NL8003723A

NL8003723A - Inulinase.

Info

Publication number: NL8003723A
Application number: NL8003723A
Authority: NL
Original assignee: Stamicarbon
Priority date: 1980-06-27
Filing date: 1980-06-27
Publication date: 1982-01-18
Also published as: DK151268B; EP0043169B1; DK151268C; US4397949A; DK283181A; DE3161176D1; EP0043169A1; CA1173766A

Description

*0

Is V

4 STAMICARBON B.V. 3202

Uitvinders: Peter J.H. PETERS te Geleen Pieter L. KERKHOFFS te Geleen

INULINASE

De uitvinding betreft enzympreparaten met inulinase-activiteit, hun bereiding en toepassing.

Het is bekend dat fructosepolymeren (inuline's) met behulp van enzymen tot fructose gehydrolyseerd kunnen woren. Het enzym kan verkregen 5 worden uit cultures van onder andere Saccharomyces fragills, Candida kefyr, Aspergillus niger en Fusarium roseum. Om de hydrolyse op industriële schaal te kunnen uitvoeren is een enzympreparaat met een zo hoog mogelijke activiteit, een grote stabiliteit en een optimale werking in zwak zuur milieu gewenst. Het doel van de uitvinding is een dergelijk 10 enzympreparaat.

Volgens de uitvinding wordt een enzympreparaat met inulinase-activiteit verkregen uit een cultuur van Aspergillus phoenicis.

Op deze wijze kan een enzympreparaat met een hoge inulinase-activiteit en een zeer lage Michaelis-constante verkregen worden, dat een 15 optimale inulinase-activiteit in een gunstig pH-gebied vertoont. Verder is de thermische stabiliteit groot en vertoont het enzym slechts weinig remming door zware-metaal-ionen en geen substraatremming. Een verder voordeel is dat in cultures van Aspergillus phoenicis het enzym met inulinase-activiteit extracellulair aanwezig is.

20 Bijzonder geschikt voor de bereiding van een enzympreparaat met inulinase-activiteit is Aspergillus phoenicis CBS 294.80, door aanvraagster gedeponeerd bij het Centraal Bureau voor Schimmelculturen te Baarn. Voor een beschrijving van Aspergillus phoenicis wordt hier verwezen naar ’The Genus Aspergillus' door K.B. Raper and D.I. Fennell 25 (Baltimore 1965) biz. 307-309.

De schimmel kan op een gebruikelijke voedingsbodem voorgekweekt worden. De sporen worden geoogst en overgebracht in een geroerd kweekvat, geschikt voor aerobe cultures. Men kan een gebruikelijk medium toepassen, bestaande uit een waterige gebufferde oplossing welke een assimileerbare 30 stikstof- en koolstofbron en een fosforbron bevat. Sporenelementen kunnen desgewenst toegevoegd worden. Een geschikt medium bestaat bijvoorbeeld uit een gesteriliseerde oplossing van 20 g gistextract, 1 g 800 3 7 23 2 * % t natriumammoniumfosfaat, 0,5 g ammoniumsulfaat en 15 g inuline In één liter water. Het toevoegen van glucose is minder gewenst, daar deze wordt omgezet in zuren. Door de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid inuline in het medium wordt de vorming van het gewenste enzym versneld. De pH van 5 het medium moet op een waarde van tenminste 4,0 gehouden worden. Bij een lagere pH wordt geen of vrijwel geen inulinase gevormd. De pH wordt bij voorkeur op een waarde tussen 5 en 7 gehouden. Bijzonder geschikt is een pH tussen 5,5 en 6,0. De temperatuur van de cultuur kan tussen 20 °C en 40 °C bedragen. Liefst past men een temperatuur tussen 25 °C en 30 °C 10 toe. Men kweekt onder aerobe condities. Van de totale hoeveelheid gevormd inulinase is ongeveer 85 % extracellulair aanwezig.

Na een kweekduur van 4 tot 10 dagen bevat de vloeistoffase een voldoende hoeveelheid van het gewenste enzym. Zo werd na 8 dagen kweken bij 28 eC en een pH tussen 5,5 en 6,0 een activiteit van 36 I.U./ml 15 kweekvloeistof gevonden. De, internationale eenheid (I.U.) is 1 ümol substraat/minuut. Door verwijderen van de cellen wordt een oplossing van het enzym verkregen, die desgewenst nog verder geconcentreerd kan worden door bij verminderde druk water af te destilleren. Het enzym kan in vaste vorm verkregen worden met de gebruikelijke methoden, zoals vriesdrogen, 20 sproeidrogen of droogdampen van de oplossing.

Het enzym kan geclassificeerd worden als inulinase (of inulase) EC 3.2.1.7.

Het volgens de uitvinding verkregen vrije enzym heeft een acti-viteitsmaximum bij ruim 60 °C en bij een pH tussen 3,5 en 4,5. De 25 Michaelis-constante Kjn is ongeveer 2 x 10"3 millimol/1, wat aanzienlijk lager is dan de waarde voor andere enzymen met inulinase-activiteit. Dit betekent dat het volgens de uitvinding verkregen enzym beter in staat is om inuline volledig te hydrolyseren dan bekende andere enzymen. Het enzym is verder weinig gevoelig voor remming door zware metaalionen, zoals 30 Hg(II). Uit de literatuur is bekend dat het uit cultures van Aspergillus niger verkregen enzym met inulinase-activiteit zeer gevoelig is voor remming door Hg(II). Het volgens de uitvinding verkregen enzym heeft verder een lage invertase-activiteit, dit in tegenstelling tot de uit cultures van gisten verkregen enzymen.

35 Het enzym kan in de vrije, wateroplosbare vorm gebruikt worden, maar voor industriële toepassing brengt men het bijvoorkeur in een water- 80037 23 3 onoplosbare, geïmmobiliseerde vorm. De immobilisatie kan met gebruikelijke methodes bewerkstelligd worden. Het enzym kan opgesloten worden in een polymeer matrix, bij voorbeeld in een polyacrylamide gel, een algi-naat gel of in celluloseacetaat. Het kan aan een ionenwisselaar geadsor-5 beerd worden, hoewel deze vorm van immobilisatie reversibel is en daarom niet de voorkeur geniet. Het is verder mogelijk het enzym te verknopen, al dan niet in aanwezigheid van een vulstof, met een bifunctioneel reagens zoals een dialdehyde, een dicarbonzuur of anhydride daarvan of een diisocyanaat. Ook kan men het enzym laten reageren met een polymeer 10 dat reactieve groepen bevat, zoals bij voorbeeld polyacrylzuuranhydride, een styreen-maleinezuuranhydride copolymeer of een poly-(-methylvinylether)-maleinezuuranhydride copolymeer. Verder kan men het enzym laten reageren met een synthetische of natuurlijke vaste stof die voorzien is van reactieve groepen. Als vaste stof kan onder meer glas, 15 staal, silica, alumina, een ionenwisselaarhars, puimsteen, spons, actieve kool of mineraal toegepast worden. Bovengenoemde en nog andere methoden zijn in de literatuur uitvoerig beschreven.

Gunstig is dat het geïmmobiliseerde enzym een lage Michaelis-constante behoudt en een optimale activiteit over een breed pH-gebied van 4,0 tot 20 ruim 5,5 bezit. Dit laatste houdt in dat schommelingen in de pH tijdens de hydrolyse toelaatbaar zijn, wat de toepassing van het geïmmobiliseerde enzym vergemakkelijkt.

Het met de werkwijze volgens de uitvinding verkregen enzym kan in vrije vorm voor de hydrolyse van inuline toegepast worden, dat uit 25 plantaardig materiaal gewonnen is. Ook kan de «tractie van het plantaardige materiaal met de hydrolyse gecombineerd worden op de in de ter inzage gelegde Nederlandse Octrooiaanvrage 7811389 beschreven wijze.

Voor de hydrolyse van een inuline-bevattende oplossing past men echter bij voorkeur het enzym in geïmmobiliseerde vorm toe. Het geïmmobiliseerde 30 enzym kan in een vast bed of gefluidiseerd bed of in een geroerde tankreactor gebruikt worden.

De hydrolyse van inuline wordt bij voorkeur uitgevoerd bij een pH tussen 4,0 en 6,0, een temperatuur tussen 20 °C en 65 °C en een inuli-neconcentratie tussen 5 en 30 gew.%, berekend op de substraatoplossing.

35 Onder inuline worden in dit kader alle in de natuur voorkomende oligomeren en polymeren verstaan, die bestaan uit één van glucose afgeleide eenheid 800 3 7 25 Λ 4 en 2 of meer van fructose afgeleide eenheden. ïnuline kan onder andere verkregen worden uit dahlia-knollen en de wortels van Jeruzalem-artisjok en cichorei.

Voorbeeld I

5 De stam Aspergillus phoenicls CBS 294.80 werd geënt op het volgende vooraf gesteriliseerde vaste medium: 30 g moutextract, 5 g bac-topepton (van Oxoid Ltd), 0,5 g ammoniumsulfaat, 5 g inuline (productcode 2327 van J.T. Baker Chemicals, Deventer, Holland), 0,2 g KC1, 20 g agar, 1 1 water. Na een kweektijd van 7 dagen bij 28 °C werden de gevormde 10 sporen geoogst.

Een cultuurmedium werd bereid door een oplossing van 20 g gistextract, 1 g natriumammoniumfosfaat, 0,5 g ammoniumsulfaat en 15 g inuline in 1 liter water te steriliseren. De pH van het medium was 5,5.

De op boven beschreven wijze verkregen sporen werden in het medium 15 gebracht, waarna men 7 dagen onder roeren (200 omw./minuut) bij 28 °C kweekte. Vervolgens werden de cellen door centrifugeren verwijderd. De overblijvende vloeistof bevatte het gevormde inulinase en had een activiteit van 36 I.U./ml. Toen de vloeistof bij 40 °C en verminderde druk drooggedampt werd en daarna de vaste stof weer opgelost werd in water tot 20 het oorspronkelijke volume, bleek de activiteit van de zo verkregen vloeistof gelijk te zijn aan de oorspronkelijke activiteit. De thermische stabiliteit van het enzym was dus goed. De activiteit van het vrije enzym was afhankelijk van de pH, met een optimum bij pH 3,5, en van de temperatuur, met een optimum bij ruim 60 eC. De Michaelis-constante ^ van 25 het vrije enzym was 10 mg/1. Aangezien de gebruikte inuline een mole-cuulgewicht van ongeveer 5000 bezat komt dit overeen met een van ongeveer 2 x 10~6 M. Toevoeging van HgCl2 tot een hoeveelheid van 0,5 gew.% (berekend op de oplossing) had slechts weinig effect op de enzymatische activiteit.

30 Voorbeeld II

In een kolom van 15 cm diameter en 200 cm lengte werd 25 1 van een 0,5 M calciumchloride oplossing, die tevens 0,5 gew.% inuline en 0,13 gew.% van een oppervlakte-actief middel (Tween-80) bevatte, gebracht. Men bereidde een homogeen mengsel van 750 ml celvrije kweekvloeistof, op de in voorbeeld I beschreven wijze verkregen uit een cultuur van Aspergillus 800 3 7 23

' V

5 phoenicis CBS 294.80, en 1750 ml 2 gew.% natrium-alginaat oplossing.

Het mengsel werd vla een fijndoseerinrlnchting langzaam boven in de kolom gedruppeld, waarbij zich kleine bolletjes van onderling gelijke afmeting vormden, die naar de bodem van de kolom zakten. Nadat het gehele mengsel 5 was toegevoegd werden de bolletjes afgefiltreerd en daarna onder roeren gewassen met achtereenvolgens een 0,5 M calclumchlorideoplossing, water en een 0,1 M acetaatbuffer (pH 5,0).

Het op deze wijze verkregen geïmmobiliseerde enzympreparaat werd gebruikt voor de hydrolyse van inuline. Hiertoe werd 10 kg van een 10 10 gew.% inuline-oplossing welke met fosfaat op een pH van 5,0 gebracht was, bij 50 °C met de bovenverkregen hoeveelheid geïmmobiliseerd enzym geroerd gedurende 1 uur. Met hoge druk vloeistof-chromatografie werd aangetoond dat de inuline volledig gehydrolyseerd was. Door filtratie werd de gevormde suikeroplossing afgescheiden. Van de suikers bleek 97 15 _ gew.% te bestaan uit fructose.

Voorbeeld III

Een fenolformaldehydehars met hydroxylgroepen (handelsproduct Duolite S761 van Dia-Prosim, Frankrijk) werd grondig gewassen met achtereenvolgens ethanol, water, verdunde loog, verdund zoutzuur, ver-20 dunde loog en 0,15 M fosfaatbuffer. 25 ml van de hars werd vervolgens één uur bij kamertemperatuur geroerd met een mengsel van 25 ml 0,15 M fosfaatbuf fer (pH 7,7) en 6 ml 25 gew.% glutaardialdehydeoplossing. De eind-pH bedroeg 6,5. De zo gemodificeerde hars werd afgefilteerd en vervolgens toegevoegd aan een op 4 °C gekoeld mengsel van 1,05 g enzymoplossing,

25 verkregen op de in voorbeeld I beschreven wijze, en 24 ml 0,15 M

fosfatbuffer. Na de suspensie 20 uur bij 4 °C geroerd te hebben werd de vaste stof afgefiltreerd en met een 1,5 M fosfaatbuffer (pH 6,5) gewassen. Door vergelijking van de activiteit van de oplossing van het vrije enzym met die van het op bovenstaande wijze verkregen 30 geïmmobiliseerde enzympreparaat werd gevonden dat het activiteitsren-dement van de immobilisatie 41,8 % bedroeg.

Het op deze wijze verkregen geïmmobiliseerde enzympreparaat werd getest. Het bleek dat de activiteit optimaal en vrijwel gelijkblijvend was in het pH gebied tussen 4,5 en 6,0.De activiteit was afhankelijk 35 van de temperatuur, met een optimum bij ruim 60 °C. De ^ was 20 mg/1, 800 3 7 23 6 overeenkomend met 4 x 10“6 m voor de omzettng van inuline met een mole-cuulgewicht van ongeveer 5000.

Overeenkomstige geïmmobiliseerde enzympreparaten konden worden verkregen uitgaande van andere harsen, zoals bijvoorbeeld Duolite A-7 5 (een aminogroepen bevattende fenol-formaldehydehars).

800 37 23

Claims

1. Enzympreparaat met inulinase-activiteit, met het kenmerk, dat het verkregen is uit een cultuur van Aspergillus phoenicis.

2. Enzympreparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het verkregen is uit een cultuur van Aspergillus phoenicis CBS 294.80 of een mutant 5 of variant daarvan.

3. Enzympreparaat volgens conclusie 1-2, met het kenmerk, dat het verkregen is door de schimmel te kweken in een verder gebruikelijk waterig medium bij een pH tussen 4,0 en 7,0 in aanwezigheid van inuline en afwezigheid van glucose en het in de kweekvloeistof aanwezige enzym te 10 winnen.

4. Enzympreparaat volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat het enzym in een in water onoplosbare vorm gebracht is door inkapseling in een calciumalginaat gel.

5. Enzympreparaat volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat het enzym 15 in een in water onoplosbare vorm gebracht is door het vrije enzym te laten reageren met een hars, verkregen door reactie van een organisch macroporeus, amino- en/of hydroxylgroepen bevattend polymeer met glutaardialdehyde.

6. Werkwijze voor het hydrolyseren van inuline in waterig milieu, in aan- 20 wezigheid van een enzym, met het kenmerk, dat men een enzympreparaat volgens één of meer der conclusies 1-5 toepast.

7. Werkwijze voor de bereiding van een enzympreparaat met inulinase-activiteit door op verder bekende wijze een geschikt micro-organisme te kweken en het gevormde inulinase te isoleren of anderszins voor een 25 substraat toegankeljk te maken, met het kenmerk, dat men een tot de soort Aspergillus phoenicis behorend micro-organisme toepast. 800 37 23