ビーズの一部
5.0ml は3.9 ｇの重さであった。この試料をＬ−アスパ
ルターゼ活性（第１表参照）の測定に使用し、0.26ｇの
大腸菌細胞を有していると概算された。

【００２７】

【数１】

【００２８】c) 2.0 ｇの大腸菌ＡＴＣＣ11303 の2.0
ｇのポリカップ（登録商標）172 中の均質分散を25℃
で、30分間25℃で木製の棒を用いて手で混合することに
より、30.0ｇのアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ45イ
オン交換ビーズ（42％Ｈ₂ Ｏ＝Ｎ−Ｈ型の）上に分散さ
せた。いくらか粘着性の薄層を、空気中に25℃で16時間
放置した。得られた自由に流動するビーズは、25.8ｇの
重さであった。これらの乾燥被覆ビーズの試料3.0 ｇ
は、体積5.0ml を有していた。1.5 Ｍフマル酸アンモニ
ウム溶液に浸すことにより、体積は5.5ml に膨脹した。
これらの湿った被覆ビーズの一部5.0ml をＬ−アスパル
ターゼの測定（第１表参照）に使用し、大腸菌含量の概
算値は0.21ｇであった。

【００２９】

【数２】

【００３０】d) 脱イオン水4.0 ｇとポリカップ（登録
商標）172 2.0 ｇ中の大腸菌ＡＴＣＣ11303 4.0 ｇの均
質分散を同量の三部に分けて、3.5 時間かけて、60個の
直径0.25のテフロン（登録商標）球を含有するアンバー
ライト（登録商標）ＩＲＡ45（42％Ｈ₂ Ｏ、フリーの＝
Ｎ−Ｈ型の）10.0ｇに加えた。この混合物を、25℃で５
乃至20 Torr で回転させた。合計で５時間減圧下で乾燥
の後、得られた乾燥被覆ビーズ（テフロン（登録商標）
球は除去した）は、7.8 ｇの重さであった。これらの乾
燥した自由に流動する被覆ビーズの一部5.0ml は、2.9
ｇの重さであった。1.5 Ｍフマル酸アンモニウム溶液で
飽和の後、体積は6.25mlに膨脹した。これらの湿った被
覆ビーズの一部5.0ml を、Ｌ−アスパルターゼの測定
（第１表参照）に使用した。概算のこの部分の大腸菌含
量は、

【００３１】

【数３】

【００３２】であった。

【００３３】e) 3.0 ｇの大腸菌ＡＴＣＣ11303 の6.0m
l の脱イオン水と3.0 ｇのポリカップ（登録商標）172
中の均質分散を、上記の減圧下での乾燥と同じ方法で1
0.0ｇのアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ45（42％Ｈ
₂ Ｏ、フリーの＝Ｎ−Ｈ型の）上に広げた。合計で10.7
ｇの乾燥被覆した自由に流動するビーズが得られた。乾
燥被覆ビーズの一部5.0ml は、3.0 ｇの重さであった。
1.5 Ｍフマル酸アンモニウム溶液中に浸した後、この体
積は5.75mlに膨脹した。湿った被覆ビーズの一部5.0ml
を、Ｌ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用し
た。この5.0ml 部分の概算の大腸菌含量は、0.73ｇであ
った。

【００３４】

【数４】

【００３５】f) 4.0 ｇの大腸菌ＡＴＣＣ11303 の4.0
ｇのポリカップ（登録商標）172 および8.0 ｇの脱イオ
ン水中の均質分散を、おおよそ等しい６部に分けて、5.
5 時間かけて25℃且つ５乃至20 Torr で、直径0.5 イン
チの８個のテフロン（登録商標）球を含有する10.0ｇの
アンバーライト（登録商標）ＩＲＡ938 ビーズ（ローム
＆ハース、73％Ｈ₂ Ｏ、直径0.38mm、四級アミンクロリ
ド塩の形態）に加えた。25℃且つ５乃至20 Torr での合
計６時間回転した後、得られた乾燥被覆した自由に流動
するビーズは、10.3ｇの重さであり且つ16.6mlの体積を
有していた。これらのビーズを過剰の1.5 Ｍフマル酸ア
ンモニウム溶液（pH8.5)に16時間25℃で浸すと、17.5ml
の湿ったビーズが得られた。1.14ｇの大腸菌ＡＴＣＣ11
303

【００３６】

【数５】

【００３７】を含有すると概算された湿ったビーズの一
部5.0ml を、Ｌ−アスパルターゼ活性の測定（第１表参
照）に使用した。

【００３８】比較例１ ポリマー結合剤を用いない、Ｌ−アスパルターゼを含有
する大腸菌細胞によるモレキュラーシーブビーズ及びイ
オン交換樹脂ビーズの被覆 Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞を固定化する
のに使用される上記のポリマーシステムの効用を実証す
るために、Ｌ−アスパルターゼだけを含有する細胞、例
えばポリマーではない結合剤で物質を被覆する次の実験
をおこなった。

【００３９】ａ）Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌
細胞ＡＴＣＣ11303 1.0ｇのリン酸ナトリウム緩衝液
（ 0.1Ｍ、pH 7.5） 5.0ml中のスラリーを同量ずつ４つ
に分けて3.5時間かけて、直径 0.5インチの10個のフテ
ロン (登録商標) 球を含有する水和した５Ａモレキュラ
ーシーブビーズ（８〜12メッシュ）10.0ｇに加えた。こ
の混合物を、25℃且つ５乃至10 Torr で回転させた。合
計約４時間後、得られた乾燥被覆された自由に流動する
ビーズは、 9.9ｇの重さであった。これらの乾燥ビーズ
の一部 5.0mlは 4.2ｇの重さであった。 1.5Ｍフマル酸
アンモニウム溶液に浸しても、体積は変化しなかった。
被覆ビーズのこの一部概算の大腸菌細胞含量は、0.42ｇ
であった。

【００４０】

【数６】

【００４１】被覆ビーズの一部 5.0mlを、 1.5Ｍフマル
酸アンモニウム溶液50ml中で25℃で24時間穏やかに撹拌
した。溶液は、かなりの量の物質がビーズから抜け落ち
たことを示して、非常に濁った。ビーズをデカントによ
り単離し、再び新しい 1.5Ｍフマル酸アンモニウム50.0
ml中25℃でＬ−アスパルターゼ活性の測定（第１表参
照）のために、穏やかに撹拌した。しかしながら、１時
間後であっても、溶液は再び非常に濁った。時折、ビー
ズを単離し、そして新しい 1.5Ｍフマル酸アンモニウム
溶液と穏やかに撹拌した。ビーズは、溶液を非常に濁す
かなりの量の物質を放ち続けた。ポリマー結合剤を同様
に細胞／ビーズ調製物(formulation）に加えると、この
性質はＬ−アスパルターゼ活性細胞被覆ビーズの製造の
いずれにおいても観察されなかった。すべてのポリマー
の実施例では、フマル酸アンモニウム溶液は、被覆ビー
ズの上に透明に残っていた。

【００４２】ｂ）同様の方法で、大腸菌ＡＴＣＣ11303
10.0ｇのリン酸塩緩衝液（ 0.1Ｍ、pH7.5）30g 中のス
ラリーをポリマー結合剤なしで、50.0ｇのアンバーライ
ト (登録商標) ＩＲＡ45（ロム＆ハスからの、42％Ｈ₂
Ｏ、＝Ｎ−Ｈ型）上に、 4.5時間かけて25℃且つ５乃至
20 Torr で被覆した。得られた47.6ｇの自由に流動する
乾燥被覆ビーズは83.5mlの体積を有していた。これらの
ビーズを過剰の 1.5Ｍフマル酸アンモニウム水溶液に浸
すと、溶液はビーズから離れた多量の物質で濃厚且つ不
透明になった。この不透明な母液からビーズを濾別（木
綿濾布、ファイバーガラスマット、43メッシュのナイロ
ンスクリーン、中位の多孔性半融グラス（medium poros
ity sintered glass））するすべての試みは失敗した。
なぜならば、濃厚なゼラチン状粒子がすぐにフィルター
につまったからである。この性質は、本発明のようにポ
リマー結合剤が細胞／ビーズ調製物(formulation）中に
混合された場合には、観察されなかった。このような場
合には、ビーズ上の水溶液は常に透明に保たれ、フィル
ター内をすみやかに流れた。

【００４３】実施例２ Ｌ−アスパルターゼ活性の測定 前記の実施例１及び比較例１に記載の固定化大腸菌ＡＴ
ＣＣ11303 組成物のＬ−アスパルターゼ活性を、第１表
に示す。各々の場合、0.002 Ｍ Ｍg ＳＯ₄ を含有する
1.5Ｍフマル酸アンモニウムの脱イオン水溶液（pH 8.
5）50ml中で穏やかに８乃至16時間25℃で振りまぜるこ
とによって、試料を試験準備した。次いで各試料から溶
液を流出させ、再び８乃至16時間25℃で穏やかに振りま
ぜる前に50mlの新しいフマル酸塩溶液を加えた。この時
点ですべての試料は、前記実施例１で述べたポリマー結
合剤と調合した。その上澄み溶液はすべて透明であっ
て、固体状支持体から抜け落ちた物質証拠がないことを
示した。ポリマー結合剤を使用せずに製造した試料（比
較例１）は、数回の洗浄後でさえも、非常に濁った上澄
み溶液を付与し続けた。このことは、細胞物質は固体状
支持体に確実に結合していないことを示している。

【００４４】次の段階では、洗浄し且つ良く排水した合
成物の一部5.0ml を（又は膜の場合、２インチ×２イン
チ×0.125 インチ）取り、新しい上記のフマル酸アンモ
ニウム溶液50.0ml中で25℃で振りまぜた。60分後に試料
を除去し、脱イオン水で１／1000に希釈した。280nm に
於ける開始時の 1.5Ｍフマル酸アンモニウム溶液（１／
1000希釈で0.43であると観察した）からの光学密度の減
少は、Ｌ−アルパルターゼ活性を示した。 280nmにおけ
る15Ｍ Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム塩(pH8.5) の
光学密度は、実質的にゼロ（＜0.005)である。

【００４５】フマル酸塩からＬ−アスパルターゼへの観
察された変化は、第１表にアスパラギン酸のモル数／時
／触媒ベットのリットル(l) として及びアスパラギン酸
のモル数／時／湿った大腸菌のkgとして示す。例えば、
ポリアゼチジン，細胞ペーストおよびイオン交換ビーズ
を用いた実施例１ｄでは、280nm に於ける光学密度は25
℃で60分後に0.43から0.32に低下した。計算は次の通り
である：

【００４６】

【数７】

【００４７】大腸菌ＡＴＣＣ １１３０３を含有するポ
リウレタンフォーム（パイポール（登録商標））の37℃
に於けるＬ−アスパルターゼ性能を示す文献中にあるデ
ータからの計算値もまた、第１表に示す。ここでは 126
ｇの細胞を有する 0.777ｌのベットは、 2.0ｌの 1.0Ｍ
フマル酸塩を 100％Ｌ−アスパラギン酸塩に37℃で変換
するために32分間要した。これらの研究者らはまた、
1.5Ｍフマル酸塩の平均変換速度は、 1.0Ｍフマル酸塩
よりも８％低いことを報告している。彼らはまた、37℃
における速度は、25℃の1.67倍であることも観察した。
このように、本出願人のデータ（25℃、 1.5Ｍフマル酸
塩）と比較した彼らのＬ−アスパラギン酸生成速度の正
しい評価は、次の通りである：

【００４８】

【数８】

【００４９】これらの値を本発明の例で得られたデータ
と比較すると、ポリウレタンフォームシステムより本方
法の優位が示される。

【００５０】

【表１】

【００５１】

【表２】

【００５２】実施例３ Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム
として）の連続生成 実施例１ｄからの湿ったビーズの一部5.0ml を、直径0.
7cm ×15cmのカバーをかぶせたガラスカラムの中に入れ
た。カラム温度は、37℃に保った。0.02ｍＭＭｇＳＯ₄
を含有する 1.5Ｍフマル酸アンモニウムの脱イオン水の
溶液（すべてpH8.5)を、連続的に 0.5ml／分の速度でビ
ーズのベットを通した。溶出生成物溶液試料を定期的に
とり、実施例２に記載したように脱イオン水で１／1000
希釈としてＬ−アスパラギン酸塩含量を分析した。溶出
液の大部分を集めたが、カラムに戻さなかった。次のデ
ータは、50日間の連続運転にわたって被覆ビーズのＬ−
アスパルターゼ活性は保持され本質的に変化しないこと
を示す。

【００５３】

【表３】

【００５４】6.0 ベット容量／時（5.0 mlの触媒ベット
を 0.5ml／分で通る）での62.5％変換率に於けるＬ−ア
スパラギン酸の生成速度は次の通りである：

【００５５】

【数９】

【００５６】37℃で１時間にわたって同じカラムを 4.0
ベット容量／時（5.0 mlの触媒ベットを0.33ml／分で通
る）の速度で動かすと、フマル酸塩(1.5Ｍ) の平均変換
率は80.0％であった。これは次に該当する：

【００５７】

【数１０】

【００５８】それぞれ 6.0及び 4.0ベット容量／時に対
応するこれらの変換率62.5％及び80.0％に基づく、 100
％変換を達成するのに必要な流速の図式的方法による控
え目の概算は、 1.5ベット容量／時である。 1.5ベット
容量／時でのＬ−ＡＳＰ生成速度は：

【００５９】

【数１１】

【００６０】これらの値（1.5 ベット容量／時での 100
％変換）および

【００６１】

【数１２】

【００６２】は、κ−カラジーナンゲル上に固定化した
大腸菌ＡＴＣＣ １１３０３細胞のカラムの連続操作で
報告された 100％変換のための 1.1ベット容量／時およ
び

【００６３】

【数１３】

【００６４】の値よりも著しく良い。

【００６５】本実施例で得られたＬ−アスパラギン酸ア
ンモニウム水溶液は、直接に使用しうることが予想され
る。例えば、乾燥固体アスパラギン酸の回収もしくは分
離なしで、アスパラギン酸のアミンのベンゾイルオキシ
カーバメイトを形成するためのベンジルクロロホルメイ
トとの反応のために使用し得、このカーバメイトは商業
上重要な甘味剤Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニ
ン メチルエステル製造の重要な中間体である。現在で
はこのベンゾイルオキシカーバメイトは、乾燥結晶固体
Ｌ−アスパラギン酸から出発して作られる。前記の酸
を、次の反応にしたがったベンジルクロロホルメイトと
の反応の前に水酸化ナトリウム水溶液中に溶解する：

【００６６】

【化３】

【００６７】本発明に従ったフマル酸アンモニウムをＬ
−アスパラギン酸アンモニウムに変換するための固定化
全細胞の酵素法は、直接的に塩基性水性生成物の流体、
例えば 1.5モルの98.5％Ｌ−アスパラギン酸アンモニウ
ム溶液を提供する。該溶液は、アンモニアの除去の後、
所望のベンジル（もしくは他の）オキシカーバメイトの
水溶液を作るためのベンジルクロロホルメイト（もしく
は他のクロロホルメイト）との反応における直接使用に
適している。これは、乾燥アスパラギン酸結晶の単離の
必要性及び時間及びこれらに付随した費用を避けること
を可能にさせる。例えば、Ｌ−アスパラギン酸アンモニ
ウム溶液からの乾燥Ｌ−アスパラギン酸結晶の単離は、
一般に次のことが必要である。

【００６８】(1) pH2.8 でＬ−ＡＳＰを沈殿させるた
めの、役0.7 乃至0.8 モルのＨ₂ ＳＯ₄ を用いた、 1.5
モルのＬ−アスパラギン酸アンモニウム生成物（Ｌ−Ａ
ＳＰ）の流体の酸性化； (2) Ｌ−ＡＳＰ生成物流体は98.5％のＬ−ＡＳＰ（残
りはフマル酸アンモニウム）を含有しているけれども、
Ｌ−ＡＳＰの沈殿物の水洗により固型Ｌ−ＡＳＰはたつ
たの89〜93％の収率でしか得られない。母液中のＬ−Ａ
ＳＰの５〜９％の保持は、Ｌ−ＡＳＰの値から考えてか
なりの損失である； (3) 沈殿したＬ−ＡＳＰ結晶の続いての乾燥もまた高
価である（１ポンド当り約５〜10セントと概算され
る）。

【００６９】本発明にしたがった水性アンモニウムＬ−
ＡＳＰ生成物の直接的使用は、段階(1)〜(3) に固有の
不便を除去する。アンモニウムＬ−ＡＳＰ生成物流体の
調整は、最適の結果を得るのに適している。例えば、水
酸化ナトリウム（アンモニウムＬ−ＡＳＰ１モル当り0.
5 乃至2.0 モルのオーダーで）の添加は、ＮＨ₄ ⁺ のＮ
Ｈ₃ との置換を生じ、ＮＨ₃ は沸騰により除去でき、さ
らにフマル酸アンモニウムを作るのに使用できる。ＮＨ
₄ ⁺ イオンのほとんどは、クロロホルメイト反応を促進
するために除去される。

【００７０】本発明は、大腸菌の固定化もしくはＬ−ア
スパラギン酸製造のためのこのような固定化細胞の使用
に限定されない。このように、他の細胞は、記載した硬
化性ポリマー物質を用いて一般に同様の方法で固定化さ
れ得る。更にこのような固定化細胞の変形例及びその使
用を次の実施例で例示する。

【００７１】実施例４ ポリアゼチジンゲルで固定化したシュウドモナス ダカ
ンエの固定化を介したＬ−アラニンの製造 シュウドモナス ダカンエ（Pseudomonas dacunhae）Ａ
ＴＣＣ21192 を、 ペプトン（バクト−デイフコ） 9.0ｇ／ｌ， カゼイン水解物（カザミノ酸、デイフコ） 2.0ｇ／ｌ， ＫＨ₂ ＰＯ₄ 0.5ｇ／ｌ， Ｍg ＳＯ₄ ・ 7Ｈ₂ Ｏ 0.1ｇ／ｌ， Ｌ−グルタミン酸ナトリウム 15.0ｇ／ｌ， （pHはＮＨ₄ ＯＨで 7.2に調整） の培地で培養した。醗酵は、好気性条件下で、23時間、
30℃、 300回転／分でおこなった。3.62ｇ（湿重量）の
細胞ペーストと 3.6ｇのポリアゼチジン水溶液（ヘルク
レスポリカップ (登録商標)172）との混合物を、木製の
棒を用いて手で25℃で均質に撹拌した。この混合物を、
3.6ｇのアンバーライト (登録商標) ＩＲＡ938 イオン
交換ビーズ（ローム＆ハス）上に分散させた。前記ビー
ズは、85％より多いビーズと会合している湿気を除去す
るために、あらかじめ25〜30℃で60時間空気中乾燥し
た。ビーズ上の混合物の薄いフィルムを25℃で24時間空
気中で乾燥させた。得られた自由に流動するビーズは、
体積20mlを占めた。これらのビーズを５容量の普通の塩
水で洗浄し、そのうちの一部18mlを、37℃に保たれたpH
5.5 （Ｈ₂ ＳＯ₄ で調整）の 1.5Ｍアスパラギン酸アン
モニウム溶液 0.5ｌを含有するフラスコ中に入れた。全
部の混合物を48時間撹拌し、一方pHは必要なとき硫酸の
添加により保持した。

【００７２】この期間の最後に、ＨＰＬＣ（μＮＨ₂ ボ
ンダパックカラム、ウォーターズ社；溶出液ＣＨ₃ ＣＮ
25％、５ｍＭＫＨＰＯ₄ pH 4.4 75％）による液体の分
析は、Ｌ−アスパラギン酸が98％収率でＬ−アラニンを
形成するように脱カルボキシル化されたことを示した。

【００７３】実施例５ ポリアゼチジンゲルで固定化された巨大菌を含有するペ
ニシリン−Ｇアシラーゼの製造 巨大菌ＡＴＣＣ14945 を先に記載（米国特許第 3,446,7
05号）した如き好気性条件下で培養した。10.5ｇ（湿重
量）の細胞物質と10.5ｇのポリアゼチジン水溶液（ヘル
クレスポリカップ (登録商標)172）との混合物を、木製
の棒を用いて手で25℃で均質になるまで撹拌した。この
混合物を 9.8ｇのアンバーライト (登録商標) ＩＲＡ93
8 イオン交換ビーズ（ローム＆ハス）上に分散させた。
前記のビーズは前もって25〜30℃で60時間空気乾燥し、
ビーズから＞85％の湿気を除去しておいた。混合物の薄
層を、25℃で24時間空気乾燥させた。得られた自由に流
動するビーズは13.1ｇの重さであり、且つ体積53mlを占
めた。１ｇのフリーな細胞に対応するこれらのビーズに
一部1247mgを、ペニシリンアシラーゼ活性の測定に用い
た。６−アミノペニシラン酸生成物を、高速液体クロマ
トグラフィ（ＨＰＬＣ）により定量した。固定化製造物
の活性は、細胞ペースト１ｇ当たり19.7μモル／時であ
った。この値は、フリーな細胞の活性の67％であった。

【００７４】実施例６ ポリアゼチジンゲルで固定化した大腸菌を含有するペニ
シリン−Ｇアシラーゼの製造 大腸菌ＡＴＣＣ9637を、Sato他、Eur. J. Appl. Mmicro
biol., 2:153〜160(1976) により報告されたよに好気的
に培養した。20.7ｇ（湿重量）の細胞ペーストと20.7ｇ
のポリアゼチジン水溶液（ヘルクレスポリカップ (登録
商標)172）との混合物を、木製棒を用いて手で25℃で均
質になるまで撹拌した。この混合物を19.3ｇのアンバー
ライト (登録商標) ＩＲＡ938 イオン交換ビーズ（ロー
ム＆ハス）上に分散させた。前記のビーズは、ビーズと
会合している＞85％の湿気を除くために、前もって25〜
30℃で60時間空気乾燥した。混合物の薄いフィルムを25
℃で24時間空気乾燥させた。得られた自由に流動するビ
ーズは27.4ｇの重さがあり、体積95mlを占めた。１ｇの
フリーの細胞に対応するこれらのビーズの一部1325ml
で、ペニシリンアシラーゼ活性を測定した。６−アミノ
ペニシラン酸生成物を、高速液体クロマトグラフィ（Ｈ
ＰＬＣ）により定量した。固定化生成物の活性は細胞ペ
ースト１ｇ当たり53.6μモル／時であり、これはフリー
な細胞活性の99％であった。

【００７５】実施例７ フルクトースの濃いコーンシロップ（High Fructose Co
rn Syrup）製造用のグルコースイソメラーゼ活性を含有
するアルスロバクター種の固定化 アルスロバクター種（Arthrobacter species）ＡＴＣＣ
21748 を液中好気性条件下で増殖させ、細胞を取り出し
た。該細胞は、60℃で細胞ペースト１ｇ（湿重量）当た
り 420μモル／時のグルコースイソメラーゼ活性を有し
た。

【００７６】47ｇのポリカップ (登録商標)172に47ｇ
（湿重量）のアルスロバクター種ＡＴＣＣ21748 を加
え、そして混合物を５〜10分間激しく撹拌した。ポリカ
ップ (登録商標) ／細胞混合物を次に撹拌しながら46.4
ｇの空気乾燥したＩＲＡ (登録商標)938ビーズにゆっく
り加え、得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。

【００７７】５mlのアルスロバクター種ＡＴＣＣ21748
固定化ビーズを含有するフラスコに、50mlの 0.2Ｍリン
酸塩緩衝液、pH 7.5、10 mＭ Ｍg ＳＯ₄ 、１ mＭ Ｃ
ＯＣｌ₂ を加え、そして溶液を撹拌しながら60℃まで加
熱した。 450mgのα−Ｄ−グルコースをフラスコに加
え、そしてフラスコを60℃ １時間、 150rpm で培養振
とう器中に入れた。固定化アルスロバクター種ＡＴＣＣ
21748 のグルコースイソメラーゼ活性は、システイン／
Ｈ₂ ＳＯ₄ 反応［Dische. Biochim. Biophys. Acta, 3
9, 140 (1960)］により決定すると、60℃に於いては細
胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり 530μモル／時であっ
た。

【００７８】10Ｍｌのアルスロバクター種ＡＴＣＣ2174
8 固定化ビーズを、循環式水浴により60℃に保たれてい
る 0.9×30cmのカバーのかかったガラスカラムに添加し
た。50 mＭトリス−塩酸緩衝液中に 250 mＭグルコー
ス、５ mＭ Ｍg ＳＯ₄ と 0.5mＭ ＣＯＣｌ₂ を含有
するあらかじめ湿った基質溶液pH 7.5を、カラムに通し
た。連続操作の６日後、固定化アルスロバクター種ＡＴ
ＣＣ21748 のグルコースイソメラーゼ活性は、60℃で細
胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり 280μモル／時であ
り、37日後ではグルコースイソメラーゼ活性は60℃で細
胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり18μモル／時であっ
た。

【００７９】実施例８ プレドニソロンもしくは関連するステロイドを製造する
ためのステロイドデヒドロゲナーゼ活性を有するアルス
ロバクター シンプレックスの固定化 アルスロバクター シンプレックス（Arthrobacter sim
plex）ＡＴＣＣ6946を、液中好気性条件下で増殖させ、
細胞を取り出した。細胞は、34℃で細胞ペースト１ｇ
（湿重量）当たり 980μモル／時のΔ−１−デヒドロゲ
ナーゼ活性を有していた。

【００８０】20ｇのポリカップ (登録商標)172に20ｇの
アルスロバクター シンプレックスＡＴＣＣ6946を加
え、そして混合物を５〜10分間激しく撹拌した。次にポ
リカップ (登録商標) ／細胞混合物をゆっくり18.6ｇの
空気乾燥ＩＲＡ (登録商標)938ビーズに撹拌しながら加
え、得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。

【００８１】５Ｍｌのアルスロバクター シンプレック
スＡＴＣＣ6946固定化ビーズを含有するフラスコに36Ｍ
ｌの20ｍＭリン酸塩緩衝液（pH 7.0）を加え、次いで60
mgのヒドロコルチゾンを含有する４Ｍｌのエタノールを
加えた。フラスコを、34℃１時間 150rpm で培養振と
う器中に置いた。固定化アルスロバクター シンプレッ
クスＡＴＣＣ6946のΔ−１−デヒドロゲナーゼ活性は、
285nmの吸光度で決定するとき、34℃で細胞ペースト１
ｇ（湿重量）当たり 440μモル／時であった。

【００８２】実施例９ フルクトースの濃いコーンシロップを製造するためのグ
ルコースイソメラーゼ活性を有するストレプトマイセス
種の固定化 ストレプトマイセス フエオクロモゲネス（Streptomyc
es phaeochromogenes）ＮＲＲＬ Ｂ3559を液中好気性
条件下で成長させ、そして細胞を取り出した。細胞は60
℃で、細胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり 7.7μモル／
分のグルコースイソメラーゼ活性を有していた。64.5ｇ
のポリカップ (登録商標)172に64.5ｇのストレプトマイ
セス フエオクロモゲネスＮＲＲＬ Ｂ3559を加え、そ
して混合物を５〜10分間激しく撹拌した。次いポリカッ
プ (登録商標) ／細胞混合物を、60.0ｇの空気乾燥ＩＲ
Ａ (登録商標)938ビーズに撹拌しながらゆっくり加え、
そして得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。

【００８３】10Ｍｌのストレプトマイセス フエオクロ
モゲネスＮＲＲＬ Ｂ3559固定化ビーズを、循環式水浴
で60℃に保った 0.9×30cmのカバーをかけたガラスカラ
ムに添加した。 250 mＭグルコース、 100 mＭ Ｎａ₂
ＳＯ₃ ，10 mＭ Ｍg ＳＯ₄および１ mＭ ＣＯＣｌ₂
を含有しＨＣｌでpH 7.0に調整されたあらかじめ湿った
基質溶液を、流速28ml／時でカラムに通した。固定化ス
トレプトマイセス フエオクロモゲネス ＮＲＲＬ Ｂ
3559のグルコースイソメラーゼ活性は、システイン／Ｈ
₂ ＳＯ₄ 反応（Dische他、上を見よ）により決定する
と、60℃で細胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり 7.7μモ
ル／分であった。

【００８４】実施例１０ フエニルアラニンを製造するためのフエニルアラニン
アンモニア リアー ゼの濃いロドスポリジウム種の固定
化 ロドスポリジウム トルロデイス（Rhodosporidiumtoru
loides）ＡＴＣＣ １０７８８を液中好気性条件下で増
殖させ、そして細胞を取り出した。細胞は３０℃で細胞
ペースト １ｇ（質重量）当たり１１２μモル／時のＬ
−フエニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有してい
た。

【００８５】１４．９ｇのポリカツプ（登録商標）１７
２に１４．９ｇのロドストポリジウム トルロイデス
ＡＴＣＣ １０７８８を加え、そして細胞混合物を５〜
１０分間激しく攪拌した。次に、ポリカツプ（登録商
標）／細胞混合物を１３．８ｇの空気乾燥ＩＲＡ（登録
商標） ９３８ビーズに攪拌しながらゆっくり加え、得
られたビーズを室温で２４時間乾燥させた。

【００８６】１Ｍｌのポドスポリジウム トルロイデス
ＡＴＣＣ １０７８８ 固定化ビーズを含有するフラ
スコに、５Ｍｌの２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．８），２５ｍＭ Ｌ−フエニルアラニン，０．００
５％ セチルピリジニウム クロライドを加えた。フラ
スコを、３０℃ １時間 １００ｒｐｍでダブノフ(Dub
noff) 振とう培養器中に入れた。固定化ロドスポリジウ
ム トルロイデス ＡＴＣＣ １０７８８のフェニルア
ラニンアンモニア−リアーゼ活性は、２７８ｎｍの吸光
度により決定すると、30℃で細胞ペースト１ｇ（湿重
量）当たり10μモル／時であった。

【００８７】実施例４〜１０に示した固定化細胞／ポリ
マー組成物がどのように使用されて示した生成物を作る
のかは、先行文献から明らかである。このように、実施
例４に関して、アスパラギン酸の脱カルボキシル化を介
してのＬ−アラニンの生成は、酵素、Ｌ−アスパルチッ
ク−β−デカルボキシラーゼにより媒介される。この酵
素の存在は、Chibata 他、Applied Microbiology，13
巻， 5号,638〜６４５ページ（1965年）により報告され
ているように、微生物学の多数の概論でよく知られてい
る。これは、クロストリジウム パーフリンジェンス，
デスルホビブリオデスルフリカンス，ノカルジア グロ
ベルラ(Nocardia globerula ），シュードモナス レプ
チリボラ（Pseudomonas reptilivora ），アセトバクタ
ー種，アクロモバクター（Acromobacter）種およびアル
カリゲネス フェカーリスにより産生される。

【００８８】Chibata 他は、アラニン形成菌株は、概論
に於いてかなり共通で、アセトバクター，アクロモバク
ター，シュードモナス，トルラ(Tolura)，トルロプシス
(Torulopsis)，アブシディス，アスペルギルス，ムコ―
ルおよびオオスポラであると決定した。chibata 他はMe
ister と共同研究者により以前に得られた知識を増加さ
せ、そしてＬ−アスパラギン酸を化学量論的にアラニン
に変換することを測定した。Ｌ−アスパラギン酸から90
％をこえるＬ−アラニンの単離収率が、容易に得られ
た。この工程は、米国特許第 3,458,400号に生物，シュ
―ドモナス ダカンエおよびアクロモバクタ― ペスチ
ファ―(Acromobacter pestifer) に関連して記載されて
おり、該特許では水性通常培地中で、乾燥生細胞もしく
は細胞フリ―抽出物によりＬ−アラニンを製造する工程
が特許請求されている。この工程の変更例は、Chibata
他の1975年米国特許第 3,898,128号により、アクルアミ
ドポリマ―中で微生物の固定化によって特許を受けてい
る。シュ―ドモナス ダカンエからの酵素の使用に於け
る他の特許は、1969年米国特許第 3,463,704号で得られ
た。Shibatani 他のApplied & Environmental Microbio
logy，38巻，３号， 359〜364 ペ―ジ（1979年）による
連続研究は、他の研究者によりＬ−アスパルチック−β
−デカルボキシラ―ゼを所有するほかの種が見つけら
れ、そしてこの酵素の製造はグルタミン酸塩の如きある
アミノ酸の添加により促進できることを示した。改良し
た製造の連続方法はYamato他のBiotechnology & Bioeng
ineering，XXII巻，2045〜2054ペ―ジ（1985年）により
発表され、この場合全生物はカラジ―ナンゲル中に固定
化されていた。さらに、他の研究者はハイポ―ル（登録
商標）フォ―ム中に固定化したシュ―ドモナス ダカン
エおよびアルカリゲネス フェカ―リスからのアラニン
の製造の研究をおこなった［Fusee 他、American Socie
ty for Microbiology Abstracts ，ダラス（1980年３
月）］。

【００８９】本発明は、以前に使用した細胞組成物の代
わりにアスパラギン酸からＬ−アラニンを製造するため
に例示した細胞／ポリマ―組成物の使用を意図してい
る。

【００９０】多量の研究が、酵素ペニシリンアシラ―ゼ
の固定化に関連しても以前になされた。例えば、Biochi
mie ，62： 317〜321(1981) を参照。Marconi 他はセル
ロ―ストリアセテ―ト繊維中にペニシリンアシラ―ゼを
固定化し［Biotechnology and Bioengineering，22： 7
35〜756(1980) ；Biotechnology and Bioengineering，
21：1057〜1073(1979)］、そして米国特許のいくつかは
酵素固定化を問題としていた：米国特許第 3,278,319
号；第 3,116,218号；第 3,190,586号；第 3,446,705
号；第 3,622,462号；第 3,736,230号；第 3,766,009
号；第 3,801,962号；第 3,883,394号；第 3,900,488
号；第 3,499,909号；第 3,736,230号；第 4,001,264
号；第 4,113,566号および第 4,230,804号。

【００９１】全細胞固定化に関しては、比較的２，３の
論文しか入手可能でないことが明らかである。田辺製薬
は、ポリアクリルイミドゲル内に包括された細胞のリポ
―トを発行している。また、chibata 他（1974年）、ド
イツ特許第 2,414,128号およびMandel他はポリアクリル
アミドゲル内への包括を発表している［Prikl. Blkhim.
Mikrobiol. 11： 219〜225(1975) ］。ＤＥＡＥセルロ
―ス上に吸着した巨大菌もしくはアクロモバクタ―の固
定化全細胞は、東洋醸造により使用されており、Fujii
他の日本特許第73 99393号及びSato他のEur. J. Applie
d Microbiology，２： 153〜160(1976) は、ペニシリン
アシラ―ゼを高活性で有する固定化大腸菌の使用による
ペニシリン−Ｇからの６−ＡＰＡの製造を報告してい
る。

【００９２】種々の他の変更もまた本発明から離れるこ
となしになし得、本発明の範囲は特許請求の範囲で定義
されると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 33/02 Ｚ 9452−4Ｂ 37/06 9452−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 11/04 (72)発明者 ルイス・エル・ウツド アメリカ合衆国、ステイト・オブ・メリー ランド・20 854、ロツクヴイレ、ゲイン ズバーロウ・ロード・11 760 (56)参考文献 特開 昭53−66491 （ＪＰ，Ａ) 特公 昭56−17073（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭48−32347（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、フ
   ェニルアラニン、６−アミノ−ペニシラン酸、フルクト
   ース コーンシロップ、及びプレドニソロン又はその関
   連ステロイドからなる群から選択される有用物質の製造
   方法であって、Ｌ−アスパルターゼ活性、Ｌ−アスパル
   テートデカルボキシラーゼ活性、フェニルアラニンアン
   モニアリアーゼ活性、ペニシリン−Ｇアシラーゼ、グル
   コース イソメラーゼ活性及びステロイドデヒドロゲナーゼ活性
   からなる群から選択される酵素活性を有する固定化微生
   物細胞を用いて適切な条件下で前記有用物質を生成させ
   ることからなり、ここで、前記微生物細胞は、硬化性ポ
   リアゼチジンプレポリマーを硬化させて得られる不溶性
   の固定化架橋ポリマーによって固定されており、かつそ
   の固定化微生物細胞が固体状不活性支持体上に被覆され
   ている、ことを特徴とする前記方法。