DE2755053A1

DE2755053A1 - Mit polyurethanen modifizierte, in wasser dispergierbare proteine und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2755053A1
Application number: DE19772755053
Authority: DE
Inventors: Frank Joseph Hartdegen; Wayne Elliott Swann
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co Conn
Priority date: 1976-12-10
Filing date: 1977-12-07
Publication date: 1978-06-22
Also published as: BE861602A; JPS5379094A; NL7713584A; FR2393005B1; CH634589A5; NL187585C; NL187585B; JPH0233356B2; AT356620B; MX4534E; ATA883577A; DE2755053C2; FR2393005A1; GB1574508A

Description

Die Erfindung betrifft an organische Polymere gebundene Proteine.

Der Ausdruck "lösliche gebundene Enzyme" bezeichnet in der Technik das Reaktionsprodukt aus einem Protein und einem polymeren natürlichen oder synthetischen Material. Dieses Reaktionsprodukt ist in flüssigen Medien, wie Wasser, löslich oder dispergierbar. Bei der Bindung des Proteins an das Polymere handelt es sich im allgemeinen um eine kovalente Bindung, obgleich auch schon Adsorptionsverfahren angewandt wurden. Die löslichen, gebundenen Proteine zeigen häufig eine biologische Reaktionsfähigkeit, die der des freien Proteins ähnlich ist. Andere besitzen im Vergleich zu den freien nichtmodifizierten Proteinen verbesserte Löslichkeit und/oder verringerte Antigenwirkung sowie andere Verbesserungen.

Die Enzyme wurden schon auf verschiedenen Wegen an verschiedene Polymere gebunden. Insbesondere hat man sie an Polyurethane, zum Beispiel Polyurethanschaum gebunden. Zum Beispiel ist in der US-Patentschrift 3 929 574 die Herstellung eines gebundenen

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(immobilisierten) Proteins, nämlich eines Enzyms, beschrieben. Sie erfolgt dadurch, daß man ein flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen unter schaumbildenden Bedingungen mit einer wässrigen Dispersion des Enzyms in Berührung bringt. Hierdurch schäumt das Polyurethan auf und bindet die Enzyme in dem gebildeten Polyurethanschaum.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Dispersion oder Lösung von Protein, das an ein Urethanpolymeres gebunden ist. Dieses Verfahren besteht im Vermischen eines mindestens in Wasser dispergierbaren, biologisch aktiven Proteins mit einem in Wasser mindestens dispergierbaren flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen. Es entsteht eine Lösung, die in Wasser dispergiert wird. Nach der Dispergierung in Wasser kann jegliches unlösliche Material, zum Beispiel durch Filtrieren abgetrennt werden.

Das Verfahren wird bei einer Temperatur durchgeführt, bei der das Polyurthanvorpolymere mit den endständigen Isocyanatgruppen in flüssigem Zustand vorliegt. Natürlich sollte die Temperatur unter der Denaturierungstemperatur des zu bindenden Proteins liegen. Die Denaturierungstemperatur von Proteinen liegt im allgemeinen über etwa 35 C. Jedoch sind einige Proteine verhältnismäßig kurze Zeit, zum Beispiel 5 bis 30 Minuten oder

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länger bei höheren Temperaturen von zum Beispiel bis zu etwa 7O°C oder etwas höher beständig.

Ohne an diese Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, daß das Protein in den erhaltenen Verbindungen über mindestens eine Ureid-Bindung an das Polyurethanpolymere gebunden ist. Die Erfindung umfaßt auch diese Verbindungen. Aus den nachstehenden Beispielen geht hervor, daß ein Protein/Polyurethan-Produkt mit anderen Eigenschaften gebildet wird. Zum Beispiel unterscheiden sich die Wanderung durch eine chromatografische Säule, die Wanderung in einem elektrischen Feld und die Löslichkeitseigenschaften von denen des freien Proteins wie auch des freien Polymeren.

Es ist natürlich bekannt, daß die Umsetzungsgeschwindigkeiten von Aminen mit Isocyanatgruppen viel größer sind als die Umsetzungsgeschwindigkeiten von Aminen mit Wasser oder Hydroxylgruppen. Es ist auch bekannt, daß Proteine, wie Enzyme, Antigene, Antikörper und einfache Proteine, zum Beispiel Serumalbumine, im wesentlichen Polymere von Aminosäuren darstellen, die verfügbare -NH₂-Gruppen aufweisen. Es ist daher wahrscheinlich, daß sich in der Protein/Vorpolymer-Lösung Ureid-Bindungen zwischen dem Protein und dem Vorpolymeren bilden.

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Man nimmt daher an, daß Protein/Polymer-Reaktionsprodukte in der Protein/Vorpolymer-Lösung vorliegen, die die folgenden idealisierten Arten einschließen, in denen "P" das Protein und "Pol" das Polymere darstellen:

1) P- NH-C-NH - Pol - NH₂

O O

2) P- NH-C-NH - Pol - NH-C-NH - P

O O

3) H₀N - Pol - NH-C-NH - P - NH-C-NH - Pol - NH₀

Es ist auch nicht unwahrscheinlich, insbesondere wenn ein Überschuß an Polymerem vorliegt, daß das Protein als Zentrum für eine Verzweigung dient, die zu der folgenden idealisierten Struktur führen kann:

O
,,NH-C-NH - Pol - NH_

4) H₂N - Pol - NH-C-NH -P^ ₀

^NNH-C-NH - Pol - NH₂

Die obigen Strukturen können unter Bildung eines ausgedehnten Netzwerkes, das sich schwer in Wasser dispergieren läßt, weitergeführt werden. Ferner kann die Gegenwart einer großen Anzahl von Polymerketten, zum Beispiel in einem Enzym, zu sterischen Behinderungen führen. Diese könnte man reduzieren, wenn das

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Substrat klein ist, wie im Fall der Peroxidase-Enzyme. Man weiß, daß diese Enzyme verhältnismäßig unbeständig sind, und nimmt daher an, daß die Umsetzung von Peroxidase-Enzymen mit Polyurethanvorpolymerem günstig ist.

Beim Dispergieren in Wasser werden alle nicht-umgesetzten -NCO-Gruppen durch Reaktion mit Wasser unter Hydrolyse in -NH₂-Gruppen umgewandelt, so daß Kohlendioxid entwickelt wird und am Polyurethanmolekül Amingruppen entstehen. Diese Amingruppen können mit den freien Isocyanatgruppen an benachbarten Polyurethanmolekülen reagieren, und diese unter Bildung von Harnstoffbindungen vor sich gehende Reaktion kann die Bildung und das Wachstum sowie die Vernetzung zu einem Poly-(harnstoffurethan)-polymeren bewirken, dessen Moleküle nicht mehr dispergierbar sind, wenn die Umsetzungen weit genug fortgeschritten sind.

In der ersten Vermischungsstufe des Proteins mit dem Vorpolymeren ist die relative Menge der -NCO-Gruppen in Beziehung zu den -NH_-Gruppen des Proteins nicht kritisch. Ein Überschuß von -NCO-Gruppen kann angewandt werden, das heißt es wird ausreichend Isocyanat verwendet, so daß nach dem Lösen des Proteins im Vorpolymeren mehr als eine Stunde nachdem die Lösung gebildet ist, freie nicht umgesetzte -NCO-Gruppen vorhanden sind, unter der Annahme, daß die Komponenten vermischt

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wurden, und daß man sie bei Raumtemperatur, zum Beispiel 21°C lösen ließ. Wenn der Überschuß an -NCO-Gruppen zu groß ist, wird die Wahrscheinlichkeit einer Kettenverlängerung beim Dispergieren in Wasser erhöht, ebenso die Wahrscheinlichkeit der Bildung unlöslicher Reaktionsprodukte. Vorzugsweise liegen die Proteinamingruppen im Überschuß vor, um die Anzahl der an jedes Proteinmolekül gebundenen Polymerketten zu reduzieren. Man nimmt jedoch an, daß die Vorteile, zum Beispiel die Stabilisierung und die verringerte Antigenwirkung der mit Polymeren modifizierten Proteine erreicht werden können, ob nun eine oder eine große Anzahl von Polymerketten an das Protein gebunden ist.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform, der Ausführungsform A, gemäß der Erfindung umfaßt das Verfahren:

(a) die Bildung eines ersten Produktes durch Vermischen in Abwesenheit von Wasser, das heißt unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen des Proteins mit einem flüssigen Polyisocyanat und

(b) die Bildung eines zweiten Produktes aus einem flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen und.in ihm gelösten Protein durch Vermischen und Umsetzen des ersten Produktes und einer entsprechenden Menge eines

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Polyols in Abwesenheit von Wasser. Alternativ umfaßt das Verfahren:

(a) Die Bildung eines ersten Produktes durch Vermischen des Proteins mit einem flüssigen Polyol in Abwesenheit von Wasser und

(b) die Bildung eines zweiten Produktes aus einem flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen und in ihm gelöstem Protein durch Umsetzung des ersten Produktes und einer entsprechenden Menge Polyisocyanat in Abwesenheit von Wasser.

Bei diesen Ausführungsformen bevorzugt man im allgemeinen die Verwendung von 2 bis 500 und insbesondere von 50 bis 100 mg Protein je g Polyol. Die Menge verwendetes Protein in Bezug auf das Isocyanat ist nicht kritisch.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren:

(a) das Vermischen des flüssigen Polyurethanvorpolymeren und eines mit dem Enzym umsetzbaren Substrats in Abwesenheit von Wasser und

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(b) das Vermischen der erhaltenen Mischung mit dem Enzym in Abwesenheit von Wasser. In diesem Falle bevorzugt man im allgemeinen die Verwendung von 5 bis 100 Molen und insbesondere von 8 bis 12 Molen Substrat je Mol Enzym.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wirkt das flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen als (a) Lösungsmittel für die Lösung des zu bindenden Proteins und (b) als Reaktionsteilnehmer für die Umsetzung mit dem an es zu bindenden Protein.

Die Verfestigungstemperatur des flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen hängt vom Molekulargewicht des Vorpolymeren und dem Gerüst des Vorpolymeren ab.

Die Bildung der Protein/Vorpolymer-Lösung wird in Abwesenheit von Wasser durchgeführt und in Gegenwart oder Abwesenheit eines Verdünnungsmittels oder einer Mischung von Verdünnungsmitteln. Selbstverständlich kann ein Verdünnungsmittel, das das Protein denaturieren oder die Dispergierbarkeit verhindern oder wesentlich reduzieren würde, nicht verwendet werden. Brauchbare Verdünnungsmittel sind in der US-Patentschrift 3 672 955 beschrieben. Die Verdünnungsmittel können in Wasser stark löslich sein, wie Aceton; mäßig löslich, wie Methylacetat oder Methylethylketon oder in Wasser unlöslich sein, wie Benzol und andere

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derartige Verdünnungsmittel, wie sie in der US-Patentschrift 3 672 955 beschrieben sind.

Die Verdünnungsmittel dienen zur Verringerung der Viskosität (a) des flüssigen Polyurethanvorpolymeren mit endständigen Isocyanatgruppen und (b) der entstehenden Lösung.

Wenn das Verdünnungsmittel in Wasser unlöslich oder im wesentlichen unlöslich ist, kann ein Emulgiermittel verwendet werden.

Man nimmt an, daß die Bindung des Proteins durch Umsetzung mit dem Vorpolymeren eine generell auf alle Proteine anwendbare Reaktion ist, die Enzyme, Antikörper und Antigene einschließt.

Solche Enzyme umfassen Oxido-Reduktasen, Lyasen, Transferasen, Isomerasen, Hydrolasen und Ligasen.

Spezifische Enzyme sind:

Urease Cellulase

Trypsin Ficin

Lactase Bromelain

Glucose-Oxidase Pankreatin

Chymotrypsin Isoamylase

Ribonuclease Lipase

Peroxidase Äpfelsäure-Dehydrogenase

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Pepsin Rennin Invertase Papain Asparaginase Pectinase Pectin-Esterase Penicillin-Amidase Glucose-Isomerase Lysozym Aminosäure-Acylase Pronase Alkohol-Dehydrogenase od-Amylase

ß-Amylase Subtilisin Aminosäure-Oxidase

Katalase Tannase Phenol-Oxidase Glucoamylase Pullulanase Hefe-Cytochrom-c-Reduktase Luciferase Nitrit-Reduktase Glutamy!-Transferase Hexokinase

Lactat-Dehydrogenase Adenosin-Desaminase Uricase

Galactose-Oxidase Diaphorase

Cholinesterase Aldolase

Pyruvat-Carboxylase Phospharylase Cephalosporin-Amidase Isozitronensäure-Dehydrogenase od-Glycerinphosphat-Dehydrogenase

Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

Äpfelsäureenzym

Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

5-Dehydroshikimin-Reduktase Glutathion-Reduktase Glycolsäure-Oxidase Nitrat-Reduktase Xanthin-Oxidase Lipoyl-Dehydrogenase Flavin-Peroxidase

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Glutathion-Synthetase Glycin-Oxidase

Glycocyamin-Phosphokinase Carboxyläse

Hippursäure-Synthetase Q^-Ketosäure-Dehydrogenase

Aldehyd-Oxidase Transketolase Bernsteinsäure-Dehydrogenase

sowie menschliches Immunoglobulin G. Die Reinheit des Proteins ist wahrscheinlich nicht kritisch. Ob rein oder nicht rein, wenn es nur die erforderlichen Amingruppen aufweist. Die Bindung kann so mit (a) reinem kristallinem Protein, (b) partiell gereinigtem nicht-kristallinem Protein, (c) unreinen, Enzyme, Antikörper oder Antigene enthaltenden getrockneten Extrakten oder (d) nicht gereinigten getrockneten Extrakten aus Fermentationsbrühen, zum Beispiel einem aus einer Brühe mit Aceton erhaltenen Fällungsprodukt bewirkt werden.

Nach der Bildung der Protein/Vorpolymer-Lösung verursachen bestimmte Proteine die Verfestigung des Vorpolymeren, wenn das Protein in ausreichend großen Mengen vorhanden ist. Ein Beispiel für dieses Phänomen ist Penicillin-Amidase. Wenn die Amidase-Werte etwa 10 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Vorpolymeren, überschreiten, besitzt die Vorpolymerlösung eine erhöhte Viskosität und kann nach etwa 60 Minuten nicht mehr gerührt werden. Bei Konzentrationen von unter etwa 5 Gew.% läßt sich die Lösung noch rühren und in Wasser dispergieren.

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Der Beginn der Verfestigung kann einfach dadurch festgestellt werden, daß man das Protein in zunehmend größeren Mengen in verschiedenen Ansätzen des Vorpolymeren löst.

Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen sind bekannt, vgl. zum Beispiel Kirk-Othmer "Encyclopedia of Chemical Technology", John Wiley and Sons, Inc., New York, 2. Auflage, Band 9, und "The Encyclopedia of Chemistry", George L. Clark, Reinhold Publishing Corporation, New York, 2. Auflage. Die erfindungsgemäß verwendeten sind in Wasser dispergierbar oder in Wasser löslich.

Unter dieser Voraussetzung kann jedes flüssige Polyurethanvorpolymere, einschließlich der in den US-Patentschriften 3 672 955 und 3 929 574 genannten, die mindestens eine freie Isocyanatgruppe je Molekül des Vorpolymeren enthalten, verwendet werden. Vorzugsweise enthält das Vorpolymere durchschnittlich 1 bis 2 Isocyanatgruppen je Molekül, obgleich auch solche mit zum Beispiel 2 bis 8 oder mehr Isocyanatgruppen je Polyurethanmolekül verwendet werden können.

Das erfindungsgemäß eingesetzte flüssige Polyurethanvorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen enthält mindestens zwei reaktionsfähige Isocyanatgruppen je Molekül des Vorpolymeren. Ein Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen

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ist ein "flüssiges Polyurethanvorpolymeres", das bei der erfindungsgemäßen Verwendung die folgenden Bedingungen erfüllt: Es ist bei 40 bis 70°C eine freifließende Flüssigkeit oder läßt sich in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel den oben angegebenen, unter Bildung einer Lösung lösen, die etwa 1 bis 50 % und insbesondere 10 bis 25 Gew.% an Polyurethanvorpolymerem mit endständigen Isocyanatgruppen enthält.

Der vorliegend verwendete Ausdruck "flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen" bezeichnet ein flüssiges Polyurethan- oder Polyharnstoffmolekül mit mindestens etwa zwei freien Isocyanatgruppen je Molekül.

Repräsentative Beispiele für Polyisocyanate, die mit einer aktive Wasserstoffatome enthaltenden Verbindung, zum Beispiel einem Glykol, Polyol, Polyglykol, Polyesterpolyol oder PoIyätherpolyol zu einem Polyurethan mit endständigen Isocyanatgruppen umgesetzt werden können, sind:

Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, handelsübliche Gemische aus Toluol-2,4- und -2,6-diisocyanat, Ethylendiisocyanat, Ethylidendiisocyanat, Propylen-1,2-diisocyanat, Cyclohexylen-1,2-diisocyanat, Cyclohexylen-1,4-diisocyanat, m-Phenylendiisocyanat, 3,3'-Diphenyl-4,4'-biphenylendiisocyanat , 4,4'-Biphenylendiisocyanat, 3,3'-Dichlor-4,4'-biphenylen-

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diisocyanat, 1,6-Hexamethylen-diisocyanat, 1 ,4-Tetramethylendiisocyanat, 1,10-Decaraethylen-diisocyanat, 1,5-Naphthalindiisocyanat, Cumol-2,4-diisocyanat, 4-Methoxy-1,3-phenylendiisocyanat, 4-Chlor-1,3-phenylendiisocyanat, 4-Brom-1,3-phenylendiisocyanat, 4-Ethoxy-1,3-phenylen-diisocyanat, 2,4'-Diisocyanatodiphenyläther, 5,6-Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat, 2,4-Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat, 4,4'-Diisocyanatodiphenyläther, Benzidin-diisocyanat, 4,6-Dimethyl-l,3-phenylendiisocyanat, 9,10-Anthracen-diisocyanat, 4,4'-Diisocyanatodibenzyl, 3,3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenylraethan, 2,6-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenyl, 2,4-Diisocyanatostilben, 3,3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenyl, 3,3'-Dimethoxy-4,4'-diisocyanatodiphenyl, 1,4-Anthracendiisocyanat, 2 ,5-Fluorendiisocyanat, 1,8-Naphthalindiisocyanat, 2,6-Diisocyanatobenzfuran, 2,4,6-Toluoltriisocyanat und p,p',p"-Triphenylmethan-triisocyanat.

Eine brauchbare Klasse flüssiger Polyurethanvorpolymerer mit endständigen Isocyanatgruppen sind die von Polyätherpolyolen und Polyesterpolyolen abgeleiteten. Diese Verbindungen können in bekannter Weise durch Umsetzung eines Polyäther (oder Polyester ) -polyols mit einem Polyisocyanat hergestellt werden, wobei man einen Überschuß des letzteren verwendet, um freie Isocyanatgruppen im Produkt zu gewährleisten. Ein typisches

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Beispiel hierfür ist nachstehend in Form einer idealisierten Gleichung wiedergegeben:

HO (—CH₂ CH₂ O—^j—H Polyätherpolyol

Λ³

/V- NCO

'NCO Polyisocyanat

NH — C-O —f- CH₂ — CH₂ O

NCO

flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen

m bezeichnet die Anzahl der sich wiederholenden Oxyethyleneinheiten. Diese können 5 bis 50 betragen.

Das Vorpolymere kann aus einer Vielzahl von Polyolen, wie sie in der US-Patentschrift 3 672 955 angegeben sind, einschließlich einfacher Polyole und Polyatherpolyole sowie Polyesterpolyole hergestellt werden.

Typische einfache Polyole sind: Propylenglykol, Trimethylenglykol, 1,2-Butylenglykol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol, 1,2-Hexylenglykol, 1,1O-Decandiol, 1,2-Cyclohexandiol, 2-Buten-1,4-diol, 3-Cyclohexen-i,1-dimethanol, 4-Methyl-3-cyclohexen-1,1-dimethanol, 3-Methylen-1,5-pentan-

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diol, Diethylenglykol, (2-Hydroxyethoxy)-1-propanol, 4-(2-Hydroxyethoxy) -1 -butanol , 5-(2-Hydroxypropoxy)-1-pentanol, 1-(2-Hydroxymethoxy)-2-hexanol, 1 -(2-Hydroxypropoxy)-2-octanol, 3-Allyloxy-1,5-pentandiol, 2-Allyloxymethyl-2-methyl-1,3-propandiol, [[(4-Pentyloxy)-methylJ-1 ,3-propandiol, 3-(o-Propenylphenoxy)-1 ,2-propandiol, Thiodiglykol, 2 , 2 ' -[.Thiobis-(ethylenoxyj] -diethanol, Polyethylenätherglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 200, 2,2'-Isopropyliden-bis-(pphenylenoxy)-diethanol, 1,2,6-Hexantriol, 1,1,1-Trimethylolpropan, 3-(2-Hydroxyethoxy)-1,2-propandiol, Ethylenglykol, 3-(2-Hydroxypropoxy)-1,2-propandiol, 2,4-Dimethy1-2-(2-hydroxyethoxy)-methylpentandiol-1,5; 1,1, 1-Tris-[(2-hydroxyethoxy)-methylj -ethan, 1,1,1-Tris- £( 2-hydroxypropoxy)-methyl] propan, Triethanolamin, Triisopropanolamin, Resorcin, Pyrogallol, Phloroglucin, Hydrochinon, 4,6-di-tert.-Butylcatechin, Catechin, Orcin, Methylphloroglucin, Hexylresorcin, 3-Hydroxy-2-naphthol, 2-Hydroxy-1-naphthol, 2,5-Dihydroxy-1-naphthol, Bisphenole, wie 2,2-Bis-(p-hydroxyphenyl)-propan und Bis-(phydroxyphenyl)-methan, 1,1,2-Tris-(hydroxyphenyl)-ethan und 1,1,3-Tris-(hydroxyphenyl)-propan.

Typische Polyätherpolyole sind solche, die durch Umsetzung eines Alkylenoxids mit einem Initiator erhalten werden, der aktive Wasserstoffatome enthält, zum Beispiel einem mehrwertigen Alkohol, wie Ethylenglykol, einem Polyamin, wie Ethylen-

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diamin oder Phosphorsäure. Die Umsetzung wird gewöhnlich in Gegenwart eines sauren oder basischen Katalysators durchgeführt. Beispiele für geeignete Alkylenoxide sind Ethylenoxid, Propylenoxid, die isomeren Butylenoxide sowie Gemische aus zwei oder mehr Alkylenoxiden, zum Beispiel Gemische aus Ethylen- und Propylenoxid. Die erhaltenen Polyätherpolyole enthalten ein Polyäthergerüst und endständige Hydroxylgruppen. Die Anzahl der Hydroxylgruppen im Polymermolekül wird durch die Funktionalität des Initiators mit aktiven Wasserstoffatomen bestimmt. Zum Beispiel führt ein bifunktioneller Alkohol, wie Ethylenglykol, zu Polyätherketten, in denen zwei Hydroxylgruppen im Polymermolekül enthalten sind. Wenn die Polymerisation des Oxids in Gegenwart von Glycerin, einem trifunktionellen Alkohol, durchgeführt wird, enthalten die gebildeten Polyäthermoleküle durchschnittlich drei Hydroxylgruppen im Molekül. Eine noch höhere'Funktionalität wird erreicht, wenn man das Oxid in Gegenwart von Polyolen, wie Pentaerythrit, Sorbit, Saccharose und Dipentaerythrit polymerisiert. Andere mehrwertige Alkohole, die mit Alkylenoxiden zu brauchbaren Polyätherpolyolen umgesetzt werden können, sind in der bereits aufgeführten Liste einfacher Polyole enthalten.

Eine besonders brauchbare Klasse von Polyätherpolyolen sind die Polyoxyethylenpolyole HO-(CH₉CH₉-O) -H, in denen χ eine

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solche Durchschnittszahl darstellt, daß das Polyol ein durchschnittliches Molekulargewicht von bis zu etwa 1000 oder etwa 2000 oder noch etwas höher besitzt.

Die verwendbaren Polyesterpolyole werden am einfachsten durch Kondensationspolymerisation eines Polyols mit einer mehrbasischen Säure hergestellt. Das Polyol und die sauren Reaktionsteilnehmer werden in solchen Anteilen verwendet, daß im wesentlichen alle Säuregruppen verestert werden und die gebildete Kette aus Estereinheiten endständige Hydroxylgruppen aufweist. Repräsentative Beispiele für solche mehrbasischen Säuren sind Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Korksäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Brassylsäure, Thapsisäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glutaconsäure, Q£-Hydromuconsäure, ß-Hydromuconsäure, Od-Butyl- «V-ethylglutarsäure, ⁰^, ß-Diethylbernsteinsäure, o-Phthalsäure, Isophthalsäure, Terephthalsäure, Hemimellithsäure, Trimellithsäure, Trimesinsäure, Mellophansäure, Prehnitinsäure, Pyromellithsäure, Zitronensäure, Benzolpentacarbonsäure, 1^-Cyclohexan-dicarbonsäure, Diglykolsäure, Thiodiglykolsaure, dimerisierte Ölsäure und dimerisierte Linolsäure. Repräsentative Beispiele für Polyole für die Herstellung dieser Polymeren sind Ethylenglykol, 1,3-Propylenglykol, 1,2-Propylenglykol, 1,4-Butylenglykol, 1,3-Butylenglykol, 1,2-Butylenglykol, Buten-1,4-diol, 1,6-Hexandiol,

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Hexen-1,6-diol, 1,7-Heptandiol, Diethylenglykol, Glycerin, Trimethylolpropan, 1,3,6-Hexantriol, Triethanolamin, Pentaerythrit, Sorbit und beliebige andere oben angegebene Polyole.

Typische, für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugte Vorpolymere mit endständigen Isocyanatgruppen sind

(a) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und einem PoIyethylenglykol·

(b) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und einem PoIyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 800 bis 1200 und vorzugsweise von etwa 1000.

(c) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und Ethylenglykol, Diethylenglykol, einem Polyoxyethylenpolyolpolymeren, Pentaerythrit, Glycerin, Trimethylolpropan und einem Polyoxypropylenpolyolpolymeren, vorausgesetzt, daß mindestens 50 Mol% des Gerüstes aus Polyoxyethylen bestehen.

(d) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und einer Mischung aus einem Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 800 bis 1200, vorzugsweise etwa 1000,und Trimethylolpropan, wobei das Trimethylolpropan und das Polyethylenglykol in einem Molverhältnis von etwa

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1:1 bis 4 und das Toluoldiisocyanat in einer Menge von etwa 0,85 bis 1,25 und vorzugsweise von 0,95 bis 1,1 Mol je Äquivalent (17 g) der vom Polyethylenglykol und dem Trimethylolpropan zur Verfügung gestellten -OH-Gruppen eingesetzt wird.

(e) Das Vorpolymere aus Toluoldiisocyanat und Ethylenglykol nach Beispiel 1 der US-Patentschrift 3 929 574.

Die Protein/Vorpolymer-Lösung wird dann in Wasser dispergiert. Vorteilhaft wird sie in genügend Wasser dispergiert und in einer ausreichend geringen Geschwindigkeit, daß die Kettenverlängerung so gering wie möglich gehalten wird. Sonst ist die Dispergierung nicht kritisch, außer, daß gerührt werden sollte, um die Kettenverlängerung bei der Dispergierung so gering wie möglich zu halten. Man hat festgestellt, daß gewöhnlich eine gewisse Kettenverlängerung eintritt und unlösliches Material entsteht, das durch Filtrieren abgetrennt werden kann. Zur Erhöhung der Ausbeute an löslichen Verbindungen sollten entsprechende Dispergierungsbedingungen eingehalten werden. Um die Bildung unlöslichen Materials zu verhindern, bevorzugt man die Verwendung wasserlöslicher hydrophiler Polyurethane mit mindestens 50 Mol% Ethylenoxideinheiten im Gerüst. Das Verhältnis Wasser zu Protein plus flüssigem Polyurethanvorpolymerem mit endständigen Isocyanatgruppen ist nicht kritisch.

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Um die Dispergierung weiter zu erleichtern, kann ein oberflächenaktives Mittel verwendet werden. Die Verwendung oberflächenaktiver Mittel ist üblich. Die einzige Forderung besteht darin, daß das oberflächenaktive Mittel natürlich nicht mit dem Protein reagieren und dadurch dessen biologische Wirkung verringern sollte. Geeignte oberflächenaktive Mittel sind nichtionische Materialien, zum Beispiel die komplexen Gemische aus Polyoxyethylenderxvaten, die unter dem Handelsnamen "Tween" auf dem Markt sind. Brauchbar sind auch die Blockcopolymeren aus Oxyethylen/Oxypropylen, die unter dem Handelsnamen "Pluronic" vertrieben werden. Das oberflächenaktive Mittel kann entweder dem Wasser, oder der Protein/ Vorpolymer-Lösung zugefügt werden.

Bei der Dispergierung der Protein/Polymer-Lösung in Wasser beobachtet man häufig, daß das Protein/Polymer-Reaktionsprodukt in Wasser löslich ist. Dies ist besonders dann der Fall, wenn das Polyurethangerüst eine merkliche Anzahl Oxyethyleneinheiten, zum Beispiel 50 % oder mehr auf Gewichtsbasis enthält. Der vorliegend verwendete Ausdruck "Dispersionen" umfaßt wässrige "Lösungen" des Protein/Polymer-Reaktionsproduktes.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält die proteinhaltige wässrige Dispersion etwa 0,1 bis 50 Gew.% eines aktiven Proteinpräparates auf wasserfreier Basis, das kovalent über

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Ureid-Bindungen an ein in Wasser dispergierbares hydrophiles Poly-(harnstoff-urethan)-polymeres mit einem Oxyalkylengerüst, das mindestens 50 Mol% Oxyethylen enthält, gebunden ist. Das Protein kann ein Enzym, ein Antikörper oder ein Antigen sein.

Für den Fachmann liegen zahlreiche Anwendungszwecke für die wässrigen Proteindispersionen oder -lösungen gemäß der Erfindung, die beständiger sind und eine geringere Antigenwirkung aufweisen, auf der Hand. Unter anderem können sie als Standards oder Kontrollen in Testverfahren angewandt werden, zum Beispiel stabilisierte Glucose-Oxidase für die Bestimmung von Serumglucose, oder stabilisierte Kreatin-Phosphokinase (KPK) als Standard für die Bestimmung von Serum KPK.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In diesen wurde das Urethanvorpolymere durch Vermischen von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 (PEG) mit Trimethylolpropan (TMOP) und Umsetzen der Mischung mit Toluoldiisocyanat (TDI), das die endständigen Isocyanatgruppen zur Verfügung stellt, erhalten. Das Molverhältnis PEG/TMOP/TDI betrug etwa 2/0,66/6,3.

Beispiel 1 An Polyurethan gebundenes Lysozym

Ein in Wasser dispergierbares Lysozym/Polyurethan-Reaktions-

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produkt wurde durch Vermischen von 0,1 g Lysozym und 1,0g des Vorpolymeren hergestellt. Diese Materialien ließ man eine Stunde in einem Exsikkator bei Raumtemperatur (etwa 21⁰C) reagieren.

Die Enzym/Polyurethan-Zusammensetzung wurde langsam zu 500 ml entionisiertem Wasser gegeben, das drei Tropfen eines PoIy-(oxyethylen/oxypropylen) oberflächenaktiven Mittels (Pluronic L-61) enthielt. Während der Zugabe des Wassers wurde heftig gerührt. Nachdem alles zugesetzt war, wurde noch 35 Minuten gerührt. Das gerührte Material trennte sich in zwei Phasen.

Die lösliche Phase wurde durch ein Whatman Nr. 40-Filter filtriert und dann durch ein 0,22 ,um-Filter. Aus der Aktivität gegen Micrococcus lysodeikticus stellte man 50 % der Enzymwirksamkeit in der löslichen Phase fest.

Eine Kontrollprobe wurde dadurch hergestellt, daß man 1,0g Vorpolymeres ohne Enzym wie oben härtete und filtrierte.

Feines Sephadex G-50 ließ man in 0,05 molarem Ammoniumacetatpuffer (pH 7,0) aufquellen und füllte damit eine 2,5 χ 45 cm Glas-Chromatographiersäule auf 2,5 χ 41 cm. Proben wurden mit 0,05 molarem Ammoniumacetatpuffer (pH 7,0) bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 1,35 ml Min." eluiert und in

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4,5 ml Fraktionen gesammelt. Für jede Fraktion wurde die Absorbens bei λ = 280 nm bestimmt. Die Absorbens jeder Probe wurde in Reihe von 60 aus der Säule eluierten Fraktionen gemessen. Die Proben wurden in folgender Weise auf die Säule aufgebracht.

Eine 2,0 ml Probe des löslichen an Polymeres gebundenen Lysozyms wurde auf die Säule aufgebracht und wie oben beschrieben eluiert. Für das lösliche an das Polymere gebundene Lysozym stellte man bei der Fraktion 37 ein Maximum mit der Absorbens 0,1 fest. Das als Kontrolle verwendete freie Polyurethan wies bei der Fraktion 41 ein Maximum mit einer Absorbens von 0,12 auf.

Die Form der Absorbenskurven für das an das Polymere gebundene Enzym und das freie Polymere waren ähnlich und zeigten keine scharfen Maxima wie Dextran und das freie Enzym. Die verhältnismäßig breite Verteilung und das Fehlen eines scharfen Maximums zeigen wahrscheinlich eine breite Verteilung der Polymerkettenlängen im gebundenen Enzym und den freien Polymerproben an.

Eine 2,0 ml-Probe mit einem Gehalt von 1,5 mg freiem Dextran vom Molekulargewicht etwa 2000 und 4 mg freies Lysozym wurden auf die Säule aufgebracht und mit Puffer eluiert. Das Dextran hatte bei der Fraktion 13 ein Maximum mit der Absorbens 0,71 und freies Lysozym bei der Fraktion 30 mit der Absorbens 0,32.

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Beispiel 2 An Polyurethan gebundenes Trypsin

Trypsin wurde unter Bildung eines in Wasser dispergierbaren Produktes an Polyurethan gebunden, indem man 0,1 g Trypsin und 0,9 g des Vorpolymeren mischte und wie im vorhergehenden Beispiel die Mischung langsam zu 500 ml entionisiertem Wasser

Nach dem Filtrieren und Trocknen des unlöslichen Materials in einem Ofen von 45°C wurden 32 % des anfänglichen Materials als unlöslich gewonnen.

Wie im vorhergehenden Beispiel wurde eine Kontrollprobe ohne Enzym hergestellt.

Sephadex G-50 (fein) ließ man in entionisiertem Wasser aufquellen und füllte damit zwei 0,9 χ 60 cm Chromatographiersäulen, die über ein kurzes dünnes Rohr in Reihe zu einer Gesamtkolonnenhöhe von 0,9 χ 120 cm verbunden wurden. Mit entionisiertem Wasser wurden bei 0,3 ml.Min. bei Raumtemperatur Proben eluiert und in 2,7 ml Fraktionen gesammelt. Für jede Fraktion wurde die Absorbens bei λ = 280 nm festgestellt.

Eine 1,0 ml-Probe des löslichen gebundenen Trypsins wurde auf die Säule aufgebracht und mit entionisiertem Wasser eluiert.

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Man stellte zwei Maxima bei 280 nm fest, das kleinere mit der Fraktion 20 und das größere mit der Fraktion 23.

Eine 1,0 ml-Probe der Kontrolle wurde auf die Säule aufgebracht und mit entionisiertem Wasser eluiert, wobei man das kleinere Maximum bei der Fraktion 18 und das größere Maximum bei der Fraktion 21 feststellte.

Eine 1,0 ml Probe, die 2 mg freies Trypsin enthielt, wurde auf die Säule aufgebracht. Sie führte bei der Fraktion 20 zu einem einzigen Maximum.

Für das lösliche gebundene Trypsin wurde ein größeres Absorbensmaximum bei etwa 190 nm und ein kleineres Maximum bei 173 nm festgestellt. Beim freies Trypsin war die Absorbens bei etwa 213 nm. Die Absorbens der Polyurethankontrolle war bei etwa 90 nm (kleineres Maximum) und bei etwa 205 nm (größeres Maximum).

Beispiel 3

Lösliches Reaktionsprodukt aus Rinderserum, Albumin und PoIyurethan

An Polyurethan gebundenes Rinderserumalbumin (RSA) wurde durch Vermischen von 0,1 g RSA mit 0,9 g des Vorpolymeren und Reaktion in einem Exsikkator (um es trocken zu halten) während

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einer Stunde hergestellt. Dieses Material wurde dann langsam zu 200 ml entionisiertem Wasser gegeben. Das Wasser wurde während der Zugabe rasch gerührt. Nach beendeter Zugabe wurde die wässrige Dispersion weitere 35 Minuten gerührt.

Die lösliche Fraktion wurde durch Filtrieren durch ein Whatman Nr. 40-Filter und dann durch ein 0,22 ,um Milliporenfilter abgetrennt. Die Menge an unlöslichen Stoffen (40 %, bezogen auf das vereinigte Gewicht an Enzym und Vorpolymeren!) wurde durch Trocknen des Rückstandes nach dem Filtrieren festgestellt.

Proben des löslichen Materials und äquivalente Mengen an freiem RSA in entionisiertem Wasser wurden auf eine Ampholine PAG-Platte (pH-Bereich 3,5 bis 9,5) auf einer den isoelektrischen Punkt einstellenden LKB-Multiphor-Einheit aufgebracht.

Man führte den Versuch bei 10⁰C durch, bis der pH-Gradient festgestellt war. Die Gelplatte mit den Proben wurde dann zur Sichtbarmachung der Proteine angefärbt.

Freies RSA, das nach den Angaben in der Literatur einen pi = 4,9 hat, führte zu vier feststellbaren Proteinbanden im pH-Bereich 4,8 bis 5,3. Die das RSA/Vorpolymer-Reaktionsprodukt enthaltende Probe erhab eine homogene Bande im pH-Bereich 4,8 bis 5,0.

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Beispiel 4 An Polyurethan gebundene Invertase

250 mg Invertase wurden in 4 g Vorpolymeren! gelöst. Die Lösung wurde langsam zu 300 ml Wasser gegeben, die mit 1000 U/Min.

gerührt wurden. Die erhaltene Dispersion wurde filtriert.

Sowohl die wässrige Phase als auch die feste Phase hatten enzymatische Wirksamkeit.

Freie Invertase wurde in Wasser dispergiert, bis der gleiche Wert an Enzymwirksamkeit erreicht war, wie bei der wässrigen Dispersion. Die beiden wässrigen Dispersionen (mit freiem und mit gebundenem Enzym) wurden 14 Tage bei 10 C aufbewahrt, innerhalb denen die Wirksamkeit beider Dispersionen um etwa 10 % abfiel. Gleichzeitig wurde ein ähnlicher Versuch durchgeführt, wobei man jedoch die Dispersionen bei 40°C aufbewahrte. Nach 14 Tagen hatte das an das Polymere gebundene Enzym noch etwa 4 5 % seiner ursprünglichen Wirksamkeit, während beim freien Enzym nur Spuren an Wirksamkeit von weniger als 5 % der anfänglichen Wirksamkeit ermittelt werden konnten.

Die wässrige Disperion des an das Polymere gebundenen Enzyms war bei 40 C thermisch beständiger als das freie Enzym.

Beispiel 5 An Polyurethan gebundenes Trypsin

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Fällung mit Trichloressigsäure Herstellung von löslichem gebundenen Protein
400 mg Trypsin wurden in 36OO mg Vorpolymerem gelöst, worauf man bei Raumtemperatur in einem Exsikkator eine Stunde reagieren ließ.

Das Reaktionsprodukt wurde dadurch in 2OO ml Wasser dispergiert, daß man kleine Anteile unter raschem Rühren innerhalb von
3Ö Minuten in das Wasser gab.

Unlösliches Produkt wurde durch Filtrieren durch ein Whatman Nr. 40-Filter und anschließend durch ein 0,22 ,um Milliporenfilter entfernt.

Die vereinigten Fällungen aus beiden Filtrationen wurden getrocknet und gewogen. Die Differenz (Gewicht des Reaktionsproduktes abzüglich der Fällungen) ist die Menge an löslichem Material in den erhaltenen 2OO ml klarer Lösung.

Das obige Verfahren wurde mit der Abweichung wiederholt, daß kein Enzym verwendet wurde, das heißt es wurden 3600 mg Vorpolymeres mit 200 ml Wasser umgesetzt. Die erhaltene Polymerlösung diente nach dem Filtrieren als Kontrolle.

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Zwei weitere Kontrollproben wurden wie folgt hergestellt: Die Kontrolle 1 enthielt 6 mg Trypsin gelöst in 10 ml Wasser, während die Kontrolle 2 6 mg Trypsin gelöst in 10 ml der freien Lösung enthielt.

Zu 10 ml jeder der obigen Lösungen wurden 30 ml einer 5 %igen Trichloressigsäurelösung gegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die gebildeten Produkte 30 Minuten mit 17.000 U/Min, zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden abdekantiert und die erhaltenen Fällungen in einem Vakuumofen getrocknet.

Die Gewichte der erhaltenen Fällungen sowie die Menge Material in jeder 10 ml-Lösung vor der Fällung waren wie folgt:

Probe	Menge Material in der Lösung	Protein in der Lösung	Polymeres in der Lösung	Fällung
ohne	72	0	72	2
Kon trolle 1	6	6	0	8
Kon trolle 2	78	6	72	9
löslich gebunden	59	(6)*	(53)*	25

Berechnet aus der bekannten Menge in Lösung (erhalten aus dem Reaktionsprodukt abzüglich der anfänglichen Fällungen) unter Verwendung des Verhältnisses Vorpolymeres/Erizym im Reaktionsgemisch.

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Trichloressigsäure ist ein bekanntes Reagenz für die Fällung von Proteinen, während die obigen Werte zeigen, daß es kein lösliches Polyurethan fällt. Wenn Trichloressigsäure zu löslichen gebundenen Proteinen gegeben wird, fallen die Proteine aus, wobei auch der Teil des löslichen Polyurethans ausgefällt wird, an den die Proteine gebunden sind.

Ähnliche Versuche wurden mit Rinderserumalbumin und Penicillin-Amidase durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

Rinderserumalbumin/Trichloressigsäurefällung

	1	insgesamt	Protein	Polymeres	Fällung	insgesamt	Protein	Polymeres	Fällung
ohne	2	62	0	62	2	62	0	62	0
Kontrolle		8	8	0	11	8	8	0	8
Kontrolle	70	8	62	16	70	8	62	12
löslich gebunden	80	(8)^a	(72)^a	23	77	(7)^a	(70)^a	20
	Penicillin-Amidase/Trichloressigsäurefällung

ohne
Kontrolle	1
Kontrolle	2
löslich gebunden

berechnet wie oben für Trypsin beschrieben

sch:kö

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Claims

UEXKÜLLΛ STOLBERG BESELERSTI'ASSE 4 20OO HAMBURG 52 PATENTANWÄLTE DR. J.-D. FRHR. von UEXKÜLL DR. ULRICH GRAF STOLBERG DIPL-ING. iÜRGEN SUCHANTKE W. R. Grace & Co. 1114 Avenue of the Americas New York, N.Y./V.St.A. (Prio: 10. Dezember 1976 US 749 430 - 14571) Hamburg, 1. Dezember 1977 Mit Polyurethanen modifizierte, in Wasser dispergierbare Proteine und Verfahren zu ihrer Herstellung Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Dispersion oder Lösung von an ein Urethanpolymeres gebundenem Protein, dadurch gekennzeichnet, daß man ein in Wasser mindestens dispergierbares biologisch wirksames Protein und ein in Wasser mindestens dispergierbares flüssiges Polyurethanvorpolymeres mit endständigen Isocyanatgruppen unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen zu einer Lösung umsetzt und diese dann in Wasser dispergiert.

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ORJGfNAL

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die wässrige Dispersion zur Entfernung nicht dispergierten Protein/Polymer-Materials filtriert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein/Polymer-Material wasserlöslich ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorpolymere ein Oxyalkylengerüst aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst aus Oxyethylen-, Oxypropylen- oder Oxybutyleneinheiten und vorzugsweise aus Oxyethyleneinheiten besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Vorpolymere von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 800 bis 1200 ableitet.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorpolymere im Gerüst mindestens 50 Mol% Ethylenoxideinheiten aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorpolymere ein lineares Polyestergerüst aufweist.

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9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Vorpolymere in Gegenwart des Proteins bildet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen entweder mit einem flüssigen Polyol oder mit einem flüssigen Isocyanat vermischt und dann die erhaltene Mischung mit einem flüssigen Isocyanat bzw. einem flüssigen Polyol versetzt, wobei man vorzugsweise 50 bis 100 mg Protein je g Polyol verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erleichterung der Dispergierung ein oberflächenaktives Mittel zusetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protein ein Enzym verwendet.

13. In Wasser dispergierbare Proteinzusammensetzung, im wesentlichen bestehend aus einem Polyurethan mit einem im wesentlichen linearen Polyoxyalkylengerüst bzw. einem im wesentlichen linearen Polyestergerüst, an das über Ureid-Bindungen ein in Wasser dispergierbares biologisch wirksames Protein gebunden ist.

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14. Zusanmensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Lösung oder Dispersion in Wasser vorliegt.

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