CH630931A5 - Verfahren zur immobilisierung von proteinen. - Google Patents

Verfahren zur immobilisierung von proteinen. Download PDF

Info

Publication number
CH630931A5
CH630931A5 CH1399977A CH1399977A CH630931A5 CH 630931 A5 CH630931 A5 CH 630931A5 CH 1399977 A CH1399977 A CH 1399977A CH 1399977 A CH1399977 A CH 1399977A CH 630931 A5 CH630931 A5 CH 630931A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
protein
prepolymer
polyurethane
reaction
tolylene diisocyanate
Prior art date
Application number
CH1399977A
Other languages
English (en)
Inventor
Frank Joseph Hartdegen
Wayne Elliott Swann
Original Assignee
Grace W R & Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US05/743,035 external-priority patent/US4098645A/en
Application filed by Grace W R & Co filed Critical Grace W R & Co
Publication of CH630931A5 publication Critical patent/CH630931A5/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/08—Processes
    • C08G18/10—Prepolymer processes involving reaction of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen in a first reaction step
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
    • C08G18/40—High-molecular-weight compounds
    • C08G18/64—Macromolecular compounds not provided for by groups C08G18/42 - C08G18/63
    • C08G18/6415—Macromolecular compounds not provided for by groups C08G18/42 - C08G18/63 having nitrogen
    • C08G18/6446—Proteins and derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/093—Polyurethanes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polyurethanes Or Polyureas (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft immobilisiertes Protein.
In der DE-Offenlegungschrift 2612138 wurde ein Verfahren zum Immobilisieren von Protein beschrieben, bei dem man in Abwesenheit von Wasser eine Lösung des Proteins in einem endständige Isocyanatgruppen aufweisenden flüssigen Polyurethan-Präpolymeren herstellt und das erhaltene Gemisch durch Zumischen von Wasser verfestigt und verschäumt. Der gewonnene selbsttragende Schaum besteht aus (a) dem immobilisierten Protein und (b) Poly-(harnstoff-ure-than)-anteilen. Das so immobilisierte Protein kann ein Enzym, ein Antikörper oder ein Antigen sein.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass man, sofern man das Protein in einer ausreichend hohen Menge zugibt, das Präpolymer, nachdem man die Lösung aus dem Protein und dem Präpolymeren gebildet hat, einfach sich verfestigen lassen kann und so die Zugabe von Wasser zur Herstellung eines Schaumproduktes nicht notwendig ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Polyurethans ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.
Die im Einzelfall erforderliche Menge an Protein ist ebenso wie die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von der Art des Proteins und auch von der speziellen Form des Präpolymeren. Es lässt sich bisher im voraus noch nicht theoretisch bestimmen, in welcher Weise das Protein mit dem Präpolymeren unter Bildung von Feststoffprodukten reagiert und in welchen Anteilen die Proteine in der Lösung verwendet werden müssen. Jedoch lässt sich durch einfache Vorversuche im Einzelfall dadurch, dass man das jeweilige Protein in sukzessive gesteigerten Anteilen in jeweils gesonderten Einzelansätzen im Präpolymeren löst, für jedes beliebige Protein bestimmen, wann die Feststoffbildung erfolgt, nachdem man das erfindungsgemässe Verfahren kennt und weiss, dass man aus Protein/Präpolymer-Lösungen ohne Zerstörung der biologischen Aktivität des Proteins Feststoffprodukte bilden kann. Die Vorversuche können von jedem Enzymfachmann leicht durchgeführt werden. Wenn einmal bestimmt worden ist, dass man ein spezielles Protein in aktiver Form in der Weise zu immobilisieren wünscht, dass man es an eine Polyurethan-Matrix bindet, so bracht man nur noch Lösungen unter Verwendung von zunehmend grösseren Mengen an Protein als gelöstem Stoff anzusetzen und festzustellen, wann die Verfestigung eintritt
Im allgemeinen beträgt der Anteil an Protein wenigstens 10 Gew.%, gewöhnlich 15 bis 50 Gew.% und vorzugsweise 20 bis 45 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Präpolymeren. Im speziellen Fall, wenn Penicillinamidase, ein für das erfindungsgemässe Verfahren bevorzugt eingesetztes Protein, verwendet wird, steigt die Viskosität der Präpolymerlösung bei Zusatzmengen des Proteins von mehr als etwa 10 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Präpolymeren, stark an, und die Lösung kann nach etwa 60 Minuten nicht mehr gerührt werden. Dagegen lässt sich bei Konzentration unter etwa 5 Gew.% die Lösung noch rühren, und beim Zumischen von Wasser erhält man, wie früher beschrieben, Schaumprodukte.
Als flüssiges Polyurethan-Präpolymer lässt sich beispielsweise ein Präpolymer einsetzen, das durch Reaktion von Toluylendiisocyanat und einem Polyethylenglykol, vorzugsweise mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 800 bis 1200, insbesondere etwa 1000, gewonnen worden ist. Das Präpolymer kann auch aus einem Gemisch aus Polyethylenglykol und Trimethylolpropan mit dem Toluylendiisocyanat gefertigt sein, wobei das Trimethylolpropan und das Polyethylenglykol in einem Molverhältnis von etwa 1:1 bis 4 und das Toluylendiisocyanat in einer Menge von etwa 0,85 bis 1,25, vorzugsweise 0,95 bis 1,1 Mol an Toluylendiisocyanat je Äquivalent (17 g) an -OH-Gruppen aus dem Polyethylenglykol plus dem Trimethylolpropan eingesetzt werden können.
Wahlweise kann das Präpolymer durch Umsetzung von Toluylendiisocyanat und einem Polyoxybutylen-Polyolpo-lymer, Ethylenglykol, Diethylenglykol, einem Polyoxy-ethylen-Polyolpolymer, Pentaerythrit, Glycerin, Trimethylolpropan oder einem Polyoxypropylen-Polyolpolymer hergestellt sein.
Grundsätzlich können im wesentlichen beliebige Di- oder Triisocyanate oder sonstige Polyisocyanate (einschliesslich Gemischen von Polyisoxyanaten) mit aktivem Wasserstoff
2~
5
10
15
20
25
3Û
3S
40
45
50
55
60
65
enthaltenden Komponenten, insbesondere Glykolen, Poly-glykolen, Polyesterpolyolen, Polyätherpolyolen oder sonstigen Polyolen sowie Gemischen von zwei oder mehr solcher Polyole benutzt werden. Einzelheiten hinsichtlich spezieller Isocyanate und Polyole sind aus der DT-OS 2612138 zu entnehmen.
Beim erfindungsgemässen Verfahren arbeitet man bei solchen Temperaturen, bei denen das endständige Isocyanatgruppen aufweisende flüssige Polyurethan-Präpolymere in flüssigem Zustand vorliegt und die unterhalb der Denaturie-rungstemperatur des zu immobilisierenden Proteins gelegen sind. Die Verfestigungstemperatur des eingesetzten flüssigen Polyurethans mit endständigen Isocyanatgruppen ist je nach Molekulargewicht des Präpolymeren und der Struktur der Grundkette des Präpolymeren unterschiedlich.
Die thermische Denaturierungstemperatur von Proteinen liegt generell über etwa 35°C. Jedoch sind einige Proteine während relativ kurzer Zeitspanne (z.B. für 5 bis 30 Minuten oder länger) bei höheren Temperaturen (z.B. bei Temperaturen bis zu etwa 70°C oder noch etwas höher) stabil.
Man kann die Reaktion in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Verdünnungsmittels oder einem Gemisch von Verdünnern durchführen. Damit die Härtungsreaktion nicht beeinträchtigt wird, sollten nur geringe Mengen an Verdünnungsmittel eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft ist es, ohne Verdünnungsmittel zu arbeiten. Es versteht sich, dass nur solche Verdünnungsmittel verwendet werden können, die das Protein nicht denaturieren. Geeignete Verdünnungsmittel sind in der US-PS 3 672 955 beschrieben. Man kann leicht wasserlösliche Flüssigkeiten, z.B. Aceton, in Wasser schwer lösliche Flüssigkeiten, z.B. Methylacetat oder Methylethyl-keton oder auch in Wasser unlösliche Flüssigkeiten, z.B. Benzol, als Verdünner einsetzen.
Die Verdünnungsmittel dienen dazu, die Viskosität (a) des endständige Isocyanatgruppen aufweisenden flüssigen Polyurethan-Präpolymeren und (b) des resultierenden Gemisches zu reduzieren.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zum Binden des Proteins praktisch jedes flüssige Polyurethan-Prä-polymere brauchbar, das wenigstens zwei freie Isocyanatgruppen je Präpolymer-Molekül enthält. Vorteilhaft sind in dem Präpolymeren durchschnittlich zwei Isocyanatgruppen je Molekül vorhanden; es kann auch ein höheres Verhältnis vorliegen, beispielsweise können 2 bis 8 Isocyanatgruppen je Polyurethanmolekül anwesend sein. Man kann zwar mit noch höheren Verhältnissen arbeiten, aber dadurch erreicht man keine weiteren Vorteile. Unter einem endständige Isocyanatgruppen aufweisenden Polyrethan-Präpolymeren, das in der vorliegenden Beschreibung als «flüssiges Polyurethan-Präpolymer» bezeichnet wird, versteht man ein solches Präpolymer, welches: (a) bei 40 bis 70°C eine frei fliessfähige Flüssigkeit ist, oder wenn man es in einem inerten Lösungsmittel löst, eine Lösung bildet, die etwa 1 bis 50 Gew.%, beispielsweise 10 bis 25 Gew.%, an dem endständige Isocyanatgruppen aufweisenden Polyurethan-Präpolymer enthält. Der in dieser Beschreibung benutzte Ausdruck «endständige Isocyanatgruppen aufweisendes flüssiges Polyurethan-Präpolymer» bezeichnet ein flüssiges Polyurethan oder Polyharn-stoffmolekül, das wenigstens etwa zwei freie Isocyanat-gruppe je Molekül hat. Nach guter Durchmischung und innigem Kontakt mit dem Protein wird das Isocyanatgruppen aufweisende Polyurethan-Präpolymer chemisch sehr aktiv. Es wird angenommen, dass einige der freien Isocyanatgruppen des Präpolymeren mit den Aminogruppen des Proteins reagieren; wenn eine ausreichende Menge an Protein vorhanden ist, entsteht bei dieser Reaktion (Bildung einer Harnstoff-Bindung) die Ausbildung und das Anwachsen eines Poly-(harnstoff-urethan)-polymeren, und
3 630931
es bilden sich auch Vernetzungsbindungen zwischen den Polymer-Molekülen aus.
Die Bindung (Protein-Immobilisierung) lässt sich mit (a) reinem kristallinem Protein, (b) teilweise gereinigtem, nicht s kristallinem Protein, (c) nicht gereinigten, getrockneten Extrakten, die Enzym-, Antikörper- oder Antigenaktivität enthalten, und (d) ungereinigten, getrockneten Extrakten aus Fermentationsmutterlauge (z.B. einem durch Acetonausfäl-lung aus der Fermentationsbrühe erhaltenem Produkt) io durchführen. Die Arbeiten der Anmelderin haben gezeigt, dass das erfindungsgemässe Verfahren benutzt werden kann, um Proteine praktisch beliebiger Reinheit (einschliesslich Enzymen, Antikörpern und Antigenen) zu binden (immobilisieren).
15 Es können auch sonstige Zusätze, wie beispielsweise Vernetzungsmittel (Polyamine, Polythiole, Polysäuren), Tenside, Benetzungsmittel, Antischaummittel, Farbstoffe, Antioxy-dantien und Füllstoffe mit verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie den Härtungs vorgang nicht beeinträchtigen. 20 Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren, das einen wirksamen Kontakt zwischen einem Protein und einer anderen Substanz, die mit dem Protein eine biologische Reaktion einzugehen vermag, ermöglicht, wobei das Protein mittels des erfindungsgemässen Verfahrens 25 immobilisiert ist. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren gebundene (immobilisierte) Enzyme sind beispielsweise in der analytischen Chemie für alle Zwecke brauchbar, bei denen bekannte gebundene Enzyme bisher eingesetzt worden sind. Beispielsweise kann Harnstoff bestimmt werden, indem 30 man eine Harnstofflösung durch eine Säule führt, die an Polyurethanschaum gebundene Urease enthält und den Harnstoff quantitativ in Ammoniak unwandelt, der durch Titration oder colorimetrisch bestimmt werden kann. Erfin-dungsgemäss hergestellte gebundene Antigene sind für die 35 Entfernung von Antikörpern aus biologischen Proben brauchbar. Beispielsweise lässt sich gebundenes menschliches Immunoglobulin G (IgG), ein Antigen, für die Entfernung von rheumatischem Arthritisfaktor (einem Antikörper) aus menschlichem Blut benutzen. Erfindungsgemäss herge-40 stellte gebundene Antikörper eignen sich zur Entfernung von Antigenen aus biologischen Proben. Z.B. kann der Antikörper von Hepatitis in erfindungsgemässer Weise an Polyurethan gebunden und der erhaltene gebundene Antikörper zur Entfernung des Hepatitis-Antigens aus dem Blut (z.B. 45 dem Blut in Blutbanken) benutzt werden.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können Enzyme jeglicher Art gebunden werden. Beispiele für solche Enzyme sind: Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen.
so Beispiele für spezifische Enzyme, die erfindungsgemäss immobilisiert (d.h. gebunden) werden können, sind nachstehend zusammengestellt: Urease, Trypsin, Lactase, Glucoseo-xydase, Chymotrypsin, Ribonuclease, Peroxydase, Pepsin, Rennin, Invertase, Papain, Asparaginase, Pektinase, Pekti-55 nesterase, Penicillinamidase, Glucoseisomerase, Lysozym, Aminosäureacylase, Pronase, Alkoholdehydrogenase, a-Amylase, ß-amylase Subtilisin, Aminosäureoxydase, Katalase, Tannase, Phenoloxydase, Glucoamylase, Pullulanase, Cellulase, Ficin, Bromelain, Pankreatin, Isoamylase, Lipase, 60 Apfelsäuredehydrogenase, Hexokinase, Lactatdehydroge-nase, Adenosindeaminase, Uricase, Galactoseoxydase, Dia-phorase, Cholinesterase, Aldolase, Pyruvatcarboxylase, Phospharylase, Cephalosporinamidase, Isozitronensäure-dehydrogenase, a-Glycerinphosphatdehydrogenase, 65 Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Äpfelsäureenzym, Glykose-6-phosphatdehydrogenase, 5-Dehydroshi-kiminreduktase, Glutathionrektase, Glykolsäureoxydase, Hefe-Cytochrom-c-reduktase, Luciferase, Nitritreduktase,
630931
Glutamyltransferase, Glutathionsynthetase, Glycocyamin-phosphokinase, Hippursäuresynthetase, Aldehydoxydase, Bernsteinsäuredehydrogenase, Nitratreduktase, Xanthin-oxydase, Lipoyldehydrogenase, Flavinperoxydase, Glycin-oxydase, Carboxylase, a-Ketosäuredehydrogenase und Transketolase. Bevorzugt wird beim erfindungsgemässen Verfahren als Enzym Penicillinamidase eingesetzt.
Das erfindungsgemäss gebundene Protein kann in einem diskontinuierlichen oder in einem kontinuierlichen System angewandt werden. Ein Beispiel für ein diskontinuierliches Verfahren ist die Hydrolyse von in einem wässrigen System vorliegendem Harnstoff. Bei diesem Verfahren werden ein oder mehrere Stücke von Polyurethan (d.h. selbsttragender Poly-(harnstoff-urethan)-schaum) mit dem daran gebundenen Enzym (Urease) in einen Ansatz mit wässrigem Harnstoff gegeben, der zu Ammoniak hydrolysiert werden soll. Wenn die Hydrolyse vollständig ist, werden die Partikel mit dem gebundenen Enzym aus der hydrolysierten Probe entfernt, gewünschtenfalls gewaschen, und in einen anderen Ansatz mit wässrigem Harnstoff gegeben, der hydrolysiert werden soll. Es ist vorteilhaft, das erfindungsgemäss erhaltene Produkt zu zerkleinern und so die Anzahl an Stellen mit aktivem Protein zu erhöhen.
Es ist vorteilhaft, das erfindungsgemäss gebundene Protein nach der Herstellung zu waschen (vorzugsweise mit Wasser) und so nicht gebundenes Protein zu entfernen und etwa noch vorhandene nicht umgesetzte Isocyanatgruppen zu hydroly-sieren.
Man kann jedoch auch das gebundene Protein in eine Säule einfüllen und zu behandelnde Lösung durch die Säule hindurchleiten. Dazu kann man in vollständig kontinuierlicher Weise, z.B. zwecks Hydrolyse (Umkehrung) einer Saccharoselösung mit gebundener Invertase, oder diskontinuierlich, z.B. zur Bestimmung von Harnstoff durch Hydrolyse einer Mehrzahl von Harnstofflösungen zu Ammoniak mit gebundener Urease und Bestimmung der Menge an Harnstoff in jeder Probe durch Analyse der hydrolysierten Proben (die gepackte Säule verlassende Lösung) auf Ammoniak, arbeiten. Bei Anwendung dieser Methode wird, nachdem jede einzelne Probe die gepackte Säule verlassen hat, die Säule mit Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der hydrolysierten Harnstofflösung (Ammoniaklösung) vereinigt, woraufhin der Ammoniakgehalt der vereinigten Flüs-s sigkeiten bestimmt wird.
Ebenso wiedas gemäss der DE-OS 26 12 138 hergestellte gebundene Protein hat das erfindungsgemäss gewonnene gebundene Protein eine lange Gebrauchsdauer, und es besitzt die gleichen Vorteile.
io In dem nachfolgenden Beispiel wird das erfindungsgemässe Verfahren noch näher erläutert.
Beispiel is 100 mg des wie nachstehend beschrieben hergestellten Präpolymeren, 100 mg Penicillinamidase und 10 mg Penicillin G (Natriumsalz) wurden zu einer Lösung vermischt. Während des Vermischens stieg die Viskosität der Lösung an, und etwa 10 Minuten, nachdem die Reaktionskomponenten mitein-20 ander in Kontakt gebracht worden waren, konnte man die Lösung nicht länger von Hand rühren. Nach 1 Stunde war die Lösung zu einem harten, festen Material geworden. Das Feststoffprodukt wurde zu Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als 840 Mikrometer zerkleinert, vermählen und 2s abgesiebt. Bezogen auf Trockengewicht betrug die Aktivität der Teilchen 1020 Einheiten/g. Die Aktivität wurde definiert als die Mikromole von Penicillin G, die je Minute bei 30°€ und pH 8 gespalten wurden.
Das in diesem Beispiel benutzte, endständige Isocyanat-30 gruppen enthaltende, flüssige Polyurethan-Präpolymer wurde durch Umsetzung von 31g Glycerin mit einer so ausreichenden Menge an Ethylenoxid gewonnen, dass 500 g eines Zwischenproduktes (eine Hydroxylendgruppen aufweisenden Polyäthers) mit einem Äquivalentgewicht von etwa 35 500 (d.h. es waren darin etwa 17 g an -OH-Gruppen je 500 g an Zwischenprodukt enthalten) gebildet wurden. Dieses Zwischenprodukt wurde mit handelsüblichem Toluylendiisocyanat umgesetzt, und dazu wurden 1,05 Mole an Toluylendiisocyanat je 500 g des Zwischenproduktes verwendet.
B

Claims (10)

630931 PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Polyurethans, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem flüssigen Urethan-Präpolymer mit endständigen Isocyanat-gruppen biologisch aktives Protein in einer zur Verfestigung des Polyurethans ausreichenden Menge löst, die Lösung in Abwesenheit von Wasser sich verfestigen lässt und ein festes, das Protein in aktiver Form gebunden enthaltendes Polyurethanprodukt gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Protein ein Enzym, einen Antikörper oder ein Antigen verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Protein Penicillinamidase verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Protein in einer Menge von wenigstens 10 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Präpolymeren, verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man ein flüssiges, endständige Isocya-natgruppen enthaltendes Polyurethan-Präpolymer verwendet, das mittels Reaktion von Toluylendiisocyanat und einem Polyethylenglykol hergestellt worden ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein flüssiges, Isocyanatendgruppen aufweisendes Polyurethan-Präpolymer verwendet, das mittels Reaktion von Toluylendiisocyanat mit einem Gemisch aus ein Molekulargewicht von 800 bis 1200 aufweisendem Polyethylenglykol und Trimethylolpropan hergestellt worden ist, wobei das Tri-methylolpropan und das Polyethylenglykol in einem Molverhältnis von 1:1 bis 1:4 und das Toluylendiisocyanat in einer Menge von 0,85 bis 1,25 Mol je Äquivalent an aus dem Polyethylenglykol plus dem Trimethylolpropan stammenden -OH-Gruppen vorhanden waren.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Isocyanatendgruppen aufweisendes flüssiges Urethan-Präpolymer verwendet wird, das durch Reaktion von Toluylendiisocyanat mit Polyoxybutylenpo-lyol, Ethylenglykol, Diethylenglykol, einem Polyoxyethylen-polyolpolymer, Pentaerythrit, Glycerin, Trimethylolpropan oder einem Polyoxypropylenpolyol hergestellt worden ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das immobilisierte Protein zwecks Entfernung von nicht gebundenem Protein und zwecks Hydrolyse von nicht umgesetzten Isocyanatgruppen wäscht.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das resultierende biologisch aktive Polyurethan zerkleinert.
10. Verwendung des nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellten gebundenen Proteins als Reaktionskomponente für eine andere Substanz, die mit dem Protein eine bilogische Reaktion einzugehen vermag.
CH1399977A 1976-11-18 1977-11-16 Verfahren zur immobilisierung von proteinen. CH630931A5 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/743,035 US4098645A (en) 1976-02-24 1976-11-18 Immobilization of proteins with polyurethane polymers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CH630931A5 true CH630931A5 (de) 1982-07-15

Family

ID=24987257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CH1399977A CH630931A5 (de) 1976-11-18 1977-11-16 Verfahren zur immobilisierung von proteinen.

Country Status (11)

Country Link
US (1) US4094744A (de)
JP (1) JPS5366491A (de)
AT (1) AT362494B (de)
BE (1) BE860941R (de)
CA (1) CA1106300A (de)
CH (1) CH630931A5 (de)
DE (1) DE2750803A1 (de)
FR (1) FR2371470B2 (de)
GB (1) GB1542009A (de)
IT (1) IT1088809B (de)
NL (1) NL7712661A (de)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237229A (en) * 1975-06-10 1980-12-02 W. R. Grace & Co. Immobilization of biological material with polyurethane polymers
US4371611A (en) * 1978-08-07 1983-02-01 W. R. Grace & Co. Enzymatic diagnostic composition
US4226935A (en) * 1978-08-07 1980-10-07 W. R. Grace & Co. Enzymatic diagnostic composition
US4732851A (en) * 1982-03-16 1988-03-22 Purification Engineering, Inc. Immobilization of cells with a polyazetidine prepolymer
US4530905A (en) * 1984-10-25 1985-07-23 The Dow Chemical Company Crosslinked gelatin foams
DE3705687A1 (de) * 1987-02-23 1988-09-01 Boehringer Mannheim Gmbh Polyurethanmodifizierte enzyme
US4962033A (en) * 1987-12-09 1990-10-09 In Vitro Scientific Products Roller bottle method of culturing cells
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK61488D0 (da) * 1988-02-05 1988-02-05 Novo Industri As Fremgangsmaade
JPH027652U (de) * 1988-06-29 1990-01-18
US4940737A (en) * 1988-11-02 1990-07-10 W. R. Grace & Co.-Conn Chemically modified hydrophilic prepolymers and polymers
US5091176A (en) * 1988-11-02 1992-02-25 W. R. Grace & Co.-Conn. Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities
JP2896580B2 (ja) * 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
EP0453621A1 (de) * 1990-04-28 1991-10-30 W.R. Grace & Co.-Conn. Polymermodifizierte Arzneimittel mit verbesserter biologischer und pharmakologischer Wirksamkeit
US5403750A (en) * 1991-03-06 1995-04-04 W. R. Grace & Co.-Conn. Biocompatible, low protein adsorption affinity matrix
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
IT1247946B (it) * 1991-05-17 1995-01-05 Instrumentation Lab Srl Stabilizzazione in forma liquida dell'enzima urato ossidasi
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5981719A (en) * 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
DE19541658A1 (de) * 1995-11-08 1997-05-15 Basf Ag Wasserlösliche oder wasserdispergierbare Pfropfpolymere, ihre Herstellung und ihre Verwendung
US9828597B2 (en) * 2006-11-22 2017-11-28 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Biofunctional materials
US20080242822A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-02 West Richard A Polyurethane formulation using protein-based material
US8252571B2 (en) * 2009-05-01 2012-08-28 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Preparation of solvent-borne polymeric bioactive coatings
US8679825B2 (en) 2009-05-01 2014-03-25 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Method facilitating removal of bioorganic stains from surfaces
IT1396613B1 (it) * 2009-11-19 2012-12-14 Stazione Sperimentale Per La Seta Processo per la preparazione di nanodispersioni acquose di prepolimeri uretanici.
US8394618B2 (en) 2010-06-21 2013-03-12 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Lipase-containing polymeric coatings for the facilitated removal of fingerprints
US11015149B2 (en) 2010-06-21 2021-05-25 Toyota Motor Corporation Methods of facilitating removal of a fingerprint
US9121016B2 (en) 2011-09-09 2015-09-01 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains
US8796009B2 (en) 2010-06-21 2014-08-05 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains
US10988714B2 (en) 2010-06-21 2021-04-27 Regents Of The University Of Minnesota Methods of facilitating removal of a fingerprint from a substrate or a coating
US9388370B2 (en) 2010-06-21 2016-07-12 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Thermolysin-like protease for cleaning insect body stains

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1227855B (de) * 1960-07-12 1966-11-03 Ichthyol Ges Verfahren zur Herstellung von Enzymkoerpern fuer die Durchfuehrung enzymatischer Reaktionen
US3672955A (en) * 1970-05-20 1972-06-27 Us Agriculture Preparation of an insoluble active enzyme
CA1042600A (en) * 1972-05-03 1978-11-14 Louis L. Wood Crosslinked hydrophilic polyurethane foams
DE2413137A1 (de) * 1974-03-19 1975-10-16 Boehringer Mannheim Gmbh Enzymatisch aktiver schaumstoff und verfahren zu seiner herstellung

Also Published As

Publication number Publication date
FR2371470A2 (fr) 1978-06-16
IT1088809B (it) 1985-06-10
NL7712661A (nl) 1978-05-22
ATA819377A (de) 1980-10-15
BE860941R (fr) 1978-03-16
US4094744A (en) 1978-06-13
DE2750803A1 (de) 1978-05-24
FR2371470B2 (fr) 1985-05-17
CA1106300A (en) 1981-08-04
AT362494B (de) 1981-05-25
JPS5366491A (en) 1978-06-13
GB1542009A (en) 1979-03-14
JPS6339232B2 (de) 1988-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CH630931A5 (de) Verfahren zur immobilisierung von proteinen.
US4098645A (en) Immobilization of proteins with polyurethane polymers
EP0008100B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines makroporösen polymeren Trägermaterials zur kovalenten Bindung von Proteinen
DE2365854C2 (de) Katalysator für biochemische Umsetzungen
US4266029A (en) Enzyme immobilization
Vorlop et al. Entrapment of microbial cells within polyurethane hydrogel beads with the advantage of low toxicity
DE3520001C2 (de) Verfahren zur Herstellung immobilisierter Mikroorganismen oder Enzyme
US3905923A (en) Poly (urea-urethane) foams containing immobilized active enzymes
DE2423831A1 (de) Verfahren zur aktivierung von kohlehydraten fuer die umsetzung mit proteinen
IE43057B1 (en) Improvements in or relating to immbilization of biologically active substances
CH640882A5 (de) Verfahren zur immobilisierung eines intrazellulaeren enzyms.
DE2625471C2 (de)
US4089746A (en) Method for insolubilizing enzymes on chitosan
DE2345186A1 (de) Neue enzymaufbereitung, sowie verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
EP0097281B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen Biokatalysators
DE2612138C2 (de) Verfahren zur Herstellung von gebundenes Protein enthaltendem Polyurethanschaum
DE2410693A1 (de) Verfahren zum immobilisieren von enzymen
DE2755053C2 (de)
EP0280212B1 (de) Polyurethanmodifizierte Enzyme
DE2413694A1 (de) Fixiertes enzympraeparat
DE2413137A1 (de) Enzymatisch aktiver schaumstoff und verfahren zu seiner herstellung
DE2605797A1 (de) Immobilisiertes enzym und verfahren zu dessen herstellung
JPH04341183A (ja) 化学修飾セルラ−ゼ
AT343085B (de) Katalysator fur biochemische reaktionen und verfahren zu seiner herstellung
US4113567A (en) Insolubilization of enzymes on modified phenolic polymers

Legal Events

Date Code Title Description
PFA Name/firm changed

Owner name: W. R. GRACE & CO.-CONN. (A CONNECTICUT CORP.)

PL Patent ceased