NL8201763A - Werkwijze ter bereiding van fructose uit insuline. - Google Patents

Description

V* ’ * / / N.0. 30993 1

Werkwijze ter bereiding van fructose uit inuline..

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een. nieuw microbieel inulinasepreparaat, dat geschikt is voor een industriële werkwijze ter bereiding van fructose en op een inuline versuikeringswerkwijze.

Fructose is de zoetste, van nature voedzame suiker met een zoet-5 heidsgraad die ongeveer 1,4 maal die van sucrose is. Fructose is gemakkelijk in water oplosbaar en heeft een grotere oplosbaarheid dan sucrose. Het zou een ruime toepassing in de voedingsmiddelenindustrie, bijvoorbeeld in alcoholvrije dranken kunnen vinden, wanneer de produktie— kosten aanzienlijk verlaagd zouden kunnen worden.

10 Fructose is in een groot aantal vruchten en in honing aanwezig.

Fructose bedraagt 50% van sucrose en kan uit sucrose bereid worden door zure of enzymatische hydrolyse gevolgd door scheiding. Echter is de scheiding van gelijke hoeveelheden glucose en fructose, die volgens speciale kristallisatietechnieken of door chromatografische scheidingen 15 kan worden uitgevoerd, kostbaar en is een van de redenen waarom de. kos— ..ten van fructoseproduktie tot dusverre aanzienlijk groter zijn: geweest dan voor sucrose.

Fructose wordt eveneens in grote hoeveelheden bereid door enzymatische isomerisatie van glucosesiropen ter bereiding van siropen, die 20 in zoetheid met sucrose vergelijkbaar zijn. In geïsomeriseerde siropen is echter het fructosegehalte beperkt tot ongeveer 42% tengevolge van het isomerisatie evenwicht tussen glucose en fructose. Siropen met hogere gehalten fructose, bijvoorbeeld 55% of 90%, worden, bereid door chromatografische scheidingstechnieken uit te voeren op geïsomeriseerde 25 siropen.

Een andere weg om het fructosegehalte van geïsomeriseerde siropen te vergroten zou mengen daarvan zijn met zuivere of vrijwel zuivere fructose siropen.

Een potentiële bron van fructose is inuline. Inuline is een niet 30 vertakt fructosepolymeer, dat in natuurlijke vorm bestaat uit 35 beta- · fructofuranoseresten met een eindstandig aanwezig glucosemolecuul, dat aan fructose gebonden is door een alpha-i, beta-2 binding zoals in sucrose.

Inuline komt als energiereserve voor in verschillende planten, in 35 het bijzonder in die van de Compositae familie, waarbij goede bronnen aardpeperknollen, dahliaknollen, cichorei en paardebloemwortels. Inuline is vrijwel onoplosbaar in koud water, maar kan in warm water worden opgelost (zie Yanousuy c.s. J.A.C.S. 55, (1933) 3658-3633).

8201763 sZ i 2

Inuline'kan met warm water uit het plantmateriaal volgens bekende methoden geëxtraheerd worden, zoals tegenstroomdiffusie van plantendelen bij verhoogde temperatuur of door het sap uit te persen Het onzuivere sap wordt door filtratie door geactiveerde kool gezuiverd of an-5 ders met kalk behandeld, zoals bij de verwerking van suikerbieten en door kool ontkleurd.

Naast inuline kan het extract polymeren bevatten met kortere ketenlengte, bijvoorbeeld fructosepolymeren en fructosepolymeren met eindstandige glucose. De gemiddelde ketenlengte van dergelijke polyme-10 ren kan variëren met de plantenbron en groei-, oogst- en opslagomstan-digheden, maar zal veelal tussen DP5 tot DP15 zijn (DP * polyme-risatiegraad).

Inuline kan door zuur onder relatief milde omstandigheden, pH 1-2, 1 tot 2 uren bij 80-90°C gehydrolyseerd worden. Echter geeft hydrolyse 15 met zuur aanleiding tot vorming van kleur en bijprodukt, bijvoorbeeld vorming van ongeveer 5% difructosedianhydriden, die het rendement dienovereenkomstig vermindert. (Whistler i.s. "Polysaccharide Chemistry" Academie Press, Inc., N.Y. 1953, blz. 287).

Aangezien fructose in oplossing het meest stabiel lijkt te zijn in 20 het pH traject van 4-6 wordt, een werkwijze voor het hydrolyseren van inuline, uitgevoerd in dit traject, verondersteld voordelig te zijn om vorming van bijprodukt en isomerisatie te vermijden.

Enzymen, die in staat zijn inuline te hydrolyseren, zijn in de literatuur beschreven als beschikbaar uit bronnen van plantenmateriaal 25 (inuline bevattende- wortels en knollen) en uit micro-organismen. De mi-crobiële enzymen kunnen uit gisten verkregen worden, zoals Kluyveromy-ces fragilis, Candida pseudotrophlcalis of kefyr alsmede uit fungi zo-als Aspergillus, Fusarium en Penicillium soorten.

De microbiële enzymen worden beschreven met pH optima in het tra-30 ject van 3,5-5,5 en temperatuuroptima tussen 45°C en 55°C. Vermeld , wordt dat de enzymen snel activiteit verliezen bij 60°C.

De microbiële inulinasen worden zowel intra- als extracellulair bereid. Het vermogen van de enzymen zowel inuline als sucrose te hydrolyseren is in sommige gevallen (Kluyveromyces fragilis) toegeschreven 35 aan een enzym met twee activiteiten. (Nham c.s. "Purification and Characterization of Inulase uit Kluyveromyces fragilis”, Korean Biochem, J. 10 (2), (1977) 95-108).

Zowel een endo- als een exo-inulase zijn uit Aspergillus niger gezuiverd. De endo component heeft zijn maximum activiteit bij pH 5,3 en 40 45°C; de exo component bij pH 5,0 en 55°C (Nakamura c.s., "Studies on 8201763 * z 3

Microbial Inulase part IV," Nippon Nogeikagaku Kaishi, 52 (4), (1978) 159-166 en Nagamura c.s., "Studies on Microbial Inulase part V," N.N.K., 52 (12), (1978) 581-587).

Tengevolge van de relatief beperkte oplosbaarheid van inuline zal 5 de hydrolyse van inuline in relatief verdunde oplossingen worden uitgevoerd en, zoals reeds uiteen gezet, bij voorkeur binnen het pH traject van ongeveer 4-6. Een 20 gew.%’s oplossing van zuivere inuline uit dah-liawortels kan bij 60°C worden bereid, maar een dergelijke oplossing is oververzadigd en precipiteer' bij lang bewaren. De maximale hoeveelheid 10 inuline, die in water bij 50-60eC oplosbaar is, zal vanzelfsprekend afhangen van de polymerisatiegraad van het fructosepolymeer. Vanzelfsprekend zal hoe lager de verwerkingstemperatuur, hoe lager de oplosbaarheid van inuline en hoe meer verdund de inuline oplossing moeten zijn.

Om microbiële infecties in de relatief verdunde inuline oplossin-15 gen te vermijden, dient de bedrijfstemperatuur van de industriële werkwijze tenminste ongeveer 60°C en bij voorkeur 60-65°C te zijn. Dit tem-peratuurniveau is gebruikelijke praktijk in de zetmeelindustrie, waar bijvoorbeeld het verzuikeringsproces gewoonlijk wordt uitgevoerd bij 60°C en 30 gew.% DS gedurende 2-5 dagen.

20 Helaas zijn de enzymen, die in de stand der techniek zijn vermeld, slecht geschikt voor commercieel gebmJk bij 60°C; zij desactiveren te snel. Toch is als praktische zaak 60°C het minimale temperatuuraiveau voor een redelijke hydrolyse zowel vanwege de inuline oplosbaarheid als ter vermijding van microbiële verontreiniging.

25 Er bestaat derhalve behoefte aan een effectief inulinasepreparaat, dat voldoende thermostabiel is om bij 60-65°G gedurende langere tijdsperioden, zoals 1-5 dagen, te worden toegepast om de hydrolyse van het inuline op een economische wijze mogelijk te maken. Voor zover aan aanvraagster bekend is tot dusverre geen inulinasepreparaat met deze ei-30 genschappen vermeld.

Aangezien de onderhavige uitvinding zichzelf met commerciële toepasbaarheid bezig houdt, dient te worden begrepen, dat een enzymatisch voortgebracht hydrolysaatprodukt veel beter in kosten en kwaliteit ten opzichte van het zure hydrolyseprodukt vereist is, aangezien fructose 35 van hoge kwaliteit zowel uit de inversie van sucrose als uit de fracti-onele scheiding van isosiropen verkrijgbaar is. Derhalve dient het inulinehydrolysaat 98 gew.% monosacharide van de (droge) vaste stoffen in oplossing te overschrijden. De uitdrukking "volledige hydrolyse" zoals hierna gebruikt, heeft betrekking op de bereiding van een inuline 40 hydrolysaat, dat 98% fructose plus glutose op basis van droge vaste 8201763 / ï * 4 stoffen overschrijdt.

De uitvinding ligt in de verrassende vondst, dat inuline het meest y rd wordt, wanneer zowel een endo- inulase activi- s inulinase activiteit aanwezig zijn en wanneer deze 5 inulinase componenten in een bepaalde verhouding, geschikt een gewichtsverhouding, aanwezig zijn.

Volgens een eerste aspect verschaft de onderhavige uitvinding een werkwijze voor het hydrolyseren van inuline met een microbieel inulina-sepreparaat, welke werkwijze het hydrolyseren omvat van inuline in een 10 waterbevattend milieu bij een pH in het traject van 3,5-7, bij een temperatuur in het traject van 60-65°C, bij aanwezigheid van een werkzame dosis van een inulinasepreparaat met een gewichtsverhouding endo-inuli-nase tot exo-inulinase in het traject van 1:10 tot 10:1, waarbij een enzymatisch volledige hydrolyse van inuline verkregen wordt.

15 Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding zijn de endo- en exo-component van het inulinase aanwezig in een gewichtsverhouding van 1:7 tot 7:1 en meer bij voorkeur 1:2 tot 4:1.

Het inulinase enzympreparaat van de onderhavige uitvinding heeft zijn optimum temperatuur bij 60°C, maar kan bij 65°C worden toegepast 20 bij pH waarden tussen 3,5-7, bij voorkeur 4-6 en meer bij voorkeur 4,5-5,0. Het behoudt ongeveer 50% van de oorspronkelijke activiteit ervan bij 60° C in 20 gew.% inuline na 48 uren. Bij voorkeur dienen 75% en meer bij voorkeur 90% van de activiteit behouden te blijven.

Volgens een ander aspect van de onderhavige uitvinding wordt een 25 inulinasepreparaat verschaft, dat uitstekend geschikt is om de werkwijze volgens de uitvinding uit te voeren, welk preparaat gekenmerkt wordt doordat het een verhouding van endo-inulinase tot exo-inulinase in het traject van 1:10 tot 10:1 op gewichtsbasis heeft.

De inuline hydrolyserende werkwijze volgens de onderhavige uitvin-30 ding kan als een discontinue werkwijze worden uitgevoerd in gebruikelijke (dextrine) versuikeringsapparatuur. Volledige hydrolyse van het inuline (d.w.z. 98% of meer fructose plus glucose) wordt bij de werkwijze verkregen. De reaktietijd hangt af van de enzymdosis en kan zich uitstrekken tot 2-4 dagen voor een meer doelmatig gebruik van het enzym 35 zonder vorming van bijprodukt of kleur. De toegepaste totale inulinase (exo en endo gecombineerd) dosis ligt in het traject van 0,25-10 Somo-gyi eenheden per gram inuline, bij voorkeur 1-5 Somogyi eenheden.’

Bij een industriële werkwijze zal het substraat voor de hydrolyse hetzij een extract van een inuline bevattende plant, bijvoorbeeld ci-40 chorei, aardpeper, dahlia, enz. of een suspensie van stukjes plantmate- 8201763 * * $ 5 riaal in water zijn. Een dergelijke extract wordt volgens bekende technieken bereid en kan door kalken, behandeling met kool of ionen-uitwis-seling, enz. gezuiverd worden, voordat de hydrolyse wordt uitgevoerd.

Bij zowel laboratoriumschaal als industriële schaal zullen inuli-5 ne-extracten vaak relatief verdund zijn, bijvoorbeeld 5-25% droge stof.

Het inuline-extract kan geconcentreerd worden tot de grens van de oplosbaarheid van inuline of de andere daarin aanwezige fructosepolymeren bij de verwerkingstemperatuur. Zoals reeds toegelicht zal het inuline-extract gevoelig zijn voor microbiële infectie, tenzij de reaktietempe-10 ratuur van de hydrolyse voldoende hoog wordt gemaakt om microbiële groei te voorkomen. Vanzelfsprekend kunnen conserveermiddelen worden toegevoegd, maar dit zal bijdragen aan de verwerkingskosten door de kosten van de conserveeremiddelen en vanwege hun verwijdering ervan na de bereiding.

15 Gevonden werd dat microbiële inulase enzympreparaten met een vol doende hoge thermostabiliteit om bij industriële hydrolysewerkwijzen bij 60-65°C te worden toegepast, bereid kunnen worden uit Aspergilli, die behoren, tot de Aspergillus niger groep.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding 20 worden de nieuwe inulasepreparaten bereid door kweken van Aspergillus ficuum stammen. Deze nieuwe inulasen zijn voldoende thermisch stabiel voor de uitvoering van de onderhavige uitvinding. Hun pH optimum is geschikt voor de uitvoering van de uitvinding. De hiervoor genoemde mi-cro-organismen brengen zowel endo— als exo-inulase voort. Echter is de 25 verhouding van endo— en exo-inulinase activiteit van het inulinase voortgebracht door het Aspergillus ficuum stam specifiek gebleken.

Aanvraagster heeft gevonden, dat het inulinase enzym voortgebracht door middel van Aspergillus ficuum, stam CBS 55565, dat identiek is met ATCC 16882, dat identiek is met IMI 91881 (onze aanduiding A 524) de 30 endo— en exo-inulinasecomponent binnen de bovengenoemde gewichtsverhouding bevat.

Dienovereenkomstig verdient het gebruik van dit specifieke micro-organisme voor de bereiding van het inulinase de voorkeur. Erkend wordt echter, dat andere deskundigen de voorkeur kunnen geven aan het mengen 35 van gescheiden voortgebrachte endo- en exo-inulinasen en daarom valt ook deze methode binnen de omvang van de onderhavige uitvinding, hoewel het een werkwijze is, die minder de voorkeur verdient.

De bijgevoegde figuren 1, 2, 3 en 4 zijn chromatogrammen, die de verschillende enzymatische werking van de endo— en exo-inulinasecompo-40 neuten van A. ficuum A-524 toelichten.

8201763 ' *· «- 6

Het endo- en exo-enzym kan gescheiden worden door ionenuitwisseling op CM-Sepharose CL-6B, dat een kationogene ionenuitwisselaar is, die als een gel geleverd wordt, zie Ion-Exchange Chromatography, Principles and Methods, uitgegeven door Pharmacia Fine Chemicals, biz. 18.

5 De endo-activiteit verplaatst bij pH 4,1 in 0,01 molair acetaatbuffer, terwijl de exo-activiteit gefixeerd is op de ionenuitwisselaar, waarna de exo-activiteit geëlueerd kan worden door middel van een zoutgradiënt in de buffer (NaCl 0 M - 0,3 M). Door middel van daarop volgende gel-filtratie op Sephracryl S-200 (bereid door covalente verknoping van al-10 lyldextran met Ν,η’-methyleenbisacrylamide, zie "Gel Filtration, THeory and Practice,” uitgegeven door Pharmacia Fine Chemicals, blz. 12, wordt nagenoeg een zuivere exo-activiteit voortgebracht. De frontfractie met endo-activiteit werd aan een ultrafiltratie onderworpen en de buffer werd veranderd tot een 0,01 M fosfaatbuffer met een pH van 7,0. Deze 15 endo-enzymoplossing werd aan een ionenuitwisselingsbehandeling onderworpen op de anionogene ionenuitwisselaar DEAE-Sepharose CL-6B, zie Ion-Exchange Chromatography, Principles and Methods," uitgegeven door Pharmacia Fine Chemicals, blz. 18. Onder deze gewijzigde omstandigheden wordt het endo-enzym op de ionenuitwisselaar gefixeerd en vervolgens 20 wordt dit geëlueerd door middel van een zoutgradiënt in de buffer (NaCl, 0 M - 0,3 M). Het endo-enzym werd verder gezuiverd door adsorp-tiechromatografie op een hydroxyapatiet agarose gel (HA-Ultrogel). Op deze wijze werden zeer zuivere endo- en exo-componenten voortgebracht.

Door middel van de zuivere endo- en exo-activiteiten werden speci-25 fieke antisera door immunisatie van konijnen bereid. Op basis van deze antisera konden kwantitatieve analyses van de endo— en exo-componenten worden uitgevoerd door middel van "rocket" immunoelektroforese, zoals beschreven in N.H. Axelsen i.s·, "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis," 1977, blz. 37. Door middel van rocket immunoelektroforese 30 van oplossingen van endo- en exo-componenten met bekende concentratie (verdunningsreeks) is gebleken dat een vrijwel lineair verband bestaat tussen de logaritme van de concentratie en het oppervlak beneden de rocket. Op basis van overeenkomstige standaardkrommen kan de hiervoor aangegeven verhouding tussen endo- en exo-component berekend worden 35 voor een inulinasepreparaat. Gevonden werd, dat de maximaal verkrijgbare inuline-omzetting (ongeveer 99%) bereikt wordt in een relatief korte tijd, wanneer inulinasepreparaten met de hiervoor aangegeven voorkeursverhoudingen tussen endo- en exo-activiteitscomponenten gebruikt worden.

40 Tengevolge echter van het feit, dat de rocket immunoelektroforese 8201763 7 analyse niet noodzakelijkerwijze onderscheid maakt tussen actieve en inactieve inulinase, wordt de inulinase activiteit en de invertase-ac— tiviteit van de inulinasepreparaten, volgens de onderhavige uitvinding, ook bepaald door middel van de hierna aangegeven bepalingen van de en-5 zymatische activiteit. De inulinase-activiteit (die zowel de endo als de exo-activiteit omvat) wordt op de volgende wijze bepaald: substraat: 5% inuline in acetaatbuffer (0,1 M) pH 4,7

incubatie: 1 ml substraat +- 1 ml enzym 20 min, 50°C

stopreagens: 4 ml 0,5 N NaOB.

10 De vrijgemaakte reducerende suikers (fructose en een kleine hoe veelheid glucose) worden kwantitatief bepaald door middel van de (Somo-gyi-Nelson methode, zie Journal of Biological Chemistry, 153 (1944) 375-380.

Een inulinase activiteitseenheid wordt gedefinieerd als de hoe-15 veelheid enzym, die beschikbaar is voor de vorming van een micromol reducerende suiker per minuut onder de hiervoor aangegeven omstandigheden.

De invertase activiteit (die in hoofdzaak de exo-activiteit omvat) wordt op de volgende wijze bepaald: 20 substraat 10Z sucrose in acetaat buffer (0,1 molair) pH 4,7

incubatie: 1 ml substraat + 1 ml enzym 20 min, 50°C

stopreagens: 1 ml 0,1 N NaOH

De vrij gemaakte glucose wordt kwantitatief bepaald door middel 25 van de (G0D-PERID methode, zie Instruction Shewets for Manual Assays '77, Boehringer Mannheim GmbH Diagnistica, Sheet 277.439.6 (1).

Hoewel scheiding van de inulinase in zuivere exo- en endo-compo— nenten uitvoerig hiervoor is besproken en de aldus gezuiverde enzympro— dukten werden toegepast bij het onderzoekwerk, waaraan enkele van de 30 hierna verschafte voorbeelden zijn ontleend, zal de praktijk van de onderhavige uitvinding op grote schaal gewoonlijk worden uitgevoerd met enzymen van industriële kwaliteit (d.w.z. minder zuivere enzymproduk-ten) voortgebracht door bewerking van een micro-organismestam die de voorkeur verdient. Bovendien zou de wens bestaan de endo- en exo-inuli-35 naseverhoudingen van het enzympreparaat van industrieële kwaliteit passend te maken om het beschikbare bijzondere inulinebronsubstraat in overeenstemming te brengen' met een grootschalige faciliteit, fractione— ring van een gemengd inulinase enzym zoals hiervoor beschreven zal niet de gebruikelijke keuze van de deskundige zijn. De voorkeur zou de toe-40 voeging van enig in hoofdzaak endo- of exo-inulinase, welke geschikt is 8201763 ** ψ 8 (bereid door kweking van een verschillende stam) in het enzympreparaat, verdienen.

Samenvattend; inuline wordt gehydrolyseerd bij 60-65°C en de hydrolyse is het meest doelmatig wanneer de verhouding tussen de endo- en 5 exo-componenten in het inulinase in het hiervoor beschreven voorkeurs-gewichttraject van 1-7 en 7-1 ligt. Vrijwel geen bijprodukten worden tijdens het hydrolyseproces gevormd. De verkregen fructosesiroop kan geconcentreerd en gezuiverd worden volgens gebruikelijke methoden voor mengdoeleinden. Ook wordt fructose gekristalliseerd, zo mogelijk na 10 scheiding van glucose, om kristallijne fructose op te leveren. Voorbeelden Voorbeeld I

Kweken van een inulinase producerend micro-organisme.

Aspergillus ficuum (A 524) werd op de volgende wijze gekweekt: 15 Kweek van inoculum

De entcultuur werd op een schuin geplaatste agar bij 37°C gedurende 7 dagen op agar met de volgende samenstelling gekweekt: ë/1 gist extract (Difco)...............4 20 K2HPO4...........................1

MgS04,7H20.......................0,5 glucose. .......................15 agar (Difco).....................15 H20 tot.......................1000 ml 25 Enten van de schudfles

De kweek van de inulinase producerende micro-organismen wordt uitgevoerd inErlenmeyer kolven van 500 ml, die voorzien zijn van een insnijding en een inoculatie-opening van rubber.

Inoculum van een schuin opgestelde agarbuis werd bereid door 9 ml 30 steriel water, dat 0,1% Tween 80 bevat, over de schuin opgestelde agar te gieten met daaropvolgend schudden op een Whirling menger. De totale suspensie werd gebruikt om één schudkolf te enten.

Kweek

De kweek in schudflessen wordt bij 37°C gedurende 7 dagen uitge— 35 voerd onder toepassing van 100 ml van een substraat met de volgende samenstelling: g/1 geweekte malsvloeistof............20 NH4H2PO4...........................12 40 KC1................................0,7 82.017 63 9 Λ ♦ τ

MgS04,7H20.........................0,5 κ2ηρο4............................10,0

FeS04,7H20.................. .0,1 sucrose...........................25 5 CaC03..............................0,05

Pluronic...........................0,1

Voorafgaande aan de behandeling in de autoclaaf wordt de pH van het substraat op 4,5 ingesteld.

De volgende opbrengsten werden verkregen: 10 inulinase activiteit invertase activiteit eenheden/ml_ eenheden/ml _ A.ficuum A 524 3 19

Voorbeeld II

Wijze van werking van de twee inulinasecomponenten 15 90 gram inuline van dahliawortels Sigma nr. 1-3754, hierna aange— duid als Sigma inuline, werden in warm water tot een totaal gewicht van 450 g opgelost. De pH werd bij 60°C op 4,5 ingesteld en twee kolven werden met elk 150 g van de oplossing gevuld. De kolven waren voorzien van magnetische roerders en in een waterbad van 60°C geplaatst. Aan de 20 eerste kolf werd 0,175 ml zuivere exo-inulinasecomponent, overeenkomend met: 2,2 inulinase-eenheden per gram inuline toegevoegd. Aan de andere kolf werd 0,7 ml zuivere endocomponent, overeenkomend met 1,4 eenhe— den/g inuline tóegevoegd.

De exo- en endo-enzymen werden bereid uit Aspergillus fieuum A 524 25 zoals beschreven in voorbeeld 1 en werden gescheiden zoals daarin is beschreven.

Monsters werden bij ingestelde tijdsintervallen genomen en 10 minuten ia een kokend-water bad verhit om de enzymen te inactiveren. Na koeling werden de monsters gefiltreerd en vervolgens met een ionenuit-30 wisselingshars (Bio-Rad AG 501-X8 [D]) als gemengd bed verwarmd om as en oplosbare stikstof te verwijderen voordat door gelchromatografie geanalyseerd wordt.

De chromatogrammen na een reaktie van 4 en 48 uren zijn in de figuren 1, 2, 3 en 4 voorgesteld. Het blijkt dat de werkingswijzen van de 35 twee enzymen geheel verschillend zijn.

Het exo-enzym vormt in hoofdzaak DP^ en slechts ondergeschikte pieken tussen DP2 en DP^4 worden gezien. Dit wijst op een wijze van werking, waarbij het inulinemolecuul trapsgewijze wordt afgebroken tot fructose en glucose vanaf het fructose-einde. Daartegemover geeft 40 het endo-enzym aanleiding tot vorming van in hoofdzaak DP3 tot DPg Λ- ψ ίο en slechts ondergeschikte pieken van DP]_ en DP2* Dit is een typisch endo-aantastingspatroon. Echter kunnen met dit endo-inulinase blijkbaar ook DP]_ en DP£ groepen worden gesplitst, maar bij een veel langzamere snelheid dan met het exo-enzym wordt gezien.

5 Voorbeeld III

Menging van exo- en endo-componenten 160 g Sigma inuline werden in warm water tot een totaal gewicht van 800 g opgelost. De pH werd op ongeveer 4,5 bij 60°C ingesteld. Zeven kolven werden elk met 100 g oplossing gevuld en van magnetische 10 roerders voorzien en vervolgens in een waterbad van 60°C geplaatst.

Endo- en exo-componenten werden aan de kolven toegevoegd, waarbij de totale enzymhoeveelheid op protelnebasis constant werd gehouden, maar de verhouding tussen endo- en exo-enzym volgens het volgende schema werd gevariëerd: 15 endo/exo ml ml ' totale activiteit/g inuline _verhouding endo exo Somogyi eenheden 1 00 0,192 0 0,54 2 7 0,168 0,024 0,92 3 3 0,144 0,048 1,3 20 4 1 0,096 0,096 2,1 5 1/3 0,048 0,144 2,8 6 1/7 0,024 0,168 3,2 7 _0_0 0,192_3J_ 1 ml endo-enzym en 1 ml exo-enzym hadden dezelfde hoeveelheid enzym op 25 protelnebasis.

Bij ingestelde tijdsintervallen werden monsters genomen en in een kokend-water bad gedurende 10 minuten verhit om de enzymactiviteit te inactiveren. Na koeling werden de monsters gefiltreerd en vervolgens behandeld met een ionenuitwisselingshars (Bio-RAD AG 501-X8 [D]) als 30 gemengd bed om as en onoplosbare stikstof te verwijderen voordat analyse met HPLC plaats had. Resultaten zijn in de tabel hierna opgenomen.

Op het chromatogram kan niet in alle gevallen glucose van een andere piek, waarschijnlijk difructose gescheiden worden. Grote hoeveelheden van deze verbinding worden gereflecteerd in een weinig veranderde 35 retentietijd voor glucose. Tot DP4 behoren sacchariden met een ketenlengte van 4 of hoger.

DP1-DP3 zijn sacchariden met een ketenlengte van 1 (behalve glucose en fructose) tot 4.

Het voorbeeld licht toe, dat de meest doelmatige hydrolyse wordt 40 uitgevoerd wanneer de endo/exo verhouding ongeveer 1 is.

8201763 -Λ 9 % t 11 endo/exo 24 uren 48 uren 72 uren verhouding___ fructose 14,3 29,1 47,3 glucose 9,3 12,5 12,6 5 DP4+ 31,9 19,8 11,8 _DPt-DP^ 44,6_39,5_28,4 7 fructuse 62,2 83,6 89,3 glucose 10,1 7,0 5,2 DP4+ 13,8 3,2 1,2 10 _DPt-DPt 14,0_6j2_4,4 3 fructose 84,8 90,4 91,2 glucose 4,8 5,5 5,8 DP4+ 6,2 1,5 0,9 _DPt-DP^ 4,2_2J_2jl 15 1 fructose 93,3 94,3 93,7 glucose 3,8 4,7 5,4 DP4+ 1,9 0,6 0,4 _DP-ι -PP7 1,0_0^4_0Λ 1/3 fructose 91,1 93,8 94,3 20 glucose 3,9 4,8 4,8 DP4-h 1,4 1,0 0,5 _DP-i-DP^ 0,9_0^5_0^4 1/7 fructose 90,0 93,5 94,4 glucose 3,9 4,6 4,3 25 DP4+ 5,3 ' 1,5 0,8 _DPt-DP^ 0,8__<^4 0 fructose 84,8 89,6 90,4 glucose 3,4 4,1 5,0 DP4+ 11,3 5,7 3,4 30 _DPt-DPs 0,5_0^5_1,3

Voorbeeld IV

Hydrolyse van inuline-extraet onder toepassing van verschillende endo— exo componentverhoudingen.

35 Bereiding van substraat 22,8 g stukjes gedroogde cichoreiwortel worden met 227 kg water bij 75°C gedurende 1 uur bij de natuurlijke pH 5,3 geëxtraheerd. Het mengsel wordt gefiltreerd en de natte wortels worden opnieuw met 150 kg water bij 75°C gedurende 30 minuten geëxtraheerd.

40 De twee extracten gaven in totaal 295 1 extract met een gehalte 8201763 t 12 droge stof gemeten als 3,5° Brix.

Het extract wordt door kalken gezuiverd. Twee porties van 687 g Ca(0H)2 elk worden achtereenvolgens bij een temperatuur van 35-40°C toegevoegd. De filtratie wordt bij 40-45“G uitgevoerd. C0£ wordt aan 5 het filtraat toegevoegd, waardoor de pH op ongeveer 7 wordt verlaagd; geen neerslag wordt waargenomen. De oplossing wordt met geactiveerde kool behandeld (2% kool op basis van gedroogde wortels) bij 75°C gedurende 30 minuten. De koolstof wordt door filtratie verwijderd en de oplossing wordt onder een verminderde druk verdampt tot. een gehalte droge 10 stof van ongeveer 24° Brix. De verkregen inuline-oplossing bezat een bruinachtige kleur.

Hydrolyse van inuline-extract.

Ongeveer 800 ml van de voorafgaande inuline-oplossing wordt op een Brixwaarde van 20° verdund, de pH wordt op 4,5 ingesteld en de oplos-15 sing wordt in 7 kolven verdeeld met 800 g oplossing in elk. De kolven werden voorzien van magnetische roerders en in een waterbad van 50°C geplaatst.

Sndo— en exo-enzymen werden aan de kolven toegevoegd, waarbij de totale enzymhoeveelheid op protelnebasis constant werd gehouden, maar 20 de endo-exo componentverhouding volgens de volgende^ tabel werd gevari— ëerd:

endo/exoverhou- ml ml tot. act./°Brix DS

ding protelnebasis_exo_endo Somogyi eenheden 0 0,096 0,27 25 7 0,012 0,084 0,46 3 0,024 0,072 0,65 1 0,048 0,048 1,05 1/3 0,072 0,024 1,4 1/7 0,084 0,012 1,6 30 _0_0,096 0_ 1,8_ 1 ml endo-enzym en 1 ml exo-enzym hadden op proteïnegewichtsbasis ongeveer dezelfde hoeveelheid enzymcomponent.

Op gestelde tijdsintervallen werden monsters genomen en in een bad met kokend water gedurende 10 minuten verhit om de enzymactiviteit te 35 inactiveren. Na koeling werden de monsters, met inbegrip van een mon-stersubstraat zonder toegevoegd enzym, gefiltreerd en vervolgens behandeld met een ionenuitwisselingshars (Bio-RAD AG 501-X8 [D]) als gemengd bed om as en onoplosbare stikstof vöör de HPLC analyse te verwijderen. De resultaten zijn in de tabellen C en D gegeven.

40 "Glucose" is de gecombineerde hoeveelheid glucose en andere compo- 8201763 13 nenten, mogelijkerwijze difructose, die niet op de chromatogrammen gescheiden worden. DP4+ omvat sacchariden met een ketenlengte van 4 of meer plus verontreinigingen in dit voorbeeld, bijvoorbeeld zout en proteïne.

5 DP^-DPg zijn sacchariden met een ketenlengte van 1 tot 4, be halve glucose, fructose.

De eindopbrengst van glucose bij dit experiment is tamelijk hoog hetgeen wijst op een lage gemiddelde ketenlengte van de fructosepolyme-ren.

10 Hier is echter te zien dat de meest doelmatige hydrolyse wordt uitgevoerd wanneer de endo/exo-enzymverhouding dicht bij 1 is.

Tabel C

Samenstelling inuline substraat fructose 0,7% 15 glucose 0,2% sucrose 5,5% DP4+ 90,4% DPL-DP3 3,2%

20 Tabel D

endo/exo 24 uren 49 uren verhouding __ fructose 12,7 21,5 ''glucose" 7,1 9,2 25 DP4+ 42,7 31,8 _DPl -PP 3_ 37,6_37,5 7 fructose 49,6 71,2 "glucose" 10,9 11,0 DP4+ 18,4 4,9 30 _DPi-DPq_.21,1_12,9 3 fructose 68,9 82,2 "glucose" 11,4 12,3 DP4+ 8,2 2,4 _DPl -PP?_1M_3,2 35 1 fructose 81-,5 84,0 "glucose" 12,2 13,0 DP4+ 4,1 1,8 _DPl -PP?_2j2_1,2 8201763 * 14 1/3 fructose 79,5 83,7 ••glucose" 12,8 13,1 DP4+ 4,5 2,0 _DPt -PP 7_3^2_1,1 5 1/7 fructose 79,0 83,6 "glucose" 12,5 12,8 DP4+ - 5,6 2,5 _DPi -DP^_ 2J|_1,1 10 0 fructose 79,4 83,4 "glucose" 12,5 12,2 DP4+ 6,5 3,0 _DPt -DPrt_ lj5_1,4

15 Voorbeeld V

Hydrolyse van inuline onder toepassing van verschillende verhoudingen endo/exocomponent.

6 Kolven, die elk. 100 g van een 20%’s Sigma, inuline oplossing bij een pH van 4,5 bevatten, werden samengesteld. De kolven werden van mag-20 netische roerders voorzien en in een waterbad van 60°C geplaatst.

Endo— en exo-inulase-enzymen werden aan de kolven toegevoegd, waarbij de enzymactiviteit binnen een nauwer traject werd gehouden dan in voorbeeld III, evenwel opnieuw onder variëring van de verhouding tussen de endo- en exo-enzymen gravimetrisch bepaald volgens de volgen-25 de tabel: endo/exo verhouding endo/exo verhouding soar van activiteiten· op proteinebasis_op act, basis_per gram inuline_ CO OO 0,67 30 4.1 0,6 0,90 2,7 0,4 0,88 1,35 0,2 0,95 0,45 0,07 1,00 0_0_1^09_ 35

Op gestelde tijdsintervallen werden monsters genomen en in een ko~ kend-water bad gedurende 10 minuten verhit om de enzymactiviteit te inactiveren. Na koeling werden de monsters gefiltreerd en vervolgens behandeld met een ionenuitwisselingshars (Bio-RAD AG 501-X8 [D]) als ge-40 mengd bed om as en oplosbare stikstof te verwijderen voordat volgens 8201763 ¢5 15 HPLC geanalyseerd wordt. De resultaten zijn in tabel E opgenomen.

Glucose is de gecombineerde hoeveelheid glucose en een andere component, mogelijkerwijze difructose, die niet op het chromatogram gescheiden kunnen worden. DP4+ omvat sacchariden met een ketenlengte 5 van 4 of meer. DP^-DPj zijn sacchariden met ketenlengten van 1 tot 4, behalve glucose en fructose.

Bij dit experiment blijkt de meest doelmatige hydrolyse voor een dosering van ongeveer één eenheid verkregen te worden, wanneer de verhouding, gravimetrisch bepaald, 4,1 is.

10 Tabel E

uren endo/exo componenten_ 24_48_72_ fructose 3,7 5,6 33,8 "glucose" 5,1 6,8 13,1 15 DP4+ 37,1 17,1 15,3 _DPI-DPI_54,2_70,5_37,9 4,1 fructose 77,4 91,5 94,7 "glucose'* 5,5 3,8 3,3 DP4-K 10,0 2,9 1,4 20 _DPi-DP^ _Tjl_1*8_0,6 2,7 fructose 80,0 92,9 94,5 "glucose" 5,4 3,3 3,4 DP4+- 9,1 2,6 1,7 _DPl -DP^_5*5_1*2_0,5 25 1,35 fructose 75,9 90,0 92,8 "glucose"· 3,8 3,5 3,3 DP4j- 16,8* 5,1 3,1 _DPT-DPg_3*5_1,5 0,8 0,45 fructose 71,0 88,1 92,5 30 "glucose" 3,1 3,7 3,4 DP4+ 23,8 7,3 3,5 _DPl-DP^_2*1_0*9_0,7 0 fructose 64,8 75,5 82,8 "glucose" 2,3 2,9 3,2 35 DP4+ 31,9 20,8 13,2 _DPI -DP^_1*0_0,8 0,8

Voorbeeld VI

2 Kolven, die elk 100 g 20 gew.% Sigma inuline oplossing bij een 40 pH van 4,5 bevatten, werden samengesteld. De kolven werden van magneti— 82 0-1 7 63 **' v 16 sche roerders voorzien en in een waterbad van respectievelijk 60 en 65°C geplaatst.

Inulase enzymen van A. ficuum A.524 werden met een dosering van 2,8 eenheden per g inuline toegevoegd. De inulase van A. ficuum bezat 5 een endo/exo verhouding van 1.

Bij gestelde tijdsintervallen werden monsters genomen en in een kokend-water bad gedurende 10 minuten verhit om het enzym te inactiveren. Na. koeling werden de monsters gefiltreerd en behandeld met een ionenuitwisselingshars (Bio-RAD AG 501-X8 [D]) als gemengd bed om as en 10 oplosbare stikstof te verwijderen voordat volgens ÏÏPLC geanalyseerd werd.

De volgende resultaten werden verkregen: temp.eC doseringseenheden componenten uren _inuline 24_48_72 96 15 60 2,8 fructose 94,0 95,5 95,3 95,1 "glucose" 4,9 4,3 4,3 4,4 DP4+· 0,8 0,2 0,2 0,1 ___ ΡΡΊ -DFq_0,3 0,1 0,2 0,3 65 2,8 fructose 93,5 95,0 95,4 95,3 20 "glucose" 4,7 4,2 4,0 4,2 DP4+ 1,2 0,5 0,2 0,1 _DP-ι -DP^_0,6 Q,3 0,3 0,4

Het. blijkt, dat een volledige hydrolyse fructose· + "glucose" ge-25 halte van ^*99% bij beide temperaturen verkregen wordt onder toepassing van dit enzympreparaat en deze dosering.

8201763

Claims (9)

1. Werkwijze voor het hydrolyseren van inuline met een microbiëel inulinasepreparaat, met het kenmerk, dat men inuline hydrolyseert in een waterbevattend milieu bij een pH in het traject van 3,5-7, bij een 5 temperatuur in het traject van 60-65°C, bij aanwezigheid van een werkzame dosering van een inulinasepreparaat met een verhouding endo-inuli-nase tot exo-inulinase in het traject van 1:10 tot 10:1 op gewichtsba-sis, waarbij een enzymatisch volledige hydrolyse van inuline wordt verkregen·

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een verhouding toepast in het traject van 7:1 tot 1:7.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men een verhouding toepast in het traject van 1:2 tot 4:1.

4. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 3, met het kenmerk, dat men 15 een inulinasepreparaat toepast, dat een inulinase bevat, dat verkregen is door kweken van een inulinasemengsel producerende stam van Aspergillus ficuum.

5. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 4, met het kenmerk, dat men een dosering van het inulinasepreparaat toepast in het traject van 20 0,25-10 Somogyi eenheden per gram inuline.

6. Inulinasepreparaat voor de uitvoering van de werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het preparaat een verhouding van en— do-inulinase tot exo-inulinase-activiteiten in het traject van 1:10 tot 10:1 op gewichtsbasis heeft.

7. Inulinasepreparaat volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het preparaat verkregen is door kweken van een inulinase producerende stam: van Aspergillus ficuum.

8. Inulinasepreparaat volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het preparaat verkregen is door kweken van de Aspergillus ficuum stam

30 CBS 55565. ************** 8201763