AT343085B

AT343085B - Katalysator fur biochemische reaktionen und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: AT343085B
Application number: AT684275A
Authority: AT
Original assignee: Grace W R & Co
Priority date: 1975-09-04
Filing date: 1975-09-04
Publication date: 1978-05-10
Also published as: ATA684275A

Description

Die Erfindung betrifft einen Katalysator für biochemische Reaktionen, welcher einen Rest des Enzyms Cellulase, Pectinase, Papain, Bromelain, Chymotrypsin, Trypsin, Ficin, Lysozym, Lactase, Amylo-
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se genannt), Aminosäure-oxydase, Asparaginase, Glukose-oxydase, Invertase, Peroxydase, Pullulanase oder Rennin, der durch Reaktion zwischen einer oder mehreren Aminogruppe (n) des Enzyms mit einer oder mehreren Isocyanatgruppe (n) eines Polyurethanpräpolymeren in einem Polyurethanmolekül eingelagert ist, enthält.

Enzyme sind Proteine, welche biochemische Reaktionen katalysieren, wobei jedes Enzym für eine bestimmte Reaktion spezifisch ist ; z. B. katalysiert eine Esterase die Hydrolyse von Esterbindungen.
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Die Erfindung besteht nun darin, dass das das Enzym enthaltende Polyurethan in Form eines Schaumes vorliegt. Der gebundenes Enzym enthaltende Polyurethanschaum kann als zusammengesetzter Katalysator für biochemische Reaktionen, für welche das Enzym ein geeigneter Katalysator ist, verwendet werden, ohne dass es notwendig ist, Trägerteilchen mit dem Polyurethan zu überziehen.

Es wurde nun folgendes gefunden : Wenn diese spezifischen Enzyme molekular an das Polyurethan gebunden in einem Polyurethanschaum enthalten sind, so weisen sie eine grössere Enzym-Aktivität pro Gewichtseinheit des zu dem Polyurethan hinzugefügten Enzyms auf, als wenn die gleiche Menge Enzym in einem Überzug aus ungeschäumtem Polyurethan enthalten ist. Es wurde auch gefunden, dass die Enzym-Aktivität nach dem Waschen in einem erfindungsgemässen Polyurethanschaum in einem grösseren Ausmass beibehalten wird als in einem Polyurethan gemäss der US-PS Nr. 3, 672, 955. Dies wird im letzten Beispiel gezeigt.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Katalysators, bei welchem ein Polyurethanpräpolymeres, das mindestens zwei freie Isocyanatgruppen enthält, mit dem Enzym Cellulase, Pectinase, Papain, Bromelain, Chymotrypsin, Trypsin, Ficin, Lysozym, Lactase, Amyloglukosidase, Penicillin-amidase, Glukose-isomerase, - Amylase, Aminos äure-acylase, Aminos äure-oxydas e, Asparagina- se, Glukose-oxydase, Invertase, Peroxydase, Pullulanase oder Rennin umgesetzt und Polymerisation unter Bildung eines Polyurethans durchgeführt wird, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln freie Präpolymere mit einer wässerigen Dispersion des Enzyms in Berüh- rung gebracht wird.

Die Erfindung besteht ferner darin, dass das Molverhältnis von Wasser zufreien-NCO-Gruppendes Präpolymeren, welche während der Schaumbildungsreaktion vorhanden sind, 6, 5 : 1 bis 390 : 1 beträgt.

Es wurde bereits früher ein Verfahren zur Herstellung eines Polyurethanschaumes vorgeschlagen, bei welchem eine erste Komponente, welche ein freie Isoeyanatgruppen enthaltendes Polyoxyäthylenpolyol dar-
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5tragen kann ; wenn jedoch keine dritte Komponente als Vernetzungsmittel vorhanden ist, so muss die Reak- tionsfunktionalität des Polyols über 2 liegen. Bei diesem Verfahren dient das Wasser als Schäumungsmittel, und es wird ein vernetzter Polyurethanschaum hergestellt.

Es wurde nun folgendes festgestellt : Wenn bei dem früher vorgeschlagenen Verfahren eines der oben spezifisch angegebenen Enzyme in der zweiten wässerigen Reaktionskomponente dispergiert wird, so wird das Enzym an dem Polyurethanschaum chemisch gebunden, und dieses Verfahren ist die bevorzugte Methode zur Herstellung des zusammengesetzten Katalysators gemäss der Erfindung.

Bei dem Verfahren nach der US-PSNr. 3, 672, 955 wird eine wässerige Dispersion des Enzyms mit einer organischen Lösung eines Polyisocyanats gemischt unter Bildung einer Emulsion, mit welcher die Träger-
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der Masse zurückbehalten, da kein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel vorhanden ist, welches die Viskosität der Polyurethanlösung herabsetzen könnte. Das Polyurethanpräpolymere kann in bekannter Weise durch Umsetzung von Di- und Triisocyanaten und anderen Polyisocyanaten mit Verbindungen, die aktiven Wasserstoff enthalten, insbesondere Glykolen, Polyglykolen, Polyesterpolyolen und Polyätherpolyolen, hergestellt werden.

Vorzugsweise Istdas Prapolymere einPolyoxyathylen-polyol (ein Polyol, welches-OCH CH- Einheiten umfasst), das, wenn es freie Isocyanatgruppen aufweist, eine Reaktionsfunktionalität von mindestens 2, vorzugsweise mehr als 2, aufweist. Diese Reaktion liefert ein freie Isocyanatgruppen aufweisendes Polyurethanpräpolymere.

Das Enzym, das vorzugsweise in wässerigem Medium vorliegt, wird gebunden, indem es mit dem Polyurethanpräpolymeren umgesetzt wird, bevor das Polyurethan geschäumt wird. Da die Polymerisationsreaktion (z. B. des Polyols mit dem Isocyanat) exotherm ist, muss die Temperatur des Reaktionsgemisches selbstverständlich bei einem Wert gehalten werden, welcher unterhalb der Temperatur der thermischen Denaturierung des Enzyms liegt. Bei derBindestufe wird durch Verwendung des entsprechenden pH-Wertes, der entsprechenden Ionenkonzentration, durch Anwesenheit von Enzymsubstrat oder erforderlichenfalls von Kationen die ursprüngliche Struktur des Enzyms aufrechterhalten. Das so erhaltene gebundene Enzym ist katalytisch wirksam.

Die physikalische Form des Enzyms ist nicht kritisch. Die Bindung wird erreicht unter Verwendung von reinen kristallinen Enzymen (Lysozym, Trypsin) ; mit teilweise gereinigten nicht-kristallinen Enzymen (Papain, Bromelain) ; mit unreinen Extrakten, welche Enzym-Aktivität aufweisen (Ficin, Pectinase) ; mit nicht-abgetrennten Fermentationsbrühen, welche ein extracellulares Enzym enthalten, ohne Reinigung oder Konzentration (Cellulase), und mitintracellularen Enzymen, welche an die Zellwände gebunden sind (Glukoseisomerase). Die Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass die Erfindung zum Binden von Enzymen verwendet werden kann, welche im wesentlichen jeden beliebigen Reinheitsgrad aufweisen können.

Unter den entsprechenden Bedingungen der Enzymreaktion kann das erfindungsgemässe gebundene Enzym für die folgenden Umwandlungen verwendet werden : Stärke in Zucker (Enzym = Amyloglukosidase), Glukose in Fructose (Enzym=Glukose-isomerase), Lactose in Glukose (Enzym = Lactase) und Penicillin G in 6-Aminopenicillan- säure (Enzym = Penicillin-amidase).
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lyol-Reaktion, die zur Herstellung des Präpolymeren verwendet wird, ein stöchiometrischer Überschuss an Isocyanatgruppen in der Polyisocyanat-Reaktionskomponente gegenüber den Hydroxylgruppen in der PolyolReaktionskomponente notwendig.

Der Ausdruck "Polyurethan-Präpolymeres" wird hier im weitesten Sinne angewendet und umfasst Pria- polymeren, welche eine Urethangruppe in dem Molekül enthalten, und Verbindungen, welche Harnstoff oder andere analoge Gruppen an Stelle der Urethangruppe enthalten. Ferner wird derAusdruck"Polyurethan"dementsprechend im weitesten Sinne angewendet und umfasst Endpolymeren, welche Harnstoff- oder andere analoge Bindungen an Stelle von Polyurethanbindungen enthalten. Die Reaktion einer Aminogruppe auf dem Enzym mit einer Isocyanatgruppe des Präpolymeren ergibt eine Harnstoffbindung.

Jedes Polyurethan-Präpolymere, welches mindestens zwei freie Isocyanatgruppen pro Molekül enthält, ist zur Verwendung beim erfindungsgemässen Verfahren geeignet. Vorzugsweise enthält das Polyurethan durchschnittlich zwei Isocyanatgruppen pro Molekül, es kann jedoch bis zu 8 Gruppen enthalten. Es sind auch höhere Molgehalte an Isocyanatgruppen anwendbar, welche jedoch keinen Vorteil bieten. In jedem Falle werden alle überschüssigen Isocyanatgruppen, welche in dem Polyurethan-Schaum (nach dem Binden des Enzyme zurückbleiben, bei der ersten Berührung des Schaumes mit Wasser, beispielsweise während einer Waschstufe, durch Hydrolyse zerstört, bevor das gebundene Enzym verwendet wird.

Die 6, 5 bis 390 Mole Wasser, welche oben erwähnt werden, können jenes Wasser einschliessen, das in derartigen späteren Waschstufen zur Hydrolyse von restlichen Isocyanatgruppen in dem Polyurethan-Schaum verwendet wird.

Repräsentative Beispiele von Polyisocyanaten, welche mit einer, aktiven Wasserstoff enthaltenden Verbindung (z. B. einem Glykol, Polyol, Polyglykol, Polyester-polyol, Folyatherpolyol u. dgi.) umgesetzt wer- den können unter Herstellung eines mit Isocyanat abschliessenden Polyurethan-Präpolymeren, das zur Verwendung beim erfindungsgemässen Verfahren geeignet ist, umfassen :

Toluol- 2, 4-diisocyanat
Toluol-2, 6-diisocyanat im Handel erhältliche Mischungen von Toluol-2, 4- und 2, 6-diisocyanaten Äthylen-diisocyanat Âthyllden-diisocyanat
Propylen-1, 2-diisocyanat
Cyclohexylen-1, 2-diisocyanat
Cyclohexylen-1, 4-diisocyanat m-Phenylen-diisocyanat 3, 3'-Diphenyl-4, 4' -biphenylen-diisocyanat 4, 4' -Biphenylen-diisocyanat 3, 3'-Dichlor-4, 4'-biphenylen-diisocyanat
1, 6-Hexamethylen-diisocyanat
1, 4- Tetramethylen-diisocyanat
1, 10-Decamethylen-diisocyanat

1, 5- Naphthalin-diisocyanat Cumol- 2, 4- diisocyana t
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Methoxy-l, 3-phenylen-diisocyanat2, 5-Fluoren-diisocyanat
1, 8- Naphthalin-diisocyanat 2, 6-Diisocyanatobenzfuran 2, 4, 6-Toluoltriisocyanat und p, p',

p"-Triphenylmethan-triisocyanat.

Eine geeignete Gruppe von mit Isocyanat abschliessenden Polyurethan-Präpolymeren umfasst jene, welche sich von Polyäther-polyolen und Polyester-polyolen ableiten. Diese Verbindungen können in bekannter Weise durch Umsetzung eines Polyäther- (oder Polyester) polyols mit einem Polyisocyanat hergestellt werden, wobei ein Überschuss des letzteren verwendet wird, um das Vorhandensein von freien Isocyanatgruppen in dem Produkt zu gewährleisten. Ein typisches, jedoch keineswegs einschränkendes Beispiel ist in Form einer idealisierten Gleichung wie folgt :
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Durch Isocyanat abgeschlossenes
Polyurethan
In den obigen Formeln bedeutet m die Anzahl der sich wiederholenden Tetramethylen-äther-Einheiten.

Diese Anzahl kann beispielsweise etwa 5 bis 50 betragen.

Die Verbindungen, welche für das erfindungsgemässe Verfahren geeignet sind, können hergestellt werden durch Umsetzung von einem der oben angegebenen Polyisocyanate mit einem der unzähligen PolyätherPolyole und Polyesterpolyole ; repräsentative Beispiele dieser Polyole sind unten angegeben.

Unter den Polyäther-polyolen, welche auf diese Weise verwendet werden können, sind jene, die durch

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Alkoholgesetzt ; nachdem die Reaktion vollständig ist, wird es durch Abfiltrieren, Zentrifugieren oder nur Herausheben, falls es in Form eines einzigen Stückes vorliegt, entfernt. Das gebundene Enzym wird sodann in einen anderen Substrat-Reaktor gegeben und ist immer noch voll wirksam. Gebundene Urease wird in eine Säule gegeben, und Substrat wird kontinuierlich durchgeleitet Das Enzym ist noch nach 6 Monaten dauernder Verwendung aktiv.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert.

Beisplel 1 : 100 g Äthylenglykol und 282 g Toluoldiisocyanat werden in einem Bad, das konstant bei einer Temperatur von 650C gehalten wird, gemischt Nachdem die Mischung klar geworden ist, wird sie auf 40C gekühlt, und 100 cm seiner Fermentationsbrühe, welche Cellulase-Aktivität aufweist, wird unter dauert dem Rühren bei 40C hinzugefügt.

Nachdem die Bildung des Polyurethan-Schaumes vollständig ist, was etwa 15 min benötigt, wird der
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gewaschen10%igen'Lösung von Pectinase in einem 0, 1 m-Phosphatpuffer mit einem PH-Wert von 5 an Stelle der Brühe verwendet wird. Nachdem die Bildung des Polyurethan-Schaumes vollständig ist, wird der Schaum mit Wasser gewaschen, in kleine Stücke geschnitten und in eine Säule eingebracht Frisch hergestellter Apfelsaft, welcher 0, l% Natriumbenzoat enthält, wird mit einer Geschwindigkeit von 11 pro Stunde durch die Säule ge-
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der Geschmacks- und Geruchseigenschaften.

Beispiel 3 : Es wird ein Präpolymeres hergestellt, wobei 960 g Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000, welche 310 g Pentaerythrit enthalten, mit 1830 g Toluoldiisocyanat umgesetzt wer-
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sung von 1% Casein eingebracht wird und die Zunahme der Absorption von Trichloressigsäurelösung bei 280 mit als Funktion der Zeit gemessen wird ; es wurde gefunden, dass er aktiv ist.

Beispiel 4 : 10 g Propylenglykol werden zu 10 g Ibluol-dilsocyanat in eine Metallschale gegeben. Die Schale wird auf eine heisse Platte gestellt, und die Verbindungen werden gerührt, bis eine homogene Mischung erhalten wird, wobei dafur gesorgt wird, dass kein Sieden oder Verdampfen der Flüssigkeit stattfirr detDie Losung wird von der Wärmequelle entfernt, und 1,0 cm3 einer Lösung, die 10%. Amyloglucosidase in einem 0, 1 m- Phosphatpuffer, PH 7, 0, enthält wird hinzugefügt Die Mischung wird rasch gerührt, bis sie viskos wird (etwa 10 bis 15 min). Das Material wird sodann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen, um die Bildung des Polyurethan-Schaumes zu vervollständigen.

Nun wird das Produkt 12 h in Wasser eingetaucht, um überschüssige NCO-Gruppen zu entfernen. Das erhaltene Produkt ist ein kristalliner Polyurethan-Schaum, welcher gewaschen wird und von welchem gezeigt wird, dass er in bezug auf die Hydrolyserung einer l% lgen Starkelosung aktiv ist
Beispiel 5 : Ein elastomerer Schaum, welcher gebundene Amyloglucosidase enthält, wird gemäss Beispiel 4 hergestellt, mit der Abweichung, dass das Propylenglykol in einer Menge von 20 g verwendet wird.

Bei s pie I 6 : 10 g eines im Handel erhältlichen Polyisocyanates, welches 9, 5% freie NCO-Gruppen enthält und 7 sich wiederholende Butoxygruppen aufweist, werden zu 1,0 cm3 einer Enzymlösung (die gleiche wie in Beispiel 4) gegeben.

Die Mischung wird gerührt, bis ein viskoser Schaum erhalten wird (5 bis 10 min). Das Material wird sodann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen, um die Schaumbildung zu vervollständigen. Das Produkt wird 12 h in Wasser eingetaucht, um überschüssige NCO-Gruppen zu entfernen. Der resultierende, gebundenes Enzym enthaltende Schaum wird gewaschen, und er ist enzymatisch aktiv.
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Es werden ähnliche Resultate erhalten.

Beisplel 9 : Folyathylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000 wird getrocknet, indem es 2 h bei 1100C unter Stickstoff bei vermindertem Druck erhitzt wird. Toluol-diisocyanat (1, 48 Mole pro Mol Hydroxyl) wird allmählich unter Rühren hinzugefügt, während die Temperatur in einem Kuhibad bel 30 Cge- halten wird. Naohdem die Zugabe beendet ist, die Temperatur auf 60 C erhöht, bis die Reaktion voll-

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2 h). 10 g dieses Präpolymeren4%igen Lactoselösung (10 g) hinzugefügt Die Reaktionskomponenten werden gerührt, bis das Schäumen beginnt Der erhaltene Schaum wird zur Entfernung der Lactose in Wasser gewaschen, und sodann in eine Lactoselösung gegeben, worauf Glukose freigesetzt wird.

Beispiel 10: Es wird ein Präpolymeres hergestellt, wobei Polyäthylenglykol mit einem Molekular- gewlohtvon lOOO. welches 33Gew.-% Glycerin enthält, mit 2, 63 m Äqu. . Ibluol-diisocyanat umgesetzt wird.
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Glukoselösung, die 0, 2 m MgSO4 enthält,Bd. 37, S. 576 bis 578 [1965] untersucht. Nachdem das gesamte Penicillin umgewandelt ist, wird der Schaum entfernt.

Der Schaum wird mit Wasser gewaschen und In eine andere Probe des Substrates gegeben. Die Zeit, die
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woraus zu ersehen ist, dass das Enzym in dem Schaum immer noch vorhanden ist.

Beispiel 12 : EawirdeinVersuchdurchgefiihrt, um (1) die Aktivität und Beibehaltung von einem der gewählten Enzyme in einem erfindungsgemässen Schaum mit (2) der Aktivität und Beibehaltung des gleichen Enzyms, wenn es an ein Polyurethan gemäss der US-PS Nr. 3, 672, 955 gebunden ist, zu vergleichen. Das untersuchte Enzym ist Amyloglucosidase.

Der erfindungsgemässe, gebundenes Enzym enthaltende Schaum wird gemäss Beispiel 4 hergestellt Ein
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672, 955 hergestellttivität wird zuerst für das unmittelbar hergestellte Produkt festgestellt ; daraufhin wird sie gemessen, nachdem das Produkt einmal in Wasser gewaschen wurde, und dann, nachdem das Produkt intensiv mitWasser gewaschen wurde.

Es wurden dabei die folgenden Ergebnisse erhalten :
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<tb>
<tb> Gebundenes <SEP> Enzym <SEP> Ausmass <SEP> der <SEP> Anfangs-Aktivität <SEP> des <SEP> löslichen
<tb> Enzyms, <SEP> festgestellt <SEP> in <SEP> : <SEP>
<tb> Ungewaschenem <SEP> trockenem <SEP> Wasch- <SEP> Intensiv <SEP>
<tb> gebundenem <SEP> Enzym <SEP> wasser <SEP> gewaschenes
<tb> (erstes) <SEP> trockenes
<tb> gebundenes
<tb> Enzym
<tb> Gemäss <SEP> Stand <SEP> der
<tb> Technik <SEP> 54% <SEP> 17% <SEP> 1%
<tb> Erfindungsgemäss <SEP> 100% <SEP> 50% <SEP> 10%
<tb>

Diese Ergebnisse bedeuten folgendes :
DerWert 54% bedeutet, dass ein Versuch mit dem Gesamtprodukt zeigt, dass dieses 54% der Aktivität des ursprünglich eingesetzten Enzyms aufweist. Das Material wird als Ganzes untersucht, und es enthält daher 100% des an der Bindereaktion teilgenommenen Enzyms.

Es wurden daher 46% des Enzyms inaktiviert, jedoch ist dieses in dem ungewaschenem Polyurethanprodukt gemäss der US-PS Nr. 3, 672, 955 noch vorhanden.

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