DE2612138C2

DE2612138C2 - Verfahren zur Herstellung von gebundenes Protein enthaltendem Polyurethanschaum

Info

Publication number: DE2612138C2
Application number: DE2612138A
Authority: DE
Inventors: Frank Joseph Columbia Hartdegen, Md.; Wayne Elliott Baltimore Swann, Md.
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co Conn
Priority date: 1975-06-10
Filing date: 1976-03-22
Publication date: 1986-09-11
Also published as: ATA280376A; FR2314194A1; CH639673A5; NL7603951A; DE2612138A1; FR2314194B1; JPS51150600A; GB1541100A; JPS5917733B2; CA1076027A; AT347028B; MX4074E

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von gebundenes Protein enthaltendem Schaum aus einer hydrophilen Po!y-{hamstoff-urethan)-SGhaummatrix mit einem Oxyalkylengerüst das mindestens 50 Mol-% Oxyäthylen enthält und 0,1 bis 50 Gew.-% eines aktiven Proteinpräparates auf wasserfreier Basis aus einem Polurethanvorpolymeren, welches mindestens zwei freie Isocyanatgruppen je Molekül Vorpolymeres enthält Protein und Wasser. Das gebundene Protein kann ein Enzym, ein Antikörper oder ein Antigen sein.

Der erfindungsgemäß hergestellte, gebundenes Protein enthaltende Polyurethanschaum kann für jede Umsetzung verwendet werden, bei der ein Kontakt zwischen dem Protein und einer anderen Substanz bewirkt werden soll. Wenn das Protein ein Enzym ist kann der enzymhaltige Schaum für eine katalytische Reaktion, für die das Enzym der geeignete Katalysator ist, verwendet werden. Wenn das Protein ein Antikörper ist kann der den Antikörper enthaltende Schaum zur Entfernung eines Antigens aus einer biologischen Probe, wie menschlichem Blut, verwendet werden und umgekehrt ein Antigen enthaltender Schaum zur Entfernung eines Antikörpers aus einer biologischen Probe.

Immobilisierte Proteine sind bereits bekannt. Zum Beispiel beschreibt die US-Patentschrift 35 74 062 ein Verfahren zur Herstellung von gebundenem Protein (Enzym), bei dem ein Polyester-polyurethan mit einem Diazoniumsalz einer Aminosäure diazotiert und dann mit einem nicht-enzymatischen, tierischen Protein unter

so Bildung eines diazotierten Polyurethans gekuppelt und dann zur Bildung des immobilisierten Enzyms mit einem Enzym umgesetzt wird.

Die US-Patentschrift 37 05 084 beschreibt einen Durchflußreaktor aus (a) einem makroporösen Reaktorkern, (b) einer polymeren Oberfläche (die aus einem Polyurethanharz bestehen kann) auf dem Reaktorkern und (c) einem auf der polymeren Oberfläche absorbierten Enzym, das durch ein vernetzendes, zweifunktionelles Mittel

(z. B. ein Polyisocyanat) an seiner Stelle gehalten wird.

In der US-Patentschrift 37 91 927 ist ein wasserunlösliches gebundenes Protein (Enzym) beschrieben, das in die Zellen eines selbsttragenden, zelligen Materials (das ein Polyurethanschaum sein kann) eingeschleppt ist, wobei das Protein an das zellbildende Material gebunden ist
Ferner beschreibt die US-Patentschrift 36 72 955 ein Verfahren zur Herstellung von gebundenem Protein (Enzym) durch (a) Emulgieren einer wäßrigen Dispersion des Enzyms mit einer Lösung eines Polyisocyanats in einem flüchtigen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel (z. B. Methylchloroform), (b) Vermischen der erhaltenen Emulsion mit einem festen, feinteiligen Träger und (c) Abdampfen des Lösungsmittels. Das gemäß dieser Patentschrift verwendete Polyisocyanat kann aus einem flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen bestehen.

In Beispiel 3 dieser Patentschrift ist die Bindung einer Enzymkomponente (einer Peroxidase) einer Fermentationsbrühe durch Vermischen eines Teils der Brühe mit einem Polyisocyanat, das in Methylchloroform gelöst ist, beschrieben. Es erscheint wahrscheinlich, daß unter den dort angegebenen Reaktionsbedingungen andere, in der Brühe enthaltene Enzyme ebenfalls immobilisiert (in Wasser unlöslich, d. h. gebunden) werden.

Die US-Patentschrift 39 29 574 beschreibt die Herstellung eines gebundenen (immobilisierten) Enzyms durch Kontakt eines flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen mit einer wäßrigen Dispersion des Enzyms unter schaumbildenden Bedingungen, wodurch im erhaltenen Polyurethanschaum das Polyurethan und das Enzym fest miteinander verbunden werden.

Nach der US-Patentschrift 39 05 923 wird ein System mit immolisiertem Enzym aus einem Enzym und einem hydrophilen Poly-(harnstoff-urethan)-schaum gebildet, wobei der Schaum das Enzym umgibt und einschließt und in aktiver Form hält Der hydrophile Schaum wird durch Umsetzung von Wasser mit einem hydrophilen Polyoxyalkylenvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen hergestellt

Gemäß T. Richardson und N. F. Olson, »Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes«, Plenum Press, New York, N. Y, 1974, Seiten 35 bis 38 wird ^-Galactosidasepulver auf ein Polyisocyanatpolymeres aufgestreut, dessen endständige Isoxyanatgruppen beim Eintauchen in einen Phosphatpuffer mit dem Enzym auf die in der F i g. 8 gezeigte Weise kuppeln.

Gemäß Husted et aL, Immobilization of /f-Galactosidase on an Insoluble Carrier with a Polyisocyanate Polymer, J. Dairy Sei, Vol. 56 No. 9 Seiten 1111 bis 1117 (1973) wirdy?-Galactosidase auf eine klebrige Oberfläche aus Polyisocyanatpolymeren aufgebracht, indem man diese Oberfläche wiederholt mit dem Enzympulver in Kontakt bringt (vgL Seite 1112, linke Spalte, Abs. 2\

Der Artikel von Avrameas et aL, The Cross-Linking of Proteins with Glutaraldehyd and its use for the Preparation of Immunoadsorbents, Immunochemistry, Band 6,1969, Seiten 53 bis 66 betrifft die Oberführung von Antigenen und Antikörpern usw. in unlösliche Materialien, indem man deren Proteinmoleküle unter Verwendung von Glaiaraldehyd vernetzt (vgL insbesondere Zusammenfassung und Diskussion, Abs. 2).

In der Literaturstelle Zaborsky, O. »Immobilized Enzymes«. CRC Press, Cleveland, Ohio. 1973. Seiten 145—147 ist die kovalente Bindung oxidierter Coenzyme an Sephaorse-e-Aminocapronsäure und andere Gele sowie an Styrolpolymere beschrieben (vgL Seite 146, linke Spalte, Abs. 3 bis rechte Spalte).

In der eigenen DE-OS 23 19 706 ist die Herstellung eines in Schaum gebundenen Enzyms beschrieben, bei der das Enzym in Wasser dispergiert und die wäßrige Dispersion des Enzyms mit einem Polyurethanvorpolymeren vermischt wird, so daß das Vorpolymere härtet und aufschäumt

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß das Enzym oder ein anderes Protein zuerst im Vorpolymeren gelöst und dann Wasser zu der Lösung gegeben werden kann, und daß hierdurch das Protein besser im Schaum zurückgehalten wird, als wenn man das Protein im Wasser dispergiert

Die Erfindung betrifft dementsprechend ein Verfahren der eingangs genannten Art das dadurch gekennzeichnet ist daß man (a) ',cnächst in Abwesenheit von Wasser eine Lösung des Proteins in dem flüssigen Polyurethanvorpolymeren herstellt und (b) die erhaltene Lösung durch Zumischen von Wasser verschäumt

Zum Beispiel können 0,5 bis 3 und vorzugsweise 03 bis 2 Teile Wasser je Teil der das flüssige Polyurethanvorpolymere und das Protein enthaltenden Lösung verwendet werden.

Das Verfahren wird bei einer Temperatur durchgeführt bei der das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen in flüssiger Form vorliegt und unterhalb der Denaturierungstemperatur des zu immobilisierenden Proteins.

Vorzugsweise umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Vorstufe der Bildung des Vorpolymeren durch Umsetzung einer Polyhydroxyverbindung mit einem Polyisocyanat und ist dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mit der Polyhydroxyverbindung oder mit dem Polyisocyanat vermischt wird, bevor diese mit ihrem Reaktionspartner umgesetzt werden.

Es wurde gefunden, daß es vorteilhaft ist wenn man den gebundenes (immobilisiertes) Protein enthaltenden Schaum (vorzugsweise mit Wasser) wäscht, um nicht gebundenes Protein zu entfernen und nicht umgesetzte Isocyanatgruppen zu hydrolysieren.

Das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen kann durch Umsetzung von ToIuoldiisocyanat mit einem Polyäthylenglykol, vorteilhaft einem Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht (durchschnittliches Molekulargewicht) von etwa 800 bis 1200 und vorzugsweise von etwa 1000 hergestellt werden.

Es ist auch möglich, das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen durch Umsetzung von Toluoldiisocyanat mit einem mehrwertigen Alkohol, nämlich einem Polyoxybutylenpolyolpolymeren, Äthylenglykol, Diäthylenglykol, einem Polyoxyäthylenpolyolpolymeren, Pentaerythrit, Glycerin. Trimethylolpropan oder einem Polyoxypropylenpolyolpolymeren herzustellen.

Das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen kann auch durch Umsetzung von Toluoldiisocyanat mit einer Mischung aus einem Polyäthylenglykol, vorteilhaft einem mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 800 bis 1200 und vorzugsweise von etwa 1000 und Trimethylolpropan hergestellt werden, wobei das Trimethylolpropan und das Polyäthylenglykol in einem Molverhältnis von etwa 1 :1 bis 4 und das Toluoldiisocyanat in einer Menge von etwa 0,85 bis 1,25 (vorzugsweise 0,95 bis 1,1) Mol Toluoldiisocyanat je Äquivalent (17 g) OH-Gruppen aus dem Polyäthylenglykol und dem Trimethylolpropan verwendet werden.

Das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen kann gemäß Beispiel 1 der US-Patentschrift 39 29 574 aus Toluoldiisocyanat und Äthylenglykol hergestellt werden.

Nach bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Protein zuerst mit einem Polyisocyanat oder einem Polyol vermischt, worauf, noch in Abwesenheit von Wasser, das Gemisch mit einem Polyol bzw. einem Polyisocyanat zum Polyurethanvorpolymeren umgesetzt wird, das in Gegenwart von Wasser verschäumt und gehärtet wird.

Bei diesen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung bevorzugt man im allgemeinen die Verwendung von etwa 2 bis 500 oder 50 bis 100 mg Protein je Gramm Polyol. Das Verhältnis Polyisocyanat zu Polyol plus Enzvm muß so beschaffen sein, daß ausreichend Isocyanatgruppen zur Umsetzung mit dem Wasser unter

Verschäumung im Polyurethanvorpolymeren vorhanden sind Im allgemeinen werden etwa 1,25 bis 4,5 und insbesondere 1,8 bis 22 Milliäquivalente NCO-Gruppen je Gramm Polyurethanvorpolymeres bevorzugt Gemäß einer weiteren Ausfühningsform der Erfindung werden zuerst flüssiges Polyurethanvorpolymeres und ein Substrat vermischt, das mit dem Enzym zu reagieren vermag, und dieses erste Gemisch wird dann in Abwesen-

heit von Wasser mit dem Enzym zu einem zweiten Gemisch versetzt, das durch Zugabe von Wasser zu einem Poly-(harnstoff-urethan)-schaum verschäumt wird.

Wenn ein Substrat zur Anwendung kommt, bevorzugt man im allgemeinen die Verwendung von etwa 5 bis 100 Mol, insbesondere von 8 bis 12 Mol Substrat je Mol Enzym. Zum Beispiel kann als Enzym Peniciliinamidase und als Substrat Benzylpenicillin, oder als Enzym Glucoamylase und als Substrat Stärke oder als Enzym

ίο Aminosäureacylase und als Substrat eine acylierte Aminosäure verwendet werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wirkt das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen als (a) Lösungsmittel für das zu bindende Protein und (b) als Reaktionspartner für die Umsetzung des Proteins, um dieses im Poly-(harnstoff-urethan)-schaum zu binden, der entsteht, wenn die vorgenannte Lösung mit Wasser vermischt wird.

Die Verfestigungstemperatur des flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen hängt vom Molekulargewicht des Vorpolymeren und der Struktur des Gerüsts des Vorpolymeren ab.

Die thermische Denaturierungstemperatur von Proteinen liegt im allgemeinen über etwa 35° C. Einige Proteine sind jedoch für verhältnismäßig kurze Zeit (z. B. 5 bis 30 Minuten oder länger) bei höheren Temperaturen (z. B. bei Temperaturen bis zu etwa 70⁰C oder etwas höher) beständig.

Im allgemeinen bevorzugt man die Verwendung etwa der 2- bis iOfachen oder einer größeren (z. B. bis zur 100- bis !00Ofacher, oder mehr) stöchiometrischen Menge des flüssigen Polyurethanvorpolyni«aen mit endständigen Isocyanatgruppen zur Herstellung rfcs Produkts der Ausführungsform A (das mit dem Zwischenprodukt der obigen Zusammenstellung identisch ist). Dieses Zwischenprodukt kann dann in einer nachfolgenden Stufe durch Vermischen mit Wasser, wie oben angegeben, verschäumt werden, um ein innig mit dem Polyurethan schaum verbundenes Protein zu erzielen.

Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Bindung (Immobilisierung) von Proteinen in aktiver und brauchbarer Form an einen Polyurethanschaum. Zunächst wird durch Umsetzung eines Überschusses an Di- und Triisocyanat und anderen Polyisocyanaten (einschließlich Gemischen von Polyisocyanaten) mit aktiven Wasserstoff enthaltenden Verbindungen, insbesondere Glycolen, Polyglykolen, Polyesterpolyolen, Polyätherpolyolen,

anderen Polyolen und Gemischen aus zwei oder mehreren solcher Polyole in bekannter Weise ein Polyurethanvorpolymeres hergestellt Diese Umsetzung führt zu einem flüssigen Poiyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen. Das Protein und das Vorpolymere werden in Abwesenheit von Wasser zu einer Lösung vermischt, die dann unter Bildung eines Poly-(harnstoff-urethan)-schaums, der das immobilisierte oder gebundene Protein in chemisch und/oder biologisch wirksamer Form enthält mit Wasser vermischt und umgesetzt

Die Bildung der Lösung (Stufe »(a)« der obigen Zusammenstellung) wird in Abwesenheit von Wasser durchgeführt Für die Stufe »(a)« kann ein Verdünnungsmittel oder ein Gemisch von Verdünnungsmittel verwendet werden oder nicht Es ist klar, daß ein Verdünnungsmittel, welches das Protein denaturieren oder die Verschäumung wesentlich reduzieren würde, nicht verwendet werden kann. Brauchbare Verdünnungsmittel sind z. B. in der US-Patentschrift 36 72 955 angegeben. Die Verdünnungsmittel können in Wasser stark löslich sein, wie z. B.

Aceton und dergleichen, mäßig löslich, wie z. B. Methylacetat Methyläthylketon und dergleichen oder unlöslich, wie Benzol und die anderen Verdünnungsmittel, die in Spalte 1, Zeile 45, folgende, der US-Patentschrift 36 72 955 aufgezählt sind.

Die Verdünnungsmittel dienen der Verringerung der Viskosität des (a) flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen und (b) des gebildeten Gemischs.

Die Verschäumungsstufe (Stufe »(b)« der oben Zusammenstellung) kann ebenfalls in Abwesenheit eines Verdünnungsmittels oder in Gegenwart eines oder mehrerer der oben genannten Verdünnungsmittel durchgeführt werden. Wenn die Verschäumungsstufe jedoch in Gegenwart eines Verdünnungsmittels durchgeführt wird, muß darauf geachtet werden, daß nicht zuviel Verdünnungsmittel vorhanden ist, so daß die Viskosität des Verdünnungsmittel enthaltenden Gemisches und der gebildeten Lösung plus dem für die Verschäumung zuge-

fügten Wasser nicht so weit reduziert wird, daß das durch die Umsetzung des Wassers mit den Isocyanatgruppen gebildetes Kohlendioxid nicht zu einer Verschäumung oder zu einer unzureichenden Verschäumung unter Bildung eines selbsttragenden Poly-(harnstoff-urethan)-schaums führt, der das immobilisierte Protein enthält

Wenn das Verdünnungsmittel in Wasser unlöslich oder im wesentlichen unlöslich ist, kann für die Verschäumungsstufe ein Emulgiermittel verwendet werden, vergl. die US-Patentschrift 36 72 955.

Die Proteinbindungs(immobilisierungs)-Reaktion läßt sich auf alle Proteine anwenden, einschließlich Enzyme, Antikörper und Antigene. Zum Beispiel können gebunden werden: Urease, Cellulase, Pektinase, Papain, Bromelain, Chymotrypsin, Trypsin, Ficin, Lysozym, Glucoseisomerase, Lactase, Penicillin-Amidase, menschliches Immunoglobulin G, Invertase, Asparginase und dergleichen. Es wurde kein Enzym, Antikörper oder Antigen oder anderes Protein festgestellt, das nicht gebunden werden kann. Die Reinheit des Proteins ist nicht kritisch. Die

Bindung (Immobilisierung) des Proteins kann bewirkt werden mit: (a) reinem, kristallinem Protein; (b) partiell gereinigtem, nicht-kristaflinem Protein; (c) unreinen, getrockneten Extrakten, die Enzym, Antikörper oder Antigen enthalten, oder (d) nicht gereinigtem, getrocknetem Extrakt aus einer Fennentationsbrühe (z. B, einem durch Fällung mit Aceton aus der Brühe erhaltenen Produkt). Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Proteine, einschließlich Enzyme, Antikörper und Antigene von im wesentlichen jedem Reinheitsgrad gebunden werden können.

Gemäß der vorstehend genannten US-Patentschrift 36 72 955 können Proteine (Enzyme) an Polyurethane mit endständigen Isocyaaatgruppen gebunden werden. Nach dem dort beschriebenen Verfahren wird das Polyurethan mit endständigen Isocyanatgruppen in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gelöst. Diese

Lösung wird unter Verwendung eines Emulgiermittels in Gegenwart eines in Wasser dispergierten aktiven Enzyms emulgiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in verschiedener Hinsicht dem der US-Patentschrift 36 72 955 ähnlich. Es kann das gleiche Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen (das dort als Polyisocyanat bezeichnet ist) verwendet werden, ferner können für die Herstellung der Vorpolymeren die gleichen Polyole => eingesetzt werden, und es können die gleichen Enzyme verwendet werden. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, erfolgt wie bei dem genannten Patent die Bindung der Proteine wahrscheinlich durch Umsetzung einer oder mehrerer Amino- und/oder Hydroxylgruppen des Proteins mit einer oder mehreren Isocyanatgruppen des Polyurethanvorpolymeren.

Wie beim Verfahren der US-Patentschrift 36 72 955 kann das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen durch Umsetzung eines Polyols mit einem Überschuß an Polyisocyanat hergestellt werden, der die Gegenwart freier (nicht-umgesetzter) Isocyanatgruppen im Polyurethanvorpolymeren gewährleistet

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in verschiedener Hinsicht auch dem der US-Patentschrift 39 29 574 ähnlich. Es kann das gleiche Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen (das dort als Poiyurethan mit endständigen Isocyanatgruppen bezeichnet ist) verwendet werden, ferner können die gleichen Proteine (Enzyme) eingesetzt werden. Wie das Verfahren der US-Patentschrift 39 29 574 ist das erfindungsgemäße Verfahren auf die Herstellung eines an Polyurethanschaum gebundenen Proteins gerichtet.

im GegensaU zum Verfahren der zuletzt genannten US-Patentschrift werden erfindungseemäß das Vorpolymere und das Enzym unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen miteinander gemischt. Beim Verfahren der US-Patentschrift wird das Vorpolymere mit einer wäßrigen Dispersion eines Enzyms gemischt.

Dementsprechend erfolgt beim Verfahren der US-Patentschrift das Vermischen und Verschäumen in einer Stufe, während das erfindungsgemäße Verfahren in zwei Stufen verläuft. Diese bestehen aus:

1. einer Vermischungsstufe, in der das Protein (das ein Enzym sein kann) und das Vorpolymere in Abwesenheit von Wasser unter Bildung einer Lösung miteinander vermischt werden, und

2. einer Verschäumungsstufe, in der Wasser in die zuvor hergestellte Lösung unter Bildung eines Schaums eingemischt wird, der das Protein gebunden enthält

im erfindungsgemäßen Verfahren, vergleiche die nachstehenden Beispiele, wird eine sehr viel größere Menge Protein an das aufgeschäumte Polyurethan gebunden (d. h, es ist in dem Poly-(harnstoff-uretHan)-schaum in aktiver, aber wasserunlöslicher Form vorhanden) als beim Verfahren der angezogenen Patentschrift. Mit anderen Worten, das erfindungsgemäße Verfahren ist hinsichtlich der Bindung des Proteins viel wirksamer als das bekannte Verfahren.

Für die erfindungsgemäße Bindung der Proteine ist jedes flüssige Polyurethanvorpolymere, einschließlich der in der US-Patentschrift 39 29 574 genannten, das mindestens zwei freie Isocyanatgruppen je Molekül Vorpolymere» enthält, geeignet Vorzugsweise enthält das Vorpolymere durchschnittlich zwei Isocyanatgruppen je MoleküL Ein höheres Verhältnis kann angewendet werden, z. B. 2 bis 8 Isocyanatgruppen je Molekül Polyurethan. Noch höhere Verhältnisse sind brauchbar, bringen aber keinen Vorteil. Jeglicher Überschuß an Isocyanatgruppen, der im Polyurethanschaum (nach der Bindung des Enzyms) zurückbleibt, wird durch Hydrolyse beim ersten Kontakt des Schaums mit Wasser, z. B. während einer Waschstufe vor der Anwendung des gebundenen Enzyms, zerstört

Die erfindungsgemäß verwendeten flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen enthalten mindestens zwei Isocyanatgruppen (reaktionsfähige Isocyanatgruppen) je Molekül Vorpolymeres. Ein Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen ist ein »flüssiges Polyurethanvorpolymeres«. wenn

(a) es bei 40 bis 70⁰C frei fließt oder, wenn es sich in einem inerten Lösungsmittel (z. B. einem inerten Lösungsmittel wie den in der US-Patentschrift 36 72 955 aufgezählten) unter Bildung einer Lösung löst, die etwa 1 bis 50 (oder 10 bis 25) Gew.-% eines Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen enthält.

Der vorstehend verwendete Ausdruck »flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen lsocyanatgruppen« bezeichnet ein flüssiges Polyurethan oder ein Polyharnstoffmolekül, das mindestens etwa zwei freie Isocyanatgruppen je Molekül enthält

Beispiele für Polyisocyanate, die mit einer aktiven Wasserstoff enthaltenden Verbindung umgesetzt werden können (z. B. einem Glykol, Polyol, Polyglykol, Polyesterpolyol, Polyätherpolyol und dergleichen), um in erfindungsgemäßer Weise ein Polyurethan mit endständigen Isocyanatgruppen herzustellen, sind in der Tabelle 1 aufgeführt

Tabelle 1 Toluol-2,4-diisocyanat To!uol-2,6-diisocyanat

handelsübliche Gemische aus Toluol-2,4- und 2,6-diisocyanat

Äthylendiisocyanat Äthylidendiisocyanat Propylen- 1,2-diisocyaiiai Cyclohexylen-1,2-diisocyanat Cyclohexylen-1,4-diisocyanat

m-Phenylendiisocyanat

S-S'-DiphenyM^'-biphenylendiisocyanat

4,4'-Biphenylendiisocyanat

33'-Dichlor-4,4'-biphenylendiisocyanat

l.b-1 lcxumcthylendiisoi'ynniii
■·. I.I 0- Dccamcthylendiisoeyana t

1.5-Naphthalindiisocyanat

Cumol-2,4-diisocyanat

4- Methoxy-1,3-phenylendiisocyanat

4-Chlor-13-phenylendiisocyanat
4-Brom-13-phenylendiisocyanat

4-Äthoxy-l 3-phenylendiisocyanat

2.4'- Diisocyanatodiphenyläther

Si-Dimethyl-LS-phenylendiisocyanat

2,4- Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat
4,4'-Diisocyanatodiphenyläther

Benzidindiisocyanat

4,6-Dimethyl-l,3-phenylendiisocyanat

'UO-Anthracendiisocyanat

4.4'- Diisocyanatodibenzyl
3,3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenylmethan

2.6-DimethyI-4,4'-diisocyanatodiphenyl

2.4-Diisocyanatostilben

S^'-Dimethyl-^'-diisocyanatodiphenyl

3.3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenyl
1.4-Anthracendiisocyanat

2.5-Fluorendiisocyanat

1,8-Naphthalindiisocyanat

2.6- Diisocyanatobenzfuran

2.4.6-Toluoltriisocyanat
ρ.ρ',ρ''-Triphenylmethantriisocyanat

1 .^-Tetramethylendiisocyanat

Eine brauchbare Klasse flüssiger Polyurethanvorpolymerer mit endständigen Isocyanatgruppen leitet sich

von Polyätherpolyolen und Polyesterpolyolen ab. Diese Verbindungen können in bekannter Weise durch Um-

Setzung eines Polyäther- (oder Polyester)-polyols mit einem Überschuß an Polyisocyanat hergestellt werden, der es gewährleistet, daß im Endprodukt zwei Isocyanatgruppen enthalten sind. In typischer Weise verläuft eine solche Umsetzung zum Beispiel nach folgender Gleichung:

HO-(CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-Ov^-H Polyätherpolyol

CH₃

^h"

CH₃ CH₃

I O Ol

OCN-C -j— NH-C—(CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-OV-C— NH-€ \-NCO

_M flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen

In den obigen Formeln bedeutet m die Anzahl der sich wiederholenden Tetramethylenäthereinheiten. Diese können z. B. etwa 5 bis 50 betragen.

Erfindungsgemäß brauchbare Verbindungen können durch Umsetzung eines der oben beschriebenen Polyisocyanate mit einer Vielzahl von Polyolen hergestellt werden, z. B. (a) mit einfachen Polyolen, wie sie in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt sind und (b) Polyätherpolyolen und Polyesterpolyolen. Beispiele für diese Polyole sind nachfolgend beschriebea

Verwendbare Polyätherpolyole sind solche, die durch Umsetzung eines Alkylenoxide mit einem Initiator

erhalten werden, der aktiven Wasserstoff enthält. Typische Beispiele für derartige Initiatoren sind mehrwertige Alkohole, wie Äthylenglykol; Polyamine, wie Äthylendiamin; Phosphorsäure usw. Die Umsetzung wird gewöhnlich in Gegenwart eines sauren oder basischen Katalysators durchgeführt. Beispiele für verwendbare Alkylenoxide sind Äthylenoxid, Propylenoxid, die isomeren Butylenoxide und Gemische aus zwei oder mehr verschiedenen Alkylenoxiden, z. B. Gemische aus Äthylen- und Propylenoxid. Die erhaltenen Polyätherpolyole enthalten 5 ein Polyäthergerüst und endständige Hydroxylgruppen. Die Anzahl der Hydroxylgruppen je Polymermolekül wird durch die Funktionaliät des Initiators mit aktivem Wasserstoff bestimmt. Zum Beispiel führt ein zweiwertiger Alkohol, wie A ihylenglykol, als Initiator mit aktivem Wasserstoff zu Polyätherketten, in denen zwei Hydroxylgruppen je Polymermolekül enthalten sind. Wenn die Polymerisation des Oxids in Gegenwart von Glycerin. einem dreiwertigen Alkohol, durchgeführt wird, enthalten die gebildeten Polyäthermoleküle durchschnittlich io drei Hydroxylgruppen je Molekül. Eine noch höhere Funktionalität, d. h. mehr Hydroxylgruppen werden erhalten, wenn man das Oxid in Gegenwart von Polyolen, wie Pentaerythrit, Sorbit, Saccharose. Dipentaerythrit und dergleichen polymerisiert. Beispiele für mehrwertige Alkohole, die mit den Alkylenoxiden zu brauchbaren Polyätherpolyolen umgesetzt werden können, sind außer den oben angegebenen die in der Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2 ^l5

Propylenglykol Trimethylenglykol 1..2-Bntv!enslykol

1,3-Butandiol 20

1,4-Butandiol 1,5-Pentandiol 1,2-Hexylenglykol 1,10-Decandiol

U-Cyclohexandiol 25

2-Buten-l,4-diol

3-Cyclohexan-1,1 -dimethanol

4-Methyl-3-cyclohexen-l,l-dimethanol

3-Methylen-l,5-pentandiol

Diäthylenglykol 30

(2- Hy droxy äthoxy)-1 - propanol

4-(2-Hydroxy äthoxy)-1 -butanol

5-(2-Hydroxypropoxy)-1 -pentanol

l-(2-Hydroxymethoxy-2-hexanol

l-(2-Hydroxypropoxy)-2-octanol 35

3-Allyloxy-1,5-pentandiol

2- Allyloxy-2-methyl-1,3-propandiol
[(4-Pentyloxy)-methy]-l,3-propandiol
3-(o-Propenylphenoxy)-1,2-propaniol

Thiodiglykol 40

2,2'-[Thiobis-(äthylenoxy)]-diäthanol

Polyäthylenätherglyke* {Molekulargewicht etwa 200)

2,2'-Isopropyliden-bis-(p-phenylenoxy)-diäthanol

1,2,6-Hexantriol

1,1,1-Trimethylolpropan 45

3-(2-Hydrocyäthoxy)-l,2-propandiol

Äthylenglykol

3-(2-Hydroxypropoxy)-1,2-propandiol

2.4-Dimethyl-2-(2-hydroxyäthoxy)-methylpentandiol-l,5

l,l,l-tris-[(2-Hydroxyäthoxy)-methyl]-äthan 50

1,1,1 -tris-[(2-Hydroxypropoxy)-methyl]-propan

Triäthanolamin Triisopropanolamin Resorcin

Pyrogallol 55

Phloroglucin Hydrochinon 4,6-Di-tertbutylcatechin Catechin

Orcin 60

Methyiphloroglucin Hexylresorcin

3- Hydroxy-2-naphthol 2- Hydroxy-1 -naphthol

23- Dihydroxy-1 -naphthol 65

bis-Phenole, wie 2,2-Bits-{p-hydroxyphenyl)-propan und Bis-(p-hydroxyphenyl)-methan l.l,2-Trix-(hydroxyphenyl) iiihan
1,1 J-Tris-(hydroxyi)hciiyl)-propan

Eine besonders brauchbare Klasse von Polyätherpolyolen sind die Polytetramethylenglykole. Sie werden durch Polymerisation von Tetrahydrofuran unter Ringöffnung erhalten und enthalten im Polymergerüst die sich wiederholende Einheit

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-

'' Die Endstellungen der Polymerketten sind durch Hydroxylgruppen besetzt.

Ebenfalls besonders brauchbar sind die Polyoxyäthylenpolyole HO-(CH₂CH₂-O)TH, in der χ ein,e solche «' Durchschnittszahl darstellt, daß das Polyol ein durchschnittliches Molekulargewicht von bis zu etwa 1000 (oder

etwa 2000 oder etwas höher) besitzt

Die als Präkursoren verwendbaren Polyesterpolyole können leicht durch Kondensationspolymerisation eines Polyols mit einer mehrbasischen Säure hergestellt werden. Das Polyol und die Säuren werden in solchen Verhältnissen angewandt, daß im wesentlichen alle Säuregruppen verestert werden und sich in den Endstellungen der gebildeten Ketten aus Estereinheiten Hydroxylgruppen befinden. Repräsentative Beispiele für mehrbasische Säuren zur Herstellung dieser Polymeren sind Oxalsäure, Molonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Korksäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Brassylsäure, Thapsinsäure, Maleinsäure, \ Fumarsäure, Glutaconsäure, Λ-Hydromuconsäure, /?-Hydromuconsäure, «-Butyl-ar-äthylglutarsäure, αβ-Ό\-

äthyibernsteinsäure, o-Phthalsäure, Isophthalsäure, Terephthalsäure, Hemimellithsäure, Trimellithsäure, Trimesinsäure, Mellophansäure, Prehnitinsäure, Pyromellithsäure, Zitronensäure, Benzolpentacarbonsäure, 1,4-Cyclohexand'carbonsäure, Diglykolsäure, Thiodiglykolsäure, dimerisierte Ölsäure, dimerisierte Linolsäure und der gleichen. Repräsentative Beispiele von Polyolen für die Herstellung dieser Polymeren sind Äthylenglykol,

ι 1,3-Propylenglykol, 1,2-PropyIenglykol, 1,4-ButyIenglykol, 1,3-Butylenglykol, 1,2-Butylenglykol, Buten-1,4-diol,

1.5-Pentandiol, 1,4-Pentandiol, 1,3-Pentandiol, 1,6-Hexandiol, Hexen-t,6-diol, 1,7,Heptandiol, Diäthylenglykol,

; Glycerin, Trimethylolpropan, 1,3,6-Hexantriol,Trimethanolamin, Pentaerythrit, Sorbit und die anderen Polyole,

' :i die vorliegend in Verbindung mit der Herstellung von PolyätherDolyolen angegeben sind.

Beim Kontakt eines Proteins, wie eines Enzyms, Antikörpers, Antigens oder dergleichen mit einem Polyurethanvorpolymeren wird letzteres chemisch aktiv. Man nimmt an, daß einige der freien Isocyanatgruppen des Vorpolymeren mit den Aminogruppen des Proteins reagieren und, wenn nachfolgend Wasser zugefügt wird, einige Isocyanatgruppen mit Wasser unter Bildung von Kohlendioxid und von Aminogruppen am Polyurethanmolekül reagieren. Diese zuletzt genannten Aminogruppen reagieren mit freien Isocyanatgruppen an benachbarten Polyurethanmolekülen, und diese zur Bildung einer Harnstoffbindung führende Umsetzung verursacht die Entstehung und das Wachstum eines Poly-(harnstoff-urethan)-polymeren unter Quervernetzung der PoIymermoleküle. Dieses weitere Wachstum und die Vernetzung sind für die Bildung eines guten Schaums wesentlich. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, daß die erfindungsgemäß erzielten 35 überlegenen Ergebnisse, d. h. die Bindung einer wesentlich größeren Menge an Enzym als sie mit den bekannten

Verfahren möglich ist, auf der Umsetzung zwischen dem Protein und den Isocyanatgruppen des flüssigen Polyurethanvorpolymeren in Abwesenheit einer konkurrierenden Umsetzung zwischen Wasser und den Isocyanatgruppen des Vorpolymeren beruht. Bei den bekannten Verfahren sind Wasser und nicht-gebundenes Protein, d. h. Protein, das noch nicht die Möglichkeit hatte, mit dem Vorpolymeren zu reagieren, zur gleichen Zeit vorhanden, und die miteinander konkurrierenden Reaktionen, d. h. die Reaktion zwischen dem Protein und . dem Vorpolymeren auf der einen Seite und Wasser und dem Vorpolymeren auf der anderen Seite verlaufen

gleichzeitig. Wie oben dargelegt, wird im erfindungsgemäßen Verfahren das Protein vor der Zugabe des Wassers zugefügt.

Während des Verschäumens können andere Zusätze, wie Vernetzungsmittel (Polyamine, Polythiole, P^lysäuren). oberflächenaktive Mittel, Netzmittel, Antischaummittel, Farbstoffe, Antioxydationsmittel, Füllstoffe usw. ebenfalls vorhanden sein.

Die Schaumbildung wird selbstverständlich durch die Freisetzung von Kohlendioxid bewirkt.
Das Verhältnis Protein zu flüssigem Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen ist nicht kritisch. Es ist jedoch wichtig, daß dieses Verhältnis so beschaffen ist, daß nicht alle Isocyanatgruppen des Vorpolymeren durch Umsetzung mit dem Protein verbraucht werden, sondern nichtumgeseizte Isocyanatgruppen zurückbleiben, die mit dem Wasser unter Bildung von Kohlendioxid reagieren können.

Das Verhältnis Wasser zu Protein plus flüssiges Polyurethanvorpolymeres ist nicht kritisch. Im allgemeinen wird jedoch die Verwendung von etwa 0,5 bis 3 oder 0,9 bis 2 Gewichtsteilen Wasser je Gewichtsteil Vorpolymeres plus Protein bevorzugt Erfindungsgemäß hergestellte gebundene Enzyme sind für die analytische Chemie von Nutzen. Zum Beispiel kann Harnstoff bestimmt werden, indem man eine Harnstofflösung durch eine Säule führt, die an Polyurethanschaum gebundene Urease enthält und den Harnstoff quantitativ in Ammoniak umwandelt, der durch Titration oder colorimetrisch bestimmt werden kann.

An Polyurethanschaum gebundene Invertase kann zur Umwandlung von Saccharose in Invertzucker verwendet werden.

An Polyurethanschaum gebundene Lipase kann zur Hydrolyse von organischen Estern verwendet werden, indem man eine Mischung aus Wasser und Ester durch eine Säule führt die mit an Polyurethanschaum gebundener Lipase gepackt ist Die Säure und der Alkohol können dann getrennt und unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gewonnen werden. Dieses Verfahren kann auch zur Analyse von Estergemischen angewandt werden. Dem Fachmann sind zahlreiche andere Verwendungszwecke für die erfindungsgemäß hergestellten gebunde- ; ζ 65 nen Enzyme bekannt

V Erfindungsgemäß hergestellte gebundene Antigene sind für die Entfernung von Antikörpern aus biologischen

Proben brauchbar. Zum Beispiel ist, wie später angegeben, gebundenes, menschliches Immunoglobulin G (IgG),

Ρ* ein Antigen für die Entfernung von rheumatischem Arthritisfaktor (ein Antikörper) aus menschlichem Blut

brauchbar.

Erfindungsgemäß hergestellte gebundene Antikörper eignen sich für die Entfernung von Antigenen aus biologischen Proben. Zum Beispiel kann der Antikörper der Hepatitis in erfindungsgemäßer Weise an Polyurethan gebunden und der erhaltene gebundene Antikörper zur Entfernung des Hepatitis-Antigens aus Blut. z. B. dem Blut in Blutbanken entfernt werden.

Das erfindungsgemäße gebundene Protein kann in einem diskontinuierlichen oder in einem kontinuierlichen System angewandt werden. Ein Beispiel für ein diskontinuierliches Verfahren ist die Hydrolyse von in einem wäßrigen System vorliegendem Harnstoff. Bei diesem Verfahren werden ein oder mehrere Stücke geschäumtes Polyurethan, d. h. selbsttragender Poly-{harnstoff-urethan)-schaum mit dem an ihn gebundenen Enzym (Urease) in einen Ansatz mit wäßrigem Harnstoff gegeben, der zu Ammoniak hydrolysiert werden soll. V/enn die Hydrolyse vollständig ist, werden die Stücke mit dem gebundenen Enzym aus der hydrolysierten Probe entfernt, falls gewünscht, gewaschen und in einen anderen Ansatz mit wäßrigem Harnstoff gegeben, der hydrolysiert werden solL

Es kann jedoch auch erwünscht sein, das gebundene Protein in einer Weise zu verwenden, bei der der Schaum nut dem gebundenen Protein in eine Säule gepackt und die zu behandelnde Lösung durch die Säule geführt wird. Dies kann z. B. mit gebundener Invertase in vollständig kontinuierlicher Weise für die Hydrolyse einer Saccharoselösung getan werden. Eine gepackte Säule kann auch für eine diskontinuierliche Bestimmung verwendet werden, z. B. zur Ermittlung von Harnstoff in einer Reihe von Harstofflösungen durch Hydrolyse mit gebundener Urease und Analyse der hydrolysierten Proben, d. h. der die gepackte Säule verlassenden Lösungen auf Ammoniak. Bei Anwendung dieser Methode wird, nachdem jede einzelne Probe die gepackte Säule verlassen hat, die Säule mit Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der hydrolysierten Harnstofflösung (Ammoniaklösung) vereinigt, worauf der Ammoniakgehalt der vereinigten Flüssigkeiten bestimmt wird.

Das erfindungsgemäß gebundene Protein hat eine, lange Gebrauchszeit, z. B.

1. wenn das gebundene Protein ein Enzym ist, verliert es seine Wirksamkeit nicht einmal nach lOOstündigem Gebrauch;

2. wenn das gebundene Protein ein Antigen ist, das zur Entfernung eines Antikörpers aus einem wäßrigen System angewandt werden kann, wird es verbraucht (»gesättigt«), wenn es eine äquivalente Menge Antikörper aufgenommen hat Das gebundene Protein muß dann regeneriert d. h. vom Antikörper befreit werden. Dies kann dadurch erfolgen, daß man eine wäßrige Regenerierungslösung durch die gepackte Säule führt und die Regenerierungslösung aus der regenerierten Säule auswäscht Eine ausgezeichnete Regenerierungslösung besteht aus einer wäßrigen Glycinhydrochloridlösung, die z. B. 0,15- bis 3molar und vorzugsweise etwa Opmolar ist Eine solche Glycinhydrochloridlösung hat einen pH-Wert von etwa 2,5.

3. Wenn das gebundene Protein aus einem Antikörper besteht, der für die Entfernung eines Antigens aus einem wäßrigen System verwendet werden kann, wird es verbraucht (gesättigt), wenn es eine äquivalente Menge Antikörper aufgenommen hat Das gebundene Protein muß dann regeneriert, d. h. vom Antigen befreit werden. Dies kann wiederum in der Weise erfolgen, daB man eine wäßrige Regencricrungslösung.

z. B. die oben beschriebene Glycinhydrochloridlösung durch die gepackte Säule führt und die regenerierte Säule wie oben wäscht

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Enzyme jeglicher Art gebunden werden. Diese Enzyme umfassen

Oxidoreduktasen

Transferasen Hydrolasen

Lyasen

Isomerasen und

Ligasen

Beispiele für spezifische Enzyme, die erfindungsgemäße immobilisiert d. h. gebunden werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Urease
Trypsin
Lactase

Glucoseoxidase

Chymotrypsin to

Ribonuclease
Peroxidase
Pepsin
Rennin

Ivertase t>5

Papain
Asparaginase
Pektinase

Pektinesterase Penicillinamidase Glucoseisomerase

Lysozym Aminosäureacylase Pronase

Alkoholdehydrogenase

Λ-Amylase

/£Amylase ίο Subtilisin

Aminosäureoxidase

Katalase Tannase Phenoloxidase GIucomylase

Pullulanase

Cellulase Ficin

Bromelain Pankreatin

Isoamylase

Lipase

Äpfelsäuredehydrogenase

Hexokinase Lactatdehydrogenase

Adenosin-deaminase

Uricase

Galactoseoxidase

Diaphorase Cholinesterase Aldolase

Pyruvatcarboxylase Phospharylase

Cephalosporinamidase Isozitronensäuredehydrogenase Λ-Glycerinphosphat-dehydrogenase

Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase Äpfelsäureenzym

Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 5-Dehydroshikimin-reduktase

Glutathion-reduktase Glykolsäureoxidase Hefe-cytochrom-c-reduktase

Luciferase Nitritreduktase

Glutamyltransferase Glutathionsynthetase Glycocyamin-phosphokinase

H ippursäuresyn thetase so Aldehydoxidase

Bernsteinsäuredehydrogenase Nitratreduktase Xanthineoxidase

Lipoyldehydrogenase Flavinperoxidase

Glycinoxidase Carboxylase

λ- Ketosauredehydrogenase

Transketolase Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

10

Beispiel 1

Ein flüssiges Polyurethanvorpolymere&mit endständigen Isocyanatgruppen wurde durch Umsetzung von 1 g (2 Milliäquivalente) Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 mit 0,229 g (2.63 Milliäquivalente) Toluoldiisocyanat hergestellt Das erhaltene Vorpolymere wurde als »Vorpolymeres 1« bezeichnet

Dieses Verfahren wurde unter Verwendung von 20 Milliäquivalenten Polyäthylenglykol und 263 Milliäquivalenten Toluoldiisocyanat wiederholt Das erhaltene flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen wurde als »Vorpolymeres 1-A« bezeichnet

10 Beispiel 2

Aus 1 g Vorpolymeren 2, das in Beispiel 9 beschrieben ist und 100 mg menschlichem Imminoglobulin G (IgG) wurde eine Mischung hergestellt Die erhaltene Lösung des IgG wurde 15 Minuten in einer trockenen Atmosphäre bei etwa 25° C gerührt Dann wurden 2 g Wasser bei etwa 25° C unter Rühren zu der Lösung gegeben. Das erhaltene, Wasser enthaltende System begann zu schäum«= und innerhalb von 10 Minuten war die Schaumbildung beendet Der erhaltene Schaum wurde sorgfältig mit Wasser gewaschen. Das Waschwasser wurde gesammelt und durch UV-Spektrofotometrie auf IgG analysiert Es wurde festgestellt daß weniger als 1 °/o des ursprünglich zugeführten IgG durch Waschen mit Wasser aus dem Schaum ausgewaschen wurde. Mit anderen Worten, 99% des eingesetzten IgG wurden an den Polyurethanschaum gebunden. Der gewaschene Schaum mit dem gebundene!? igG wurde als »Schaum Λ« bezeichnet

Beispiel 3

Der Schaum A wurde in eine Säule gepackt Menschliches Blut, das 100 mg rheumatischen Arthritisfaktor enthielt, wurde langsam durch die Säule geführt Die roten Blutzellen wurden nicht zerstört. Die Analyse des die Säule verlassenden Bluts zeigte, daß im wesentlichen der gesamte rheumatische Arthritisfaktor aus ihm entfernt wurde.

Ein zweiter Teil menschlichen Bluts, der etwa 100 mg rheumatischen Arthritisfaktor enthielt wurde langsam durch die gleiche Säule geführt Es wurde nur ein kleiner Teil des rheumatischen Arthritisfaktors aus der Blutprobe entfernt was anzeigt, daß die Aktivität des gebundenen Proteins erschöpft war.

Das gebundene Protein wurde dadurch reaktiviert daß man etwa 100 ml Glycinhydrochloridlösung (etwa 0,5 molar mit einem pH-Wert von Z 5) durch die gepackte Säule führte. Die Säule wurde dann mit Wasser vom Glycinhydrochlorid freigewasohen. Ein dritter Teil menschlichen Bluts, der etwa 100 mg rheumatischen Arthritisfaktor enthielt wurde langsam durch die Säule geführt Die Analyse des die Säule verlassenden Bluts zeigte an, daß der gesamte rheumatische Arthritisfaktor aus ihm entfernt war. Die bestätigt, daß das gebundene IgG durch die Behandlung mit dem Glycinhydrochlorid reaktiviert wurde.

Das gebundene IgG kann für die Verwendung in einer sehr großen Anzahl von Versuchen — 15 bis 20 oder mehr — reaktiviert werden.

Beispiel 4
Vergleichiversuch

Dieser Versuch veranschaulicht die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bindung von Protein an Polyurethan gegenüber den bekannten Verfahren.

1 g flüssiges Polyurethanvorpolymeres (Vorpolymeres 2) gemäß Beispiel 9 wurde mit einer Mischung aus 100 mg menschlichem IgG und 2 g Wasser vermischt Das erhaltene Gemisch aus Vorpolymeren!, IgG und Wasser wurde etwa 10 Minuten gerührt In etwa weiteren 5 Minuten war die Verschäumung vollständig. Der Schaum wurde sorgfältig mit Wasser gewaschen, und die Waschwässer wurden wie oben analysiert. Man stellte fest, daß 35% des zugeführten IgG im Waschwasser vorhanden waren. Es wurde gefunden, daß das in dieser Weise gebundene IgG den rheumatischen Arthritisfaktor wirksam aus menschlichem Blut entfernte, ohne daß die roten Blutzellen zerstört wurden. Es entfernte jedoch nur etwa 65% der Menge, die von dem gemäß Beispiel 2 gebundenen IgG entfernt wurden, bevor eine Regenerierung durch Behandlung mit Glycinhydrochloridlösung erforderlich wurde. ·

Beispiel 5

Ein an Polyurethan gebundenes Protein wurde nach der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 2 hergestellt, jedoch wurde Invertase anstelle des IgG und das Vorpolymere 3 gemäß Beispiel 12 anstelle des Vorpoly- eo nieren 2 verwendet.

Es wurde gefunden, daß 91% des Enzyms (Invertase) an den Polyurethanschaum (Poly-harnstoff-urcthan)-schaum gebunden wurden.

Das so gebundene Enzym erwies sich als hoch wirksam bei der Inversion von Saccharoselösungen. Die Enzymwirksamkeit blieb über viele Stunden (1440) erhalten, während denen Saccharoselösung kontinuierlich durch eine Säule geführt wurde, die mit der gebundene Invertase gepackt war. Selbst nach Ablauf dieser Zeit zeigte das gebundene Enzym noch seine gesamt«; ursprüngliche Wirksamkeit.

ν. Beispiel 6

y Vergleichsversuch

|; 5 Das Verfahren des Beispiels 5 wurde in der Weise modifiziert, daß man das Enzym (Invertase) mit dem Wasser

t; vermischte und dann das Enzym-Wasser-Gemisch zum Vorpolymeren gab. Es wurden nur 68% des zugeführten

: Enzyms an das Polyurethan gebunden. Der Rest des Enzyms (42%) wurde im Waschwasser gefunden, das durch

Waschen des geschäumten Polyurethans mit dem gebundenen Enzym erhalten wurde.

: 10 Beispiel 7

Γ" Asparaginase wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 5 an Polyurethanschaum gebunden. Es

wurden 75% der Asparaginase gebunden. Das gebundene Enzym erwies sich als hoch wirksam und behielt seine ::;: Wirksamkeit in 12 Versuchen, zwischen denen 1 Stunde gewaschen wurde, um das Asparagin, ein Amid, in

Asparaginsäure, umzuwandeln.

Beispiel 8
Vergleichsversuch

'_ j Wiederholte man das Verfahren des Beispiels 7, modifizierte es jedoch in der Weise, daß ma,; alie Asparaginase

ψ- mit dem Wasser mischte, bevor man das Enzym mit dem Poiyurethanvorpoiymeren in Berührung brachte, so

wurde kein Enzym an den gebildeten Schaum gebunden. Das gesamte Enzym wurde mit Wasser aus dem Schaum ausgewaschen. Der gewaschene Schaum wies keine enzymatische Wirksamkeit auf.

Beispiel 9

2 Mol Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 und 1 Mol Trimethylolpro- > pan wurden vermischt und bei 100 bis 110⁰C unter einem Druck von 5 bis 15 Torr getrocknet, um das Wasser zu

entfernen. Das erhaltene getrocknete Gemisch, das insgesamt 7 Mol (119 g) reaktionsfähige, endständige Hydroxylgruppen enthielt, wurde langsam unter Rühren innerhalb etwa 1 Stunde in ein Reaktionsgefäß gegeben, das 6.65 Mol Toluoldiisocyanat enthielt. Das Toluoldiisocyanat und das im Reaktionsgefäß entstehende Gemisch • wurden auf 6O⁰C gehalten. Dann wurde 3 Stunden gerührt, wobei man wiederum auf etwa 60⁰C hielt Anschließend wurden weitere 1,05 Mol Toluoldiisocyanat zugefügt, und es wurde noch 1 Stunde gerührt, wobei man auf etwa 60⁰C hielt Auf diese Weise wurde ein Überschuß von 10 Mol-% Toluoldiisocyanat zu einer Mischung aus Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000 und Trimethylolpropan gegeben. Hierdurch wurde gewährleistet, daß aiie Hydroxylgruppen des Polyols mit isocyanat umgesetzt wurden und, daß tine gewisse Kettenverlängerung infolge einer Vernetzung der Polyole mit dem überschüssigen Toluoldiisocyanat auftrat

Das erhaltene flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen wurde als » Vorpcslymeres 2« bezeichnet. Es kann in erfindungsgemäßer Weise zur Bindung von Proteinen verwendet werden.
ι Die physikalischen Eigenschaften der gebundenen Proteine enthaltenden Schäume können durch Variieren

der für dia Herstellung der flüssigen Polyurethanvorpolymeren verwendeten Mengenverhältnisse an Polyolen variiert werden. Die physikalischen Eigenschaften können ferner durch Verwendung anderer Polyole, z. B. der oben aufgeführten Polyole variiert werden.

Beispiel 10

Aus I g Vorpolymerem 2 und 5 mg Pilzlactase wurde bei etwa 25°C eine Mischung hergestellt Diese Mischung wurde 15 Minuten bei etwa 25°C in einer trockenen Atmosphäre gerührt Dann wurden 2 g Wasser zugefügt, wobei man die gebildete Mischung bei etwa 25° C rührte. Diese Mischung begann zu schäumen und innerhalb von 10 Minuten war die Schaumbildung vollständig. Der erhaltene· Schaum wurde sorgfältig bei etwa 25° C mit Wasser gewischen. Das Waschwasser wurde gesammelt und durch UV-Spektrofotometrie auf Lactass untersucht Es wurde gefunden, daß weniger als 1% der ursprünglich zugeführten Lactase durch Waschen mit Wasser aus dem Schaum ausgewaschen wurden. Mit andek-err Worten, 99% der ursprünglich eingesetzten Lactase wurden an den Polyurethanschaum gebunden.

Beispiel 11

Die gemäß Beispiel 10 gebundene und gewaschene Lactase wurde n*it einer gepufferten Lactoselösung untersucht. Es wurde das folgende Verfahren angewandt:

^S Versuch-Nr. 1

Das gesamte gebundene Enzym wurde in einen Kolben gegeben, der eine bestimmte Menge gepufferter ιό Lactoselösung enthielt, und es wurde die Geschwindigkeit der Glucosebiidur g als Funktion der Zeit ermittelt

Versuch-Nr.2

Im wesentlichen gleichzeitig wurde ein ähnlicher Versuch mit 5 mg freier, d. h. nicht-gebundener Lactase, durchgeführt, wie sie für die Herstellung der gebundenen Lactase eingesetzt wurde.

Die Hydrolysegeschwindigkeit im Versuch-Nr. 1 und Versuch-Nr. 2 war gleich, was anzeigt, daß die gebunde- ne Lactase <hre volle Wirksamkeit behalten hat, d. h. durch die Enzymbindung keine Aktivität verlorengegangen ist

Das gebundene Enzym wurde aus dem Kolben entfernt und mit Wasser gewaschen. Die Versuch-Nr. 1 und 2 wurden wiederholt, wobei man für die Wiederholung des Versuchs-Nr. 1 den gewaschenen Schaum und für die Wiederholung des Versuchs-Nr. 2 5 mg freies Enzym des gleichen Ursprungs wie für den ersten Versuch-Nr. 2 «erwendete.

Die in den Wiederholungen der Versuche Nr. 1 und 2 erzielten Ergebnisse waren mit denen der ersten Versuche Nr. 1 und 2 identisch.

Beispiel 12 is

Ein flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen wurde durch Umsetzung von 31 g Glycerin mit soviel Äthylenoxid hergestellt, daß 500 g Polyäther mit endständigen Hydroxylgruppen und einem Äquivalentgewicht von etwa 500 (d. h. einem Gehalt von etwa 17 g OH-Gruppen je 500 g des Zwischenprodukts) erhalten wurden. Dieses Zwischenprodukt wurde mit handelsüblichem Toluoldiisocyanat unter Verwen- :n dung von 1,05 Mol Toluoldiisocyanat je 500 g Zwischenprodukt umgesetzt. Das erhaltene flüssige PolyuriMhnnvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen wurde als »Vorpolymeres 3« bezeichnet.

Beispiel 13

3 g des gemäß Beispiel 9 hergestellten Vorpolymeren 2 wurden mit 2 ml Benzol vermischt und 5 Minuten gerührt. Zu diesem ersten Gemisch wurden 10 mg Jackbean Urease gegeben, und das so gebildete Gemisch wurde 15 Minuten bei etwa 25° C gerührt und zur Verschäumung mit Wasser versetzt. Anschließend wurde etwa 5 Minuten gerührt.

Nachdem die Schaumbildung vollständig war, wurde der selbsttragende Schaum in kleine Stücke (etwa jo 25 mm³) geschnitten. Diese kleinen, immobilisierte Urease enthaltenden Stücke wurden 18 Stunden gewaschen.

Eine Probe der gewaschenen kleinen Stücke aus Schaum mit immobilisierter Urease wurde auf ihre Ureasewirksamkeit untersucht. Hierzu verglich man die Geschwindigkeit der Ammoniakbildung in einer Standard Harnstofflösung durch die immobilisierte Urease mit der Geschwindigkeit der Ammoniakbildung in einem anderen Teil der Standard Harnstofflösung durch eine vorbestimmte Menge freier, d. h. nicht-immobilisierter Jackbean Urease.

Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigten, daß 11% der ursprünglich eingesetzten Urease als aktive immobilisierte Urease im Schaum enthalten waren.

Beispiel 14

Das allgemeine Verfahren des Beispiels 13 wurde wiederholt, jedoch wurde das Benzoi durch Äthylenglykol ersetzt. In diesem Fall ergab die Untersuchung des Schaums nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 13. daß 3,5% der ursprünglich eingesetzten Urease in aktiver Form im Schaum gebunden waren.

45 Beispiel 15

Das allgemeine Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, jedoch wurde (a) das IgG durch 10 mg Urease ersetzt und (b) nachdem die Mischung aus dem Vorpolymeren 2 und Urease 15 Minuten gerührt worden war. wurden 2 ml Äthylenglykol zugefügt und das erhaltene Gemisch wurde etwa 5 Minuten gerührt, bevor man 2 g Wasser zur Bildung des selbsttragenden Schaums zufügte.

Die Untersuchung dieses immobilisierte Urease in gebundener Form enthaltenden Schaums nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 13 ergab, daß 21% der ursprünglich eingesetzten Urease in Form immobilisierter, aktiver Urease vorhanden waren.

55 Beispiel 16

Das allgemeine Verfahren des Beispiels 15 wurde wiederholt Es wurde jedoch in der Weise modifiziert, daß man (a) 10 mg Urease mit 2 ml Äthylenglykol vermischte und (b) 3 g Vorpolymeres 2 zu der Urease-Äthylenglykol-Mischung gab. Das Gemisch aus Urease, Äthylenglykol und Vorpolymeren! wurde dann wie in Beispiel 15 ω mit Wasser versetzt um einen Schaum mit gebundener Urease zu erhalten.

Die Untersuchung dieses Schaums mit dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 13 ergab, daß 3.7% der ursprünglich eingesetzten Urease als aktive, immobilisierte Urease im Schaum enthalten waren.

Das in den Beispielen 13 bis 16 verwendete Verdünnungsmittel verringerte die Viskosität des flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen. Die verwendete Menge Verdünnungsmittel ist nicht kritisch. Sie verringert die Viskosität des Vorpolymeren häufig im Sinne einer erleichterten Handhabung.

so daß sich das verdünnte und damit weniger viskose Vorpolymere leichter gießen und rühren läßt. Die Viskosität darf jedoch nicht soweit verringert werden, daß das Vorpolymere plus Verdünnungsmittel plus Protein beim Vermischen mit Wasser keinen selbsttragenden Schaum mehr bildet.

Beispiel 17

Es wurde gefunden, daß bestimmte Enzyme, z. B. Penicillinamidase, Glucoamylase, Glucoseisomerase und Anvnosäureacylase, die erfindungsgemäß gebunden werden können, unter Zugrundelegung der tatsächlich vorhandenen Menge Enzym in der immobilisierten Form eine geringere enzymatische Wirksamkeit aufweisen ίο als in der freien Form.

Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, daß diese Erscheinung auf primäre oder

sekundäre Aminogruppen an den aktiven Stellen der Enzyme zurückzuführen ist, und daß diese Aminogruppen an einigen der an den Polyurethanschaum gebundenen Enzymmoleküle mit den Isocyanatgruppen des flüssigen Polyureihanvorpolymeren reagieren, so daß Harnstoffeinheiten gebildet und die Aminogruppen aufweisenden aktiven Stellen der Enzyme inaktiviert werden.

Es wurde nun gefunden, daß diese Verringerung der enzymatischen Wirksamkeit durch Zumischen eines

sogenannten »Substrats« (ein Material, auf welches das spezifische Enzym wirkt, z. B. Benzylpenicillin im Falle von Penicillinamidase, Stärke im Falle von Glucoamylase, Glucose im Falle von Glucoseisomerase und acylierte .Aminosäure-, wie acetyliertes Glycin im Falle der Aminosäureacylase) zum flüssigen Polyurethanvorpolymeren, bevor das Vorpolymere mit dem Enzym vermischt wird, stark verringert werden kann.

Der nachstehende Versuch 1 im Vergleich zum Versuch 2 zeigt den Vorteil dieser Verfahrensweise.

Versuch 1

Das allgemeine Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt. Jedoch wurden in diesem Fall (a) 50 mg Benzylpenicillin mit dem Vorpolymeren (Vorpolymeres 2 gemäß Beispiel 9) vermischt, bevor man das Protein zugab und (b) das Protein bestand aus 50 mg Penicillinamidase anstelle des im Beispiel 2 verwendeten IgG.

Es wurde gefunden, daß 65% der Penicillinamidase an den Poly-(harnstoff-urethan)-schaum gebunden wurden und 42% der gebundenen Penicillinamidase ihre enzymatische Wirksamkeit behielten.

Versuch 2

Das allgemeine Verfahren des Versuchs 1 wurde wiederholt Jedoch wurde kein Benzylpenicillin zu dem Vorpolymeren gegeben.

Es wurde festgestellt, daß 66% der eingesetzten Penicillinamidase gebunden wurden, aber nur 14% der gebundenen Penicillinamidase ihre enzymatische Wirksamkeit behielten.

Im Versuch 1 wurde die aus dem Schaum ausgewaschene Menge Enzym durch Spektrofotometrie festgestellt. Die Differenz zwischen diesem Wert und dem eingesetzten Enzym stellt die Menge an im Schaum gebundenen Enz\mdar.

Die Menge an gebundenem Enzym mit enzymatischer Wirksamkeit wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 13 zur Ermittlung der enzymatischen Wirksamkeit gebundener Urease ermittelt In diesem Falle wurde jedoch die Standard Harnstofflösung durch eine Standard Benzylpenicillinlösung und die freie Urease durch freie Penicillinamidase ersetzt Die gleichen allgemeinen Verfahren wurden zur Ermittlung (a) der Menge an gebundener Penicillinamidase und (b) der enzymatischen Wirksamkeit der gebundenen Penicillinamidase im Versuch 2 angewendet.

Verfahren 1

Ein flüssiges Polyurethanvorpolymeres, das als »Vorpolymeres P-1« bezeichnet wird, kann dadurch hergestellt werden, daß man 100 g Äthylenglykol und 561 g Toluoldiisocyanat mischt und das erhaltene Gemisch etwa eine halbe Stunde auf etwa 65° C hält

Verfahren 2

Das allgemeine Verfahren des Beispiels 2 wird wiederholt, jedoch wird das dort verwendete Vorpolymere 2 durch das oben hergestellte Vorpolymere P-I ersetzt

Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten wie in Beispiel 2. Der ausgewaschene, gebundenes IgG enthaltende Schaum wird als »Schaum A-P« bezeichnet

Verfahren 3

Das allgemeine Verfahren des Beispiels 3 wird unter Verwendung des Schaums A-P anstelle des Schaums A wiederholt

Die erzielten Ergebnisse entsprechen im wesentlichen denen des Beispiels 3.

Verfahren 4

Das allgemeine Verfahren des Beispiels 5 wird unter Verwendung des Vorpolymeren P-I anstelle des Vorpolymeren 2 wiederholt.
Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten wie in Beispiel 5. ϊ

Verfahren 5

In Abwesenheit von Wasser werden 6 g Toluoldiisocyanat und 100 mg Urease gemischt. Dieses Gemisch wird in Abwesenheit von Wasser mit 1 g Äthylenglykol versetzt. Durch Zugabe einer ausreichenden Menge Wasser, ι ο ζ. B. von 1 g Wasser je Gemisch, wird ein Poly-(harnstof f-urethan)-schaum gebildet, der in gebundener (immobilisierter) Form enzymatisch wirksame Urease enthält, d. h. durch die Zugabe des Schaums zu einer wäßrigen Harnstofflösung, die z. B. 0,03 Mol Harnstoff je Liter enthält, wird der Harnstoff unter Bildung von Ammoniak und Kohlendioxid hydrolysiert.

Verfahren 6

Das im Verfahren 5 verwendete Äthylenglykol wird durch die äquivalente Menge (bezogen auf die OH-Gruppen) Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 ersetzt. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erzielt im Verfahren 5, d. h. bei Zugabe des Schaums zu einer wäßrigen } larnstofflösung, die 0,03 Mol Harnstoff je Liter enthält, wird der Harnstoff hydrolysiert.

Verfahren 7

In Abwesenheit von Wasser werden 1 g Äthylenglykol und 100 mg Urease gemischt. Dazu werden in Abwc- 2"> senheit von Wasser 6 g Toluoldiisocyanat gegeben. Durch Zumischen einer ausreichenden Menge Wasser. /. B. von 1 g Wasser je g Gemisch wird ein Poly-(harnstoff-urethan)-schaum gebildet, der enzymatisch wirksame Urease in gebundener (immobilisierter) Form enthält. Gibt man nämlich den Schaum zu einer wäßrigen Harnstofflösung, die z. B. 0,03 Mol Harnstoff je Liter enthält, so wird der Harnstoff unter Bildung von Ammoniak und Kohlendioxid hydrolysiert.

Verfahren 8

Das im Verfahren 7 verwendete Äthylenglykol wird durch die äquivalente Menge (bezogen auf die OH-Gruppen) Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 ersetzt. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erzielt wie im Verfahren 7, d. h. die Zugabe des Schaums, der Urease in gebundener Form enthält, zu einer wäßrigen Hamstofflösung mit 0,03 Mol Harnstoff je Liter führt zu einer Hydrolyse des Harnstoffs.

Der vorliegend verwendete Ausdruck »Polyisocyanate« umfaßt auch Diisocyanate.

Die erfindungsgemäß verwendeten flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen enthalten mindestens zwei reaktionsfähige Isocyanatgruppen je Molekül Vorpolymeres.

Der Ausdruck »Polyur?thanschaum« und »verschäumtes Polyurethan« bezeichnet, sofern nichts ar.Jeres angegeben ist, einen selbsttragenden Poly-(hamstoff-urethan)-schaum. Wenn die Verschäumung in erfindungsgemäßer Weise in Gegenwart eines Proteins durchgeführt wird, enthält der gebildete Schaum das aktive Protein in gebundender (immobilisierter) Form.

Die Temperatur bezieht sich, sofern nichts anderes angegeben ist, auf ⁰C, und die genannten Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von gebundenes Protein enthaltendem Schaum aus einer hydrophilen PoIy-(harnstoff-urethan)-schaummatrix mit einem Oxyalkylengerüst das mindestens 50 Mol-% Oxyäthylen ent-

hält, und 0.1 bis 50 Gew-% eines aktiven Proteinpräparates auf wasserfreier Basis aus einem Polyurethanvorpolymeren, welches mindestens zwei freie Isocyanatgnippen je Molekül Vorpolymeres enthält Protein und Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) zunächst in Abwesenheit von Wasser eine Lösung des Proteins in dem flüssigen Polyureihanvorpolymere herstellt und (b) die erhaltene Lösung durch Zumischen von Wasser verschäumt

ίο 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man das Vorpolymere durch Umsetzung einer

Polyhydroxyverbindung mit einem Polyisocyanat herstellt und das Protein mit der Polyhydroxyverbindung oder dem Polyisocyanat vermischt bevor diese mit dem anderen Reaktionspartner umgesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet daß man den gebildeten Schaum zur Entfernung von nicht gebundenem Protein und zur Hydrolyse nicht-umgesetzter Isocyanatgruppen mit Wasser wäscht

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß man das flüssige Polyurethanvorpolymere durch Umsetzung von Toluoldüsocyanat und Polyäthylenglykol mit vorzugsweise einem Molekulargewicht von etwa 800 bis 1200 herstellt

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß man das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen durch Umsetzung von Toluoldüsocyanat mit einem PolyalkohoL

nämlieh einem rölyöxybutylenpolyo!po5ynicren, Äthylengiykol, DiäthylenglykoL einem Polyoxyäthylenpolyol. Pentaerythrit Glycerin, Trimethylolpropan oder einem Polyoxypropylenpolyol herstellt

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß man das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen durch Umsetzung von Toluoldüsocyanat mit einer Mischung aus Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 800 bis 1200 und Trimethylolpropan herstellt wobei man das Trimethylolpropan und das Polyäthylenglykol in einem Molverhältnis von etwa 1:1 bis 4 und das Toluoldüsocyanat in einer Menge von etwa 0,85 bis 1,25 Mol je Äquivalent der durch das Polyäthylenglykol und das Trimethylolpropan eingeführten OH-Gruppen verwendet

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet daß man der Mischung aus Polyurethan und Protein vor der Zugabe des Wassers ein Substrat zufügt das mit dem Protein zu reagieren vermag.