DE2805950C2

DE2805950C2 - Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen

Info

Publication number: DE2805950C2
Application number: DE2805950A
Authority: DE
Inventors: Hideo Hirohara; Shigeyasu Ibaraki Osaka Nabeshima; Tsuneyuki Takatsuki Osaka Nagase
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1977-11-05
Filing date: 1978-02-13
Publication date: 1982-01-21
Also published as: IT1095409B; JPS5467091A; NL7801593A; NL174949B; IT7820240A0; CA1107669A; JPS5650833B2; FR2407945A1; NL174949C; FR2407945B1; US4170696A; DE2805950A1

Description

C₂H₅

N — C₂H₄X

/
C₂H₅

oder dessen Salz, wobei X Halogen oder Hydrogensulfat bedeutet,

in Gegenwart von alkalisch reagierenden Verbindungen oder organischen Aminen im Mengenverhältnis von 1/3 bis 10 Teile b) pro 1 Teil trockenes Harz a).

2. Trägermaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Diäthylaminoäthyl-Derivat oder dessen Salz das Hydrochlorid von /?-Diäthylaminoäthylchlorid, das Hydrobromid von /?-Diäthylaminoäthylbromid oder jS-Diäthylaminoäthyl-hydrogensulfat eingesetzt wurde.

3. Trägermaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Diäthylaminoäthyl-Derivat oder dessen Salz in einem Anteil von 1/2 bis 3 Teile Diäthylaminoäthyl-Derivat auf 1 Teil trockenes Harz eingesetzt wurde.

4. Trägermaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als alkalisch reagierende Verbindung Natriumhydroxid eingesetztwurde.

5. Verwendung des Trägermaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Unbeweglichmachen von Enzymen, wobei das Enzym mittels eines kovalente Bindungen erzeugenden Verfahrens oder mittels eines Absorptions-Verfahrens an dem Harz angebracht wird.

Diese Erfindung betrifft ein Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen, weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieses Trägermaterials und die Anwendung des Trägermaterials bei einem Verfahren zum Unlöslichmachen der Enzyme. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Trägermaterial für das Unlöslichmachen von Enzymen, das ein Diäthylaminoäthyl-Gruppen enthaltendes Phenol-Formaldehyd-Harz aufweist, das durch Reaktion eines Diäthylaminoäthyl-Derivates oder dessen Salz mit einem makroporösen Phenol-Formaldehyd-Harz erhalten worden ist (nachfolgend wird dieses makroporöse Phenol-Formaldehyd-Harz verschiedentlich auch nur kurz als »Harz« bezeichnet); das verwendete Harz weist funktioneile Gruppe auf, die mit dem Diäthylaminoäthyl-Derivat oder dessen Salz in Gegenwart einer alkalisch reagierenden Verbindung zu reagieren vermögen. Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein entsprechendes Verfahren zur Herstellung dieser Trägermaterialien.

Da unbeweglich gemachte Enzyme eine Reihe kommerzieller Anwendungsmöglichkeiten gefunden haben (vgl. z. B. C. R. Zaborsky, »Immobilized Enzymes«, in C. R. C. Press, 1973) sind in den letzten Jahren eine Reihe von Verfahren zum Unbeweglichmachen von Enzymen entwickelt worden; weiterhin sind eine Reihe Trägermaterialien für diesen Zweck bekannt Zu häufig verwendeten Trägermaterialien gehören Polysaccharide und deren Derivate, z. B. vernetztes Dextran, da sich diese als brauchbare Träger für verschiedene Enzyme erwiesen haben (vgl. Enzymologie, Band 31, Seite 214 [1966]). In der Praxis hat sich jedoch gezeigt, daß diese Polysaccharide häufig eine ungenügende mechanische Festigkeit aufweisen, so daC es schwierig ist, im Kolonnenbetrieb eine ausreichende Strömungsgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten. Weiterhin besteht die Gefahr, daß sich diese Trägermaterialien auf der Basis von Polysacchariden im Betrieb zusetzen; ferner weisen diese Materialien lediglich eine geringe

so Beständigkeit gegen den Angriff von Mikroben auf. Eine weitere große Schwierigkeit besteht darin, daß in Gegenwart großer Elektrolytmengen im Reaktionsgemisch die ionisch gebundenen Enzyme leicht von diesen Trägern abgelöst werden. Andererseits ist bereits

r> früher, Ende der 50er Jahre, die Anwendung von Kunstharzen, insbesondere ionenaustauschender Kunstharze, als Trägermaterialien für das Unbeweglichmachen von Enzymen bekanntgeworden. Im Rahmen der damaligen Untersuchungen ist man davon ausge-

Ki gangen, daß diese Harze geringen praktischen Wert haben werden, da pro Gewichtseinheit Trägermaterial lediglich eine kleine Menge Enzym aufgebracht werden konnte, und das unbeweglich gemachte Enzym lediglich eine geringe Aktivität aufwies. Andererseits weisen

4> ionenaustauschende Harze mit einer Kunstharzmatrix eine Reihe besonderer Eigenschaften auf, die sie für den vorgesehenen Zweck gegenüber den Polysacchariden und deren Derivaten überlegen erscheinen lassen. Zu diesen vorteilhaften Eigenschaften gehören eine ausrei-

■>o chende mechanische Festigkeit und eine höhere Beständigkeit beim kontinuierlichen Betrieb über längere Zeitspannen in einer großvolumigen Kolonne, ohne daß in größerem Ausmaß mit Beschädigungen gerechnet werden muß. Weiterhin weisen diese

j") Kunstharze eine solche Teilchengröße auf, daß eine ausreichende Strömungsgeschwindigkeit im Kolonnenbetrieb gewährleistet ist; ferner sind diese Kunstharze in besonders hohem Ausmaß gegen den Angriff von Mikroben beständig.

ho Aus der DE-OS 25 05 350 ist ein Verfahren zur Herstellung von Anionenaustauschern durch Substitution von hydrophilen polymeren Gelen bekannt. Bei diesen handelt es sich um Matrixmaterialien auf der Basis von Hydroxyacrylat- und Hydroxymethacrylat-

b^r) Harzen. Diese Materialien haben sich für die Sorption von Biopolyrneren und für die sich entwickelnde Flüssigkeitschromatographie als sehr geeignet erwiesen, insbesondere zur Anwendung bei Trennungen vor

empfindlichen biologischen Materialien. Diese bekannten Anionenaustauschergele sind somit für die Flüssigkeitschromatographie von Biopolymeren bestimmt und haben ein daran angepaßtes Adsorptionsvermögen für diese Biopolymeren. Im Rahmen solcher Trennungsverfahren sollen die Biopolymeren lediglich vorübergehend an das Austauschergel gebunden werden. Da eine dauerhafte Bindung der Biopolymeren an das Austauschergel gerade nicht angestrebt wird, stellen diese bekannten Anionenaustauschergele keine Trägermaterialien zum Unbeweglichmachen von Enzymen im Sinne der vorliegenden Erfindung dar.

Weiterhin werden in einem Artikel von G. Maneke in »Chimia« 28, 467 bis 474 (1974) verschiedene Trägermaterialien für das Unbeweglichmachen von Enzymen beschrieben. Unter anderem werden unlösliche, makromolekulare Trägersubstanzen auf der Basi? von Polysaccharid-Derivaten synthetischen Polymeren wie etwa Polyaminostyrol, einem Copolymerisat aus Maleinsäureanhydrid und Äthylen, Copolymerisaten aus Acrylsäure und Methacrylsäure, Polyvinylalkohol, etc., genannt. Für verschiedene makroporöse Polymere wird aufgezeigt, daß eine größere Oberfläche zu einem höheren Anteil an gebundenem Enzym führt. In diesem Artikel werden eine Reihe Brückenbildnerkomponenten zur Bindung des Enzyms an das Trägermaterial angegeben. Die Verwendung von Diäthylaminoäthyl als brückenbildende Komponente wird dort nicht erwähnt.

Im Hinblick auf die obengenannten Umstände sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt worden, die zu der Feststellung geführt haben, daß in besonderer Weise modifizierte Ionen-austauschende Phenol-Formaldehyd-Harze, zu deren Herstellung in Harze mit besonderen physikalischen und chemischen Eigenschaften Diäthylaminoäthyl-Gruppen mit einer spezifischen Affinität zu einer großen Anzahl von Enzym-Proteinen eingeführt worden sind, ausgezeichnete Trägermaterialien für das Unbeweglichmachen von Enzymen darstellen. Im Rahmen dieser Unterlagen werden Diäthylaminoäthyl-Gruppen als »DEAE«-Gruppen bezeichnet. Die vorliegende Erfindung beruht im wesentlichen auf dem Auffinden dieses Sachverhalts.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen bereitzustellen, mit dem ein unbeweglich gemachtes Enzym erhalten wird, das hohe Aktivität aufweist, die in besonders hohem Ausmaß beibehalten wird, und/oder wobei das Trägermaterial eine große Menge unbeweglich gemachtes Enzym enthalten kann. Das Trägermaterial soll dabei für die kommerzielle Anwendung geeignet sein, Enzyme durch das Unbeweglichmachen zu stabilisieren vermögen und für den wiederholten und kontinuierlichen Einsatz von Enzymen geeignet sein, die als Katalysatoren in homogenen, wäßrigen Reaktionen eingesetzt werden.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist darauf gerichtet, ein Verfahren zur Herstellung dieses Trägermaterials anzugeben. Die Erfindung betrifft ein Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen, erhalten durch Umsetzung a) eines makroporösen Phenol-Formaldehyd-Harzes, das eine mittlere Porengröße von 15 bis 100 nm, eine spezifische Oberfläche von wenigstens 1 m² pro Gramm trockenes Harz und ein Gesamtvolumen an Makroporen mit einer Porengröße von 10 bis 200 ηm von wenigstens 0,1 cm³ pro Gramm trockenes Harz aufweist, und das gegebenenfalls mit Polyäthylenpolyamin mit nicht mehr als 4 wiederkehrenden Äthyiamineinheiten umgesetzt ist, wobei gegebenenfalls noch die Aminogruppen ganz oder teilweise in die tertiäre Form übergeführt werden, mit b) einem Diäthylaminoäthyl-Derivat der allgemeinen Formel

C₃H₅
\

N-C₂H₄X

C₂H₅

oder dessen Salz, wobei X Halogen oder Hydrogensulfat bedeutet, in Gegenwart von alkalisch reagierenden Verbindungen oder organischen Aminen im Mengenverhältnis von 1/3 bis 10 Teile b) pro 1 Teil trockenes Harz a).

Es ist festgestellt worden, daß das erfindungsgemäße DEAE-modifizierte Harz nicht nur die bereits obenerwähnten ausgezeichneten Eigenschaften eines Ionenaustauschenden Harzes aufweist, wie etwa mechanische Festigkeit, Standfestigkeit im Kolonnenbetrieb und Beständigkeit gegen Mikrobenangriff, sondern auch ein außerordentlich gutes Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen darstellt, das große Anteile an immobilisiertem Enzym zu binden vermag, wobei das gebundene Enzym eine hohe spezifische

so Aktivität aufweist und diese Aktivität lange beibehält.

Das erfindungsgemäße Trägermaterial aus DEAE-modifiziertem Harz erweist sich in der praktischen Anwendung als ein sehr guter Träger, insbesondere weil die an diesem Träger unbeweglich gemachten Enzyme

j5 ihre Aktivität im hohen Ausmaß beibehalten, was für die Anwendung von unbeweglich gemachten Enzymen über eine lange Zeitspanne im kontinuierlichen Betrieb den wichtigsten Faktor darstellt.

Dementsprechend scheinen die ausgezeichneten Eigenschaften des DEAE-modifizierten Harzes als Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen nicht auf dem Vermögen der DEAE-Gruppen zum Anionenaustausch zu beruhen, sondern vielmehr auf der spezifischen Affinität dieser Gruppen zu den Enzymmolekülen, was eine inhärente Eigenschaft von DEAE-Gruppen ist. Diese Vermutung wird weiterhin durch das nachfolgende Ergebnis belegt.

Für die nachfolgende Betrachtung ist das Ionenaustausch-Vermögen von Harzen von Bedeutung; dieses Ionenaustausch-Vermögen wird mittels der absatzweisen Neutralisations-Titration geschätzt, nachdem das Harz in die OH-Form übergeführt worden ist; zur Bestimmung des Trockengewichtes wird das Harz in die OH-Form übergeführt, im Vakuum mehr als 10 Std. lang bei 60⁰C getrocknet, daraufhin mehr als 2 Std. lang bei Raumtemperatur (etwa 18 bis 25° C) gehalten und daraufhin gewogen; soweit nachfolgend von dem Ionenaustausch-Vermögen die Rede ist, wurde dieses stets nach den angegebenen Verfahren bestimmt.

bo Hin makroporöses Phenol-Formaldehyd-Polykondensations-Harz mit einem Anionenaustausch-Vermögen von 7,10 meq/g trockenes Harz wurde mit Polyäthylen-Polyamin (die Anzahl der wiederkehrenden Äthylenamin-Einheiten beträgt nicht mehr als 4)

b5 behandelt, damit das Harz Hydroxylgruppen, primäre Aminogruppen und sekundäre Aminogruppen aufweist und für die DEAE-Modifizierung geeignet ist. Wird an diesem Harz unter alkalischen Reaktionsbedingungen

die DEAE-Modifizierungsreaktion durchgeführt, so ist die Gewichtszunahme des Harzes häufig größer als die Zunahme des Anionenaustausch-Vermögens durch die DEAE-Gruppen; die Gründe hierfür werden noch nicht sehr gut verstanden, wobei angenommen wird, daß das gesamte Anionenaustausch-Verrr.ögen bezogen auf eine Gewichtseinheit des trockenen Harzes auf einen Wert von weniger als 7.10meq/g abgenommen hat Obwohl beispielsweise durch die D EAE-Modifizierungs reaktion eine Gewichtszunahme bis zu 57,2% auftritt, wird ein gesamtes Anionenaustausch-Vermögen von 6,34 meq/g trockenes Harz festgestellt, wobei das Anionenaustausch-Vermögen der DEAE-Gruppen 1,82 meq/g trokkenes Harz ausmacht Trotzdem ist bei Einsatz dieses DEAE-modifizierten Harzes als Trägermaterial der Anteil an unbeweglich gemachten Enzymen pro Gewichtseinheit größer als bei dem ursprünglichen Trägermaterial, das ohne DEAE-Modifizierung ein Anionenaustauschvermögen von 7,10 meq/g trockenes Harz aufweist.

Weiterhin gewährleistet die Verwendung des DEAE-modifizierten Harzes als Trägermaterial eine hohe Aktivität der unbeweglich gemachten Enzyme, wobei die Beibehaltung dieser Aktivität gut ist; im Ergebnis erweisen sich die DEAE-modifizierten Harze als überlegene Trägermaterialien. Somit beruht die Auswirkung der Modifizierung mit DEAE-Gruppen nicht auf einer Zunahme des Anionenaustausch-Vermögens, sondern offensichtlich auf einer spezifischen, inhärenten Affinität der DEAE-Gruppen zu den Enzymen, wobei die Art dieser Affinität bislang noch nicht im einzelnen verstanden wird.

Bei der DEAE-Modifizierung tritt gemeinsam mit der Zunahme des Gewichtes auch eine Zunahme des Harzvolumens auf; im Ergebnis wird deshalb lediglich eine geringe Veränderung des Verhältnisses von Volumen/Gewichtseinheit festgestellt. Wird z. B. ein Phenol-Formaldehyd-Polykondensations-Harz mit einer solchen Teilchengröße, daß das Harz ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,25 bis 1,0 mm passiert, in eine Säule gepackt, und Flüssigkeit durch diese Säule hindurchgeleitet, so weist 1 g des trockenen Harzes vor und nach der Modifizierung mit DEAE-Gruppen ein Volumen zwischen 3,0 und 4,0 ml auf.

Das erfindungsgemäße DEAE-modifizierte Harz kann dadurch erhalten werden, daß man eine Verbindung der nachfolgenden Formel

bindungen, wie sie durch die Formel

C₂H

2Π5

C₂H₅

N-C₂H₄-X

C₂H

2Π5

(wobei X für Halogen oder Hydrogensulfat steht) oder dessen Säureadditions-Salz in Gegenwart einer alkalisch reagierenden Verbindung mit einem makroporösen Phenol-Formaldehyd-Harz reagieren läßt, das funktionell, mit den DEAE-Gruppen reagierende Gruppen aufweist. Hierbei ist es wichtig, die Reaktion unter solchen Bedingungen durchzuführen, daß das Harz von dftm Reaktionsgemisch auch in den Innenabschnitten d6r Makroporen benetzt wird, damit DEAE-modifizierte Harze mit einem hohen Substitutionsgrad erhalten wenden.

Die zu d^r DEAE-Modifizierung verwendeten VerN-C₂H₄-X

wiedergegeben wird, oder deren Säureadditionssalze sind vorzugsweise das Hydrochlorid von /?-Diäthylaniinoäthylchlorid, das Hydrobromid von 0-Diäthylaminoäthylbromid oder /J-Diäthylaminoäthyl-Hydrogensulfat und ähnliche Verbindungen. Im Hinblick auf die Reaktivität und wirtschaftliche Erwägungen ist die Verwendung des Hydrochloride von /?-Diäthylaminoäthylchlorid besonders vorteilhaft.

Der Anteil an den zu verwendenden DEAE-Modifizierungsmitteln hängt von dem gewünschten Anteil an einzuführenden DEAE-Gruppen (Substitutionsgrad) ab; andererseits erweist sich ein Harz mit einem zu kleinen Anteil an solchen Gruppen als wenig spezifisch im Sinne der vorliegenden Erfindung. Es ist deshalb gewöhnlich vorteilhaft, einen über die stöchiometrischen Mengen hinausgehenden Überschuß zu verwenden, damit die Reaktion glatt abläuft. Andererseits ist es schwierig, genaue Voraussagen über die Anzahl der Mole des Harzes und die Anzahl der funktionellen, bei der DEAE-Modifizierung reagierenden Gruppen auf der Oberfläche des Harzes zu machen. Dementsprechend wird ein Anteil von 1/3 bis 10 Teilen DEAE-Modifizierungsmittel auf 1 Teil trockenes Harz angewandt; bevorzugt wird ein Anteil an 1/2 bis 3 Teilen DEAE-Modifizierungsmittel auf 1 Teil trockenes Harz. Zu den im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten alkalisch reagierenden Verbindungen gehören Alkalimetallhydroxide wie etwa Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid; Erdalkalimetallhydroxide wie etwa Calciumhydroxid oder Magnesiumhydroxid; und ähnliche Verbindungen. In verschiedenen Fällen können für diesen Zweck auch organische Amine wie etwa Triäthylamin und ähnliche Verbindungen eingesetzt werden. Vorzugsweise werden als alkalisch reagierende Verbindungen die Alkalimetallhydroxide eingesetzt, unter denen das Natriumhydroxid besonders bevorzugt verwendet wird.

Die alkalisch reagierende Verbindung wird in einem Anteil zugesetzt, welcher der 1/10- bis 5fachen

so Mol-Menge an DEAE-Modifizierungsmittel entspricht. Sofern es erforderlich ist, das Säureadditionssalz im Verlauf der Reaktion zu entfernen, wird eine ausreichende Menge alkalisch reagierende Verbindung vorgesehen, damit die Säure neutralisiert werden kann.

Zu den Phenol-Formaldehyd-Harzen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit DEAE-Gruppen modifiziert werden sollen, gehören Harze, die geeignete funktionelle Gruppen aufweisen, wie etwa die primäre Aminogruppe, die sekundäre Aminogruppe oder die

Hydroxylgruppe. In Übereinstimmung mit der Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen bereitzustellen, wobei die unbeweglich gemachten Enzyme im industriellen Maßstab als Katalysator eingesetzt werden sollen, wird ein solches Harz vorgesehen, das zusätzlich zu den obengenannten funktionellen Gruppen in großer Zahl Makroporen aufweist, deren Porengröße Werte von ungefähr 10 nm bis zu einigen 100 nm aufweist;

weiterhin soll das Harz Mikroporen aufweisen, was vom Ausmaß der Vernetzung abhängt, so daß insgesamt ein großes Porenvolumen und ein großer spezifischer Oberflächenbereich gewährleistet sind. Solche Makroporen werden auf physikalischem Wege durch ein besonderes Polymerisationsverfahren erzeugt. Harze mit Makroporen weisen eine bessere mechanische Festigkeit auf, als solche Harze, die lediglich Mikroporen enthalten; aus diesem Grunde sind Harze mit Makroporen besonders für einen kontinuierlichen Betrieb geeignet. Makroporöse Harze werden in der einschlägigen Fachwelt auch als MR-Harze, als MP-Harze, als Harze mit makro-rektikularer Struktur oder als Harze mit hochporöser Struktur u. dgl. bezeichnet. Damit die makroporösen Harze eine deutliche Wirkung im Hinblick auf das ünbewegiichmachen von Enzymen aufweisen, soll der spezifische Oberflächenbereich der Harze wenigstens 1 m²/g trockenes Harz betragen; sehr bevorzugt werden Harze mit einem spezifischen Oberflächenbereich von 5 m²/g trockenes Harz oder mit noch höheren Werten; der spezifische Oberflächenbereich des trockenen Harzes wird mittels der bekannten Absorption von Stickstoff bestimmt; hierzu kann ein handelsübliches Meßgerät verwendet wenden; weiterhin kann der spezifische Oberflächenbereich mittels des BET-Verfahrens bestimmt werden, um die bereits erhaltenen Werte zu bestätigen. Weiterhin soll das Gesamtvolumen an Makroporen mit einer Porengröße von 10 bis 200 ηm wenigstens 0.1 cmVg trockenes Harz betragen; vorzugsweise ist für das Gesamtvolumen dieser Makropo-

Tabelle 1

20 ren ein Wert von wenigstens 0,2 cmVg trockenes Harz vorgesehen; die Porengröße und das Porenvolumen werden mit einem handelsüblichen Porosimeter bestimmt, das auf der Basis des Eindringens von Quecksilber arbeitet; bei den ermittelten Meßergebnissen wird davon ausgegangen, daß die Makroporen zylindrische Form haben mit einem kreisförmigen Querschnitt. Größere Poren mit einer Porengröße von 200 nm und mehr tragen nur wenig zur Dimensionsbeständigkeit des unbeweglich gemachten Enzyms bei. Die mittlere Porengröße, fü.· die in Abhängigkeit von dem unbeweglich zu machenden Enzymen verschiedene Werte vorgesehen werden können, soll zwischen 15 nm und 100 nm liegen.

Solche makroporösen Harze, welche die oben angegebenen Anforderungen erfüllen, können nach bekannten Verfahren hergestellt werden; darüber hinaus sind bereits zahlreiche makroporöse Harze handelsüblich zugänglich. Weiterhin enthalten die meisten handelsüblich zugänglichen Harze als funktioneile Gruppen Hydroxylgruppen, aliphatische primäre Aminogruppen oder aliphatische sekundäre Aminogruppen.

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind einige Beispiele für die zuletzt genannten makroporösen Harze aufgeführt, gemeinsam mit deren physikalischen und chemischen Eigenschaften. Bei der DEAE-Modifizierung verändern sich der Oberflächenbereich und das Porenvolumen der Harze nicht nennenswert; sofern Änderungen festgestellt worden sind, liegen diese innerhalb der experimentellen Fehlergrenzen.

Handelsübliches
Harz

Matrix lonenaustauschende

Gruppen

!-"unklionelle Gruppen fur die DFiAI-- Modifizier.	Spez. OberfL- Bereich (nr/g)	Gesamt- poren- Volumen*) (cm-'/gl	Mitll. Po ren- ι durchm. (nm)	Ionen austausch vermögen (meq/g)
-OH	68.1	0.563	25	4.38
-OH	24.6	O.oOO	40	5.31
-OH. -NM₁. -NHR	31.6	0.534	42	7.10
-OH, -NHR	95.3	0.680	29	4.24
-OH	90.3	0.605	34	0
-OH	10.8	0,062	38	2.37

phenolKch tertiarisiertes Produkt

aus Polyäthylenpolyamin

phenolisch tertiarisiertes Produkt

aus Polyäthylenpolyamin

(Vergleichspräparat)

Anmerkung: Sämtliche Eigenschaften sind entsprechend den oben angegebenen Verfahren bestimmt und berechnet worden. ") Gesam'.porenvolumen der Makroporen mit einer Porengröße von 10 nm bis 200 nm.

phenol i sch Polyäthylenpolyamin

phenolisch teilweise tertiarisiertes

Produkt aus Polyäthylenpolyamin

phenolisch - j

Polystyrol quarternäres Ammonium- -OH salz (Typ II)

0,06

2.40

Im wesentlichen gibt es keinen besonderen oberen mechanische Festigkeit unzureichende Werte an, wenn Grenzwert für den spezifischen Oberflächenbereich und für den spezifischen Oberflächenbereich und das das Gesamtporenvolumen; andererseits nimmt die Gesamtporenvolumen zu große Werte vorgesehen

werden. Aus diesem Grund soll der spezifische Oberflächenbereich nicht mehr als 120m²/g betragen; das Gesamtporenvolumen soll nicht mehr als 80% des Gesamtvolumens des Harzes ausmachen.

Die Auswahl des für die Reaktion verwendeten Lösungsmittels ist nicht in besonderer Weise beschränkt; es kann ein wäßriges Lösungsmittel, ein nicht-wäßriges Lösungsmittel oder ein Gemisch aus Wasser mit einem nicht-wäßrigen Lösungsmittel vorgesehen werden. Die Reaktion wird gewöhnlich bei Temperaturen durchgeführt, die nicht oberhalb 200⁰C liegen; diese Beschränkung der Temperatur beruht darauf, daß bei zu hohen Temperaturen Kettenbrüche und/oder unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können; der bevorzugte Temperaturbereich für die Reaktion liegt unter 100⁰C; andererseits ist bei zu niedrigen Temperaturen die Reaktionsgeschwindigkeit gehemmt; aus diesen Gründen liegt ein besonders bevorzugter Temperaturbereich zwischen ungefähr 10 und 80⁰C. Das Reaktionsgemisch kann mit der Maßgabe gerührt werden, daß die Reaktionspartner gut durchgemischt werden, ohne daß das Harz zerbrochen wird.

Sofern das betrachtete Harz bereits vor der Einführung von DEAE-Gruppen ein anionenaustauschendes Harz darstellt (dessen lonenaustausch-Vermögen mittels Ca bezeichnet wird) können das auf die DEAE-Gruppen beruhende Anionenaustausch-Vermögen (nachfolgend als Cd bezeichnet) und das Gesamt-Anionenaustausch-Vermögen nach der Einführung von DEAE-Gruppen (nachfolgend als Crbezeichnet) mit der nachfolgenden Gleichung ausgedrückt werden:

Cp=Ct-Ca(XZY)

wobei X für das Gesamtgewicht des trockenen, anionenaustauschenden Harzes vor der DEAE-Modifizierung, und Y für das Gesamtgewicht des trockenen Harzes nach der DEAE-Modifizierung stehen. Der dabei ermittelte Wert für Co liegt zwischen 0 und ungefähr 5 meq/g trockenes Harz und kann manchmal auch negative Werte annehmen, wenn bei der DEAE-Modifizierung eine zu große Gewichtszunahme auftritt. Wie bereits oben ausgeführt worden ist, und noch deutlicher aus den nachfolgenden Beispielen ersichtlich wird, können ausgezeichnete Trägermaterialien für das Unbeweglichmachen von Enzymen dann erhalten werden, wenn der Wert von Co angenähert 0 beträgt. Andererseits kann nicht einfach aus dem Wert für Co abgeleitet werden, ob ein durch DEAE-Modifizierung erhaltenes Kunstharz ein gutes Trägermaterial darstellt oder nicht; vielmehr ist für die Beurteilung der Güte eines DEAE-modifizierten Kunstharzes als 1 rägermateriai das Verhältnis Z von Bedeutung, das die Gewichtszunahme bei der DEAE-Modifizierung entsprechend der nachfolgenden Gleichung wiedergibt:

Z= (Y/X-\) XlOO(Vo)

Daraus folgt, sofern für die DEAE-Modifizierung ein Harz vorgesehen wird, das bereits Anionenaustausch-Vermögen aufweist, soll vorzugsweise wenigstens eine der nachfolgenden Bedingungen erfüllt sein, nämlich

Cb>0,5 meq/g; und Z> 10;

vorzugsweise sollen die nachfolgenden Bedingungen erfüllt sein, nämlich

C_D> 1,0 meq/g; und Z> 20;
besonders bevorzugt soll wenigstens eine der nachfolgenden Bedingungen erfüllt sein, nämlich
Cd> 1,5 meq/g; und Z> 30.

Wenn andererseits die DEAE-Gruppen in ein Harz eingeführt werden, das lediglich Hydroxylgruppen als funktionell Gruppen für die Reaktion mit dem DEAE-Modifizierungsmittel aufweist, und selbst kein Anionenaustausch-Vermögen aufweist (unabhängig davon, ob das Harz Kationenaustausch-Vermögen aufweist), folgt aus der obigen Gleichung, daß Co Cr wird, so daß es angestrebt wird, daß der Wert für Co nicht kleiner sein soll als 1,0 meq/g; vorzugsweise soll unter diesen Bedingungen der Wert für Cd nicht kleiner sein als 2,0 meq/g, um ein Trägermaterial mit ausgezeichneten Eigenschaften für das Unbeweglichmachen von Enzymen zu erhalten. Sofern im Verlauf einer Reaktion eine große Anzahl DEAE-Gruppen nicht eingeführt werden kann, kann die Modifizierungsreaktion vorzugsweise 2 oder 3mal wiederholt werden. Gewöhnlich ist ein Harz, das neben den DEAE-Gruppen andere Anionen-austauschende Gruppen enthält, als Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen besser, als ein Harz, das als anionenaustauschende Gruppen lediglich DEAE-Gruppen enthält.

Eine der Besonderheiten der erfindungsgemäß als Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen vorgesehenen mit DEAE-Gruppen modifizierten makroporösen Harze besteht darin, daß das Unbeweglichmachen sowohl über kovalente Bindungen erzeugende Verfahren wie über Absorptionsverfahren möglich ist, solange einige Hydroxylgruppen, primäre Aminogruppen oder sekundäre Aminogruppen unverändert in dem Harz zurückbleiben.

Die Herstellung der unbeweglich gemachten Enzyme über ein Absorptionsverfahren kann nach üblichen Maßnahmen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das DEAE-modifizierte Harz mit einer wäßrigen Säure oder einer alkalischen Lösung (in Konzentrationen von 0,02 bis 3 m) behandelt werden, um die DEAE-Gruppen zu aktivieren; alternativ dazu kann das DEAE-modifizierte Harz mit einer Pufferlösung (in Konzentrationen von ungefähr 0,02 bis 3 m) behandelt werden, die nahe dem pH-Wert für die Enzymwirkung gepuffert ist; im Anschluß daran wird sorgfältig gewaschen und daraufhin das DEAE-modifizierte Harz für eine ausreichende Zeitspanne in eine Lösung desjenigen Enzyms eingetaucht, das unbeweglich gemacht werden soll (hierbei ist es wichtig, daß die Lösung auch die inneren Abschnitte der Makroporen des Harzes benetzt); im Anschluß daran kann gerührt werden, sofern dies angestrebt wird; weiterhin wird filtriert und das erhaltene Produkt gewaschen. Für dieses, auf Absorption beruhende ünbewegiichmachen, soii die Temperatur nicht mehr als 4O⁰C betragen, außer es handelt sich um ein wärmebeständiges Enzym; nach einer bevorzugteren Ausführungsform wird jedoch bei ungefähr I0°C oder noch niedrigeren Temperaturen gearbeitet. Das auf diese Weise hergestellte, unbeweglich gemachte Enzym kann gewöhnlich ungefähr 100 mg oder noch mehr Enzymproteine auf 1 g trockenes Trägermaterial enthalten; das Produkt ist beständig, solange es nicht mit einer Salzlösung von hoher Ionenstärke gewaschen wird. Zu den Enzymen, die gemäß der vorliegenden Erfindung an dem Trägermaterial unbeweglich gemacht werden können, gehören nicht nur diejenigen Enzyme, die lediglich aus einfachen Proteinen bestehen; sondern auch solche Enzyme, die Coenzyme erfordern. Weiterhin kann nicht nur eine einzige Sorte von Enzymen

aufgebracht werden, sondern es ist möglich, gleichzeitig 2 oder noch mehr verschiedene Sorten von Enzymen unbeweglich zu machen.

Sofern andererseits das Anbringen der Enzyme über ein Verfahren, das kovalente Bindungen erzeugt, vorgesehen ist, können verschiedene entsprechende Maßnahmen vorgesehen werden, welche die Reaktivität der Hydroxylgruppen, der primären Aminogruppen oder der sekundären Aminogruppen ausnutzen, welche in dem verwendeten Trägermaterial aus DEAE-modifiziertem Harz vorhanden sind. Im besonderen sei auf die relativ einfachen Verfahren zur Ausbildung kovalenter Bindungen verwiesen, mittels denen Enzyme dauerhaft angebracht werden können, wie etwa

(1) die Anbringung über s-Triazinyl-Derivate, wobei Cyanurchlorid oder dessen Derivate eingesetzt werden;

(2) die Anbringung unter Verwendung von Glutaraldehyd;und

(3) die Anbringung über die Verwendung von Carbodiimiden.

Sofern das Unbeweglichmachen mittels Verfahren erfolgt, die kovalente Bindungen erzeugen, ist der Anteil des unbeweglich gemachten Enzyms pro Gewichtseinheit Trägermaterial kleiner, als im Falle des Unbeweglichmachens über Absorptionsverfahren; andererseits kann ein Trägermaterial erhalten werden, dessen spezifische Aktivität an unbeweglich gemachten Enzymen ausgezeichnet ist, und das eine sehr gute Beibehaltung der Aktivität aufweist.

Zu typischen Beispielen für Enzyme, die erfindungsgemäß unbeweglich gemacht werden können, gehören Alkohol-Dehydrogenase, Aspartat-Aminotransferase, Asparaginase, Aspartat-Decarboxylase, Aminosäuren-Racemase, Asparagin-Synthetase, D-Aminosäuren-Oxidase, Amino-Acylase, λ- und /S-Amylase, Adenosin-Deaminase, Amylo-Glucosidase, Aspartase, Bromelain, Catalase, Cellulase, Cholin-Esterase, Chymotrypsin, Colagenase, Deoxyribonuclease, Dextranase, Ficin, Fumarase, Galactose-Oxidase, ß-Galactosidase, Glucose-Isomerase, Glucose-Oxidase, Glutaminase, Glutamat-Dehydrogenase, Hesperidinase, Hexokinase, Invertase, Inulase, Lactase, Esterase, Lactat-Racemase, Lipase, Lysozyme, Papain, Pronase, Pepsin, Penicillin-Amidase, Pectinase, Phosphatase, Phosphorilase, Maltase, Protease, Ribonuclease, Melibiase, Phenol-Oxidase, Tannase, Tyrosinase, Trypsin, Urease, Uricase, und weitere ähnliche Enzyme.

Sofern zum Unbeweglichmachen der Enzyme das Absorptionsverfahren benutzt wird, sind hierfür besonders Enzyme geeignet, deren isoelektrischer Punkt stärker im sauren Bereich liegt, als der optimale pH-Wert. Zum Beispiel seien hier genannt, Pronase, Amino-Acylase, Glucose-Isomerase, ^-Galactosidase (Lactase), Ribonuclease, ß-Amylase, Iso-Amylase, Pullulanase, Urease, Deaminase, Lipase, Esterase und ähnliche Enzyme. Sofern zur Anbringung andererseits ein Verfahren benutzt wird, das kovalente Bindungen erzeugt, kann hierfür irgendein beliebiges Enzym vorgesehen werden, mit Ausnahme solcher Enzyme, die beim Unbeweglichmachen Enzym-Aktivität verlieren.

Beispiel 1

In einem druckfesten Becherglas wurden 13,8 g Natriumhydroxid in 60 ml Wasser gelöst (sofern nachfolgend von »Wasser« gesprochen wird, soll sich dies stets auf destilliertes Wasser beziehen). In die

erhaltene Lösung werden 20,0 g trockenes Harz C (s. Tabelle 1) eingetaucht; zum Entgasen wurde ungefähr 50 min lang mit einer Wasserstrahlpumpe verbunden, während das Gemisch mit Eiswasser gekühlt wurde. Anschließend wurde unter Spülung mit 200 ml Wasser das Harz und die Natriumhydroxid-Lösung in einen 500-ml-K.olben überführt. Während das Gemisch langsam gerührt wurde, wurden im Verlauf von 2 Std. aus einem Tropftrichter 180 ml einer wäßrigen Lösung mit 50,0 g jS-Diäthylaminoäthylchlorid-Hydrochlorid (DEAEC ■ HCl) tropfenweise zugesetzt. Hierbei stieg die Reaktions-Temperatur von einem Anfangswert von etwa 2O⁰C bei Beginn der tropfenweisen Zugabe auf ungefähr 50^cC nach einer Stunde und wurde auf dieser Temperatur gehalten. Nachdem die tropfenweise Zugabe beendet worden war, wurde das Rühren für weitere 3 Std. fortgesetzt, daraufhin das Reaktionsgemisch filtriert und das Harz nacheinander mit Wasser, 0,5 m wäßriger Salpetersäure, Wasser, 0,5 m wäßriger Natriumhydroxid-Lösung, Wasser, 0,5 m wäßriger Salpetersäure, Wasser und 0,5 m wäßriger Natriumhydroxid-Lösung gewaschen. Anschließend wird das Harz sorgfältig so lange mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser einen pH-Wert von 6,9 aufweist. Anschließend wird das Harz nach dem oben angegebenen Verfahren getrocknet, die Gesamtmenge des gewogenen Harzes beträgt 28,9 g; daraus resultiert ein Z-Wert von 44,5%. Aus dem gemessenen Gesamt-Anionenaustausch-Vermögen von 6,74 meq/g wurde ein auf den DEAE-Gruppen beruhendes Anionenaustausch-Vermögen von 1,80 meq/g berechnet.

Beispiel 2

Es wurde das gleiche Harz und der gleiche Anteil an DEAEC ■ HCl verwendet wie in Beispiel 1. Nachfolgend sind lediglich diejenigen Anteile und Bedingungen aufgeführt, die sich vom obigen Beispiel 1 unterscheiden. Im einzelnen wurde eine wäßrige Lösung mit 14,0 g Natriumhydroxid hergestellt; das Harz wird zusammen mit der wäßrigen Lösung mit ungefähr 50 ml Wasser in einen 500-ml-Kolben überführt. Während das Reaktionsgemisch bereits eine Temperatur von 62° C aufweist, wird im Verlauf von 2 Std. eine Lösung von 50 g DEAEC · HCI in 70 ml Wasser tropfenweise zugesetzt. Eine Stunde nach Beginn der tropfenweisen Zugabe ist die Temperatur des Reaktionsgemisches auf 68°C angestiegen. Nach Beendigung der tropfenweisen Zugabe wird das Reaktionsgemisch insgesamt 7 Std. lang bei einer Temperatur von 55 bis 60⁰C gehalten, damit die Reaktion ablaufen kann. Anschließend wird das Harz analog zu Beispiel 1 filtriert, gewaschen und getrocknet. Die Gesamtmenge des erhaltenen Harzes beträgt 39,5 g; dessen Z-Wert beträgt 97,5%; an dem Harz wird ein Gesamt-Anionen-Austauschvermögen von 3,50 meq/g festgestellt; hieraus wird ein Co-Wert von — 0,09 meq/g errechnet; unter Berücksichtigung der experimentellen Fehlerquellen entspricht dies einem Cd-Wert von angenähert 0 meq/g. Die Bestimmung des Wassergehaltes zum Zeitpunkt der Trocknung ergab für das Ausgangsharz einen Wassergehalt von 0,084 g Wasser/g trockenes Harz; entsprechend weist das DEAE-modifizierte Harz C einen Wassergehalt von 0,0837 g Wasser/g trockenes Harz auf, was innerhalb der experimentellen Fehlerquellen praktisch den gleichen Wert ergibL Aus diesem Grunde muß geschlossen werden, daß in diesem Beispiel die Gewichtszunahme sowohl auf unbekannten Seitenreaktionen wie auf der üblichen DEAE-Modifizierung beruht

Be i s ρ i e I 3

Eine Lösung aus 7,2 g Natriumhydroxid in ungefähr 35 ml Wasser wird in einem Eiswasser-Bad gekühlt; in diese gekühlte Lösung werden 10,0 g Harz C eingetaucht und der Behälter mit dem Reaktionsgemisch anschließend 1 Std. lang an die Wasserstrahlpumpe angeschlossen, um das Gemisch zu entgasen. Daraufhin werden das Harz und die Natriumhydroxid-Lösung mit ungefähr 35 ml Wasser in einen 300-ml-K.olben gespült und daraufhin tropfenweise im Verlauf von 1,5 Sld. 60 ml eine wäßrige Lösung mit 18,1 g DEAEC ■ HCl zugesetzt; während der Zugabe wird das vorgelegte Gemisch bei einer Temperatur von 55 bis 60° C gehalten und kontinuierlich gerührt; 7 Std. nach Beginn der tropfenweisen Zugabe wird die Reaktion abgebrochen, das Produkt filtriert, und gewaschen und getrocknet, wie das bei Beispiel 1 beschrieben ist; man erhält insgesamt 15,72 g Produkt mit einem Z-Wert von 57,2%; es wird ein CtWert von 6,34 meq/g bestimmt, aus dem ein CV Wert von 1,82 meq/g errechnet wird.

Beispiel 4

In 25 ml einer 4 η wäßrigen Natriumhydroxid-Lösung werden 4,0 g sorgfältig gewaschenes und getrocknetes Harz E eingebracht; zum Entgasen wird ungefähr 30 min lang an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen, während das Gemisch bei 2 bis 4⁰C gehalten wird; anschließend wird das Gemisch unter Spülung mit ungefähr 20 ml Wasser in einen Kolben überführt. Das vorgelegte Gemisch wird in dem Kolben bei einer Reaktionstemperatur von 50 bis 60° C gehalten, langsam gerührt, und 28 ml einer wäßrigen Lösung mil 7,6 g ^-Diäthylaminoäthylbromid-Hydrobromid (DEAEB · HBr) tropfenweise im Verlauf von mehr als 1 Std. zugesetzt. 6 Std. nach Beginn der tropfenweise Zugabe wird die Reaktion abgebrochen, das Produkt filtriert, gewaschen und getrocknet, wie das in Beispiel 1 beschrieben ist. Es wird eine verhältnismäßige Gewichtszunahme von 10,f% festgestellt; der CrWert entspricht dem Co-Wert; beide haben einen Wert von 1,57 meq/g.

Sofern das auf diese Weise DEAE-modifizierte Harz als Ausgangsmaterial (4,42 g) verwendet wird und die zweite Reaktion wie oben angegeben wiederholt wird, wird eine Gesamtmenge Harz von 4,73 g mit einem Co-Wert von 2,48 meq/g erhalten. Sofern eine dritte DEAE-Modifizierung durchgeführt wird, und als Ausgangsmaterial das nach der zweiten DEAE-Modifizierung erhaltene Harz eingesetzt eird, wird eine Gesamtmenge von 5,04 g Harz mit einem Co-Wert von 2,74 meq/g erhalten.

Beispiele 5 bis 14

In der folgenden Tabelle 2 sind die Reaktionsbedingungen für die Herstellung verschiedener Trägermaterialien, sowie die Eigenschaften dieser Trägermaterialien aufgeführt. Die angegebene Wassermenge entspricht der Gesamtmenge an im Verlauf der Reaktion verwendetem Wasser. Sofern keine anderen Angaben vorliegen, wird das Ausgangsmaterial in eine wäßrige Lösung der alkalischen Verbindung eingebracht, anschließend etwa 30 bis 60 min lang entgast, während mit Eiswasser gekühlt wird; die Reaktionsdauer entspricht der Zeitspanne von Beginn der tropfenweisen Zugabe bis zum Filtrieren des Harzes; die Filtration, das Waschen und Trocknen erfolgen in gleicher Weise, wie das in Beispiel 1 angegeben ist.

Tabelle 2 Beispiel

Ausgangsharz

Gewicht

(gi

Menge
NaOH

(E)

Menge

DEAEC-

Menge
Wasser

(ml)

Anfangl.
Reaktionstemperatur

(⁰C)

Reaktionslemperatur

(⁰C)

5	D	10,0	6,9	25,0
6	B	20,0	13,8	50,0
7	B	10,0	10,0')	33,6²)
8	A	9,9	6,3	25,8
9	C	7,0	6,0	25,8
10	D	7,0	6,3	29,6³)
11	C	5,0	3,5	12,0
12	A	6,0	7,2	15,5
13	C	10,0	6,3	18,0
14	C	5,0	3,5	12,0
Vergleichs	F	10,0	7,5	18,1
beispiel 1
Vergleichs	G	10,0	7,5	18,1
beispiel 2
Anmerkungen:
') KOH.
²) DEAEB	HBr.
³) DEAFHS	= jS-Diäthylaminoäthylhydrogensulfat.

340
420
280
200
180
180

75

80

Aceton
70 + 70
Dioxan
50 + 50
100

100

22
20
20
20
20
20
22
22
20

20
20
20

55-60

60

20±2

20

22

90-95

20

20
60
60

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Beispiel	Zeitspanne	Dauer der	Reaktions
Nr.	bis zum	DEAEC-	dauer
	Erreichen	HCl-Zugabe
	der Reaklions-
	temperalur
	<h)	<h)	<h)
5	1.0	1.75	6
6	1,0	2.0	6
7	1,5	1.75	6
8	-	2,0	12
9	-	0	10
10	-	1,75	10
11	-	1.0	10
12	0,5	0.75	2
13	-	2,0	12
14	-	1.5	10
Vergleichs-	1,0	1,5	6

C₁

(meq/g)

beispiel 1

Vergleichsbeispiel 2

0,75

12,63	26,3
22,0	10,0
12,4	24,0
12,36	25
9,26	40
8,20	17,1
6,6	32,0
7,1	18,5
13,9	39,0
7,1	42,0
10,1	1,0

2.0

10,15

1,5

4,45
4,82
5,74
4,83
7,09
4,70
8,10
4,90
8,11
8,05
2,40

2,42

1,10

1,45

1,25

2,0

1,08

2,73

1,12

3,00

3,05

0,02

0,09

Nachfolgend wird über das Unbeweglichmachen von Enzymen an den erfindungsgemäßen Trägermaterialien, sowie über einige Untersuchungen zur Reaktionsfähigkeit berichtet. In den nachfolgenden Untersuchungen wird die spezifische Aktivität von Glucose-Isomerase, der Protehigehalt und der Fructose-Gehalt mittels der nachfolgend angegebenen Verfahren bestimmt:

1) Bestimmung der Aktivität

Einer Glucose-Isomerase-Lösung werden 0,1 m D-Glucose, 0,05 m Phosphatpuffer-Lösung und 0,005 m MgSO₄ · 7 H₂O zugesetzt, der pH-Wert wird bei 7,0 g halten; die Reaktion wird im Verlauf einer Stunde bei 70° C durchgeführt Anschließend wird der Anteil an gebildeter Fructose bestimmt. Eine Aktivitäts-Einheit entspricht der Menge an Enzym, die unter den angegebenen Bedingungen zur Bildung von 1 mg Fructose erforderlich ist.

Zur Bestimmung der Aktivität der unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase wird der Fructosegehalt in dem Filtrat bestimmt, wenn die Reaktion unter langsamem Rühren unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen durchgeführt wird; die einzige Abweichung besteht darin, daß anstelle der Glucose-Isomerase-Lösung die unbeweglich gemachte Glucose-Isomerase zugesetzt, und anschließend das Filtrat durch Filtrieren des Reaktionsgemisches abgetrennt wird. Wiederum entspricht einer Aktivitätseinheit der Anteil an unbeweglich gemachter Glucose-Isomerase, die zur Bildung von 1 mg Fructose erforderlich ist.

2) Bestimmung des Fructose-Gehaltes

Zur Bestimmung des Fructose-Gehaltes wird das Cystein-Carbazol-Sulfat-Verfahren bei 30⁰C durchgeführt und 30 min nach Beendigung der Reaktion quantitativ das Absorptionsvermögen bei 560 nm bestimmt. Unter diesen Bedingungen hat die prozentuale, auf Glucose zurückführbare Verfärbung nur einen Wert von ungefähr '/200 der auf den Fructose-Gehalt jo zurückführbaren Verfärbung und ist deshalb vernachlässigbar.

3) Bestimmung des Proteingehaltes

Diese Bestimmung erfolgt mittels einer quantitativer Analyse entsprechend dem Lowry-Verfahren, wie es ir »Seikagaku Jikken Koza« (Biochemical Experimem Course), Band 5, Seite 27, beschrieben ist; die Kalibrierkurve wurde unter Verwendung von kristallinem Rinder-Serumalbumin (250 μg/ml Lösung) angefertigt.

Versuch 1

Es werden 30 ml einer 0,05 m Phosphatpuffer-Lösunj (pH-Wert 7,65, mit 0,00:5 m MgSO₄ · 7 H₂O) hergestellt die 45 330 Einheiten Glucose-Isomerase (mit einem Proteingehalt von 399 rng) enthält; die Glucose-Isomerase wurde aus einer mittels Ultraschall zerkleinerter Suspension von lebenden, zum Stamm der Streptomyces gehörenden Mikroorganismus-Zellen isoliert und mittels Aceton-Fraktionierung gereinigt. In diese Lösung wexden 3,0 g des nach Beispiel 1 hergestellten DEAE-modifizierten Harzes eingebracht; zum Unbe weglichmachen des Enzyms wird 16 Std. lang bei 20° C unter leichtem Rühren bei 80 UpM gehalten.

Nach Ablauf dieser Reaktion wird die unbeweglid gemachte Glucose-Isomerase mittels Filtrieren abge trennt und mit 0,2 m Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wer 7,65) sowie mit Wasser gewaschen. Aus der Aktivitä des erhaltenen Filtrats wird errechnet, daß eine solche Menge Enzym immobilisiert worden ist, die 41 75( Glucose-Isomerase-Aktivitätseinheiten entsprechen daraus resultiert, daß 92,1% der eingesetzten Enzymaktivität unbeweglich gemacht worden ist.
In gleicher Weise wird aus dem in dem Filtral

b5 verbliebenen Proteingehalt bestimmt, daß 333,4 mg Protein unbeweglich gemacht worden sind, was einem Anteil von 83,3% des vorhandenen Proteins entspricht Dieses unbeweglich gemachte Enzym wird in eine mil

130 263/30:

Yl

Heizmantel versehene Säule (0 15 mm) eingebracht, und 3 m gereinigte Glucose-Lösung mit einem Durchsatz von SV=2,5 h.-¹ durch die Säule geführt, wobei die Säule auf einer Temperatur von 60⁰C gehalten wird 20Std nach Beginn der Umsetzung wurde' eine Umwandlung in Fructose von 50,4% festgestellt.

Vergleichsversuch 1

Der oben angegebene Versuch 1 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß anstelle des DEAE-modifizierten Harzes C das unmodifizierte Harz C eingesetzt worden ist; hierbei wurde ermittelt, daß 19 800 Aktivitätseinheiten unbeweglich gemacht worden sind, der Anteil an unbeweglich gemachtem Protein beträgt lediglich 167 mg. Wird dieses unbeweglich gemachte

Enzyin in eine Säule gepackt, und 3 m gereinigte Glucose-Lösung mit einem Durchsatz von SV=5,5 h"¹ durch die bei 65° C gehaltene Säule geführt, so wird lediglich ein Umwandlungsgrad von !9,0% festgestellt

Versuche 2 bis 8

Unter den gleichen Bedingungen analog zu Versuch 1 wurde gereinigte Glucose-Isomerase, die aus lebenden, zum Stamm der Streptomyces gehörenden Mikroorganismus-Zellen extrahiert worden ist, an verschiedenen Trägermaterialien unbeweglich gemacht; die erhaltenen Produkte weisen die in der nachfolgenden Tabelle 3 angeführten Eigenschaften auf; in Tabelle 3 entsprechen die Bezeichnungen der Trägermaterialien den Nummern der vorangegangenen Beispiele.

Tabelle 3	Träger	Menge	Aktivität des	Aktivität des	Durchsatz	von 3 m	gereinigter •Glucose-Lösung	Umwand
Versuch	material	Träger	zugesetzten	unbeweglich	durch die	Säule		lungsgrad in
Nr.	Nr.	material	Enzyms	gemachten	pH	SV	Tempe	Fructose nach
				Enzyms			ratur	20 bis 24 h
								50
		(g)	(Einheiten)	(Einheiten)*)		(h-¹)	(⁰C)	50
	2	3,0	45 330	41980	7,65	3,5	65	50,5
2	3	3,0	44 100	40 770	7,65	3,5	60	52
3	9	3,0	21 530	20 540	8,2	2,5	60	50,5
4	6	1,0	8 610	6 690	7,65	2,0	65	50
5	5	1,0	8 610	7 700	8,2	2,5	60	50
6	8	1,0	7 400	6 100	7,65	2,0	60
7	4	2,0	22 700	20 800	8,2	3,0	60
8

Berechnet aus der Aktivität der Waschwässcr.

Versuch 9

In 20 ml In wäßriger Natriumhydroxid-Lösung wurden 2,0 g des nach Beispiel 2 hergestellten, DEAE-modifizierten Harzes C eingebracht; anschließend wurde 15 min lang bei 4⁰C entgast und daraufhin durch Filtration die überschüssige Alkali-Lösung entfernt. Das verbleibende Harz wurde in 25 ml, bei Raumtemperatur gehaltenem Dioxan eingebracht; nach 5 min unter Rühren wurden dem Gemisch 20 ml einer Dioxan-Lösung mit 4 g Cyanurchlorid zugesetzt; anschließend wurde bei Raumtemperatur heftig gerührt. Nach Ablauf von 3 min wurden 25 ml kaltes Wasser zugesetzt und nach weiteren 5 see wurden 25 ml Eisessig zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Das Reaktionsgemisch wurde schnell mit kaltem Wasser und kaltem Aceton gewaschen. Das erhaltene Harz wurde in eine Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 7,8) eingebracht, die 20 400 Einheiten Glucose-Isomerase (mit einem Proteingehalt von 149 mg) enthält. Zum Unbeweglichmachen wurde 5 Std. lang bei 2 bis 4°C gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 0,2 η Natriumhydroxid-Lösung bei 7,8 gehalten wurde. Das unbeweglich gemachte Enzym wurde durch Filtrieren abgetrennt, mit (mit Eiswasser gekühlter) 5 m Natriumchlorid-Lösung, 0,1 m Phosphatpuffer-Lösung und eiskaltem Wasser (in dieser Reihenfolge) gewaschen, bis im Waschwasser kein Protein nachweisbar war. Aus der Enzymaktivität und dem Proteingehalt der Waschwässer wurde ermittelt, daß ein 17 500 Aktivitätseinheiten entsprechender Enzymanteil (86%) unbeweglich gemacht worden ist; der unbeweglich gemachte Proteingehalt wurde zu 121 mg (81%) bestimmt.

Versuch 10

200 mg handelsüblich zugängliches Enzym Pronase E (aus Streptomyces griseus) wurden in 25 ml 0,05 m Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 7,0, 4°C) gelöst; in diese Lösung wurden 2,0 g des nach Beispiel 1 erhaltenen, DEAE-modifizierten Harzes C eingebracht. Das Gemisch wurde langsam 8 Std. lang bei 4°C unter der Saugwirkung einer Wasserstrahlpumpe gerührt, um das Enzym durch Absorption unbeweglich zu machen. Daraufhin wurde das Produkt mit unbeweglich gemachter Pronase E sorgfältig mit 0,05 m Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 6,0) und daraufhin mit Wasser gewaschen. Es wurde festgestellt, daß 182 mg Enzym-Protein unbeweglich gemacht worden sind. Die spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms wurde bei 40⁰C und konstant bei 6,0

bo gehaltenem pH-Wert bestimmt, wobei als Substrat eine 20%ige DL-Lysin-Methylester-Lösung verwendet wurde; es ergab sich eine Aktivität von 3,42 μΜοΙ/mg · min, was 57% der spezifischen Aktivität des gelös'-n Enzyms entspricht.

Versuch 11

Im wesentlichen analog zu den in Versuch 9 angegebenen Bedingungen wurde das Enzym Pronase E

durch Erzeugung kovalenter Bindungen unbeweglich gemacht; die Abweichungen bestanden darin, daß anstelle von dem in Versuch 12 eingesetzten 2,0 g DEAE-modifizierten Harz C 2,0 g nach Beispiel 12 hergestelltes, DEAE-modifiziertes Harz A eingesetzt wurde, und anstelle der Glucose-Isomerase 20 400

Einheiten Pronase E verwendet wurden. Es wurde ein Anteil von 95,8 mg unbeweglich gemachtes Enzym/g Träger festgestellt; bei 40⁰C und konstant gehaltenem pH-Wert von 6,0 wurden mittels 20%iger DL-Lysin-Methylester-Lösung als Substrat eine spezifische Aktivität von 2,90 μΜοΙ/mg · min festgestellt

Versuche 12 bis 14

Das Enzym Pronase E wurde an verschiedenen erfindungsgemäßen, in der nachfolgenden Tabelle 4 aufgeführten Trägermaterialien unbeweglich gemacht Hierzu wurden zwei verschiedene Verfahren angewandt, nämlich einmal das Absorptionsverfahren, das im wesentlichen dem obigen Versuch 10 entspricht, und ein Verfahren zur Erzeugung kovalenter Bindungen, wobei

Tabelle 4

entsprechend Versuch 11 mit Cyanurchlorid gearbeitet wurde. Die Bezeichnung des Trägermaterials entspricht den obengenannten Beispielen. Die spezifischen Aktivitäten wurden jeweils bei 40⁰C und konstant bei 6,0 gehaltenem pH-Wert ermittelt, wobei als Substrat eine 20%ige DL-Lysin-Methy'.ester-Lösung verwendet wurde.

Versuch	Träger	Verfahren zum Unbeweglichmachen	Menge des	Menge des	Menge des	Spezifische
Nr.	material		Träger	vorgelegten	unbeweglich	Aktivität
	Nr.		materials	Enzyms	gemachten
					Enzyms
			(g)	(mg)	(mg/g-Träger)	(μ Mol/min · mg)

12 7 durch kovalente Bindungen 1,0 120 105 1,91

13 1 durch kovalente Bindungen 1,0 115 73 4,86

14 5 durch kovalente Bindungen 1,0 100 78 3,48

Versuch 15

Das Unbeweglichmachen von Lactase wurde im wesentlichen analog zu Versuch 9 mittels Cyanurchlorid unter der Erzeugung kovalenter Bindungen durchgeführt; im einzelnen wurden als Enzym 100 mg Lactase aus Asperigillus Oryzae, und als Trägermaterial 1,0 g, nach Beispiel 2 hergestelltes DEAE-modifiziertes Harz C eingesetzt. Nachdem das unbeweglich gemachte Enzym sorgfältig gewaschen worden ist, wurde ein Anteil von 66,7 mg unbeweglich gemachtes Enzym-Protein/g Trägermaterial festgestellt; bei 30⁰C und einem pH-Wert von 4,5 wurde mit 5%iger Lactose-Lösung als Substrat eine spezifische Aktivität von 5,2 μΜοΙ/ mg · min festgestellt; dies entspricht 30% der Aktivität einer entsprechenden Enzym-Lösung (die Lösung weist eine Aktivität von 17,3 μΜοΙ/mg · min auf).

Versuch 16

Bei diesem Versuch wurde Lactase aus Asperigillus Oryzae (jedoch mit einem gegenüber dem in Versuch 15 eingesetzten Enzym anderen Reinheitsgrads, nämlich mit einer Aktivität der Enzymlösung von 10,2 μΜοΙ/ mg · min bei 30⁰C und einem pH-Wert von 4,5) eingesetzt; im einzelnen wurden 165 mg dieser Lactase in 10 ml 0,02 m Phosphat-Citrat-Pufferlösung (pH-Wert 4,5) bei 4⁰C gelöst. In diese Lösung wurden 1,0 g des nach Beispiel 5 hergestellten, DEAE-modifizierten Harzes D eingebracht; zur Durchführung des Unbeweglichmachens wurde unter leichtem Rühren (80IJpM) 16 Stunden lang bei ungefähr 4⁰C gehalten. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das unbeweglich gemachte Enzym mit 0,05 m Phosphat-Citrat-Pufferlösung (pH-Wert 4,5) gewaschen und anschließend mit Wasser gewaschen. Es wurde ein Anteil von 123 mg unbeweglich gemachtem Enzym ermittelt; bei 30⁰C und einem pH-Wert von 4,5 wurden mittels 5%iger

Lactose-Lösung als Substrat eine spezifische Aktivität von 2,1 μΜοΙ/mg · min ermittelt.

Versuch 17

200 mg Lactase aus Aspergillus Oryzae (Enzymaktivität in Lösung bei pH-Wert 4,5 und 30°C 17,3 μΜοΙ/ mg · min) wurden in 10 ml 0,02 m Phosphat-Citrat-Pufferlösung (pH-Wert 5,5) bei 4⁰C gelöst In diese Lösung wurden 1,0 g des nach Beispie) 3 hergestellten, DEAE-modifizierten Harzes C eingebracht; zum Unbeweglichmachen wurde unter leichtem Rühren (80 UpM) 18 Std. lang bei ungefähr 4⁰C gehalten. Nach Beendigung der Umsetzung wurde mit 0,05 m Phosphat-Citrat-Pufferlösung (pH-Wert 5,5) und daraufhin mit Wasser gewaschen; es wurde festgestellt, daß 149 mg Enzym unbeweglich gemacht worden sind; bei pH-Wert 5,5 und 3O⁰C wurde mittels 5%iger Lactose-Lösung als Substrat eine spezifische Aktivität von 2,1 μΜοΙ/mg · min gemessen.

Versuch 18

In diesem Versuch wurde als Enzym handelsüblich zugängliche ß-Amylase aus Sojabohnen eingesetzt; das Enzym hatte eine Aktivität von 1,5XlO⁴ Einheiten/g; hierbei ist eine Aktivitätseinheit dahingehend definiert, daß für 1min bei pH-Wert 4,5 eine 100>> Glycose entsprechendes Reduktionsvermögen erhalten wird. 300 mg dieser j3-AmyIase wurden in 30 ml 0,02 m Acetat-Pufferlösung (pH-Wert 5,0) gelöst; von den unlöslichen Anteilen wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. In die verbleibende Lösung wurden 2,0 g des nach Beispiel 1 hergestellten, DEAE-modifizierten Harzes C eingebracht Nachdem durch Anschluß einer Wasserstrahlpumpe entgast worden ist, wird zum Unbeweglichmachen unter leichtem Rühren (80 UpM) 16 Std. lang bei ungefähr 4°C gehalten. Nach Beendi-

gung der Umsetzung wurde sorgfältig mit der angegebenen Acetat-Pufferlösung und daraufhin mit Wasser gewaschen; das Produkt enthält 129 mg unbeweglich gemachtes Enzym/g Trägermaterial. Dieses unbeweglich gemachte Enzym wird in eine, mit Heizmantel versehene, bei 5(T C gehaltene Säule gepackt und als Substrat eine 2%ige Lösung löslicher Stärke bei einem Durchsatz von SV = 0,4 h~' durch die Säule geführt Mittels dem Somogyi-Nelson-Vt-rfahren wurde die Zunahme des Anteils an reduzierendem Zucker bestimmt, um damit die Menge an gebildeter Maltose zu ermitteln. Hierbei wurden im Effluat 11,9 mg Maltose/ml Lösung festgestellt Unter diesen Bedingungen wurde 10 Tage lang eine kontinuierliche Reaktion durchgeführt Am 10. Tag wurden im Effluat immer noch 12,0 mg Maltose/ml Lösung festgestellt, woraus ersichtlich ist daß lediglich eine geringe Änderung erfolgt ist

Versuch 19

2,0 g von dem nach Beispiel 8 hergestellten, DEAE-modifiziertem Harzes A wurden mit 0,05 m Veronal-Pufferlösung (pH-Wert 7,0) equilibriert und dann in 30 ml 0,05 m Veronal-Pufferlösung eingebracht, die 300 mg Aminoacylase aus Aspergillus Oryzae enthält; zum Unbeweglichmachen wurde unter leichtem Rühren (80UpM) 15 Std. lang bei ungefähr 4° C gehalten. Aus der Aktivität des Filtrats wurde errechnet, daß das Produkt 97 mg unbeweglich gemachtes Enzym/g Trägermaterial enthält. Diese unbeweglich gemachte Aminoacylase wurde in eine mit Heizmantel versehene, bei 40⁰C gehaltene Säule (0 10 mm) gepackt; durch die Säule wurde kontinuierlich 0,2 m N-Acetyl-DL-Methionin-Lösung (pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt von 1 χ 10-⁴ m CoCl₂) geführt. Nach 24 Std. wurde eine 100%ige Hydrolyse des L-Isomeren festgestellt; auch nach weiteren 10 Tagen wurde kein Aktivitätsverlust festgestellt.

Versuch 20

400 mg handelsüblich erhältliche Adenyl-Deaminase (mit einer Aktivität von 50 000 Einheiten/g) zur Herstellung von Inosinsäure wurden in 50 ml 0,02 m Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 5,6), die bei ungefähr 4°C gehalten wurde, gelöst. In diese Lösung wurden 4,0 g des nach Beispiel 3 hergestellten DEAE-modifizierten Harzes C eingebracht. Zum Entgasen wurde an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen; anschließend wurde zum Unbeweglichmachen bei leichtem Rühren (80 UpM) 16 Stunden lang bei ungefähr 4° C gehalten. Es wurden 72 mg unbeweglich gemachtes Enzym/g Trägermaterial festgestellt. Dieses unbeweglich gemachte Enzym wurde in eine, mit einem Heizmantel versehene Säule (0 15 mm) gebracht; die Säule wurde bei 50⁰C gehalten und 4 Tage lang mit einem Durchsatz von SV = 1,1 h-' eine i%ige Adenylsäure-Lösung durch die Säule geführt; selbst nach 100 Std. wurde kein Aktivitätsverlust festgestellt.

Anwendungsbeispiele

Nachfolgend sind verschiedene Anwendungsbeispiele angegeben. Die Anwendungsbeispiele 1 bis 5 betreffen Versuche zur kontinuierlichen Isomerisierung, wobei in einer Säule an erfindungsgemäßen Trägermaterialien unbeweglich gemachte Glucose-Isomerase eingesetzt wurde. Die Anwendungsbeispiele 6 bis 8 betreffen Versuche. b<:i denen in absatzweisiem Betrieb wiederholt unbeweglich gemachte Pronase E eingesetzt wurde. Bei den Anwendungsbeispielen 9 und 10 wurde in absatzweisem Betrieb wiederholt unbeweglich gemachte Lactase eingesetzt Die bei diesen Versuchen ermittelten Ergebnisse sind in den Tabellen 5 bis 7 aufgeführt Die in den Tabellen aufgeführten Versuchs-Nr. beziehen sich auf die oben angegebenen Versuche und betreffen unbeweglich gemachte Enzyme, die entsprechend diesen Versuchen hergestellt und deren Aktivitäten entsprechend diesen Versuchen bestimmt worden sind. Die Glucose-Isomerase wurde in eine Säule gepackt, und 3 m gereinigte Glucose (54 W/V °/o) unter den gleichen Bedingungen wie in den obigen Versuchen angegeben, durch die Säule geführt. Dementsprechend wurde der Durchsatz SV bis zum Ende der Arbeitsweise in der Säule konstant gehalten; derjenige Zeitpunkt zu dem der Umwandlungsgrad in Fructose auf den halben Wert des ursprünglichen Wertes absinkt wird als Halbwertszeit bezeichnet (in Tabelle 3 entspricht die ursprüngliche Aktivität der nach 20 bis 24 Std. ermittelten Aktivität). Diejenige Menge an festen, gereinigten Glucose-Komponenten, die mit 1 g des unbeweglich gemachten Enzyms bis zu demjenigen Zeitpunkt behandelt werden, zu dem der Umwandlungsgrad in Fructose auf 1/4 des ursprünglichen Wertes abgenommen hat, wird als Produktivität bezeichnet. Sofern erfindungsgemäße Trägermaterialien eingesetzt werden, ist die Beibehaltung der Aktivität sehr gut und die Produktivität ist sehr hoch, wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist.

Bei den Versuchen mit unbeweglich gemachter Pronase E wurden 10 ml einer 10%igen L-Lysin-Methylester-Lösung als Substrat verwendet, und es wurden jeweils 100 mg der nach den entsprechenden Versuchen unbeweglich gemachten Enzyme eingesetzt. Bei der absatzweisen Arbeitsweise wurden die Versuche jeweils wiederholt. Für einen Versuch wurde eine Zeitspanne von 40 min benötigt; die Anzahl der Versuche, nach deren Ablauf die Umsetzung auf die Hälfte des im ersten Versuch festgestellten Wertes abgenommen hat, wird als Halbwertszahl bezeichnet; der Umsatz wurde jeweils mit einem pH-Meßgerät bestimmt.

Bei den Versuchen mit unbeweglich gemachter Lactase wurden ungefähr 100 mg unbeweglich gemachtes Enzym eingesetzt; als Substrat wurden 10 ml einer 5%igen Lactase-Lösung eingesetzt; jeder Versuch dauerte 30 min und wurde absatzweise unter leichtem Rühren (80 UpM) durchgeführt. Zur Bestimmung der Aktivität diente die Menge an gebildeter Glucose. Die weiteren Bedingungen dieser Versuche entsprachen den oben angegebenen Versuchen.

Tabelle 5

Kontinuierliche Isomerisierungsreaktion in einer Säule

Anwendungs- Beispiel	Versuch Nr.	Halbwertszeit der Aktivität	Produktivität
Nr.		(Tage)	(g Zucker/g unbewegl. Enzym)
I 2 3 4 5	1 2 3 5 8	95 43 53 48 46	20 500 13 150 16 600 12 800 14 800

Tabelle 6 Wiederholter	23 Einsatz von unbeweglicher	Pronase E	Tabelle 7 Wiederholter	24 Einsatz von unbeweglicher	Lactase
Anwendungs- Beispiel Nr.	Versuch Nr.	Halbwerts- 5 zahl	Anwendungs- Beispiel Nr.	Versuch Nr.	llalbwerts- zahl
6 7 8	14 18 19	90 50 25 ¹⁰	9 10	20 22	69 38

Claims

Patentansprüche:

t. Trägermaterial für das Unbeweglichmachen von Enzymen, erhal.cn durch Umsetzung

a) eines makroporösen Phenol-Formaldehyd-Harzes, das eine mittlere Porengröße von 15 bis 100 um, eine spezifische Oberfläche von wenigstens 1 m² pro g trockenes Harz und ein Gesamtvolumen an Makroporen mit einer Porengröße von 10 bis 200 nm von wenigstens 0,1 cm³ pro g trockenes Harz aufweist, und das gegebenenfalls mit Polyäthylenpolyamin mit nicht mehr als 4 wiederkehrenden Äthylenamineinheiten umgesetzt ist, wobei gegebenenfalls noch die Aminogruppen ganz oder teilweise in die tertiäre Form übergeführt werden, mit

b) einem Diäthylaminoäthyl-Derivat der allgemeinen Formel