DE2605797A1 - Immobilisiertes enzym und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Description

Priorität: 18.Februar 1975 in USA Serial No.: 550 898

Es ist bekannt, daß Enzyme, die Proteinnatur haben und gewöhnlich wasserlöslich sind, biologische Katalysatoren umfassen, die dazu dienen, viele und unterschiedliche chemische Reaktionen zu regulieren, die in lebenden Organismen auftreten. Die Enzyme können auch isoliert und auf analytischen, medizinischen und industriellen Anwendungsgebieten verwendet werden. Beispielsweise finden sie Verwendung in industrieller Anwendung bei der Herstellung von Lebensmittelprodukten, wie Käse oder Brot, und außerdem werden sie bei der Herstellung alkoholischer Getränke verwendet. Einige spezielle Anwendungen in der Industrie sind beispielsweise die Verwendung von Enzymen zur Auftrennung

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von Aminosäuren, bei der Modifizierung von Penicillin unter Bildung verschiedener Substrate derselben, die Verwendung verschiedener Proteasen bei der Käseherstellung, beim Zartnachen von Fleisch, für Detergenspräparate, bei der Lederherstellung und als Verdauungshilfen, die Verwendung von Carbo hydrasen bei der Stärkehydrolyse, bei der Rohrzuckerinversion, bei der Glukoseisomerisierung usw., die Verwendung von Nucleasen bei der Gerucheinstellung oder die Verwendung von Oxidasen für die Oxidationsverhinderung und Farbeinstellung von Nahrungsmitteln. Diese Verwendungen sowie viele andere sind in der Literatur ausführlich beschrieben.

Wie oben ausgeführt wurde, sind Enzyme, da sie gewöhnlich wasserlöslich und allgemein instabil und leicht deaktivierbar sind, auch schwierig aus den Lösungen, in welchen sie benützt werden, für eine nachfolgende Wiederverwendung zu isolieren, bzw. es ist schwierig, ihre katalytische Aktivität über relativ lange Zeiträume zu erhalten. Diese Schwierigkeiten führen natürlich zu erhöhten Kosten bei der Verwendung von Enzymen für gewerbliche Zwecke infolge des Erfordernisses, dieses Enzym häufig zu ersetzen, wobei ein solcher Ersatz gewöhnlich mit jeder Anwendung erforderlich ist. Um den hohen Kosten eines Ersatzes oder Austausches entgegenzuwirken, wurde vorgeschlagen, die Enzyme vor ihrer Verwendung zu immobilisieren bzw. unlöslich zu machen. Durch eine Immobilisierung bzw .Trägerfixierung der Enzyme durch verschiedene Systeme, die nachfolgend im einzeln noch erläutert werden, ist es möglich, die Enzyme relativ zu stabilisieren und daher die Wiederverwendung

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des Enzyms zu ermöglichen, das sonst einer Deaktivierung unterliegen oder in dem Reaktionsmedium verlorengehen würde. Solche immobilisierten bzw. trägerfixierten oder unlöslich gemachten Enzyme können in verschiedenen Reaktorsystemen verwendet werden, wie ingepackten Säulen, gerührten Behälterreaktoren usw., je nach der Natur des Substrates, das darin benützt wird. Im allgemeinen liefert die Immobilisierung der Enzyme eine günstigere oder breite UmgebungsStabilität, ein Minimum an Auslaufproblemen und Haterialbehandlung sowie die Möglichkeit, die Aktivität des Enzyms selbst aufzubessern.

Wie oben ausgeführt wurde, sind verschiedene allgemeine Methoden sowie zahlreiche Modifikationen derselben beschrieben, durch welche die Immobilisierung von Enzymen erreicht werden kann. Eine allgemeine Methode besteht darin, das Enzym auf einer festen Oberfläche zu adsorbieren, wie beispielsweise, wenn ein Enzym, wie Aminosäureacylase, auf einem Cellulosederivat, wie DEAE-Cellulose adsorbiert wird, Papain oder Ribonuclease auf porösem Glas adsorbiert wird, Katalase auf Aktivkohle adsorbiert wird, Trypsin auf Quarzglas oder Cellulose adsorbiert v/ird und Chymotrypsin auf Kaolinit adsorbiert wird. Eine andere allgemeine Methode besteht darin, ein Enzym in einem Gelgitter einzuschließen, indem man beispielsweise Glucoseoxidase, Urease oder Papain in ein Polyacrylamidgel einschließt, Acetylcholinesterase in ein Stärkegel oder ein Siliconpolymer einschließt, Glutaminsäure-pyruvsäuretransaminase in ein Polyamid- oder Celluloseacetatgel einschließt oder ähnliches. Eine weitere allgemeine Methode ist die Ver-

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netzung mit Hilfe bifunktioneller Reagentien und kann in Kombination mit jeder der oben erwähnten allgemeinen Immobilisier ungsmethoden ausgeführt werden. Bei der Anwendung dieser Methode binden bifunktionelle oder polyfunktionelle Reagentien, die eine intermolekulare Vernetzung induzieren können, kovalent die Enzyme aneinander sowie an den festen Träger, Diese Methode ist beispielhalber durch die Verwendung von Glutardialdehyd oder Bisdiazobenzidin-2,2'-disulfonsäure zur Bindung eines Enzyms, wie Papain, an einen festen Träger zu erläutern. Eine weitere Methode zur Immobilisierung eines Enzyms besteht in einer kovalenten Bindung, bei der Enzyme, wie Glucoamylase, Trypsin, Papain, Pronase, Amylase, Glucoseoxidase, Pepsin, Rennin, Pilzprotease, Lactase usw., durch kovalente Bindung an ein polymeres Material gebunden werden, welches seinerseits an einen organischen oder anorganischen festen porösen Träger gebunden wird. Diese Methode kann auch mit den oben erwähnten Immobilisierungsverfahren kombiniert werden.

Die oben aufgezählten Methoden zur Immobilisierung von Enzymen besitzen alle einige Nachteile, die gegen ihre Verwendung in industriellen Verfahren sprechen. Wenn beispielsweise ein Enzym direkt auf der Oberfläche eines Trägers adsorbiert wird, sind die Bindungskräfte, die zwischen dem Enzym und dem Träger auftreten, oftmals recht schwach, obwohl einige Literaturstellen sagen, daß ein relativ stabiler Verbund dieses Typs erreicht wurde, wenn die Porengröße des Trägers und der Drehungsdurchmesser (Spindurchmesser) des Enzyms in Wechselbeziehung zueinander gebracht werden. Die Porengröße des Trägers kann

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jedoch einen Durchmesser von etwa 1000 A nicht überschreiten. Im Hinblick auf diese schwache Bindung wird das Enzym oftmals leicht in Gegenwart von Lösungen des zu behandelnden Substrates desorbiert. Außerdem kann das Enzym teilweise oder sehr stark infolge des Fehlens einer Mobilität oder infolge einer Wechselwirkung zwischen dem Träger und den aktiven Stellen des Enzyms deaktiviert v/erden. Ein anderes Verfahren, das angewendet werden kann, ist der Einschluß von Enzymen in Gelgitter, v/as durch Polymerisieren einer wäßrigen Lösung oder Emulsion, die die monomere Form des Polymers und das Enzym enthält, oder durch Einarbeitung des Enzyms in das vorgeformte Polymer nach verschiedenen Methoden, oftmals in Gegenwart eines Vernetzungsmittels, erreicht werden kann. Obwohl diese Methode einer Trägerfixierung oder Immobilisierung von Enzymen einen Vorteil hat, indem die zur Erreichung des Einschlusses benützten Reaktionsbedingungen gewöhnlich so mild sind, daß oftmals nur eine geringe Änderung oder Deaktivierung des Enzyms eintritt, hat diese Methode auch Nachteile, da der Verbund schlechte mechanische Festigkeit hat,

die bei einer Verwendung in Säulen mit kontinuierlichen Fließsystemen zu einer Verdichtung führt, was seinerseits eine Verstopfung der Säule nach sich zieht. Solche Systeme haben auch ziemlich weite Veränderungen der Porengröße und führen so zu Porengrößen, die groß genug sind, um den Verlust von Enzym zu erlauben. Außerdem können einige Porengrößen auch so klein sein, daß große Diffusionshindernisse für den Transport des Substrats und Produktes zu einer Reaktionsverzögerung führen, und dies trifft besonders dann zu, wenn man ein Substrat mit hohem MoIe-

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kulargewicht verwendet. Die Nachteile, die bei der Immobilisierung eines Enzyms durch intermolekulare Vernetzung auftreten, wie oben bereits erwähnt wurde, beruhen auf dem Mobilitätsmangel mit daraus resultierender Deaktivierung infolge der Unfähigkeit des Enzyms, die für maximale Aktivität erforderliche natürliche Konfiguration einzunehmen, besonders wenn die aktive Stellung in die Bindung einbezogen ist.

Methoden kovalenter Bindung erwiesen sich als breit anwendbar und können entweder als die einzige Iirinobilisierungsmethode oder als ein Bestandteil vieler der bereits beschriebenen Methoden, in denen Vernetzungsreaktionen angewendet werden, benützt werden. Diese Methode wird oftmals dazu verwendet, das Enzym sowie den Träger über ein bifunktionelles intermediäres Molekül zu binden, in welchem die funktionellen Gruppen des Moleküls, wie beispielsweise ."-Aminopropyltriäthoxysilan, in der Lage sind, mit funktionellen Resten zu reagieren, die sowohl in dem Enzym als auch in einem organischen oder anorganischen porösen Träger vorhanden sind. Eine große Vielzahl von Reagentien und Trägern wurde auf diese Weise verwendet, und die Methode hat den Vorteil, daß sie in dem zusammengesetzten Produkt starke kovalente Bindungen und in vielen Fällen große Aktivität schafft. Die kovalente Bindung des Enzyms an den Träger muß über funktioneile Gruppen an dem Enzym erreicht werden, die ihrerseits nicht wesentlich für seine katalytische Aktivität sind, wie freie Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, phenolische Gruppen, Sulfhydrylgruppen usw. Diese funktionellen Gruppen reagieren auch mit einer großen Vielzahl anderer funktio-

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neller Gruppen/ wie einerAldehydogruppe, Isocyanatogruppe, Acylgruppe, Diazogruppe, Azidogruppe, Anhydrogruppe, aktivierten Estergruppe usw., um kovalente Bindungen zu bilden. Dessen ungeachtet, hat diese Methode oftmals auch zahlreiche Nachteile, da sie teure Reaktanten und Lösungsmittel einschließt und sehr spezielle und kostspielige poröse Träger und umständliche mehrstufige Verfahren verwendet, die das Herstellungsverfahren für gewerbliche Zwecke unwirtschaftlich machen.

Nach dem Stand der Technik gibt es daher viele Methoden zur Immobilisierung von Enzymen, doch erfüllen diese in verschiedenerlei Hinsicht nicht die Erfordernisse industrieller Anwendung. Wie nachfolgend noch im einzelnen diskutiert wird, umfaßt keine der bekannten Zusammensetzungen jene nach der vorliegenden Erfindung. Diese bestehen aus einem anorganischen porösen Träger, der ein polymeres Material natürlichen oder synthetischen Ursprungs, das in situ aus einem Monomer oder vorgeformten Polymer gebildet wurde, enthält, wobei dieses polymere Material in den Poren des Trägers eingeschlossen und teilweise adsorbiert ist und funktioneile am Polymergerüst hängende, sich von dort aus erstreckende Gruppen enthält. Das Enzym ist erfindungsgemäß teilv/eise an das Grundmaterial adsorbiert und auch kovalent an die aktiven Stellen an den Endabschnitten der am Polymergerüst hängenden Gruppen oder in der Nähe dieser Endabschnitte gebunden, so daß das Enzym Bewegungsfreiheit bekommt, welche es ihm erlaubt, seine maximale Aktivität auszuüben. Beispielsweise betrifft die US-PS 3 556 945 trägerfixierte Enzyme, bei denen das Enzym direkt an

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einem anorganischen Träger, wie Glas, adsorbiert ist. Die US-PS 3 519 538 befaßt sich mit trägerfixierten Enzymen, bei denen die Enzyme chemisch über ein intermediäres Silankupplungsmittel an einen anorganischen Träger gebunden sind. In ähnlicher Weise benützt auch die US-PS 3 783 101 eine Organosilanzusammensetzung als Bindemittel, wobei das Enzym kovalent an einen Glasträger mit Hilfe eines Silanzwischenbindemittels gebunden ist, der Siliciumanteil des Kupplungsmittels an den Träger gebunden ist, während der organische Anteil des Kupplungsmittels an das Enzym gebunden ist, und die Zusammensetzung ein Metalloxid auf der Oberfläche des Trägers zwischen c om Träger und dem Siliciumanteil des Kupplungsmittels enthält. In der US-PS 3 821 083 ist der inerte Träger mit einem vorgeformten Polymer, wie Polyacrolein, überzogen, an das ein Enzym gebunden ist. Nach den meisten Beispielen in dieser Patentschrift ist es jedoch erforderlich, zunächst die Zusammensetzung sauer zu hydrousieren, bevor das Enzym auf dem Polymer abgelagert wird. Ein anderer Stand der Technik, die US-PS 3 705 084, beschreibt einen macroporösen Enzymreaktor, worin ein Enzym auf der Polymeroberfläche eines macroporösen Reaktorkernes adsorbiert und danach an seiner Stelle vernetzt wird. Durch Vernetzung der Enzyme auf der Polymeroberfläche nach ihrer Adsorption wird das Enzym teilweise weiter immobilisiert und kann nicht frei wie in seinem natürlichen Zustand als Katalysator wirken. Die Vernetzung von Enzymen vernetzt sie im Effekt miteinander und verhindert dadurch eine freie Bewegung des Enzyms und vermindert die Mobilität des Enzyms, v/elche ein notwendiges Erfordernis für maximale Aktivität ist.

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Die Erfindung betrifft nun neue Zusammensetzungen, die trägerfixiertes immobilisiertes Enzym umfassen. Spezieller befaßt sich die Erfindung mit neuen Zusammensetzungen, die einen immobilisierten Enzymverbund umfassen, der ein organischanorganisches Grundmaterial enthält, welches seinerseits aus einem anorganischen porösen Trägermaterial besteht, das ein organisches Polymermaterial enthält, welches in situ aus einem Monomer, hydrolysierten Polymer oder vorgeformten Polymer synthetischen oder natürlichen Ursprungs durch Umsetzung mit einem geeignete reaktive Reste enthaltenden bifunktionellen Monomer gebildet wurde. Dieses Polymermaterial ist in den Poren des oben erwähnten Trägermaterials eingeschlossen und adsorbiert und besitzt außerdem am Polymergerüst hängende und sich von diesem aus erstreckende Gruppen mit funktionellen Resten, wobei die funktionellen Reste in den Endbereichen dieser Gruppen oder nahe diesen Fndbereichen liegen. Ein Enzym ist kovalent an diese Gruppen mit funktionellen Resten gebunden und außerdem teilweise an dem organisch-anorganischen Grundmaterial adsorbiert.

Wie oben ausgeführt wurde, kann die Verwendung von Enzymen in analytischen, medizinischen oder industriellen Anwendungsbereichen stark verbessert v/erden, wenn diese Enzyme sich in einem immobilisierten oder trägerfixierten Zustand befinden, d.h., wenn diese Enzyme sich durch Kombination mit anderen festen Materialien selbst in einem solchen Zustand befinden, in dem sie nicht wasserlöslich sind und daher wiederholt verwendet werden können, wobei die katalytische Aktivität des Enzyms erhalten bleibt. Um in einem immobilisierten Zustand vorzuliegen, müssen

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die Enzyme in irgendeiner Weise ar einen wasserunlöslichen Träger gebunden werden, so daß sie dadurch in einem nichtwasserlöslichen Zustand industriell verwendet werden können.

Es ist somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Zusammensetzungen zu erhalten, in welchen Enzyme in einem immobilisierten oder trägerfixierten Zustand vorliegen. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Zusammensetzungen zu erhalten, in welchen ein Enzym an einem organisch-anorganischen Grundmaterial adsorbiert und gleichzeitig an funktionalisierte, an dem Grundmaterial hängende Gruppen kovalent gebunden ist, v/obei dieses Grundmaterial seinerseits in den Poren des anorganischen porösen Trägermaterials adsorbiert und eingeschlossen ist.

Nach einem Aspekt betrifft eine Ausführungsform dieser Erfindung einen immobilisierten Enzymverbund, und dieser umfaßt ein kombiniertes organisch-anorganisches Grundmaterial aus einem anorganischen porösen Träger, der in den Poren des Trägers adsorbiert und eingeschlossen ein organisches Polymermaterial enthält, v/obei das Polymermaterial daran hängende Gruppen mit funktioneilen Resten enthält, sowie ein Enzym, das an das Grundmaterial adsorbiert und an die funktioneilen Reste der an dem organischen Polymermaterial hängenden Gruppen in deren Endbereichen oder in der Mähe derselben kovalent gebunden ist.

Eine spezielle Ausführungsform dieser Erfindung betrifft einen immobilisierten Enzymverbund, der ein organisch-anorganisches Grundmaterial aus einem porösen Kieselsäure-Tonerdeträger mit

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niedrigem Schüttgewicht und mit relativ großer Oberfläche, das auch anorganische Zusatzstoffe enthalten kann, sowie ein in situ hergestelltes Tetraäthylenpentamin-Glutaraldehyd^ Polymermaterial, das in den Poren des Kieselsäure-Tonerdeträgers adsorbiert und eingeschlossen ist, und schließlich ein Enzym, das Glucoamylase umfaßt, welche kovalent an die an dem Polymermaterial hängenden Glutaraldehydgruppen im Endbereich dieser Gruppen oder nahe derselben gebunden und außerdem teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert ist.

Andere Zielsetzungen und Ausführungsformen finden sich in der detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung.

Wie oben ausgeführt, befaßt sich die vorliegende Erfindung mit immobilisierten Enzymverbundpräparaten, die ein kombiniertes organisch-anorganisches Grundmaterial aus einem anorganischen porösen Trägermaterial mit in den Poren des anorganischen porösen Trägermaterials adsorbiertem und eingeschlossenem organischem Polymermaterial umfassen. Außerdem enthält das Polymermaterial daran hängende Gruppen mit an diese Gruppen in ihrem Endbereich oder nahe demselben gebundenem Enzym, und außerdem ist dieses Enzym auch teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert. Im Gegensatz zu den Zusammensetzungen, die immobilisierte Enzyme nach dem Stand der Technik enthalten, können die Zusammensetzungen nach der Erfindung unter Verwendung relativ billiger Reaktanten sowie unter Benützung einfacherer Stufen in dem Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung gewonnen v/erden. Außerdem ist die mechanische Festigkeit und

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die Stabilität der Enzymverbundpräparate nach der vorliegenden Erfindung größer als diejenige, die immobilierte Enzyme nach dem Stand der Technik besaßen. Daher ist leicht ersichtlich, daß die Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung wirtschaftliche Vorteile besitzen, die sie für industrielle Anwendung brauchbar machen.

Die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung kann in relativ einfacher Weise hergestellt v/erden. Bei der bevorzugten Herstellungsmethode wird das anorganische poröse Trägermaterial mit einer Lösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung, eines bi- oder polyfunktionellen Monomers, eines Polymerhydrolysats oder eines vorgeformten Polymers behandelt, wonach die nichtadsorbierte Lösung in an sich bekannter Weise entfernt wird; wie durch Ablaufenlassen. Es können auch andere billige organische Lösungsmittel, wie Aceton, Tetrahydrofuran oder dergleichen, als Träger für die oben erv/ähnten Monomere od^f Polymere verwendet werden. Nach der Entfernung der nichtadsorbierten Lösung wird dann der feuchte poröse Träger mit einem relativ großen Überschuß von 5 bis 20 Mol-% eines zweiten bifunktionellen Monomers behandelt, in welchem die reaktiven Gruppen vorzugsweise durch eine Kette mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen voneinander getrennt sind, wobei dieses zweite bifunktionelle Monomer ebenfalls in einer wäßrigen Lösung zugegeben wird. Dabei bildet sich ein polymeres Grundmaterial, das in den Poren des Trägers adsorbiert und eingeschlossen wird und von dem aus sich am Polymergrundgerüst hängende Gruppen des zweiten Monomers erstrecken. Diese Gruppen enthalten funktionelle Reste infolge der Tatsache, daß eine überschüssige Menge des zweiten

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bifunktionellen Monomers bei der Behandlung des Trägers verwendet wurde. Die unuiugesetzten funktioneilen Reste sind dann für kovalente Bindungen an das Enzym verfügbar, das zu dem resultierenden organisch-anorganischen Grundmaterial zugesetzt wird, und zwar wiederum gewöhnlich in einer v/äßrigen Lösung. Nach Entfernung der unumgesetzten Materialien, wie durch Behandlung, durch Waschen usw., ist das Enzym nicht nur kovalent an die am Polymer hängenden Gruppen mit funktioneilen Resten in deren Endbereichen oder nahe derselben gebunden, sondern ist teilweise auch an das Grundmaterial adsorbiert. Es ist daher leicht ersichtlich, daß das gesamte Immobilisierungsverfahren in einfacher und billiger Weise unter Benützung wäßriger bzw. billiger Lösungsmittelmedien durchgeführt v/erden kann, wobei das Verfahren über einen Temperaturunterschied durchgeführt wird, der im Bereich von unterhalb Umgebungstemperatur (etwa 5°C) bis zu erhöhten Temperaturen von etwa 60 C liegen kann und vorzugsweise bei Umgebungstemperatur (etwa bis 25 C) liegt. Dieses Verfahren wird unter Benützung einer minimalen Zahl von Verfahrensstufen durchgeführt und gestattet außerdem eine leichte Entfernung der überschüssigen Reaktionspartner und der fertigen Zusammensetzung.

Viele der anorganischen Träger, die im Stand der Technik beschrieben sind, sind Materialien mit "kontrollierter Porengröße", wie Glas, Tonerde usw., mit einen Porendurchmesser von 500 bis 700 A für etwa 96 % des Materials und mit einem maximalen Porendurchmesser von 1000 A, einer Oberfläche von

40 bis 70 m /g und Teilchengrößen von 40 bis 80 Maschen

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(US-Siebreihe). Außerdem können diese Träger mit Metalloxiden, wie Zirkonoxid und Titandioxid, überzogen sein, um größere Stabilität zu erreichen. Im Gegensatz zu diesen Trägern liegt es im Erfindungsgedanken, daß die anorganischen porösen Träger, die hier benützt v/erden, Materialien sind, die Porendurchmesser im Bereich von 100 A bis zu 55 000 A besitzen, wobei so viel wie 25 bis 60 % des porösen Trägermaterials Poren mit Durchmessern oberhalb 20 000 A besitzen und die Oberfläche im Bereich

von 150 bis 200 m /g liegt. Die Teilchengröße kann auch über einen weiten Bereich von 10 bis 20 Maschen bis zu einem feinen Pulver variieren, wobei diese Teilchengröße von dem speziellen System abhängt, in welchem sie verwendet v/erden. Die porösen Trägermaterialien können auch mit verschiedenen Oxiden des oben beschriebenen Typs überzogen werden, oder sie können darin eingelagert verschiedene andere anorganische Materialien enthalten, wie Borphosphat usw., wobei diese anorganischen Materialien dem Trägermaterial spezielle Eigenschaften verleihen. Eine besonders brauchbare Form von Trägermaterial besteht aus einem Keramikkörper, der den Porositätstyp haben kann, welcher hier für Materialien nach der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, oder er kann honigwabenartig aufgebaut sein mit verbindenden Macrokanälen in dem gesamten Körper, wobei solche Materialien allgemein als Monolithe bekannt sind und mit verschiedenen Typen poröser Tonerde, Zirkonoxid usw. ,beschichtet sein können. Die Verwendung solcher Trägertypen hat den besonderen Vorteil, daß sie den freien Fluß selbst hochviskoser Substrate gestattet, die oftmals industriellen enzymkatalysierten Reaktionen unterzogen werden.

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Die anorganischen porösen Trägermaterialien, die als eine Komponente des kombinierten organisch-anorganischen Grundmaterials verwendet v/erden, sind beispielsv;eise bestimmte Metalloxide, wie Tonerde und besonders ίίΤ-Tonerde, Kieselsäure, Zirkonoxid oder Gemische der Metalloxide, wie Kieselsäuve-Tonerde, Kieselsäure-Zirkonoxid, Kieselsäure-Magnesia, Kieselsäure-Zirkonoxid-Tonerde usw., oder <T-Tonerde, die andere anorganische Verbindungen, wie Borphosphat usw., enthält, Keramikkörper usw. sowie Kombinationen der obigen Materialien und eines der Materialien, die als Überzug für ein anderes Material dienen kann, welches selbst den Träger darstellt.

Die Polymermaterialien, die in situ in solcher Weise gebildet werden, daß das Polymermaterial in den Poren des anorganischen Trägers des oben beschriebenen Typs teilweise adsorbiert und teilweise eingeschlossen ist, kann nach den oben beschriebenen allgemeinen Methoden hergestellt werden, d.h., indem zunächst eine Lösung mit 2 bis 25 % eines bi- oder polyfunktionellen Monomers, eines Polymerhydrolysats oder eines vorgeformten Polymers adsorbiert wird, wobei das Monomer oder Polymer ursprünglich synthetisch oder natürlich vorkommend ist und vorzugsweise in Wasser oder anderen Lösungsmitteln löslich ist, welche letztere gegenüber den anschließend verwendeten Reaktionen inert sind. Wie oben ausgeführt wurde, liegt es innerhalb des Erfindungsgedankens, daß ein zweites bifunktionelles Monomer dann in ähnlicher Weise zugesetzt wird, um durch Umsetzung mit dem auf dem anorganischen Träger adsorbierten ursprünglichen Zusatzstoff ein organisch-anorganisches Grundmaterial zu bilden. Die funktionellen Gruppen, die auf dem bifunktionellen

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Monomer vorliegen, umfassen bekannte reaktive Reste, wie Amino-, Hydroxyl-, Carboxy-, Thiol-, Carbonyl- und ähnliche Reste. Wie bereits oben ausgeführt wurde, sind die reaktiven Gruppen der bifunktionellen Verbindungen vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise durch Ketten voneinander getrennt, die 4 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten. Die reaktiven Reste sind in der Lage, sich kovalent mit den anfänglichen Zusatzstoffen und anschließend, nach dem Auswaschen unumgesetzter Materialien, mit dem Enzym zu verbinden, das in der anschließenden Stufe zugegeben wird, wobei das Enzym dann kovalent an die funktioneile Gruppe im Endbereich oder nahe dem Endbereich der funktionellen Kette gebunden ist und gleichzeitig auch an das Grundmaterial adsorbiert ist. Nach Zugabe des Enzyms zu dieser Zusammensetzung bildet sich ein relativ stabiles trägerfixiertes Enzym, das hohe Aktivität und hohe Stabilität besitzt. Außerdem besitzt die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung auch sehr vielseitige Verwendbarkeit zusätzlich zu den anderen oben aufgezählten Vorteilen, da man sie verwenden kann, um trägerfixierte Enzyme in Abwesenheit eines anorganischen Trägers, der in sauren oder alkalischen Medien löslich ist, herzustellen. Wie nachfolgend im einzelnen aufgeführt wird, behalten je nach den verwendeten Reaktionspartnern die trägerfixierten Enzyme ihre Stabilität in solchen Medien, wenn sie in Kombination mit dem anorganischen Träger nach den bekannten Verfahren hergestellt wird. Durch diese Eigenschaften ist es möglich, die Verwendungen dieser trägerfixierten Enzyme auszuweiten.

Spezielle Beispiele bi- oder polyfunktioneller Monomere, von Polymerhydrolysaten oder vorgeformten Polymeren, die anfangs

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auf dem anorganischen Träger adsorbiert werden können, sind etwa wasserlösliche Polyamine, wie Ethylendiamin, Diäthylentriamin, Triäthylentetramin, Tetraäthylenpentamin, Pentaäthylenhexamin, Hexamethylendiamin, Polyäthylenimin usw. , wasserunlösliche Polyamine, wie Methylendicyclohexylamxn, Methylendianilin usw., natürliche und synthetische teilhydrolysierte Polymere und vorgeformte Polymere, wie Nylon, Kollagen, PoIyacrolein, Polymaleinsäureanhydrid, Alginsäure, Kaseinhydrolysat, Gelatine usw. Einige spezielle Eeispiele bifunktioneller Zwischenmaterialien, die zu den oben aufgezählten Produkten zugesetzt v/erden können, um ein organisch-anorganisches Grundmaterial zu produzieren, und die die oben aufgeführten notwendigen Eigenschaften besitzen, sind etwa Verbindungen, wie Glutardialdehyd, Adipoylchlorid, Sebacoylchlorid, Toluoldiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat usw. Wenn ein Polyäthylenamin des oben beschriebenen Typs mit Glutardialdehyd in Abwesenheit eines anorganischen porösen Trägers umgesetzt wird, bekommt man ein in wäßriger Säure lösliches Material, während bei Umsetzung von Polyäthylenamin mit einem Diisocyanat oder Acylhalogenid ein wasserunlösliches Produkt erhalten wird. Umgekehrt, wenn ein Reaktionskomplex ohne den anorganischen Träger freie Carboxylgruppen enthält, bekommt man einen alkalisch löslichen Komplex. Infolge des großen Überschusses an intermediären bifunktionellen Molekülen mit Abstandshalterfunktion, die verv/endet v/erden, enthält das Polymergrundmaterial, das gebildet wird, daran hängende Gruppen, die die Abstandshaltermoleküle umfassen, wobei sich diese Moleküle von dem Grundmaterial aus erstrecken und reaktive Reste haben, die in ihren

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Endbereichen oder nahe diesen vorliegen und in der Lage sind, mit dem. Fnzym zu reagieren und dieses über kovalente Bindungen an die Äbstandshaltermoleküle zu binden. Außerdem wird das Enzym, konkurrierend auch teilweise an dein Grundmaterial adsorbiert, wenn es zugegeben wird, nachdem die unumgesetzten Reagentien durch Waschen von den organisch-anorga.nischen Grundmaterial entfernt wurden. Bindung des Enzyms lediglich an das organische Grundmaterial beeinflußt gewöhnlich nicht die Abhängigkeit der Löslichkeit des.Aggregats von dem pH-Wert der Lösung, doch wenn der anorganische Träger entsprechend den obigen Angaben eingeschlossen wird, zeigt die Gesanitzusammensetzung bzw. das trägerfixierte Enzym hohe Stabilität über einen relativ weiten pH-Bereich von 3 bis 9, wobei die Stabilität natürlich auch eine Funktion der optimalen pH-Eigenschaften des verwendeten speziellen Enzyms und des verwendeten anorganischen Trägers ist. Daher ist leicht ersichtlich, daß ein geeignetes organisch-anorganisches Grundmaterial, das in vielen Situationen anv/endbar ist, mit dem Trägermaterial gebildet wird, indem man irgendeine der oben beschriebenen Materialtypen, die dem Fachmann bekannt sind, adsorbiert und dann mit irgendeinem bifunktionellen Molekül, das dein Fachmann ebenfalls bekannt ist und zweckmäßige funktionelle Reste enthält, behandelt, um es mit dem ursprünglichen Zusatzstoff umzusetzen, vorausgesetzt, daß ein genügend großer Überschuß des bifunktionellen Moleküls verwendet wird, um an dem Polymer hängende Gruppen zu liefern, die in der Lage sind, anschließend mit dem zu immobilisierenden Enzym zu reagieren. Durch Benutzung dieser funktionellen, an dem Polymer hängenden Gruppen als Bindungsstellen für

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die Enzyme bekommen die Enzyme eine größere Mobilität, so daß die katalytische Aktivität des Enzyms über eine relativ längere Zeit auf einem hohen Stand bleibt, als dies möglich ist, wenn das Enzym nach irgendwelchen anderen Methoden immobilisiert wurde, wie durch Einschluß in ein Gelgitter, Adsorption auf einer festen Oberfläche oder Vernetzung des Enzyms mit Hilfe bifunktioneller Rcagentien. Selbstverständlich ergeben jedoch nicht alle Rezepturen gleichwertige Ergebnisse hinsichtlich der Stabilität oder Aktivität.

Beispiele von Enzymen, die durch eine kovalente Binaungsreaktion immobilisiert werden können und die eine Aminogruppe enthalten, welche mit einem Aldehydrest oder Isocyanatorest der an dem Polymer hängenden Gruppe reagieren kann, während das Polymermaterial in den Poren eines porösen Trägermaterials eingeschlossen und adsorbiert ist, sind beispielsweise Trypsin, Papain, Ilexokinase, ß-Galactosidase, Ficin, Bromelain, Milchsäuredehydrogenase, Glucoamylase, Chymotrypsin, Pronase, Kcylase, Invertase, Amylase, Glucoseoxiöase, Pepsin, Rennin, Pilzprotease usw. Im allgemeinen kann jedes Enzym verwendet werden, dessen aktive Stelle nicht in die kovalente Bindung eingeschlossen ist. Obwohl die obige Diskussion um am Polymermaterial hängende Gruppen kreiste, die als einen funktionellen Rest ein Aldehyd- oder Isocyanatogruppe; enthalten, liegt es auch innerhalb des Erfindungsgedankens, daß die am Polymer hängende Gruppe andere funktioneile Reste enthalten kann, die mit Carboxy-, Sulfhydroy- oder anderen Resten, die gewöhnlich in Enzymen vorhanden sind, reagieren kann. Die kovalente Bin-

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dung von Enzymen, die diese anderen Reste enthalten, mit anderen am Polymer hängenden Gruppen, erfolgt jedoch nicht notwendigerweise mit äquivalenten Ergebnissen und kann auch erheblich größere Kosten bei der Herstellung der Zwischenprodukte einschließen. Die obige Auflistung der porösen festen Träger, Monomere, Hydrolysate, Polymere und Enzyme ist lediglich repräsentativ für die verschiedenen Verbindungsklassen, die verwendet werden können, doch ist die vorliegende Erfindung nicht notwendigerweise hierauf beschränkt.

Die Herstellung der Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung erfolgt bevorzugt ansatzweise, wie bereits im einzelnen beschrieben wurde, obwohl es innerhalb des Erfindungsgedankens liegt, das fertige zusammengesetzte Produkt gegehenenfalls auch in kontinuierlicher Betriebsweise herzustellen. Wenn ein kontinuierliches Verfahren angewendet wird, wird eine Menge des porösen festen Trägermaterials in eine geeignete Apparatur, gewöhnlich eine Säule, gegeben. Das poröse feste Trägermaterial kann in irgendeiner erwünschten Form vorliegen, wie als Pulver, Pellets, Monolithe und dergleichen, und wird in die Säule eingeführt, wonach eine vorzugsweise wäßrige Lösung, beispielsweise eines polyfunktioneilen Amins, in Berührung mit dem porösen Träger gebracht wird, bis letzterer mit der Aminlösung gesättigt ist, und den Überschuß läßt man dann ablaufen. Ein Abstandshalter- oder intermediäres bifunktionelles Molekül, wie Glutardialdehyd, wird dann in Berührung mit dem gesättigten Träger gebracht. Die Bildung des polymeren Grundmaterials erfolgt somit in einem wäßrigen System, wobei

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die Umsetzung während einer Zeit erfolgt, die im Bereich von 1 bis 10 Stunden liegen kann, gewöhnlich aber von kurzer Dauer ist. Nach Entfernung des überschüssigen Glutardialdehyds durch Ablaufenlassen und Auswaschen wasserlöslicher und unumgesetzter Materialien, was im Falle eines Polyamins vorzugsweise mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 4 erfolgt, wird eine wäßrige Lösung des Enzyms in Kontakt mit dem Träger gebracht oder durch die Säule im Kreislauf geführt, und diese Stufe bewirkt eine kovalente Eindung des Enzyms an die endständigaiAldehydgruppen der an dem Polymer hängenden Iloleküle mit funktionellen Resten, welche sich von dem Grundmaterial aus erstrecken. Dies geschieht solange, bis es keine weitere physikalische Adsorption und/oder kovalente Bindung des Enzyms an das organisch-anorganische Grundmaterial und die daran hängenden Moleküle mehr gibt. Das überschüssige Enzym wird in dem Auslauf nach Ablaufenlassen und Waschen der Säule zurückgewonnen. Die Säule ist jetzt fertig für die Verwendung in chemischen Reaktionen, worin die katalytische Wirkung des Enzyms auftritt. Die Verfahren werden meistens in Zeit-, Temperatur- und Konzentrationsparametern durchgeführt, wie sie oben im Zusammenhang mit dem Ansatzverfahren beschrieben wurden, und führen zu vergleichbaren immobilisierten Enzymkomplexen. Es liegt auch innerhalb des Erfindungsgedankens, daß mit geeigneten Modifikationen des pH-Werts und der Temperatur, die für den Fachmann auf der Hand liegen, das Verfahren für eine große Vielzahl anorganischer poröser Träger, polymerbildender Reaktanten und Enzyme angewendet werden kann.

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Die folgenden Beispiele dienen der v.'eiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

In diesem Beispiel V7urden 2 g einer porösen Kieselsäure-Ton er deinasse mit darin eingelagertem Borphosphat, mit einer Teilchengröße von 40 bis 80 Maschen (US-Siebreihe), mit einem Porendurchmesser im Bereich von etwa 100 bis etwa 55 000 R und mit einer Oberfläche von etwa 150 bis 200 m /g als der anorganische Träger für die neue Zusammensetzung nach der Erfindung verwendet. Dieser Träger wurde bei einer Temperatur von etwa 26O°C (500 F) calciniert, um darin enthaltene adsorbierte Feuchtigkeit zu entfernen. Danach wurde der Träger mit 55 ml einer 4 ϊ-igen wäßrigen Lösung von Tetraäthylenpentamin bei Umgebungstemperatur während 1 Stunde im Vakuum behandelt, um die Eindringung der Lösung in die Poren des Trägers zu erleichtern. Die überschüssige nichtadsorbierte Lösung wurde dann abgegossen, wobei etwa 25 % des Tetraäthylenpentamins in den Poren des Trägers adsorbiert waren. Danach wurde der feuchte Träger mit 25 ml einer 5 %-igen wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd bei Umgebungstemperatur behandelt, und es fand eine fast unmittelbare Reaktion unter Eildung eines unlöslichen Reaktionsproduktes auf der Oberfläche und in den Poren des Trägers statt. Die überschüssige Glutardialdehydlösung v/urde dann abgegossen und der organisch-anorganische Komplex gewaschen, um unumgesetzte und unadsorbierte Reaktanten zu entfernen, wobei das Waschen zunächst mit Wasser und dann mit einer 0,02-nolaren Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert

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von 4_;2 erfolgte und das Waschen auf einer Temperatur von 45 C durchgeführt v.⁷urde. Danach wurde eine Enzymlösung mit einem Gehalt von etwa 200 mg Glucoamylase je 25 ml Wasser zugesetzt, und man ließ diese Lösung mit der Zusammensetzung bei Umgebungstemperatur während 1 Stunde reagieren. Am Ende dieser 1-stüncligen Periode wurde die überschüssige Glucoamylaselösung abgegossen, und das trägerfixierte Enzym wurde mit Wasser gewaschen, um ungebundenes und/oder unadsorbiertes Enzym zu entfernen. Die Zusammensetzung wurde dann 24 Stunden mit einer Acetatpufforlösung,ähnlich der oben beschriebenen, ausgelaugt. Die Menge an adsorbiertem und/oder kovalent gebundenem Enzym wurde durch Dv^as-Mikrcgaschromatographieanalysen vor und nach der Zugabe des Enzyms bestimmt. Die Aktivität des trägerfixierten Enzyms wurde dann an Hand der Glucosemenge bestimmt, die unter Verwendung einer 30 %-igen verdünnten Stärkelösung als Substrat bei pH 4,2 und 6O°C und unter Verwendung des Worthington¹s Glucostatverfahrens zur 7malyse der Glucose gebildet wurde, wobei letzteres Verfahren als das zuverlässigere Verfahren zur Bestimmung der Brauchbarkeit des trägerfixierten Enzyms eingesehen wird. Eine Aktivität von 28 Einheiten/Granm Träger mit einer Enzymbeladung von 29 mg/g Träger wurde nach diesem Verfahren erhalten (eine Einheit bedeutet die Produktion von 1 g Glucose/Std bei 60 C gemäß den Testbestimmungen). Es sei bemerkt, daß trotz der bekannten Löslichkeit bei pH 4,2 des trägerfixierten Enzyms bei Herstellung in Abwesenheit eines anorganischen Trägers wehrend der Auslaugung mit einer Pufferlösung von pH 4,2 einvernachlässigbarer Enzymverlust aus dem kcmbinier-

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ten anorganisch-organischen Komplex auftrat. Dies wurde durch Analyse des Auslaufs aus der Behandlung demonstriert.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde das Verfahren des Beispiels 1 mit der Ausnahme wiederholt, daß der anorganische poröse Träger eine Teilchengröße von 10 bis 30 Maschen besaß. Die Kieselsäure-Tonerdemasse mit einem Gehalt an darin eingelagertem Borxihosphat wurde mit Tetraathylenpentamin,' Glutardialdehyd und Glucoainylase in ähnlicher Weise wie oben behandelt. Man erhielt einen aktiven immobilisierten Enzymkomplex, jedoch mit verminderter Aktivität, wahrscheinlich wegen eines Diffusionsproblems durch die größere Teilchengröße der Masse.

Beispiel 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden 2 g einer Kieselsäure-Tonerdemasse, die die gleichen physikalischen Eigenschaften der Teilchengröße, des Porendurchmessers und der Oberfläche wie in Beispiel 1 besaß, mit einer Acetonlösung von Tetraathylenpentamin behandelt, und anschließend erfolgte die Behandlung mit einer Tolyldiisocyanatlösung au^h in Aceton statt der wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd. Nach dem Abgießen der überschüssigen Diisocyanatlösung und nach Waschen mit Wasser wurde der organisch-anorganische Komplex weiter mit einer wäßrigen Glucoamylaselösung behandelt. Wie in Beispiel 1, umfaßte des fertige Produkt einen aktiven, vollständig unlöslichen Enzymkomplex.

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Beispiel 4

Um zu erläutern, daß verschiedene Konzentrationen von Lösungen verwendet werden können, um das erwünschte Produkt
herzustellen, wurde das obige Beispiel 1 mit der Ausnahme
wiederholt, daß höher konzentrierte Lösungen der verschiedenen Reagentien verwendet wurden. Beispielsweise wurden
2 g einer Kieselsäure-Tonerdemasse von 10 bis 30 Maschen
mit 25 ml einer 20 %-igen Tetraathylenpentaminlösung behandelt, und nach dem Abgießen wurden 50 ml einer 25 %-igen Glutardialäehydlösung zugesetzt. Dieser Komplex wurde nach dem Waschen dann mit einer wäßrigen Lösung von Glucoamylase behandelt, um ein immobilisiertes trägerfixiertes Enzym herzustellen, das eine Aktivität von etwa 12 Einheiten/Gramm, bezogen
auf den Gluccstattest, besaß.

Beispiel 5

Zu einer Kieselsäure-Tonerdemasse aus 2 g Teilchen mit 10 bis 30 Maschen wurden 25 ml einer 5 %-igen wäßrigen, teilhydrolysiorten Kollagenlösung zugegeben, die anstelle des Tetraäthylenpentamins verwendet wurde. Nach dem Abgießen und Behandeln mit Glutardialdehyd wurde das organisch-anorganische Grundmaterial gewaschen und dann mit einer Glucoamylaselösung behandelt. Die fertige Zusammensetzung wurde in ähnlicher Weise v/ie in Beispiel 1 durch Dekantieren, Waschen.Auslaugen mit einer
gepufferten Lösung (pH 4,2) behandelt, um ein immobilisiertes trägerfixiertes Enzym zu ergeben, das eine Aktivität von etwa 10 Einheiten/Gramm besaß.

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Beispiel 6

In diesem Beispiel v/urde eine Kieselsäure-Tonerdemasse mit einer Teilchengröße von 10 bis 30 riaschen, einem Porendurchmesser im Bereich von etwa 100 bis etwa 55 000 Λ und mit einer Oberfläche von etwa 150 bis 200 m /g durch Zugabe von Tetraäthylenpentamin in einer 1 %-iyen teilhydrolysierten wäßrigen Kollagenlösung behandelt, v/obei das Kollagen als zusätzliches Bindemittel benützt wurde. Nach dem Ablaufenlassen und Umsetzen mit Glutardialdehyd v/urde das organischanorganische Grundmaterial dann mit einer Glucoamylaselösung nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 1 behandelt, um ein aktives trägerfixiertes Enzym herzustellen.

Beispiel 7

Um zu erläutern, daß verschiedene Enzyme bei der Herstellung der erwünschten Zusammensetzungen verwendet v/erden können, v/urde eine Kieselsäure-Tonerdt.masse, die darin eingelagert Borphosphat enthielt, mit einer Tetraäthylenpentaminlösung behandelt, dekantiert und gewaschen, und dann wurde eine Glutardialdehydlösung zugesetzt, und die resultierende Zusammensetzung v/urde nun mit einer wäßrigen Lactaselösung behandelt. Dies ergab ein aktives trägerfixiertes Enzym, ähnliche Verfahren kennen verwendet v/erden, um Enzyme, './ie Proteasen, Glucoseisomerasen und Glucoseoxidasen, zu binden und aktive trägerfixierte Enzyme zu bekommen.

Beipsiel 8

In diesen Beipsiel enthielt eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm 14,2 g eines aktiven trägerfixten Enzyms,

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das aus Gucoamylase hergestellt worden war, welche an einen porösen Kieselsäure-Tonerdeträger von 10 bis 30 Maschen mit <"arin eingelagerten Borphosphat gebunden war, wobei das trägerfixierte Enzym in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war. Die Säule vurde kontinuierlich während 30 Tagen bei einer Temperatur von 45 C verwendet, um eine wäßrige 30 %-ige verdünnte Stärkclösung zu hydrolysieren, die auf pH 4,2 gepuffert worden war. Der .Auslauf wurde hinsichtlich der Glucoseproduktion unter Verwendung des Worthington-Glucostatverfahrens analysiert. Es wurde gefunden, daß es während dieses Zeitraumes keinen erkennbaren Verlust an Enzymaktivität gab und daß der Prozentsatz der Umwandlung von Stärke in Glucose bei dieser Temperatur und bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 150 ml/h 62 % betrug.

3eispiel 9

Um die Tatsache zu erläutern, daß verschiedene Substrate oder Träger benützt werden können, um die erwünschten Zusammensetzungen herzustellen, wurde ein nit Tonerde überzogener Mo:olith, der aus einem honigwabenartigen Keramikkörper mit verbindenden Hacrokanälen bestand, in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, d.h. cer Monolith wurde mit Lösungen von Tetraäthylenpentaiain, Glutardialdehyd und einem Glucoamyläseenzym behandelt, wobei die Behandlung mit einem Stufenverfahren erfolgte, das das oben beschriebene Dekantieren, vraschen und Auslaugen umfaßte. Der ursprüngliche Keramikmonolith besaß ein Trockengewicht von 256 g, wovon 13 % aus Tonerdeüberzug bestanden. Das fertige rrciaobilisierte trägerfixierte

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Enzym wurde zu einer Säule in einer Glasrühre mit einem Innendurchmesser von 70 mm gemacht, um kontinuierlich mit Hilfe einer geeigneten Punpapparatur in einem temperaturkontrollierten Behälter arbeiten zu können, wobei der Behälter auf einer Temperatur von 45 C gehalten wurde. Während einer 40-tägigen Periode kontinuierlicher Benutzung für die Hydrolyse einer 30 %-igen gepufferten verdünnten Stärkelösung fand man, daß nur etwa 3 % der ursprünglichen Aktivität des trägerfixierten Enzyms verlorengingen, während eine Fließgeschwindigkeit von etwa 85 ml/h aufrechterhalten wurde. Außerdem wurde gefunden, daß während der 40-tägigen Periode etwa 80 % der Stärke in Glucose umgewandelt wurden. Um die Eigenschaften des Systems weiter zu studieren, wurden anschließend Veränderungen der Fließgeschwindigkeit vorgenommen, wobei gefunden wurde, daß es bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 38 ml/h möglich war, eine Umwandlung im Bereich von 92 bis 93 % der Stärke in Glucose zu bekommen. Die relativ lange Zeit, während der dieses Enzym verwendet wurde, um Stärke in Glucose umzuwandeln, ohne daß ein wesentlicher Verlust an Enzyiaaktivität entweder durch Desorption oder Deaktivierung auftrat, zeigte die lange Lebensdauer des Katalysators.

Beispiel 10

In diesem Beispiel wurde ein Monolithtyp von trägerfixiertem Enzym in einer Säule ähnlich wie in Beispiel 9 hergestellt, wobei die Ausnahme darin bestand, daß das Enzym, das zur Herstellung des Komplexes verwendet wurde, Lactase statt Glucoar.iylase v/ar. Das trägerfixierte Enzym wurde hinsichtlich der Stabilität unter kontinuierlichem Fluß geprüft, wobei die Tera-

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peratur während 29 Tagen auf 37 C gehalten wurde. Es wurde wiederum gefunden, daß kein merklicher Verlust an Aktivität des inmobilisierten trägerfixierten Enzyms eintrat. Dieses immobilisierte Enzym vrarde bei der Behandlung einer 5 %-igen Lactoselösung verwendet, die auf pH 4,2 gepuffert worden war, wobei die Lactoselösung der Säule nit einer Geschwindigkeit von 54 ml/h zugeführt wurde. Während der 29-tägigen Periode wurde gefunden, daß es eine etwa 35 %-ige Umwandlung von Lactose in Glucose und Galactose ergab.

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Claims (10)

1. - 3ο Patentansprüche

   ill Immobilisiertes trägerfixiertes Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem kombinierten organisch-anorganischen Grundmaterial aus einem anorganischen porösen Träger mit einem in dessen Poren adsorbierten und eingeschlossenen organischen Polymernaterial, v/obei das Polymermaterial daran hängende Gruppen mit funktionellen Resten enthält, und einem an das Grundmaterial adsorbierten und kovalent an die funktionellen Reste der an dem organischen Polymermaterial hängenden Gruppen in deren Endbereichen oder nahe derselben gebundenen Enzym besteht.
2. 2. Iraiiiobilisiertes trägerfixicrtes Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Polymermaterial in situ aus einem Monomer, einem hydrolysierten Polymer oder einem Polymer natürlichen oder synthetischen Ursprungs durch Umsetzung mit einem bifunktionellen reaktiven Monomer gev/onnen wurde.
3. 3. Immobilisiertes trägerfixiertes Enzym nach /Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische poröse Trägermaterial I -Tonerde oder Kieselsäure-Tonerde, besonders Borphosphat enthaltende Kieselsäure-Tonerde, oder ein mit poröser Tonerde überzogener honigwabenartiger Keramikkörper mit verbindenden I'acrokanälen ist.

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4. 4. Immobilisiertes trägerfixiertes Enzym nach Jinspr^efy L hl 6 ' 'J · dadurch gekennzeichnet, daß es als organisches Polymermaterial das Reaktionsprodukt von Polyäthyleniiain mit Glutardialdehyd, von Tetraäthylonpentarain mit Glutardialdehyd, von Tetraäthylenpentamin mit Tolyldiisocyanat, von Pentaäthylenhexamin mit Glutardialdehyd oder eines Gemisches von Tetraäthylenpentamin und von teilhydrolysiertem Kollargen mit Glutardialdehyd enthält.
5. 5. Immobilisiertes trägerfixiertes Enzym nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Glucoamylase, Lactase, Pilzprotease, Glucoseisornerase und/oder Glucoseoxydase enthält.
6. 6. Immobilisiertes trägerfixiertes Enzym nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sein unorganisches poröses Trägermaterial Porendurchiaesser im Bereich von 100 bis 55 000 A* mit so viel wie 25 bis 60 % des porösen Trägerrnaterials mit Durchmesse3.-n oberhalb 20 000 A* und eine Oberfläche im Bereich von 150 bis 200 m /g besitzt.
7. 7. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten trägerfixierten Enzymen nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das anorganische Trägermaterial mit einer ersten Lösung, eines bi- oder polyfunktionellen Monomers, eines Polymerhydrolysats oder eines vorgeformten Polymers behandelt, die nichtadsorbierte Lösung entfernt, das anorganische Trägermaterial mit einem relativ großen Überschuß einer zweiten Lo-

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   sung eines bjfunktionellen Monomers unter Bildung des organisch-anorganischen Grundmaterial 'behandelt, eine Enzymlösung zu dem resultierenden organisch-anorganischen Grundmaterial zusetzt und die unumgesetzten Materialien entfernt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Lösung, als zweite Lösung und als Enzymlösung wäßrige Lösungen verwendet.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger für das bi- oder polyfunktionelle Monomer, das Polymerhydrolysat oder vorgeformte Polymer organische Lösungsmittel, wie Aceton oder Tetrahydrofuran, verwendet.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweite bifunktioneile Monomere solche verwendet, die reaktive Gruppen besitzen, welche durch eine Kette mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen voneinander getrennt sind.

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