DE2750803A1 - Verfahren zur herstellung von biologisch aktiven polyurethanen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von biologisch aktiven polyurethanen

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Description

Beschreibung
Die Erfindung betrifft immobilisiertes Protein.
In dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 26 12 138.0) wurde ein Verfahren zum Immobilisieren von Protein beschrieben, bei dem man in Abwesenheit von Wasser eine Lösung des Proteins in einem endständige Isocyanatgruppen aufweisenden flüssigen Polyurethan-Präpolymeren herstellt und das erhaltene Gemisch durch Zumischen von Wasser verfestigt und verschäumt. Der gewonnene selbsttragende Schaum besteht aus (a) dem immobilisierten Protein und (b) Poly-(harnstoff-urethan)-anteilen. Das so immobilisierte Protein kann ein Enzym, ein Antikörper oder ein Antigen sein.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß man, sofern man das Protein in einer ausreichend hohen Menge zugibt, das Präpolymer, nachdem man die Lösung aus dem Protein und dem Präpolymeren gebildet hat, einfach sich verfestigen lassen kann und so die Zugabe von Wasser zur Herstellung eines Schaumproduktes nicht notwendig ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktivem Polyurethan nach dem Hauptpatent, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in dem flüssigen, endständige Isocyanatgruppen aufweisenden Polyurethan-Präpolymeren bio-
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logisch aktives Protein in einer zur Verfestigung des Polyurethans ausreichenden Menge löst, die Lösung in Abwesenheit von Wasser sich verfestigen läßt und ein festes, das Protein in aktiver Form gebunden enthaltendes Polyurethan-Produkt gewinnt. Ein Beispiel für dieses Phänomen ist Penicillinamydase. Die im Einzelfall erforderliche Menge an Protein ist ebenso wie die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von der Art des Proteins und auch von der speziellen Form des Präpolymeren. Es läßt sich bisher im voraus noch nicht theoretisch bestimmen, in welcher Weise das Protein mit dem Präpolymeren unter Bildung von Feststoffprodukt reagiert und in welchen Anteilen die Proteine in der Lösung verwendet werden müssen. Jedoch läßt sich durch einfache Vorversuche im Einzelfall dadurch, daß man das jeweilige Protein in sukzessive gesteigerten Anteilen in jeweils gesonderten Einzelansätzen im Präpolymeren löst, für jedes beliebige Protein bestimmen, wann die Feststoff bildung erfolgt, nachdem man das erfindungsgemäße Verfahren kennt und weiß, daß man aus Protein/Präpolymer-Lösungen ohne Zerstörung der biologischen Aktivität des Proteins Feststoffprodukte bilden kann. Die Vorversuche können von jedem Enzymfachmann leicht durchgeführt werden. Wenn einmal bestimmt worden ist, daß man ein spezielles Protein in aktiver Form in der Weise zu immobilisieren wünscht, daß man es an eine Polyurethan-Matrix bindet, so braucht man nur noch Lösungen unter Verwendung von zunehmend größeren Mengen an
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Protein als gelöstem Stoff anzusetzen und festzustellen, wann die Verfestigung eintritt.
Im allgemeinen beträgt der Anteil an Protein wenigstens 10 Gew.%, gewöhnlich 15 bis 50 Gew.% und vorzugsweise 2O bis 45 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Präpolymeren. Im speziellen Fall, wenn Penicillinamidase, ein für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt eingesetztes Protein, verwendet wird, steigt die Viskosität der Präpolymerlösung bei Zusatzmengen des Proteins von mehr als etwa 10 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Präpolymeren, stark an, und die Lösung kann nach etwa 60 Minuten nicht mehr gerührt werden. Dagegen läßt sich bei Konzentrationen unter etwa 5 Gew.% die Lösung noch rühren, und beim Zumischen von Wasser erhält man, wie früher beschrieben, Schaumprodukte.
Man kann beim erfindungsgemäßen Verfahren beliebige endständige Isocyanatgruppen enthaltende, flüssige Polyurethan-Präpolymere, wie sie gemäß dem Verfahren des Hauptpatents eingesetzt werden und in der DT-OS 26 12 138 näher beschrieben sind, benutzen. Bezüglich der Einzelheiten wird auf die DT-OS 26 12 138 Bezug genommen.
So läßt sich beispielsweise ein Präpolymer einsetzen, das durch Reaktion von Toluylendiisocyanat und einem Polyethylen-
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glykol, vorzugsweise mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 800 bis 1200, insbesondere etwa 1000, gewonnen worden ist. Das Präpolymer kann auch aus einem Gemisch aus Polyethylenglykol und Trimethylolpropan mit dem Toluylendiisocyanat gefertigt sein, wobei das Trimethylolpropan und das Polyethylenglykol in einem Molverhältnis von etwa 1:1 bis 4 und das Toluylendiisocyanat in einer Menge von etwa 0,85 bis 1,25, vorzugsweise 0,95 bis 1,1 Mol an Toluylendiisocyanat je Äquivalent (17 g) an -OH-Gruppen aus dem Polyethylenglykol plus dem Trimethylolpropan eingesetzt werden können.
Wahlweise kann das Präpolymer durch Umsetzung von Toluylendiisocyanat und einem Polyoxybutylen-Polyolpolymer, Ethylenglykol, Diethylenglykol, einem Polyoxyethylen-Polyolpolymer, Pentaerythrit, Glycerin, Trimethylolpropan oder einem PoIyoxypropylen-Polyolpolymer hergestellt sein.
Grundsätzlich können im wesentlichen beliebige Di- oder Triisocyanate oder sonstige Polyisocyanate (einschließlich Gemischen von Polyisocyanaten) mit aktivem Wasserstoff enthaltenden Komponenten, insbesondere Glykolen, Polyglykolen, Polyesterpolyolen, Polyätherpolyolen oder sonstigen Polyolen sowie Gemischen von zwei oder mehr solcher Polyole benutzt
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werden. Einzelheiten hinsichtlich spezieller Isocyanate und Polyole sind aus der DT-OS 26 12 138 zu entnehmen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren arbeitet man bei solchen Temperaturen, bei denen das endständige Isocyanatgruppen aufweisende flüssige Polyurethan-Präpolymere in flüssigem Zustand vorliegt und die unterhalb der Denaturierungstemperatur des zu immobilisierenden Proteins gelegen sind. Die Verfestigungstemperatur des eingesetzten flüssigen Polyurethans mit endständigen Isocyanatgruppen ist je nach Molekulargewicht des Präpolymeren und der Struktur der Grundkette des Präpolymeren unterschiedlich.
Die thermale Denaturierungstemperatur von Proteinen liegt generell über etwa 35°C. Jedoch sind einige Proteine während relativ kurzer Zeitspannen (z.B. für 5 bis 30 Minuten oder länger) bei höheren Temperaturen (z.B. bei Temperaturen bis zu etwa 7O°C oder noch etwas höher) stabil.
Man kann die Reaktion in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Verdünnungsmittels oder einem Gemisch von Verdünnern durchführen. Damit die Härtungsreaktion nicht beeinträchtigt wird, sollten nur geringe Mengen an Verdünnungsmittel eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft ist es, ohne Verdünnungsmittel
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zu arbeiten. Es versteht sich, daß nur solche Verdünnungsmittel verwendet werden können, die das Protein nicht denaturieren. Geeignete Verdünnungsmittel sind in der US-PS 3 672 955 beschrieben. Man kann leicht wasserlösliche Flüssigkeiten, z.B. Aceton, in Wasser schwer lösliche Flüssigkeiten, z.B. Methylacetat oder Methylethylketon oder auch in Wasser unlösliche Flüssigkeiten, z.B. Benzol, als Verdünner einsetzen.
Die Verdünnungsmittel dienen dazu, die Viskosität (a) des endständige Isocyanatgruppen aufweisenden flüssigen Polyurethan-Präpolymeren und (b) des resultierenden Gemisches zu reduzieren.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zum Binden des Proteins praktisch jedes flüssige Polyurethan-Präpolymere brauchbar, das wenigstens zwei freie Isocyanatgruppen je Präpolymer-Molekül enthält. Vorteilhaft sind in dem Präpolymeren durchschnittlich zwei Isocyanatgruppen je Molekül vorhanden; es kann auch ein höheres Verhältnis vorliegen, beispielsweise können 2 bis 8 Isocyanatgruppen je Polyurethanmolekül anwesend sein. Man kann zwar mit noch höheren Verhältnissen arbeiten, aber dadurch erreicht man keine weiteren Vorteile. Unter einem endständige Isocyanatgruppen aufweisenden Polyurethan-Präpolymeren, das in der vorliegenden
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Beschreibung als "flüssiges Polyurethan-Präpolymer" bezeichnet wird, versteht man ein solches Präpolymer, welches: (a) bei 40 bis 70°C eine frei fließfähige Flüssigkeit ist, oder wenn man es in einem inerten Lösungsmittel löst, eine Lösung bildet, die etwa 1 bis 5O Gew.%, beispielsweise 10 bis 25 Gew.%, an dem endständige Isocyanatgruppen aufweisenden Polyurethan-Präpolymer enthält. Der in dieser Beschreibung benutzte Ausdruck "endständige Isocyanatgruppen aufweisendes flüssiges Polyurethan-Präpolymer" bezeichnet ein flüssiges Polyurethan oder Polyharnstoffmolekül, das wenigstens etwa zwei freie Isocyanatgruppe je Molekül hat. Nach guter Durchmischung und innigem Kontakt mit dem Protein wird das Isocyanatgruppen aufweisende Polyurethan-Präpolymer chemisch sehr aktiv. Es wird angenommen, daß einige der freien Isocyanatgruppen des Präpolymeren mit den Aminogruppen des Proteins reagieren; wenn eine ausreichende Menge an Protein vorhanden ist, entsteht bei dieser Reaktion (Bildung einer Harnstoff-Bindung) die Ausbildung und das Anwachsen eines Poly-(harnstoff-urethan)-polymeren, und es bilden sich auch Vernetzungsbindungen zwischen den Polymer-Molekülen aus.
Die Bindung (Protein-Immobilisierung) läßt sich mit (a) reinem kristallinem Protein, (b) teilweise gereinigtem, nicht kristallinem Protein, (c) nicht gereinigten, getrockneten Extrakten, die Enzym-, Antikörper- oder Antigen-
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aktivität enthalten, und (d) ungereinigten, getrockneten Extrakten aus FeriiiGntationsmutterlauqe (z.B. einem durch Acetonausfällung aus der Fermentationsbrühe erhaltenem Produkt) durchführon. Die Arbeiten der Anmelderin haben gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren benutzt werden kann, um Proteine praktisch beliebiger Reinheit (einschließlich Enzymen, Antikörpern und Antigenen) zu binden (immobilisieren) .
Es können auch sonstige Zusätze, wie beispielsweise Vernetzungsmittel (Polyamine, Polythiole, Polysäuren), Tenside, Benetzungsmittel, Antischaummittel, Farbstoffe, Antioxydantien und Füllstoffe mit verv/endet werden, vorausgesetzt, daß sie den Härtungsvorgang nicht beeinträchtigen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren, das einen wirksamen Kontakt zwischen einem Protein und einer anderen Substanz, die mit dem Protein eine biologische Reaktion einzugehen vermag, ermöglicht, wobei das Protein mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens immobilisiert ist. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gebundene (immobilisierte) Enzyme sind beispielsweise in der analytischen Chemie für alle Zwecke brauchbar, bei denen bekannte gebundene? Enzyme bisher eingesetzt worden sind. Beispielsweise kann Harnstoff bestimmt werden, indem man
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eine Harnstofflösung durch eine Säule führt, die an Polyurethanschaum gebundene Urease enthält und den Harnstoff quantitativ in Ammoniak umwandelt, der durch Titration oder colorimetrisch bestimmt werden kann. Erfindungsgemäß hergestellte gebundene Antigene sind für die Entfernung von Antikörpern aus biologischen Proben brauchbar. Beispielsweise läßt sich gebundenes menschliches Immunoglobulin G (IgG), ein Antigen, für die Entfernung von rheumatischem Arthritisfaktor (einem Antikörper) aus menschlichem Blut benutzen. Erfindungsgemäß hergestellte gebundene Antikörper eignen sich zur Entfernung von Antigenen aus biologischen Proben. Z.B. kann der Antikörper von Hepatitis in erfindungsgemäßer Weise an Polyurethan gebunden und der erhaltene gebundene Antikörper zur Entfernung des Hepatitis-Antigens aus dem Blut (z.B. dem Blut in Blutbanken) benutzt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Enzyme jeglicher Art gebunden werden. Beispiele für solche Enzyme sind: Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen.
Beispiele für spezifische Enzyme, die erfindungsgemäß immobilisiert (d.h. gebunden) werden können, sind nachstehend zusammengestellt: Urease, Trypsin, Lactase, Glucoseoxydase, Chymotrypsin, Ribonuclease, Peroxydase, Pepsin, Rennin, Invertase, Papain, Asparaginase, Pektinase, Pektinesterase,
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Penicillinamidase, Glucoseisomerase, Lysozym, Aminosäureacylase, Pronase, Alkoholdehydrogenase, Oi.-Amylase, ß-Amylase, Subtilisin, Aminosäureoxydase, Katalase, Tannase, Phenoloxydase, Glucoamylase, Pullulanase, Cellulase, Ficin, Bromelain, Pankreatin, Isoamylase, Lipase, Apfelsäuredehydrogenase, Hexokinase, Lactatdehydrogenase, Adenosindeaminase, Uricase, Galactoseoxydase, Diaphorase, Cholinesterase, Aldolase, Pyruvatcarboxylase, Phospharylase, Cephalosporinamidase, Isozitronensäuredehydrogenase, rrl -Glycerinphosphatdehydrogenase , Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Äpfelsäureenzym, Glykose-6-phosphatdehydrogenase, 5-Dehydroshikiminreduktase, Glutathionreduktase, Glykolsäureoxydase, Hefe-Cytochrom-c-reduktase, Luciferase, Nitritreduktase, Glutamyltransferase, Glutathionsynthetase, Glycocyaminphosphokinase, Hippursäuresynthetase, Aldehydoxydase, Bernsteinsäuredehydrogenase, Nitratreduktase, Xanthinoxydase, Lipoyldehydrogenase, Flavinperoxydase, Glycinoxydase, Carboxylase, oC-Ketosäuredehydrogenase und Transketolase. Bevorzugt wird beim erfindungsgemäßen Verfahren als Enzym Penicillinamidase eingesetzt.
Das erfindungsgemäß gebundene Protein kann in einem diskontinuierlichen oder in einem kontinuierlichen System angewandt werden. Ein Beispiel für ein diskontinuierliches Verfahren ist die Hydrolyse von in einem wäßrigen System vorliegendem Harnstoff. Bei diesem Verfahren werden ein oder mehrere Stücke von
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Polyurethan (d.h. selbsttragender Poly-(harnstoff-urethan)-schaum) mit dem daran gebundenen Enzym (Urease) in einen Ansatz mit wäßrigem Harnstoff gegeben, der zu Ammoniak hydrolysiert werden soll. Wenn die Hydrolyse vollständig ist, werden die Partikel mit dem gebundenen Enzym aus der hydrolysierten Probe entfernt, gewünschtenfalls gewaschen, und in einen anderen Ansatz mit wäßrigem Harnstoff gegeben, der hydrolysiert werden soll. Es ist vorteilhaft, das erfindungsgemäß erhaltene Produkt zu zerkleinern und so die Anzahl an Stellen mit aktivem Protein zu erhöhen.
Es ist vorteilhaft, das erfindungsgemäß gebundene Protein nach der Herstellung zu waschen (vorzugsweise mit Wasser) und so nicht gebundenes Protein zu entfernen und etwa noch vorhandene nicht umgesetzte Isocyanatgruppen zu hydrolysieren.
Man kann jedoch auch das gebundene Protein in eine Säule einfüllen und zu behandelnde Lösung durch die Säule hindurchleiten. Dazu kann man in vollständig kontinuierlicher Weise, .-..B. zwecks Hydrolyse (Umkehrung) einer Saccharoselösung mit gebundener Invertase, oder diskontinuierlich, z.B. zur Bestimmung von Harnstoff durch Hydrolyse einer Mehrzahl von Harnstofflösungen zu Ammoniak mit gebundener Urease und Bestimmung der Menge an Harnstoff in jeder Probe
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durch Analyse der hydrolysierten Proben (die gepackte Säule verlassende Lösung) auf Ammoniak, arbeiten. Bei Anwendung dieser Methode wird, nachdem jede einzelne Probe die gepackte Säule verlassen hat, die Säule mit Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der hydrolysierten Harnstofflösung (Ammoniaklösung) vereinigt, woraufhin der Ammoniakgehalt der vereinigten Flüssigkeiten bestimmt wird.
Ebenso wie das gemäß dem Hauptpatent DT-OS 26 12 138 hergestellte gebundene Protein hat das erfindungsgemäß gewonnene gebundene Protein eine lange Gebrauchsdauer, und es besitzt die gleichen Vorteile.
In dem nachfolgenden Beispiel wird das erfindungsgemäße Verfahren noch näher erläutert.
Beispiel
100 mg des wie nachstehend beschrieben hergestellten Präpolymeren, 100 mg Penicillinamidase und 10 mg Penicillin G (Natriumsalz) wurden zu einer Lösung vermischt. Während des Vermischens stieg die Viskosität der Lösung an, und etwa 10 Minuten, nachdem die Reaktionskomponenten miteinander in Kontakt gebracht worden waren, konnte man die Lösung nicht länger von Hand rühren. Nach 1 Stunde war die Lösung zu einem harten, festen Mate-
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rial geworden. Das Feststoffprodukt wurde zu Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als 840 Mikrometer zerkleinert, vermählen und abgesiebt. Bezogen auf Trockengewicht betrug die Aktivität der Teilchen 1020 Einheiten/g. Die Aktivität wurde definiert als die Mikromole von Penicillin G, die je Minute bei 3O°C und pH 8 gespalten wurden.
Das in diesem Beispiel benutzte, endständige Isocyanatgruppen enthaltende, flüssige Polyurethan-Präpolymer wurde durch Umsetzung von 31 g Glycerin mit einer so ausreichenden Menge an Ethylenoxid gewonnen, daß 500 g eines Zwischenproduktes (eines Hydroxylendgruppen aufweisenden Polyäthers) mit einem Äquivalentgewicht von etwa 500 (d.h. es waren darin etwa 17 g an -OH-Gruppen je 500 g an Zwischenprodukt enthalten) gebildet wurden. Dieses Zwischenprodukt wurde mit handelsüblichem Toluylendiisocyanat umgesetzt, und dazu wurden 1,05 Mole an Toluylendiisocyanat je 500 g des Zwischenproduktes verwendet.
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Claims (10)

UCXKCLt-* ^rOI.BEHG PATENTANWÄLTE 20O0 HAMBURG 5? IM«. J.-O. FRHR. von UEXKULL CHCL Ut-RICH GRAf= STOLBERG CHPL.-ING. JÜRGEN SUCHANTKE W.R. Grace & Co. (Prio: 18. November 1976 US 743 O35 - 14530) Avenue of the Americas New York, N.Y. 10O36 / V.St.A. Hamburg, 11. November 1977 Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Polyurethanen {Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 26 12 138.0) Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Polyurethanen, nach Patent . ... — (Patentanmeldung P 26 12 138.0) unter Verwendung eines Polyurethan-Präpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen und Protein, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem flüssigen Polyurethan-Polymeren mit endständigen Isocyanatgruppen biologisch aktives Protein in einer zur Verfestigung des Polyurethans ausreichenden Menge löst, die Lösung in Abwesenheit von Wasser sich verfestigen läßt und ein festes, das Protein
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in aktiver Form gebunden enthaltendes Polyurethanprodukt gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protein Enzym, Antikörper oder Antigen verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protein Penicillinamidase verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein in einer Menge von wenigstes 10 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Polymeren, verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein flüssiges, endständige Isocyanatgruppen enthaltendes Polyurethan-Präpolymer verwendet, das durch Reaktion von Toluylendiisocyanat und einem Polyethylenglykol hergestellt worden ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein flüssiges, Isocyanatendgruppen aufweisendes Polyurethan-Präpolymer verwendet, das durch Reaktion von
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Toluylendiisocyanat mit einem Gemisch aus ein Molekulargewicht von 800 bis 12OO aufweisendem Polyethylenglykol und Trimethylolpropan hergestellt worden ist, wobei das Trimethylolpropan und das Polyethylenglykol in einem Molverhältnis von etwa 1:1 bis 1:4 und das Toluylendiisocyanat in einer Menge von 0,85 bis 1,25 Mol je Äquivalent an aus dem Polyethylenglykol plus dem Trimethylolpropan stammenden -OH-Gruppen vorhanden waren.
7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Isocyanatendgruppen aufweisendes flüssiges Urethan-Präpolymer verwendet wird, das durch Reaktion von Toluylendiisocyanat mit Polyoxybutylenpolyol, Ethylenglykol, Diethylenglykol, einem Polyoxyethylenpolyolpolymer, Pentaerythrit, Glycerin, Trimethylolpropan oder einem Polyoxypropylenpolyol hergestellt worden ist.
8. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das immobilisierte Protein zwecks Entfernung von nicht gebundenem Protein und zwecks Hydrolyse von nicht umgesetzten Isocyanatgruppen wäscht.
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9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das resultierende biologisch aktive Polyurethan zerkleinert.
10. Verwendung eines nach dem Verfahren gemäß der Ansprüche
1 bis 9 hergestellten gebundenen Proteins als Reaktionskomponente für eine andere Substanz, die mit dem Protein eine biologische Reaktion einzugehen vermag.
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