DE2930319A1

DE2930319A1 - Diagnostische zusammensetzung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2930319A1
Application number: DE19792930319
Authority: DE
Inventors: Murray Campbell Fuseee
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1978-08-07
Filing date: 1979-07-26
Publication date: 1980-02-28
Also published as: FR2433183B1; SE7906115L; ATA540379A; GB2027717A; NL7905745A; DK329879A; FR2433183A1; CA1131573A; AT365645B; US4226935A; GB2027717B; BE878137A; JPS5526892A

Description

Beschreibung

In der deutschen Patentanmeldung P 27 50 803 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem Enzyme in hydrophilen Urethanvorpolymeren gelöst werden und die erhaltene Mischung unter Verschäumen oder nicht unter Verschäumen gehärtet wird, um feste Schäume oder Folien zu erhalten, die das Enzym in aktiver Form gebunden enthalten. Die deutsche Patentanmeldung P (US-Ser. No. 362 488) beschreibt ein Verfahren, bei dem die Enzyme in Wasser gelöst werden und die wäßrige Lösung zur Verschäumung eines hydrophilen Urethanvorpolymeren verwendet wird, so daß man einen Polyurethanschaum erhält, der gebundene Enzyme in aktiver Form enthält. Gemäß der deutschen Patentanmeldung P 27 55 053 werden die Enzyme direkt mit einem hydrophilen Urethanvorpolymeren vermischt, worauf man die Lösung in Wasser dispergiert, um eine Lösung oder Dispersion von Enzymen zu erhalten, die an wasserlösliche oder an in Wasser dispergierbare Polyurethane gebunden sind. Die US-Patentschrift 3 929 574 beschreibt die Verwendung von aktive gebundene Enzyme enthaltenden Polyurethanschäumen für verschiedene Testverfahren sowie für Umsetzungen, bei denen Schäume mit gebundenen Enzymen für die Umwandlung eines Substrates in ein gewünschtes Produkt verwendet werden, z. B. für die Hydrolyse von Penicillin V zu Penicillin G unter Verwendung von Penicillinamidase als gebundenem Enzym.

030009/0677

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Immobilisierung von Enzymen, das so erhaltene Produkt und seine Verwendung. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man die Enzyme in einem Polyurethanschaum oder nichtgeschäumtem Polyurethan unter Verwendung einer Aminosäure und/oder einer Protein kuppelnden Verbindung immobilisiert.

In den letzten Jahren haben enzymmatische Reaktionen für die chemische Analyse zunehmend an Bedeutung gewonnen, insbesondere hinsichtlich der Analyse biologischer Substanzen, wie von Blut und anderen Körperflüssigkeiten. Dementsprechend beschreibt eine Vielzahl von Literaturstellen die Bindung von Enzymen unter Verwendung einer großen Anzahl von Substraten.

Die Verwendung von Polyurethansubstraten ist in den oben angegebenen Patentanmeldungen beschrieben. In der US-Patentschrift 3 574 062 ist ein System angegeben, in dem ein Polyester-Polyurethan Schaum unter Anwendung eines komplexen Verfahrens mit Aminosäuren und Proteinen zur Bindung von Enzymen verwendet wird. Das erhaltene Produkt kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden:

Polyester ) Enzym

) I

Polyurethan) Aminosäure-Rinderserumalbumin

) I

Träger ) Enzym

030009/0677

Die US-Patentschrift 3 830 699 beschreibt die Bindung von Enzymen an Polyacrylnitrilpolymere über eine Zwischenreaktion der Nitrilgruppen mit einem Alkohol und HCl unter Bildung eines Imidoesters, worauf mit dem Enzym gekoppelt wird. Gemäß Lee und Mitarbeiter in Biochimie, Band 58 (1976), Seiten bis 497, werden Enzyme unter Anwendung einer Zwischenreaktion zwischen einem als EDC bezeichneten Carbodiimid, nämlich 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyD-carbodiimid-HCl und funktionellen Gruppen auf der Collagenoberfläche an Collagen gekuppelt. Anschließend wird das "aktivierte" Collagen mit dem Enzym umgesetzt. In dieser Literaturstelle ist angegeben, daß das Verfahren auf eine Vielzahl von Enzymen, z. B. Hexokinase anwendbar ist. Die Verwendung von Carbodiimid für die Bindung von Enzymen ist auch in Chemical Abstracts, Band 74, 19777h und 19778j beschrieben, wonach Acrylamid-Acrylsäure Copolymere mit einem wasserlöslichen Carbodiimid umgesetzt werden, worauf sich eine Reaktion mit einer wäßrigen Enzymlösung anschließt. Als Enzyme werden Trypsin und eine Kombination aus Hexokinase mit Glukose-6-phosphat-dehydrogenase verwendet.

Die Erfindung umfaßt eine diagnostische Zusammensetzung aus einem Enzym oder einer Mischung von Enzymen, die in biologisch wirksamer Form an eine Carboxylgruppen aufweisende Poly-(harnstoff-urethan)-Matrix mit Oxyalkylenabschnitten im Gerüst gebunden ist, wobei mindestens 60 Mol% der Öxyalkyleneinheiten aus Oxyethyleneinheiten bestehen. Die Enzyme sind

030009/0677

an mindestens eine äußere Oberfläche der Matrix gebunden. Die diagnostische Zusammensetzung erhält man dadurch, daß man eine Aminosäure mit einem Überschuß des Urethanvorpolymeren zu einem Carboxylgruppen enthaltenden Urethanvorpolymeren umsetzt, d. h. die Amin- und Urethangruppen reagieren unter Bildung eines Vorpolymeren, das freie Carboxylgruppen im Innern längs der Polymerkette aufweist, wobei die Endstellungen des Vorpolymeren durch Isocyanatgruppen besetzt sind. Das Carboxylgruppen aufweisende Vorpolymere wird gehärtet und unter Verwendung eines Carbodiimids mit einem Enzym gekoppelt.

Der vorliegend verwendete Ausdruck "Aminosäure" bezeichnet "polymere" Aminosäuren, d. h. Proteine, Peptide und Proteinhydrolysate sowie "monomere" Aminosäuren, z. B. Glycin, Leucin, Phenylalanin u. ä.

Unter dem Ausdruck "diagnostische Zusammensetzung" werden Polyurethanfolien, -schäume oder andere feste Polyurethangegenstände verstanden, bei denen ein oder mehrere Enzyme an mindestens eine äußere Oberfläche und nicht verhältnismäßig gleichmäßig durch das Polymere verteilt sind. Der Ausdruck "NAD(P)" bezeichnet Nikotinamid-adenin-dinukleotid und/oder Nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat.

Die diagnostische Zusammensetzung wird zur Analyse verschiedener biologischer Materialien, d. h. von humanen Körperflüssigkeiten zur Bestimmung von verschiedenen in ihnen enthaltenen Komponen-

030009/0677

ten verwendet. Zum Beispiel kann man die diagnostische Zusammensetzung in Form mehrerer Röhrchen herstellen, von denen das erste Hexokinase gebunden an die innere Oberfläche enthält, und das zweite gebunden an die innere Oberfläche Glukose-6-phosphat-dehydrogenase. Eine Probe menschlichen Blutserums wird zusammen mit Nikotinamid-adenindinukleotid (NAD), Kreatin-phosphat, Glukose, Mg und Adenosin-diphosphat durch die beiden Röhrchen geführt, wodurch sich die in der Probe enthaltene Menge Kreatinphosphokinase quantitativ ermitteln läßt. Bei der diagnostischen Reaktion katalysieren die Enzyme Umsetzungen zwischen den Komponenten der wäßrigen Lösung unter Bildung von NADH, das direkt proportional zu der in der Probe enthaltenen Menge Kreatin-phosphokinase ist. Der NADH-Wert wird photometrisch abgelesen.

Die vorstehend angegebene diagnostische Reaktion kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden:

(1) CP + ADP ^Mg ^- ATP"^Mg + C

++ hex M(-⁺⁺

(2) ATP ^Mg +G ^ADP-"*" + G-6-P

G-6-PDH

(3) G-6-P + NAD NADH + 6-Phosphoglukonat

Bei der obigen Reaktionsfolge haben die Abkürzungen die nach stehenden Bedeutungen: CP (Kreatinphosphat), ADP (Adenosindiphosphat) , CPK (Kreatinphosphokinase), ATP (Adenosintri-

030009/0677

phosphat), G-6-P (Glukose-6-phosphat), NAD (Nikotinamidadenin-dinukleotid), G-6-PDH (Glukose-6-phosphat-dehydrogenase) und G (Glukose).

Bei dem vorstehend genannten Beispiel können die zwei Röhrchen durch ein einziges Röhrchen ersetzt werden, das gebunden eine Mischung von Enzymen enthält. Ferner kann sowohl das System mit einem als auch das mit zwei Röhrchen zur Analyse von ATP, Glukose, Glukose-6-phosphat und NAD oder NADP (Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat) verwendet werden.

Ferner können durch Variieren der verwendeten Reaktionsteilnehmer die Hexokinase/G-6-PDH Röhrchen zusammen oder getrennt zur Analyse der folgenden Substanzen verwendet werden:

zu analysierende Substanzen

ADP

ATP

G-6-P NAD(P) Glukose-1-phosphat Fruktose-6-P Myokinase

Phosphoglukose-isomerase Galaktokinase

Reagenzien

Mg⁺⁺,	CP, CK, G, NAD(P)	I	NAD(P)
Mg⁺⁺,	ADP, CK, G, NAD(P)
Mg⁺⁺,	G, NAD(P)	Phosphoglukomutase,
Mg ,	ATP, NAD(P)
NAD(P]
G-6-P

Phosphoglukose-isomerase, NAD(P)

(2)ADP, Mg⁺⁺, G, NAD(P) (Messung des erzeugten ATP)

Fruktose-6-phosphate, NAD(P)

ATP, Mg , Galaktose, Glukose, (Messung der Verringerung des ATP-Wertes)

030009/0677

Bei der Durchführung der obigen Analyse können die für eine maximale Empfindlichkeit der einzelnen Methoden zu verwendenden Mengen der Reagenzien leicht durch routinemäßige Untersuchungen unter Verwendung variierender Mengen der Reagenzien ermittelt werden.

Für die Herstellung der diagnostischen Zusammensetzung wird das Urethanvorpolymere unter Verwendung eines Überschusses des Vorpolymeren (in bezug auf die NH_-Gruppen der Aminosäure) mit einer Aminosäure umgesetzt, so daß das NCO/NH₂ Verhältnis etwa 100/1 bis etwa 4/1 beträgt. Man nimmt an, daß aufgrund der unterschiedlichen Reaktionsfähigkeit der Aminogruppen und der Carboxylgruppen die Aminogruppen zuerst mit den NCO-Gruppen des Vorpolymeren reagieren, wobei jede primäre Aminogruppe mit 2 und jede sekundäre Aminogruppe mit einer NCO-Gruppe zu reagieren vermag. Das entstandene Produkt kann als kettenverlängertes Urethanvorpolymeres bezeichnet werden, bei dem die Aminogruppen in der Kette gebunden sind und die Carboxylgruppen an der Kette hängen. Die Umsetzung Vorpolymeres/Aminosäure kann in Gegenwart von Lösungsmitteln durchgeführt werden, die eine oder beide Reaktionsteilnehmer lösen oder mit ihnen mischbar sind, z. B. von Ethylalkohol oder Ethylacetat. Die Reaktion wird im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 30 C durchgeführt. Verwendbare Aminosäuren sind z. B. Phenylalanin, Glycin,öC-Amino-isobuttersäure, 12-Amino-dodecansäure, p-Aminophenylessigsäure und p-Aminohippursäure. Geeignete

030009/0677

Proteine sind ζ. B. Gelatine, Albumine, wie Rinderserumalbumin und Collagen. Notwendig ist, daß das Protein nichtumgesetzte Carboxylgruppen außer den primären und sekundären Amingruppen enthält.

Das carboxylierte Vorpolymere wird mit den üblicherweise eingesetzten Härtungsmitteln, wie Aminen oder Wasser, gehärtet. Vorzugsweise härtet man dadurch, daß man das Vorpolymere Wasserdampf aussetzt. Die Geschwindigkeit der mit Wasser bewirkten Härtung ist wichtig, da die Umsetzung Wasser/NCO CO- freisetzt, das der Polymermatrix Porosität verleiht. Wenn die CO₂-Entwicklung verhältnismäßig schnell vor sich geht, kann das Vorpolymere in einen Schaum umgewandelt werden, während bei geringeren Geschwindigkeiten nichtgeschäumte Strukturen entstehen, die häufig als Folien bezeichnet werden. Die Techniken zur Herstellung von Folien oder Schäumen durch Steuerung der Geschwindigkeit der CO₂-Entwicklung sind bekannt und bilden nicht Teil der Erfindung.

Vor der Härtung ist das carboxylierte Vorpolymere eine viskose Flüssigkeit, die sich durch überziehen eines Metallstabs, durch Formen oder durch Ausbreiten des Vorpolymeren auf einer flachen Oberfläche unter Bildung einer Folie leicht formen läßt.

030009/0677

" 2930313

Nach dem Härten und gegebenenfalls Formen wird die carboxylierte gehärtete Polymermatrix mit einem Aktivierungsmittel zur Umsetzung gebracht, das eine oder mehrere funktionelle Gruppen aufweist, die mit den Carboxylgruppen unter Bildung kovalenter Bindungen reagieren, die durch primäre oder sekundäre Amingruppen eines Enzyms ersetzt werden können. Beispiele für geeignete Aktivierungsmittel sind Carbodiimide, Säurechloride, Succinimide und die Acetylierung mit Methanol und HCl mit nachfolgender Hydrazidbildung unter Verwendung von Hydrazin. Woodward's Reagenz "K" ist ebenfalls geeignet. Spezielle Beispiele für die oben genannten Komponenten umfassen: Carbodiimide: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, N^'-Dicyclohexylcarbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, Diphenylcarbodiimid; Woodward's Reagenz K, d. h. N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat; Säurechloride, z. B. Thionylchlorid und Succinimide, z. B. N-Hydroxysuccinimid.

Bedingungen für die Umsetzung der obigen Aktivierungsmittel mit Carboxylgruppen sind hinreichend bekannt. Mit Carbodiimiden wird die Reaktion im allgemeinen bei saurem pH-Wert von vorzugsweise etwa 3 bis etwa 6 und einer Temperatur von unter 10 C, vorzugsweise zwischen O und 5 C durchgeführt. Das Carbodiimid kann in wäßriger oder nichtwäßriger Lösung verwendet werden, und es sollte eine ausreichende Menge eingesetzt werden, um alle vorhandenen Carboxylgruppen umzusetzen,

030009/0677

d. h., daß -N=C=N-/-COOH Verhältnis sollte mindestens 1/1 und vorzugsweise etwa 6/1 bis etwa 60/1 betragen. Hinsichtlich des angegebenen Temperaturbereiches ist darauf hinzuweisen, daß ein Gefrieren der Reaktionsteilnehmer selbstverständlich vermieden werden sollte. Man nimmt an, daß das Carbodiimid oder das andere Aktivierungsmittel mit den Carboxylgruppen unter Bildung verhältnismäßig labiler Bindungen reagiert, die durch Aminogruppen von Proteinen, wie Enzymen, verdrängt werden können. Die Bindung ist auch in der Wärme instabil, und daher sollten die Reaktionstemperaturen weniger als 10 C betragen, wie oben in bezug auf Carbodiimide angegeben ist.

Das "aktivierte" Polymere wird anschließend mit einer wäßrigen Enzymlösung umgesetzt. Die Umsetzung wird unter alkalischen Bedingungen und vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa 9,0 durchgeführt. Die verwendete Enzymmenge variiert mit der Anzahl der im Enzym enthaltenen Aminogruppen. Für Hexokinase hat man festgestellt, daß, bezogen auf das Gewicht des aktivierten Polymeren, etwa 0,2 bis etwa 2,0 % Enzym in der wäßrigen Lösung vorhanden sein sollten, d. h. diese Menge Enzym sollte in der wäßrigen Lösung gelöst sein, die mit dem aktivierten Polymeren in Kontakt gebracht wird. Ähnlich sollten für Glukose-6-phosphat-dehydrogenase etwa 0,05 bis etwa 0,5 Gew.% Enzym verwendet werden. Für jedes einzelne Enzym kann das optimale Bindungsvermögen in einer Versuchsreihe mit verschiedenen Mengen Enzym mit nachfolgender

030009/0677

-■- ΐ7 -

Analyse der gebundenen Menge Enzym festgestellt werden. Außer den oben angegebenen Enzymen können auch andere Enzyme verwendet werden, nämlich Glycerin-dehydrogenase, Lipase, Glukose-oxidase, Galaktose-oxidase, Laktat-dehydrogenase, Glukose-dehydrogenase, Malat-dehydrogenase, Peroxidase, Katalase, Kreatin-phosphokinase, Uricase, Urease, Alkoholdehydrogenase, Cholesterin-oxidase,«(-Amyläse, A-Amylase, Glukoamylase, Laktase, Glukose-isomerase, Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Bromelain, Hydrogenase, Diaphorase, Dextranase, Rennin, Cellulase, Cellobiase, Glycerin-kinase, Pyruvat-kinase, Pektinase, Adenylat-kinase und Lysozym.

Die Temperatur für die Enzymbindung sollte etwa 4 bis etwa 20 C und vorzugsweise etwa 4 bis etwa 10 C betragen. Man hat festgestellt, daß die Verwendung von mehr als einer Schicht carboxyliertem Polymeren hinsichtlich der Menge gebundenen wirksamen Enzyms keine wesentlichen Vorteile bringt. Man nimmt daher an, daß bei festen, nichtgeschäumten Produkten das Enzym hauptsächlich an der Oberfläche der Polymermatrix und nicht im Innern gebunden ist. Außerdem wurde gefunden, daß die Einführung von Blasen, z. B. durch Luft oder andere Gase in die Enzymlösung, die mit den aktivierten Röhrchen in Kontakt gebracht wird, die Menge gebundenen Enzyms erhöht.

030009/0677

Es sind zahlreiche Anwendungszwecke für gebundene immobilisierte Enzyme bekannt. Die erfindungsgemäße diagnostische Zusammensetzung eignet sich besonders für die Analyse von Kreatln-phosphokinase (CPK). Diese Analyse kann in der Weise durchgeführt werden, daß man an die innere Oberfläche eines einzigen Polyurethanröhrchens eine Mischung aus Hexokinase und Glukose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH) bindet. Unter Bezugnahme auf die beigefügte Figur wird schematisch ein mechanisches System für kontinuierliche Analysen einer großen Anzahl von Serumproben beschrieben. Solche Vorrichtungen sind hinreichend bekannt, z. B. die Technicon AAII der Technicon Corp., Tarrytown, New York. In der Darstellung wird die Serumprobe in die Probenschale I gegeben, die die Probe mit einer Geschwindigkeit von 0,32 cm /min. durch die Leitung 3 in den vereinheitlichten Pumpenkopf 5 abgibt. Gleichzeitig wird eine Mischung aus Kreatinphosphat, Adenosindit ι

phosphat, Mg und N-Acetylcystein in kontrollierter Menge (0,60 cm /min.) durch die Leitung 7 in den Pumpenkopf 5 geführt und Luft durch die Leitung 9 in einer Menge von 0,32 cm /min. N-Acetylcystein (N-Ac) ist als CPK-Aktivator erforderlich. Die Luft- und CP/ADP/N-Ac/Mg Ströme werden in der Schlange 11 gemischt und anschließend mit dem Probenstrom 3 vermischt. Der Strom passiert das Heizbad 13, wo er auf etwa 37° C erwärmt wird. Danach wird der erwärmte Strom in die obere Kammer 15 der Dialysiervorrichtung 16 geführt. Jegliches in der Probe enthaltene CPK katalysiert die Reaktion zwischen dem CP und dem ADP unter Bildung von ATP und Kreatin. Das ADP,

030009/0677

ATP und Kreatin diffundieren durch die Membran 17 in die zweite Kanuner 19 der Dialysiervorrichtung 16. Die zweite Kammer der Dialysiervorrichtung enthält auch eine NAD/ Glukose/Mg Mischung, die durch die Leitung 21 über den Pumpenkopf 5 in das System eingespritzt wird (1,00 cm /min.). Die NAD/Glukose/Mg Mischung wird mit Luft vermischt, die durch die Leitung 23 (0,32 cm /min.) durch den Pumpenkopf eingeführt wird. Der NAD/Glukose/Mg Luftstrom kommt durch die Leitung 25 in die Dialysekammer 19 und wird mit ATP aus der oberen Kammer 15 vereinigt. Danach wird der vereinigte Strom durch die Leitung 31, durch das Schlangenrohr 33 und die Fließzelle 41 und anschließend durch die Leitung 51 und den Pumpenkopf 5 zu einem Abfallbehälter geführt.

Das Rohr 33 ist in erfindungsgemäßer Weise hergestellt und enthält immobilisiert an seiner Oberfläche eine Mischung aus Hexokinase und G6PDH. Die Enzyme katalysieren die Umsetzung von ATP, Glukose, Mg⁺⁺, NAD(P) und G6P unter Bildung von NAD(P)H. Die Menge an NAD(P)H wird photometrisch bei 340 Nanometer in der Fließzelle 41 abgelesen, wodurch sich die Menge des in der ursprünglichen Probe enthaltenen CPK quantitativ ermitteln läßt.

Das erfindungsgemäß verwendete Vorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen ist das Reaktionsprodukt aus einem Polyoxy alkylenpolyol und einem Polyisocyanat. Das Äquivalentgewicht der OH-Gruppen der erfindungsgemäß brauchbaren PoIy-

030009/0677

oxyalkylenpolyole beträgt etwa 350 bis 4OOO. Diese Polyole sollten mindestens 60 Mol% Oxyethylen im Oxyalkylenanteil (ausschließlich des Initiators) enthalten, um ein Vorpolyraeres mit guten hydrophilen Eigenschaften zu ergeben. Besonders gute Ergebnisse werden mit Polyolvorläufern erzielt, deren Äquivalentgewicht der OH-Gruppen etwas größer als 350, z. B. 500 bis 2000 ist.

Die Polyoxyalkylenketten des erfindungsgemäß verwendeten Vorpolymeren enthalten vorzugsweise hauptsächlich oder vollständig Oxyethyleneinheiten, z. B. mehr als 70 Mol%, jedoch sind Copolymere, Terpolymere usw., die eine geringere Menge an Oxypropylen, 0xy-1-2-butylen oder 0xy-1-4-butylen Einheiten enthalten, nicht nachteilig und können zu erwünschten Eigenschaften führen, z. B. die Flexibilität des gehärteten Polymeren erhöhen. Bei den Copolymeren kann es sich um solche mit beliebiger Verteilung oder um Blockcopolymere handeln, die in der Technik bekannt sind. Für die erfindungsgemäßen Zwecke können somit Copolymere eingesetzt werden, in denen die Oxyalkylenketten in beliebiger Verteilung oder als Blöcke enthalten sind, wobei ein überwiegender Anteil von mehr als 60 Mol% der sich wiederholenden Einheiten aus Oxyethyleneinheiten besteht.

Ebenso können zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorpolymeren einfache Gemische aus Polyoxyethylenpolyolen und anderen

030009/0677

--Zt -

2330319

Polyolen sowie Gemische aus Oxyethylengruppen enthaltenden Vorpolymeren verwendet werden, vorausgesetzt/ die Gesamtmenge der Oxyethyleneinheiten im gehärteten Polymeren beträgt immer mindestens 60 Mol%. Diese unterschiedlichen Gemische und Copolymeren können in der Weise ausgewählt werden, daß die hydrophilen Eigenschaften, die Flexibilität und die Verstreckbarkeit oder die Paßfähigkeit des gehärteten Polymeren variiert werden.

Die Isocyanatkomponenten des erfindungsgemäßen Vorpolymeren leiten sich von aliphatischen, aromatischen oder Aralkylpolyisocyanaten ab. Vorzugsweise bestehen sie aus einem Diisocyanat, z. B. aus Tolylendiisocyanat (TDI), Xylylendiisocyanat (XDI), Napthalindiisocyanat, 4,4'-Diphenylmethandiisocyanat (MDI), Phenylendiisocyanat, "PAPI" usw. Auch Isomere dieser Diisocyanate oder deren Gemische sind verwendbar, z. B. 2,4-2,6-TDI, 1,5-Napthalindiisocyanat, m-Phenylendiisocyanat sowie die in Polyurethanes: Chemistry and Technology by Saunders & Frisch, Teil 1, Interscience Publishers, New York (1962), Seite 348, und Encyclopedia of Chemical Technology by Kirk and Othmer, 2. Auflage, Band 12, Seiten 46, 47, Interscience Publishers, New York (1967) aufgeführten Diisocyanate.

030009/0677

In den folgenden Beispielen haben die nachstehenden Bezeichnungen die Bedeutung:

PAPI ein Polyarylpolyisocyanat der Upjohn Co.

EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-

hydrochlorid mit der Strukturformel:

)„.HC1

PABA p-Aminobenzoesäure

HK Hexokinase aus Hefe.

In den Beispielen wurde Hexokinase verwendet, die von der Worthington Biochemical Co., Freehold, New Jersey, als lyophilisiertes Pulver mit einer spezifischen Wirksamkeit von 138 Einheiten/mg erhalten worden war, wobei eine Wirksamkeitseinheit diejenige Enzymmenge ist, die 1,0 ,umol NAD/minute bei 30° C und einem pH-Wert von 8,0 reduziert.

G6PDH Glukose-6-phosphat-dehydrogenase. Die in den Beispielen verwendete G6PDH war von der Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, als lyophilisiertes Pulver mit einer spezifischen Wirksamkeit von 500 NAD Einheiten/mg erhalten worden, d. h. eine Wirksamkeitseinheit oxidiert 1,0 ,umol Glukose-6-phosphat in einer Minute bei pH 7,4 und 25° C unter Verwendung von NAD als Coenzym zu 6-Phosphogluconat.

030009/0677

ADP und ATP Adenosindiphosphat und

Adenos intriphosphat

NAD und NADH Nikotinamid-adenin-dinukleotid und

reduziertes Nikotinamid-adenin-dinukleotid

NADP Nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat

Das Vorpolymere A wurde durch Vermischen von 2 Moläquivalenten Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 und 0,66 Moläquivalenten Trimethylolpropan hergestellt. Die Mischung wurde zur Entfernung von Wasser unter einem Druck von 5 bis 15 Torr bei 100 bis 110° C getrocknet. Die getrocknete Mischung wurde langsam innerhalb etwa einer Stunde in ein Reaktionsgefäß gegeben, das 5,52 Moläquivalente Toluoldiisocyanat (TDI) enhielt. Die Temperatur der Mischung aus TDI und Polyol wurde während der Zugabe und mehrere Stunden danach auf 45 bis 65° C gehalten, wobei man rührte. Während dieser Reaktionsperiode erfolgte im Vorpolymeren eine Kettenverlängerung. Anschließend wurden innerhalb etwa 0,5 bis 1 Stunde weitere 0,78 Moläquivalente TDI zugegeben, wobei man rührte und die Temperatur auf etwa 60 C hielt.

Das Vorpolymere B besteht aus einer Mischung von 80 Gewichtsteilen des Vorpolymeren A mit 20 Gewichtsteilen PAPI. Das Vorpolymere C besteht aus Sanprene WE-108X (Sanyo Chemical Industries Ltd., Kyoto, Japan) und enthält eine Polyolkompo-

030009/0677

nente mit einem Molverhältnis Ethylenoxid/Propylenoxid von etwa 5/1 und einem Molekulargewicht von etwa 3000 bis 35O0. Das Vorpolymere D besteht aus einer Mischung von 80 Gewichtsteilen des Vorpolymeren C mit 20 Gewichtsteilen PAPI. Das Vorpolymere E besteht aus dem Vorpolymeren XD-1421 (Dow Chemical Co., Midland, Michigan) und enthält ein Polyol mit einem Molverhältnis Ethylenoxid/Propylenoxid von etwa 3/1 und einem Molekulargewicht von etwa 50OO. Das Vorpolymere F besteht aus einer Mischung von etwa 80 Gewichtsteilen des Vorpolymeren E und 20 Gewichtsteilen PAPI.

Beispiel 1

Herstellung von Polyurethanröhrchen, die gebunden an ihre innere Oberfläche HK und G6PDH enthalten

1 % (Gewicht/Gewicht) PABA wurde mit einer Mischung aus 80 Gew.% des Vorpolymeren C und 20 Gew.% PAPI vermischt. Die Mischung ließ man etwa 15 Minuten reagieren und verwendete sie dann zum gleichmäßigen Überziehen der Oberfläche eines 30 cm langen Stahlstabes, wofür man etwa 30 mg der Mischung aus Vorpolymerem und PABA verwendete. Die Mischung ließ man dadurch härten, daß man sie etwa 30 Minuten feuchter Luft (relative Luftfeuchtigkeit 90 %) aussetzte. Anschließend wurde ein zweiter Überzug aufgebracht, indem man das Vorpolymere A mit dem gleichen Gewichtsanteil Azeton vermischte und 15 mg

030009/0677

dieser Mischung auf den ersten überzug aufbrachte. Der zweite überzug wurde im wesentlichen in der gleichen Weise gehärtet wie der erste überzug. Weitere überzüge aus der Mischung von Azeton und Vorpolymeren* A wurden aufgebracht, bis das gebildete beschichtete Röhrchen einen inneren Durchmesser von etwa 1,59 mm und einen äußeren Durchmesser von etwa 9,53 mm hatte. Auf diese Weise wurde 35 Röhrchen hergestellt.

Die Röhrchen wurden von den Metallstäben entfernt, indem man diese in Wasser weichen ließ. Anschließend wurden 5 cm EDC-Lösung etwa fünf Stunden bei einer Temperatur von etwa 4 C im Kreislauf durch jedes Röhrchen geführt. Die Kreislaufgeschwindigkeit betrug etwa 1 cm /min. Die EDC-Lösung enthielt 40 mg EDC je cm Wasser, wobei der pH-Wert mit HCl auf 4,5 eingestellt war. Nach den fünf Stunden wurde jedes Röhrchen etwa 10 Minuten gewaschen, indem man durch die Röhrchen 0,1M K-Phosphatpuffer (pH 7,6) mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 bis 10 cm /min. führte.

An jedes Röhrchen wurde Enzym gebunden, indem man 826 Einheiten HK und 350 Einheiten G6PDH in ausreichend K-Phosphatpuffer (wie oben beschrieben) zu einer wäßrigen Lösung mit einem Gesamtvolumen von 1,5 cm löste.

Eine wie vorstehend angegeben hergestellte Enzymlösung wurde durch jedes Röhrchen mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 cm /min. bei 4° C etwa eine Stunde lang geführt, worauf man die Röhrchen

030009/0677

bei 4° C über Nacht stehen ließ und dabei die Enzymlösung in Kontakt mit der inneren Schicht der Röhrchen hielt. Anschließend wurde jedes Röhrchen etwa eine Stunde mit 1M NaCl in O,1M K-Phosphatpuffer (pH 7,O) gewaschen.

Für die Aufbewahrung der Röhrchen nach ihrer Herstellung, oder nach ihrem Gebrauch, wird jedes Röhrchen mehrere Minuten mit 7,0 Tris-Pufferlösung (0,10M) gespült, um jegliches Substrat auszuwaschen. Der Tris-Puffer wird anschließend durch 2M (NH₄)₂SO₄-Lösung ersetzt, die 0,10M K-Phosphatpuffer, pH 7,0 enthält. Für lange Aufbewahrungsperioden, z. B. von mehr als 24 Stunden, werden die mit (NH.)«SO.-Lösung wie zuvor angegeben gefüllten Röhrchen vorzugsweise in einen Behälter gegeben, der gleichfalls mit einer ähnlichen Lösung gefüllt ist, worauf man den Behälter verschließt, um ein Verdampfen zu verhindern. Die Röhrchen werden in einem Kühlschrank bei 4 C aufbewahrt.

Bei der Bestimmung der Enzymwirksamkeit der Röhrchen wird das co-gebundene G6PDH zur Feststellung der HK-Wirksamkeit verwendet. Unter Verwendung von Tris-Puffer (0,1OM, pH 7,5) der MgCl₂.6H₂O (3,0 mg/cm³), Glukose (3,33 mg/cm³), ATP (1,33 mg/cm ) und NAD (1,0 mg/cm ) enthält, werden etwa 4 cm der obigen Substratlösung durch das Röhrchen geleitet und bei Raumtemperatur und einer Fließgeschwindigkeit von 1 cm /min. analysiert. Das ausströmende Material wird gesammelt, vermischt und der NADH-Wert in einem Spektrophotometer bei 34Onm abgelesen. Für HK beträgt die optische Dichte (OD) 0,41O +

030009/0677

0,164, bezogen auf die Analyse der 35 Röhrchen mit einer Länge von jeweils etwa 30 cm.

Das G6PDH wird unter Verwendung des gleichen Tris-Puffers wie oben bestimmt, der Glukose-6-phosphat (0,83 mg/cm ) und NAD (0,25 mg/cm ) enthält. 4 cm der Substratlösung werden durch das Röhrchen geführt und bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 cm /min. bei Raumtemperatur analysiert. Das ausströmende Material wird gesammelt, vermischt und das NADH in einem Spektrophotometer bei 340 nm abgelesen. Die optische Dichte für G6PDH beträgt etwa 0,323 + 0,113, bezogen auf die Analyse der 35 Röhrchen mit einer Länge von jeweils etwa 30 cm. Für die Vergleichsversuche gemäß Beispiel 2 wurde die optische Dichte für HK und G6PDH als Standard verwendet.

Beispiel 2

Zur Bestimmung der Wirkung anderer Parameter auf die Leistungsfähigkeit der Röhrchen mit gebundenem Enzym wurden Röhrchen mit einer Länge von jeweils 30 cm unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Technik, jedoch unter Abwandlung eines oder mehrerer Parameter hergestellt. In jedem Fall wurde die Wirksamkeit des gebundenen HK und des G6PDH bestimmt.

Zwei Röhrchen mit erhöhten Mengen an HK von 1239 Einheiten/ 30 cm Röhrchen wurden hergestellt. Der HK-Wert betrug 0,625 + 0,065, der G6PDH-Wert dagegen 0,313 + 0,013. Ferner wurden

030009/0677

zwei Röhrchen mit erhöhten G6PDH-Werten von 667 Einheiten/30 cm Röhrchen (HK-Beladung = 826 Einheiten) hergestellt. Der HK-Wert betrug 0,630 + 0,050 und der G6PDH-Wert 0,445 + O.

Außerdem wurden zwei Röhrchen mit 1239 Einheiten HK und 667 Einheiten G6PDH/3O cm Röhrchen hergestellt. Der HK-Wert betrug 0,490 + 0,070 und der G6PDH-Wert 0,319 + 0,049.

Ein weiteres Röhrchen wurde hergestellt, wobei man eine wäßrige Enzymlösung verwendete, die neben den in Beispiel 1 angegebenen anderen Bestandteilen 2 mg/cm Glukose enthielt. Die gebundene Wirksamkeit an HK betrug 0,565 und die an G6PDH 0,309. Ferner wurde anstelle der Glukose 1 mg/cm NAD in der wäßrigen Enzymlösung verwendet. Die Wirksamkeit an gebundenem HK dieses Röhrchens betrug 0,760 und die an G6PDH 0,354. Die Verwendung einer Kombination von 2 mg/cm Glukose und 1 mg/cm NAD in der Enzymlösung ergab ein Röhrchen, dessen Wirksamkeit an gebundem HK 0,878 und an G6PDH 0,424 ausmachte.

Ferner wurden Röhrchen hergestellt, wobei man den in Beispiel 1 angegebenen EDC-Wert variierte. Die erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

030009/067?

EDC-Wert	gebundenes HK	gebundenes G6PDH
	(optische Dichte)	(optische Dichte)
1 mg/cm	0,134	0,190
2 mg/cm	0,415	0,260
4 mg/cm	0,498	0,302
10 mg/cm	0,316 + 0,023	0,242 + 0,004
20 mg/cm	0,390 + 0,083	0,211 + 0,038

Bei Werten von 10 und 20 mg/cm EDC wurden zwei bzw. drei Röhrchen hergestellt. Abgesehen vom 1 mg/cm -Wert schien die Konzentration an EDC die Enzymwirksamkeit der Röhrchen nicht zu beeinträchtigen.

Um die Wirkung der Zahl der PABA enthaltenden Polymerschichten zu ermitteln, wurden 16 Röhrchen unter Verwendung eines Überzugs und 14 Röhrchen unter Verwendung zweier überzüge hergestellt. Die Röhrchen mit einem PABA enthaltenden inneren Überzug zeigten eine Wirksamkeit von gebundenem HK von 0,392 + 0,185 und von G6PDH von 0,262 + 0,077. Für die Röhrchen mit zwei inneren PABA enthaltenden überzügen betrug die Wirksamkeit an gebundenem HK O,371 + 0,153 und an G6PDH 0,270 + O,096. Man ersieht hieraus, daß die Anwendung eines einzigen PABA enthaltenden inneren Überzugs zu etwa der gleichen Enzymwirksamkeit führt wie zwei Schichten, was anzeigt, daß die Enzymwirksamkeit.hauptsächlich an die innere Oberfläche der Röhrchen gebunden wird.

030009/0677

Ein einziges Röhrchen wurde in der Weise hergestellt, daß man das EDC durch 40 mg/cm 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulphonat ersetzte. Auf Mol-Basis wurde das Cyclohexyl-carbodiimid in einer Menge von 0,094 Mol gegenüber etwa 0,2 Mol EDC verwendet. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,05 Mol und an G6PDH 0,167. Gemäß einer weiteren Variation des Verfahrens nach Beispiel 1 wurde ein Röhrchen unter Verwendung von 1 Gew.% PABA und 99 Gew.% des Vorpolymeren C hergestellt. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,116 und an G6PDH 0,154. Sechs Röhrchen wurden unter Verwendung von 1 Gew.% PABA und 99 Gew.% des Vorpolymeren B hergestellt. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,281 + 0,075 und die an G6PDH 0,211 + 0,029. Ferner wurden Röhrchen unter Verwendung des Vorpolymeren B wie zuvor angegeben hergestellt, wobei man die Menge des verwendeten Enzyms variierte. Die erzielten Ergebnisse sind nachfolgend zusammengestellt:

Zugefügte Zugefügte Gebundenes HK Gebundenes G6PDH HK-Einheiten G6PDH-Einheiten Optische Dichte Optische Dichte

413	192	0,138	0,157
275	128	0,120	0,158
826	230	0,188	O,179
826	115	0,180	0,168

Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, daß die Änderung der Enzymkonzentration zu einer Änderung der Enzymwirksamkeit in

030009/0677

den Röhrchen führt.

Unter Verwendung von 99 Gew.% des Vorpolymeren A und von 1 Gew.% PABA wurde ein Röhrchen hergestellt. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,376 und die an G6PDH 0,217.

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde in der Weise abgewandelt, daß man eine Mischung aus 90 Gew.% des Vorpolymeren A und 10 Gew.% Rinderserumalbumin verwendete. Die Mischung ließ man etwa 15 Minuten reagieren und verwendete sie dann zur Herstellung eines Röhrchens wie in Beispiel 1. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,171 und die an G6PDH 0,221. Unter Verwendung von 10 Gew.% Rinderserumalbumin, 1 Gew.% PABA und 89 Gew.% des Vorpolymeren A wurde ein zweites Röhrchen hergestellt. Das Rinderserumalbumin und das PABA wurden mit dem Vorpolymeren A vermischt, worauf man die Mischung etwa 15 Minuten reagieren ließ und sie dann zu einem Röhrchen formte, wie in Beispiel 1 angegeben. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,257 und die an G6PDH 0,264.

Unter Verwendung einer Mischung aus 1 Gew.% PABA und 99 Gew.% des Vorpolymeren E wurde ein Röhrchen hergestellt. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,195 und die an G6PDH 0,164.

Mit einer Mischung aus 1 Gew.% PABA und 99 Gew.% des Vorpolymeren F wurden drei Röhrchen hergestellt. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,562 + 0,083 und die an G6PDH 0,269

030009/0S77

+ 0,005.

Beispiel 3 Vergleichsbeispiel

2478 Einheiten HK und 1050 Einheiten G6PDH wurden mit 0,1 g des Vorpolymeren A vermischt. Die Mischung ließ man etwa eine halbe Stunde reagieren. Dann wurde sie auf einen 90 cm langen Metallstab aufgebracht, gehärtet, vom Stab entfernt und wie in Beispiel 1 aufbewahrt. Die Wirksamkeit des an das 90 cm lange Röhrchen gebundenen HK betrug 0,022 und die des G6PDH 0,027. Das Beispiel 3 veranschauchlicht somit, daß die direkte Zumischung von trocknen, pulvrigen Enzymen zum Vorpolymeren Röhrchen mit enzymmatischer Wirksamkeit ergibt, daß diese Wirksamkeit jedoch wesentlich geringer ist als bei Röhrchen, die nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt wurden.

Beispiel 4

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß man anstelle des PABA etwa 2 % (Gewicht/Gewicht) Gelatine (hydrolisiertes Collagen) verwendete und als Vorpolymeres das Vorpolymere A. Die Wirksamkeit an gebundenem HK betrug 0,400 und die an G6PDH 0,350 (Röhrchenlänge = 30 cm).

030009/0677

Beispiel 5

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß man verschiedene Aminosäuren anstelle von PABA verwendete. Als Vorpolymeres wurde das Vorpolymer A eingesetzt. Die Analyse der 30 cm langen Röhrchen ergab:

Aminosäure <fl -Aminoisobuttersäure

p-Aminohippursäure /-Aminododecans äur e p-Aminopheny!essigsäure

Scha/be

HK	G6PDH
0,201	0,145
0,322	0,284
0,361	0,257
0,444	0,461

030009/0677

Leerseite

Claims

Patentansprüche

Diagnostische Zusammensetzung, enthaltend eine Mischung aus Hexokinase und Glukose-6-phosphat-dehydrogenase, die in biologisch wirksamer Form an eine carboxylierte Poly-(harnstoff-urethan)-Matrix mit Oxyalkylen-Abschnitten im Gerüst gebunden ist, wobei mindestens 60 Mol% der Oxyalkyleneinheiten aus Oxyethyleneinheiten bestehen und die Enzyme an mindestens eine äußere Oberfläche der Matrix gebunden sind.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, etwa 0,001 bis etwa 1,0 % Hexokinase und etwa 0,001 bis etwa 1 % Glukose-6-phosphat-dehydrogenase enthält.

030009/0679

'"²" 2930313
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix aus einem Schaum besteht.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet/ daß die Matrix aus einer Folie besteht.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix in Form einer selbsttragenden rohrförmigen Folie vorliegt, an deren innerer Oberfläche die Enzyme gebunden sind.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gerüstkomponenten aus Polyoxyethylen/ Polyoxypropylen Copolymeren bestehen.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymermatrix aus dem gehärteten Produkt der Umsetzung zwischen einer Aminosäure und einem ürethanvorpolymeren besteht.
8. Verfahren zur Herstellung diagnostischer Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure mit einem Überschuß an Urethanvorpolymerem zu einem carboxylierten Vorpolymeren umsetzt, das carboxylierte Vorpolymere härtet und unter Verwendung eines Carbodiimids mit einem Enzym kuppelt.

030009/0677
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das carboxylierte Vorpolymere vor dem Härten formt.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das carboxylierte Vorpolymere zu einem Schaum härtet.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das carboxylierte Vorpolymere zu einer Folie härtet.
12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Hexokinase, Glukose-6-phosphatdehydrogenase oder eine Mischung aus Hexokinase und Glukose-6-phosphat-dehydrogenase verwendet.
13. Die Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 7 zur Analyse menschlicher Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man sie mit einer ersten wäßrigen Lösung der Körperflüssigkeiten in Kontakt bringt und in der durch die katalytische Einwirkung der immobilisierten Enzyme auf die erste wäßrige Lösung gebildeten zweiten wäßrigen Lösung die Menge mindestens einer Komponente bestimmt.

030009/0677
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Adenosintriphosphat bestimmt.
15. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Adenosindiphosphat bestimmt.
16. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Kreatinphosphat bestimmt.
17. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Glukose bestimmt.
18. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Glukose-6-phosphat bestimmt.
19. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Nikotinamid-adenin-dinukleotid bestimmt.
20. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat bestimmt.
21. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Glukose-1-phosphat bestimmt.

030009/0677
22. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Fruktose-6-phosphat bestimmt.
23. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Myokinase bestimmt.
24. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Phosphoglukose-isomerase bestimmt.
25. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Galaktokinase bestimmt.
26. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Kreatin-phosphokinase bestimmt.
27. Verwendung nach Anspruch 13 und 26, dadurch gekennzeichnet, daß die erste wäßrige Lösung die zu untersuchende Körperflüssigkeit, Kreatinphosphat, Glukose, Adenosindiphosphat, Magnesiumionen und NAD oder
NAD-Phosphat enthält und in der durch die enzymmatische Einwirkung gebildeten zweiten wäßrigen Lösung NADH oder NADPH in einer Menge enthalten ist, die der Kreatinphosphokinase Menge in der zu untersuchenden Körperflüssigkeit proportional ist.

030009/0677
28. Die Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration an NADH oder NADPH photometrisch bestimmt.

030009/0877