KR100913587B1 - 이눌린의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, (1) 수크로오스의 농도를 조정함으로써 이눌린의 평균중합도를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법, (2) 상기 접촉 시 온도를 조정함으로써 이눌린의 평균중합도를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법, 및/또는 (3) 상기 수크로오스가 상기 이눌린 합성효소에 의해 소비되어 평형상태에 도달하였을 때 수크로오스를 추가로 첨가하여 이눌린의 생성반응이 계속되게 하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 또한 상기 제조방법에 의해 얻어지는 소정의 평균중합도를 갖는 이눌린을 제공한다.

이눌린, 평균중합도, 수크로오스, 이눌린 합성효소

Description

이눌린의 제조방법{Processes for producing inulin}

본 발명은 이눌린 합성효소를 수크로오스에 작용시켜 이눌린을 제조하는 방법에 있어서, 수크로오스의 농도를 조정하는 것, 반응 시의 온도를 조정하는 것, 및/또는 수크로오스를 추가 첨가하는 것에 의해 이눌린의 평균중합도를 조절하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법에 관한 것이다. 또한 상기 제조방법에 의해 얻어지는, 소정의 평균중합도를 갖는 이눌린에 관한 것이다.

이눌린은 다당류의 일종으로, 자연계에 널리 분포하고 있으며 달리아, 돼지감자, 목향 등 국화과 식물의 괴경이나 치커리의 뿌리 등에 콜로이드상으로 존재하는 것이 알려져 있다. 그 성질은 전분과는 달리 온수에 녹고, 그 구조는 수크로오스의 프룩토오스 측에 D-프룩토플라노오스가 β-(2->1) 결합으로 순차적으로 탈수중합한 것이다. 그 중합도는 프룩토오스 사슬 길이에 따라 달라지며 식물 유래 이눌린의 경우 중합도는 약 8 내지 60 범위인데, 그 중합도의 평균(평균중합도)은 생물학사전(이와나미쇼텐, 제2판(1978))에 의하면 32~34, 이화학사전(이와나미쇼텐, 제3판(1979))에 의하면 약 30이라고 기재되어 있다.

이눌린은 수용성의 난소화성(難消化性) 식물섬유이므로 식이섬유(dietary fiber)로서 주목받고 있고, 비피더스균의 증식효과 등이 있으므로 최근의 건강지향 붐과 맞물려 수요가 계속 증가하고 있다. 종래 이눌린은 주로 해외에서 생산되고 있다. 해외에서는 치커리나 돼지감자 등 식물을 재배하여 그 근경으로부터 착즙액을 건조함으로써 제조되며, 일반적인 식품재료로서 이용되고 있다. 한편, 일본에서는 이들 식물의 상업적 재배가 곤란하므로, 이눌린은 제조되고 있지 않다.

따라서 이눌린의 입수는 수입에 의존할 수 밖에 없어, 가격도 국산의 유사기능을 갖는 물질보다 고가이므로, 산업이용상 장애가 되고 있다. 또한 식물 유래 이눌린은 추출원료가 식물이기 때문에 수량이 수확에 의해 좌우되며, 수확 직후 추출을 실시하지 않으면 자가소화 등에 의해 이눌린의 함량이 감소하는 문제점이 있다.

또한 식물 유래 이눌린의 경우, 식물 착즙액을 대강 분획한 후, 분무 건조시켜 상품화한 것이기 때문에 이눌린의 중합도가 식물 본래의 성질에 좌우되어 프룩토오스 사슬 길이의 중합도 분포의 범위가 넓고, 평균치에서 많이 벗어난 중합도 수치(중합도범위: 약 8~60)를 갖는 이눌린이 얻어지므로, 균일성이 결여되는 문제점이 있다. 예를 들어 Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35(6), 525-552(1995)에는, 각종 식물(달리아, 치커리, 돼지감자) 유래 이눌린의 HPAEC-PAD 크로마토그래피에 의한 이눌린의 중합도 범위를 나타낸 결과가 기재되어 있는데, 어떤 식물 유래의 이눌린에 있어서도 중합도 약 10~60의 광범위에 걸쳐 여러 개의 피크가 확인되었으므로, 균일성이 결여되었음이 명확했다. 이러한 결과를 해결하기 위해서는 사용목적에 대응하여 특정 중합도가 높은 비율로 나타나는 중합도 분포를 갖는 이눌린을 생성할 수 있으면 좋으나, 이것은 극히 어렵다.

또한 이눌린의 이용상의 문제점에 있어서는, 너무 중합도가 높은 분획을 이 용하는 경우, 물에 대한 용해성이 떨어지고 실제 이용 시 바람직하지 않은 상황을 초래한다는 문제점도 있다.

한편, 이눌린을 제조하는 방법으로써, 상술한 대로 식물로부터 추출하는 것 이외에, 이눌린 합성효소를 이용하여 화학적으로 이눌린 또는 이눌린 유사물질을 제조하는 방법이 있다. 예를 들어 식물로부터 추출하여 얻어진 효소를 사용하여 수크로오스로부터 이눌린을 생성하는 방법이 M.Luscher 등에 의해 보고된 바 있다(FEBS letter 385, 39(1996)). 이 방법은, 수크로오스 : 수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제(SST) 및 β-(2->1) 프룩탄 : β-(2->1) 프룩탄 1-트랜스퍼라아제(FFT), 2종류의 효소의 공동작용에 의한 것이다. 그러나, 식물체로부터 효소를 대량으로 제조하는 것은 시간과 노력을 필요로 하며 공업규모로 이용하는 것은 현실적이지 못하다.

또한 미생물의 효소를 작용시킨 이눌린 유사물질의 제조방법이 보고된 바 있다. 예를 들어, 아스퍼질러스 시도위(Aspergillus sydowi)의 분생포자 또는 균체 처리하여 이눌린 타입의 구조를 갖는 물질을 얻는 방법이 개시되어 있다(J. Biol. Chem., 43, 171(1920); Agric. Biol. Chem., 37,(9), 2111, (1973); 특개소61-187797; 특개평5-308885). 또한 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 또는 후사리움(Fusarium) 속에 속하는 미생물이 생산하는 효소가 이눌린 유사물질을 생성하는 것, 스토렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 속하는 미생물이 생산하는 효소가 이눌린 유사물질을 생성하는 것이 보고된 바 있다(특원소55-40193; Acta. Chem. Scand., B28, 589). 그러나 이들 미생물에 의해 생산되는 효소를 이용 하여 생성되는 물질은, 이눌린 구조와 유사한 물질이긴 하나, 식물 유래의 이눌린과 비교하면 그 분자가 거대하거나 결합형식이 상이한 물질이어서, 이눌린을 생성하는 방법이라고 할 수 없다.

미생물 유래의 효소를 이용하여 이눌린을 생성하는 방법으로서, 본 발명자들이 출원한 PCT/JP01/01133에 기재된 방법이 있다. 이것은 수크로오스를 원료로 하여, 이것에 신규 이눌린 합성효소를 작용시켜 비교적 중합도가 갖추어진 이눌린을 제조하는 방법이다. 이 방법으로는, 미생물 유래의 효소를 이용하여 이눌린을 생성한다는 목적이 달성되며, 식물로부터 추출한 이눌린과 비교하여 비교적 균일한 평균중합도의 이눌린(평균중합도 8~20)을 얻을 수 있으나, 소정의 중합도를 갖는 이눌린으로 한정하여 이를 효과적으로 얻는 수단으로서는 확립되지 않았다.

본 발명은 이눌린 합성효소를 수크로오스에 작용시켜 이눌린을 제조하는 방법에 있어서, 소정의 평균중합도를 갖는 이눌린을 제조 가능케 하는 수단을 제공하는 것을 그 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 계속한 결과, 이눌린 합성효소를 사용하여 수크로오스로부터 이눌린을 제조하는 반응에 있어서, 수크로오스 농도, 이눌린 합성효소와 수크로오스 접촉 시의 온도, 수크로오스를 반응도중 추가로 첨가하는 것에 의해 이눌린의 평균중합도를 조절할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 이하의 (1)~(9)를 제공한다.

(1) 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, 수크로오스의 농도를 조정함으로써 이눌린의 평균중합도를 조절하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.

(2) 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, 상기 접촉 시 온도를 조정함으로써 이눌린의 평균중합도를 조절하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.

(3) 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, 상기 수크로오스가 상기 이눌린 합성효소에 의해 소비되어 평형상태에 도달하였을 때 수크로오스를 추가로 첨가하여 이눌린의 생성반응이 계속되게 함으로써 이눌린의 평균중합도를 높이는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.

(4) 수크로오스의 추가 첨가를 반복하여 행하는 것을 특징으로 하는 상기 (3)에 기재된 이눌린의 제조방법.

(5) 이눌린 합성효소가, 수크로오스에는 작용하여 이눌린을 생성하지만, 케스토오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 갖는 것임을 특징으로 하는 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 이눌린의 제조방법.

(6) 이눌린 합성효소가, 해당 효소를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양균체 또는 그 처리물인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 이눌린의 제조방법.

(7) 상기 (1),(2) 또는 (3)에 기재된 방법 중 2 이상을 조합하여 실시하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.

(8) 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 소정의 평균중합도를 갖는 이눌린의 제조방법.

(9) 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용함으로써 얻어지는 소정의 평균중합도를 갖는 이눌린.

본 명세서는 본 출원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 제2001-293067호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

본 발명 이눌린의 제조방법에 관하여, 이하에서 상세히 설명한다.

본 발명의 방법은, 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, 이눌린의 평균중합도를 조절하기 위한 각종 방법이다.

본 발명에 있어서, 이눌린이란 수크로오스의 프룩토오스 측에 D-프룩토플라노오스가 β-(2->1) 결합으로 순차적으로 탈수중합한 다당류로서, 글루코오스에 2 분자 이상의 프룩토오스가 중합한 것을 의미하며, 2~4 분자의 프룩토오스가 중합한 저중합도의 프룩토올리고당을 포함한다.

상기에서, 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시킨다 함은, 수크로오스를 탄소원으로서 함유하는 배지 등에 이눌린 합성효소를 첨가하고, 이들이 반응액 중에서 수크로오스를 기질로 하여 이눌린을 생성할 수 있는 조건 하에서 반응시키는 것을 의미한다.

여기서, 이눌린 합성효소는, 수크로오스를 이눌린으로 변환할 수 있는 기질특이성을 갖는 효소이면 어느 것이나 사용 가능하다. 그 예로서, 수크로오스에 작용하여 이눌린을 생산하나, 케스토오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 갖는 이눌린 합성효소를 들 수 있다.

또한, 이눌린 합성효소로는, 해당 효소를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양균체 또는 그 처리물도 포함된다. 여기서 배양균체란, 적절한 조건 하에서 배양된 상기 미생물을 의미하며, 생균이어도 좋고 동결건조된 것이어도 좋고 또는 아세톤 파우더 등의 형태여도 좋다. 또한, 배양균체 처리물이란, 본 발명의 효소를 그 기능을 상실하는 일 없이 채취할 수 있는 것이면 특별한 제한이 없으나, 예를 들면 상기 배양균체의 파쇄물, 균체추출액, 고정화균체 등을 의미한다. 여기서 배양균체의 파쇄물 및 균체추출액이란, 해당 균체를 공지의 파쇄방법, 예를 들면 초음파 파쇄법, 다이노밀 파쇄법, 프렌치프레스 파쇄법에 의해 파쇄되어 얻어지는 물질 및 추출액을 의미한다. 또한, 고정화균체란, 공지의 고정방법, 예를 들면 포괄법, 담체결합법으로 상기 균체를 고정화하고, 필요에 따라 가교한 것을 의미한다. 포괄법으로는, 카라기난이나 알긴산 등의 천연고분자를 사용하는 방법을 들 수 있다.

상기 이눌린 합성효소 중, 수크로오스에 작용하여 이눌린을 생성하나, 케스토오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 갖는 이눌린 합성효소 미생물로부터 얻어지는 이눌린 합성효소로 는, 구체적으로 PCT/JP01/01133에 기재되어 있는 바실러스 에스피 217C-11 주(FERM BP-7450)의 배양액 또는 배양균체 또는 그 처리물로부터 얻어지는 것을 사용할 수 있다.

이 바실러스 에스피(Bacillus sp.) 217C-11 주의 배양 및 효소의 조정방법에 관하여, 이하에서 간단히 설명한다.

배지에 첨가하는 탄소원으로는, 통상 사용되는 것을 적당한 농도로 사용하면 된다. 예를 들면, 수크로오스, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스 등의 당질을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 본 균을 사용하여, 수크로오스를 기질로 하여 이눌린을 생성시키는 효소를 조제함에 있어서 가장 바람직한 탄소원은 수크로오스이며, 이를 주탄소원으로 한 액체배지를 사용하여 배양을 행함으로써 해당 효소활성은 향상된다. 물론, 조당, 폐당밀 등의 수크로오스 함유물을 사용해도 좋다.

질소원으로는, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 옥수수 침지수(corn steep liquor) 등의 유기질소원, 그밖에 황산, 초산, 인산의 암모늄염 등의 무기질소원을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 무기염류로는, 칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 망간, 철 등의 황산염, 염산염, 탄산염, 초산염, 인산염 등을 각각 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한 필요에 따라 아미노산, 비타민 등 통상의 배양에 사용되는 영양원 등도 적절히 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서 사용하기에 적절한 배지로는, 수크로오스 0.5~2%(w/v), 펩톤 1%, 효모 엑기스 0.5%, 인산2칼륨 0.2%를 포함하는 pH 7~8의 액체배지를 사용하는 것이 적당하다.

배양은, 진탕배양 또는 Jar fermentor를 사용하여 통기조건 하에서 행할 수 있다. 배지의 pH는 6~9 범위가 바람직하며, 배양온도는 25℃~37℃의 범위가 바람직하며, 배양시간은 미생물이 증식할 수 있는 시간 이상이면 좋고, 5~96시간, 바람직하게는 15~72시간이다.

바실러스 에스피(Bacillus sp.) 217C-11 주를 상기 배지에서 배양한 후, 원심분리에 의해 균을 제거하고, 그런 다음 배양상청액을 분획분자량 30,000의 한외여과막을 이용하여 농축하고, 반응용 효소액으로서 사용할 수 있다.

또한, 바실러스 에스피(Bacillus sp.) 217C-11 주 유래의 효소를 포함하는, 수크로오스에 작용하여 이눌린을 생산하나, 케스토오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 갖는 이눌린 합성효소는, 이하의 이화학적 성질을 갖는 것이다.

분자량: 45,000~50,000

최적온도: 40~50℃

열안정성: 45℃를 넘으면 서서히 활성을 잃기 시작하여, 50℃에서 70%, 60℃에서 40%의 잔존활성을 나타낸다.

최적 pH: 7~8 (45℃)

pH 안정성: pH 6 이상에서 안정.

이눌린 합성효소의 농도는, 반응액 중의 수크로오스(기질)를 충분히 이용할 수 있는 농도이면 좋고, 예를 들면 수크로오스 40~60%(w/w)의 경우, 이눌린 합성효소의 활성이 0.4 unit/mL 반응액이 되는 농도로 하는 것이 바람직하다.

수크로오스가 기질로서 이눌린을 생성하기에 적절한 pH는, pH 6~8의 범위의 반응액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 해당 반응액의 pH를 유지하기 위해 인산완충액을 사용할 수 있다. 반응시간은, 이눌린 합성효소의 사용량 등에 따라 적절히 변경할 수 있으나, 통상 0.1~100시간, 바람직하게는 0.5~72시간이다.

얻어진 이눌린의 평균중합도 분석은, 이하와 같이 실시할 수 있다.

또한 중합도란, 이눌린 중의 사카라이드 단위(프룩토오스 및 글루코오스 단위)의 수이며, 평균중합도는, 예를 들면 이하와 같이, HPLC, GC, HPAEC 등의 통상적 분석법에 의해 구해진 분석결과의 피크 중 꼭대기를 평균중합도로 할 수 있다. 칼럼으로는, 예를 들어 신화화공(shinwa chemical industries)제작의 ULTRON PS-80N (8 x 300mm) (용매:물, 유속:0.5mL/min, 온도:50℃), 또는 TOSOH 제작의 TSK-GEL G3000PWXL(7.8 x 300mm) (용매:물, 유속:0.5mL/min, 온도:50℃)를 사용하고, 검출기로는 시차굴절계를 사용함으로써 확인된 생성 이눌린의 중합도를, 표준물질로서 예를 들면 식물 유래의 이눌린인 오라프티사의 라프테린 ST(평균중합도 11)과 라프테린 HP(평균중합도 22)를 사용하여 작성한 검량선에 의해 구할 수 있다. 또한 이눌린의 중합도 분석에 관하여는, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35(6), 525-552(1995) 등의 문헌을 참고하여 실시할 수 있다.

본 발명에서는, 상기 이눌린의 제조방법에 있어서, (1) 수크로오스 농도의 조정, (2) 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시킬 때의 온도 조정, (3) 수크로오스 추가 첨가를 행함으로써, 생성되는 이눌린의 평균중합도를 조절하는 것이 가능하다.

이눌린의 평균중합도를 조절하는 첫 번째 방법으로서 수크로오스 농도의 조 정은, 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, 수크로오스의 농도를 조정함으로써 이눌린의 평균중합도를 조절하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법이다.

본 발명에서 사용하는 수크로오스의 농도는, 예를 들면 3~68%(w/w), 바람직하게는 10~60%(w/w)의 범위인데, 수크로오스 농도를 상기 범위 내에서 낮게 설정함으로써 얻어지는 이눌린의 평균중합도를 높일 수 있다. 예를 들면 반응온도가 15℃인 경우, 원료인 수크로오스 농도가 50%일 때 얻어지는 이눌린의 평균중합도는 10임에 비하여, 원료인 수크로오스 농도가 20%일 때 얻어지는 이눌린의 평균중합도는 18이다. 또한, 반응온도가 37℃인 경우, 원료인 수크로오스 농도가 60%일 때 얻어지는 이눌린의 평균중합도는 9임에 비하여, 원료인 수크로오스 농도가 20%일 때 얻어지는 이눌린의 평균중합도는 20이다. 따라서, 수크로오스 농도를 적절히 설정함으로써, 원하는 평균중합도의 이눌린을 얻을 수 있다.

이눌린의 평균중합도를 조절하는 두 번째 방법으로서 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시킬 때 온도의 조정은, 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, 상기 접촉 시 온도를 조절함으로써 이눌린의 평균중합도를 조절하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법이다.

이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시킬 때의 반응온도는 20~70℃, 바람직하게는 40~50℃인데, 반응온도를 상기 범위 내에서 높은 온도로 설정함으로써 얻어지는 이눌린의 평균중합도를 높일 수 있다. 예를 들면 수크로오스 농도가 50%인 경우, 반응온도가 15℃일 때 이눌린의 평균중합도는 10임에 비하여, 반응온도가 37℃ 일 때는 이눌린의 평균중합도가 14이다. 또한, 수크로오스 농도가 30%인 경우, 반응온도가 15℃일 때 이눌린의 평균중합도는 15임에 비하여, 반응온도가 37℃일 때는 이눌린의 평균중합도가 19이다. 따라서, 반응온도를 적절히 설정함으로써 바라는 이눌린의 평균중합도를 얻을 수 있다.

이눌린의 평균중합도를 조절하는 세 번째 방법으로서 수크로오스의 추가 첨가는, 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, 상기 수크로오스가 상기 이눌린 합성효소에 의해 소비되어 평형상태에 도달하였을 때 수크로오스를 추가 첨가하여, 이눌린 생성반응을 계속되게 하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법이다.

수크로오스를 추가 첨가하는 시기는, 수크로오스에 이눌린 합성효소를 접촉시켜 이눌린의 제조를 개시한 후이며, 이눌린 합성효소의 활성이 인정되고, 또한 수크로오스의 소비가 반응에 의해 어느 정도 진행된 시기이나, 특히 바람직하게는 합성반응이 평형에 도달한 시점이다. 반응의 진행상태에 대하여는, HPLC에 의한 성분분석에 의해 확인할 수 있다.

수크로오스를 추가 첨가하는 횟수는, 이눌린 합성효소의 활성이 잔존하고, 합성반응이 계속되고 있는 한, 특별한 제한이 없고, 원하는 평균중합도에 따라 임의적으로 설정할 수 있으나, 높은 평균중합도를 갖는 이눌린을 얻기 위해서는 수크로오스의 추가 첨가 횟수를 많게 하는 것이 바람직하다.

또한, 이들 방법은 단독으로 사용해도, 또는 2종류 이상을 조합해서 사용해도 좋다.

상기 방법을 실시함으로써, 소정의 평균중합도를 갖는 이눌린을 얻을 수 있다. 소정의 평균중합도를 갖는 이눌린은, 중합도 8~25 사이의 임의의 원하는 평균중합도를 갖는 이눌린을 얻기 위한 최적의 농도, 접촉온도, 및/또는 수크로오스의 추가 첨가를 설정함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면 수크로오스 농도 50%, 접촉온도 15℃의 설정, 또는 수크로오스 농도 60%, 접촉온도 45℃의 설정, 또는 수크로오스 농도 60%, 접촉온도 50℃의 설정에 따른 반응에 의해 8~12 범위 내의 평균중합도를 갖는 이눌린을 얻을 수 있다. 또한, 예를 들어 수크로오스 농도 30%, 접촉온도 15℃의 설정, 또는 수크로오스 농도 40%, 접촉온도 37℃의 설정, 또는 수크로오스 농도 50%, 접촉온도 45℃의 설정에 있어서, 13~18 범위 내의 평균중합도를 갖는 이눌린을 얻을 수 있다. 또한, 예를 들어 수크로오스 농도 20%, 접촉온도 37℃의 설정, 또는 수크로오스 농도 30%, 접촉온도 37℃의 설정에 있어서, 19~25 범위 내의 평균중합도를 갖는 이눌린을 얻을 수 있다.

이런 방법으로 얻어진 본 발명의 이눌린은, 프룩토오스 사슬 길이의 중합도 분포에 있어서 평균치에서 벗어나는 흩어짐이 적고, 특정 중합도가 높은 비율로 나타나는 뾰족(sharp)한 분포를 나타내는 일정한 품질을 갖는 이눌린이다. 또한 본 명세서에 있어서 중합도분포라 함은, 이눌린이 갖는 프룩토오스 사슬 길이의 중합도의 최대치~최소치의 분산범위를 나타내는 것으로, 본 발명의 이눌린은 평균중합도±20 이내, 바람직하게는 평균중합도±15 이내의 중합도 범위를 갖는 이눌린이다. 또한 중합도 분포의 최대치~최소치의 범위에 있어서는, 최대치~최소치가 35 이하, 바람직하게는 30 이하의 중합도 범위를 갖는 이눌린이다.

도 1은 수크로오스 농도 및 반응온도와 이눌린의 평균중합도의 관계를 나타내는 그림이다.

도 2는 수크로오스의 추가 첨가와 이눌린의 평균중합도의 관계를 나타내는 그림이다.

도 3은 수크로오스의 추가 첨가 횟수와 이눌린의 평균중합도의 관계를 나타내는 그림이다. 도면 중 화살표는 추가 첨가의 시기를 나타낸다.

도 4는 본 발명 이눌린(평균중합도 17)의 HPLC에 의한 분석결과를 나타내는 그림이다.

도 5는 식물유래의 라프테린 ST(평균중합도 11, 오라프티사 제조)의 HPLC에 의한 분석결과를 나타내는 그림이다.

도 6은 식물유래의 라프테린 HP(평균중합도 22, 오라프티사 제조)의 HPLC에 의한 분석결과를 나타내는 그림이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 : 바실러스 에스피( Bacillus sp. ) 217C-11 주(strain)로부터 효소액의 조제

바실러스 에스피(Bacillus sp.) 217C-11 주(FERE BP-7450)을, 수크로오스 0.5~2%(w/v), 펩톤 1%, 효모 엑기스 0.5%, 인산2칼륨 0.2%, 황산마그네슘 0.05%를 포함하는 pH 7~8의 액체배지에서 30℃로 18시간 진탕 배양하였다.

그런 다음, 그 배양 상청액에 고형의 황산암모늄을 첨가하여, 70% 포화로 침전하는 분획을 원심분리기를 사용하여 모았다. 그리고 그 침전물을 pH 7.0의 20mM 인산완충액에 용해시켜, 투석 튜브에 넣은 다음, 동일한 완충액으로 충분히 투석하여 효소의 조효소액을 얻었다. 그런 다음 통상적 방법에 따라 토소(TOSOH)주식회사 제작의 TSKgel DEAE 토요팔650, 팔마시아 제작의 세파크릴 S-300을 사용하여 해당 조효소액을 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피에 적용함으로써, 본 발명 이눌린 합성효소를 정제하였다.이것을 반응용 효소 표준품으로 사용하였다.

실시예 2 : 수크로오스 농도 및 반응온도의 조정에 의한 생성 이눌린의 평균중합도 조절

실시예 1에서 조제한 이눌린 합성효소를 2u/mL, 인산완충액(pH 7.0) 10mM, 수크로오스 농도를 최종 농도로 각각 20%(w/w), 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w)이 되도록 물로 조정하여 반응액으로 했다. 각 반응액을 15℃, 37℃, 45℃, 50℃로 설정한 각 항온수조에 넣고 48시간 반응시켰다. 생성된 이눌린의 평균중합도를 조사한 결과를 도 1에 나타내었다.

그 결과, 어떤 반응온도의 경우에도, 생성된 이눌린의 평균중합도는 반응중의 수크로오스 농도가 낮아질수록 높아졌다. 또한, 수크로오스 농도가 같은 경우, 반응온도가 높아질수록 생성되는 이눌린의 평균중합도가 높아짐이 확인되었다.

실시예 3 : 수크로오스의 추가 첨가에 의한 이눌린의 평균중합도의 조절효과

40g의 수크로오스, 실시예 1에서 조제한 30u/mL의 이눌린 합성효소 2.4~4g에 물을 첨가하여 100g으로 한 반응액을 500mL 삼각 플라스크에 넣고, 150rpm으로 교반하면서 반응시켰다(이하, 제1반응이라 한다). 수크로오스의 소비가 거의 정지된 시점에 40%(w/w) 수크로오스를 20~100g의 양으로 양을 바꿔가며 제1 반응용액에 첨가하고, 다시 수크로오스의 소비가 정지할 때까지 반응을 계속하였다(이하, 제2반응이라 한다). 또한, 수크로오스의 추가 첨가에 의해 이눌린 합성효소가 희석되므로, 효소의 최종 첨가농도를 모두 일정하게 하기 위해, 제1반응 단계에서의 효소의 첨가량에 변화를 주어 조정하였다.

표 1에, 제1반응의 이눌린 합성효소 첨가량과 반응시간 및 반응액 성분의 분석치와 생성된 이눌린의 평균중합도를 나타내었다. 또한 표 2에, 제2반응의 수크로오스 추가 첨가량과 반응시간 및 반응액 성분의 분석치와 생성된 이눌린의 평균중합도를 나타내었다. 또한 도 2에, 수크로오스 추가 첨가량의 차이에 의한 생성 이눌린의 평균중합도의 차이에 대해 나타내었다. 그 결과, 제1반응 후 추가 첨가하는 수크로오스 양이 많을수록, 생성되는 이눌린의 평균중합도는 높아지는 것이 확인되었다.

제1반응의 결과

제1반응
효소량(g)	시간(hr)	HPLC(당조성%)
		이눌린	수크로오스	글루코오스	프룩토오스	DP(평균중합도)
2.4	22	44.8	7.7	44.1	2.3	16
2.8	20	44.8	7.6	44.2	2.3	16
3.2	18	44.8	7.5	44.3	2.3	16
3.6	16	44.7	7.5	44.3	2.3	16
4.0	14	44.7	7.5	44.3	2.3	16

제2반응의 결과

제2반응
수크로오스 첨가량(g)	시간(hr)	HPLC(당조성%)
		이눌린	수크로오스	글루코오스	프룩토오스	DP(평균중합도)
20	16	44.4	8.5	44.0	2.4	17
40	18	44.0	9.1	43.9	2.3	18
60	20	43.6	9.5	43.9	2.3	19
80	22	43.2	10.3	43.5	2.3	20
100	24	43.5	9.6	43.9	2.4	20

실시예 4 : 수크로오스의 추가 첨가횟수 조정에 의한 생성 이눌린의 평균중합도 조절효과

수크로오스 5g에 0.4M 인산완충액(pH 7) 0.25mL, 30u/mL 이눌린 합성효소 4g을 첨가하고, 물로 10g으로 조정한 용액을 60℃로 제1반응을 실시하였다. 이 제1반응의 수크로오스 소비가 평형에 도달한 때, 50%(w/w) 수크로오스 용액(pH 7)을 1회 당 5g 씩 추가 첨가하고, 제2반응을 계속하였다. 상기 조작을 4회 반복하고, 각 회마다 생성 이눌린의 평균중합도를 조사하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 명확하게 알 수 있듯이, 수크로오스를 추가 첨가하는 횟수가 증가할수록 이눌린의 중합도는 높아지고, 4회의 추가 첨가를 거쳐 얻어진 이눌린의 평균중합도는 23에 달하였다.

실시예 5 : 중합도 분포의 검토

컬럼으로는 TOSOH 제작의 TSK-GEL G3000PWXL (7.8 x 300mm) (용매:물, 유속:0.5mL/min, 온도:50℃)를 사용하고, 검출기로는 시차굴절계를 사용한 HPLC 분석에 의해 확인된 본 발명의 이눌린의 중합도를, 표준물질로서 식물 유래의 이눌린인 오라프티사의 라프테린 ST(평균중합도 11)과 라프테린 HP(평균중합도 22)를 사용하여 작성한 검량선에 의해 구하고, 본 발명의 이눌린과 식물 유래 이눌린의 중합도 분포를 비교하였다. 본 발명 이눌린의 결과를 도 4에, 라프테린 ST(평균중합도 11)과 라프테린 HP(평균중합도 22)의 결과를 각각 도 5와 도 6에 나타내었다. 이들 결과에서 분명히 알 수 있듯이 본 발명의 이눌린(평균중합도 17)은, 표준물질로 사용한 식물 유래의 이눌린보다 피크의 폭은 좁고, 피크의 높이는 높아져 있다.

또한 본 발명의 이눌린과 식물 유래의 이눌린인 라프테린 HP의 구체적인 중합도 분포 범위의 수치를 확인한 결과, 평균중합도가 17인 본 발명 이눌린은 중합도 분포가 4~30의 범위임에 비하여, 평균중합도가 22인 라프테린 HP의 분포는 8~60 정도로서, 본 발명 이눌린의 사슬 길이(쇄장) 분산범위는 라프테린 HP의 약 1/2임을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 이눌린은, 중합도가 평균치에서 벗어나는 흩어짐이 적고, 특정 중합도가 높은 비율로 나타나는 분포를 나타내는 것이므로, 일정한 품질을 갖는 이눌린임이 명확하였다.

본 발명에 의하면, 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서, 수크로오느의 농도 및/또는 반응온도의 반응조건을 조정하는 것, 또는 수크로오스의 추가 첨가를 1회 이상 실시하는 것에 의해, 어느 특정한 평균중합도를 갖는 이눌린을 인위적으로 제조할 수 있다. 그 결과, 소망하는 가장 유효한 평균중합도를 갖는 이눌린 분획만을 상황에 따라 채취하는 것이 가능하므로, 이눌린을 용도에 따라 효과적으로 활용할 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고하여 본 명세서에 도입하기로 한다.

Claims (9)

1. 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 8 내지 25의 평균 중합도를 갖는 이눌린 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서,

   이눌린의 평균 중합도가 수크로오스 농도를 3 내지 68%(w/w)로 조정함으로써 조절되고;

   이눌린 합성효소가 바실러스 에스피 217C-11(Bacillus sp. 217C-11)(FERM BP-7450)로부터 유래된 것으로서, 수크로오스에는 작용하여 이눌린을 생성하지만, 케스토오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 가지며,

   분자량 : 45,000 내지 50,000

   최적 온도 : 40 내지 50℃

   열안정성 : 45℃ 이상에서 점진적으로 불활성화되기 시작하고, 50℃에서 70%의 잔류 활성을 가지고,

   최적 pH : 45℃에서 7~8

   pH 안정성 : pH 6 이상에서 안정

   한 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.
2. 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 8 내지 25의 평균 중합도를 갖는 이눌린 생성하는 이눌린의 제조방법에 있어서,

   이눌린의 평균 중합도가 접촉 시 온도를 20 내지 70℃로 조정함으로써 조절되고;

   이눌린 합성효소가 바실러스 에스피 217C-11(Bacillus sp. 217C-11)(FERM BP-7450)로부터 유래된 것으로서, 수크로오스에는 작용하여 이눌린을 생성하지만, 케스토오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 가지며,

   분자량 : 45,000 내지 50,000

   최적 온도 : 40 내지 50℃

   열안정성 : 45℃ 이상에서 점진적으로 불활성화되기 시작하고, 50℃에서 70%의 잔류 활성을 가지고,

   최적 pH : 45℃에서 7~8

   pH 안정성 : pH 6 이상에서 안정

   한 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.
3. 삭제
4. 이눌린 합성효소를 수크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 이눌린의 제조방법으로서, 이눌린 합성효소가 바실러스 에스피 217C-11(Bacillus sp. 217C-11)(FERM BP-7450)로부터 유래된 것으로서, 수크로오스에는 작용하여 이눌린을 생성하지만, 케스토오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 갖는 것이며, 상기 수크로오스가 상기 이눌린 합성효소에 의해 소비되어 평형상태에 도달하였을 때 수크로오스의 추가로 첨가를 반복하여 행하여 이눌린의 생성반응이 계속되게 함으로써 이눌린의 평균중합도를 높이는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.
5. 삭제
6. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이눌린 합성효소가, 해당 효소를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양균체이거나, 또는 배양된 세포, 세포 추출물 또는 고정화된 세포의 분쇄 생성물인 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.
7. 제1항, 제2항 또는 제4항에 기재된 방법을 2 이상 조합하여 실시하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.
8. 삭제
9. 삭제

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