WO2003027304A1 - Procedes de fabrication d'inuline - Google Patents

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WO2003027304A1
WO2003027304A1 PCT/JP2002/009958 JP0209958W WO03027304A1 WO 2003027304 A1 WO2003027304 A1 WO 2003027304A1 JP 0209958 W JP0209958 W JP 0209958W WO 03027304 A1 WO03027304 A1 WO 03027304A1
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inulin
sucrose
polymerization
degree
producing
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PCT/JP2002/009958
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Inventor
Tadashi Wada
Masao Ohguchi
Original Assignee
Fuji Nihon Seito Corporation
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0051—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Fructofuranans, e.g. beta-2,6-D-fructofuranan, i.e. levan; Derivatives thereof
    • C08B37/0054—Inulin, i.e. beta-2,1-D-fructofuranan; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention provides a method for producing inulin by allowing inulin synthase to act on sucrose, comprising adjusting the concentration of sucrose, adjusting the temperature at the time of the reaction, and adding Z or sucrose to the average of inulin.
  • the present invention relates to a method for producing inulin, which comprises controlling the degree of polymerization. Further, the present invention relates to inulin having a predetermined average degree of polymerization obtained by the production method.
  • Inulin is a type of polysaccharide that is widely distributed in nature and is known to be present in the form of colloids in tubers and chicory roots of asteraceae plants such as dahlia, jerusalem artichoke and oguruma. Unlike starch, it dissolves in warm water, and its structure is a structure in which D-fructofuranose is sequentially dehydrated and polymerized by jS-(2 ⁇ 1) bonds on the fructose side of sucrose. The degree of polymerization depends on the chain length of fructose.
  • the degree of polymerization is in the range of about 8 to 60, and the average of the degree of polymerization (average degree of polymerization) is defined in the Biology Dictionary ( According to Iwanami Shoten, 2nd edition (1978)), it is 32 to 34, and according to the Dictionary of Physical and Chemical Sciences (Iwanami Shoten, 3rd edition (1979)), about 30 is described.
  • inulin is a water-soluble, indigestible dietary fiber, it has attracted attention as a dietary fiber.In addition, it has a growing effect on bifidobacteria, and its demand is growing in conjunction with the recent health-conscious boom. .
  • inulin is mainly produced overseas. Overseas, it is produced by cultivating plants such as chicory jerusasum and drying the juice from the rhizome, and is used as a general foodstuff. On the other hand, inulin is not manufactured in Japan due to the difficulty of commercial cultivation of these plants.
  • inulin has to rely on imports, and its price is more expensive than domestically produced substances with similar functions, which is a barrier to industrial use. Also derived from plants However, inulin has a problem in that the yield is influenced by the crop because the extraction material is a plant, and if the extraction is not performed immediately after harvesting, the inulin content will decrease due to autolysis or the like.
  • a method for producing inulin there is a method for chemically producing inulin or an inulin analog using an inulin synthase, in addition to the above-described extraction from a plant.
  • a method for producing inulin from sucrose using an enzyme obtained by extracting from a plant has been reported by M. Luscher et al. (FEBS letter 385, 39 (1996)).
  • This method involves the synergistic action of two enzymes: sucrose: sucrose 1-snorrectosyltransferase (SST) and] 3- (2 ⁇ 1) fructan: ⁇ (2 ⁇ 1) fructan 1-fructosyltransferase (FFT) It is due to.
  • preparing enzymes in large quantities from plants requires time and effort and is not practical for industrial use.
  • sucrose is used as a raw material, and a novel inulin synthase is allowed to act on the raw material to produce inulin having a relatively uniform degree of polymerization.
  • the purpose of producing inulin using an enzyme derived from a microorganism was achieved, and it was possible to obtain inulin having an average degree of polymerization relatively uniform as compared with inulin extracted from a plant (average degree of polymerization). 8 to 20), a means for effectively obtaining inulin having a predetermined degree of polymerization has not been established. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for producing inulin by allowing inulin synthase to act on sucrose, and to provide means capable of producing inulin having a predetermined average degree of polymerization.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, in the reaction for producing inulin from sucrose using inulin synthase, the sucrose concentration, the contact between inulin synthase and sucrose, The present inventors have found that the average polymerization degree of inulin can be adjusted by additionally adding temperature and sucrose during the reaction, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following (1) to (9).
  • a method for producing inulin wherein inulin is produced by contacting inulin synthase with sucrose, wherein the average polymerization degree of inulin is adjusted by adjusting the concentration of sucrose.
  • inulin is produced by contacting inulin synthase with sucrose, the sucrose is consumed by the inulin synthase, and sucrose is added when the equilibrium state is reached.
  • a method for producing inulin comprising increasing the average degree of polymerization of inulin by continuing the reaction of forming inulin.
  • Inulin synthase acts on sucrose to produce inulin, but has an action and substrate specificity that does not act on kestose, manoletose, lactose, trenodulose, and cellobiose
  • a method for producing inulin comprising a combination of two or more of the methods described in (1), (2) or (3).
  • a method for producing inulin having a predetermined average degree of polymerization comprising using the method according to any one of (1) to (7).
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the sucrose concentration and the reaction temperature and the average polymerization degree of inulin.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the additional addition of sucrose and the average degree of polymerization of inulin.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the number of additional additions of sucrose and the average degree of polymerization of inulin. In the figure, arrows indicate the timing of additional addition.
  • FIG. 4 is a view showing the results of HPLC analysis of inulin (average degree of polymerization: 17) of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of HPLC analysis of plant-derived rafterin ST (average degree of polymerization 11, manufactured by Orafti Co.).
  • Figure 6 is a graph showing the results of analysis by HPLC of Rafuterin HP plant-derived (manufactured by average polymerization degree of 2 2, Orafti Inc.).
  • the method of the present invention is a method for producing inulin by contacting inulin synthase with sucrose to produce inulin, and is a method for adjusting the average degree of polymerization of inulin.
  • inulin is a polysaccharide obtained by sequentially dehydrating and polymerizing D-fractofuranose on the fructose side of sucrose through a 0- (2 ⁇ 1) bond, and two or more molecules of fructose are polymerized on glucose. It means low molecular weight fractionated oligosaccharides in which 2 to 4 molecules of fructose are polymerized.
  • contacting inulin synthase with sucrose means that inulin is added to a medium or the like containing sucrose as a carbon source, and these can generate inulin using sucrose as a substrate in a reaction solution. It means reacting under the conditions.
  • any enzyme can be used as long as it has a substrate specificity capable of converting sucrose to inulin.
  • inulin synthase which acts on sucrose to produce inulin, but does not act on kestose, maltose, ratatose, trehalose, cellobiose, and has substrate specificity.
  • the inulin synthase also includes a culture solution or culture of a microorganism producing the enzyme, or a processed product thereof.
  • the cultured cells are under appropriate conditions It means the above-mentioned cultured microorganisms, which may be live cells or lyophilized, or may be in the form of acetone powder or the like.
  • the treated cultured cells are not particularly limited as long as the enzyme of the present invention can be collected without losing its function. For example, a crushed cell of the above cultured cells, a bacterial cell extract, and immobilization may be used. It means a transformed cell.
  • the crushed product of the cultured cells and the cell extract are substances obtained by crushing the cells by a known crushing method, for example, an ultrasonic crushing method, a dynomill crushing method, or a French press crushing method.
  • Means extract means those obtained by immobilizing the cells by a known immobilization method, for example, an inclusive method or a carrier binding method, and cross-linking as necessary. Examples of the inclusive method include a method using a natural polymer such as carrageenan and alginic acid.
  • inulin synthases act on sucrose to produce inulin, but do not act on kestose, manoletose, lactose, trehalose, cellobiose, and inulin synthase microorganisms having substrate specificity.
  • Specific examples of the obtained inulin synthase include a culture solution of Bacillus sp. Strain 217C-11 (FERM BP-7450) described in PCT / JP01 / 01133, a cultured cell thereof, and a processed product thereof. Can be used.
  • a carbon source to be added to the medium a commonly used one may be used at an appropriate concentration.
  • saccharides such as sucrose, glucose, fructose, and manoletose can be used alone or in combination.
  • sucrose the most preferred carbon source is sucrose, and cultivation is performed by using a liquid medium containing this as the main carbon source. The enzyme activity is improved.
  • sucrose-containing substances such as crude sugar and molasses may be used.
  • Nitrogen sources include organic nitrogen sources such as peptone, meat extract, yeast extract, and corn 'steep liquor, as well as inorganic nitrogen sources such as sulfuric acid, nitric acid, and ammonium salts of phosphoric acid, alone or in combination.
  • organic nitrogen sources such as peptone, meat extract, yeast extract, and corn 'steep liquor
  • inorganic nitrogen sources such as sulfuric acid, nitric acid, and ammonium salts of phosphoric acid, alone or in combination.
  • inorganic salts potassium, sodium, calcium, magnesium, manganese, iron and other sulfates, hydrochlorides, carbonates, nitrates, phosphates and the like can be used alone or in combination.
  • nutrients used in ordinary culture such as amino acids and vitamins, can be used as appropriate.
  • a suitable medium for use in the method of the present invention is sucrose 0.5-2 ° /. (w / v), peptone 1%, yeast extract 0.5%, dipotassium phosphate 0.2%
  • the culture can be performed under shaking culture or under aeration conditions using a jar fermenter.
  • the pH of the medium is preferably in the range of 6 to 9
  • the culture temperature is preferably in the range of 25 ° C to 37 ° C
  • the culture time may be any time longer than the microorganism can grow, and is preferably 5 to 96 hours. Is 15-72 hours.
  • the bacteria After culturing Bacillus sp. 217C-11 strain in the above-mentioned medium, the bacteria are removed by centrifugation, and the culture supernatant is then concentrated using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut-off of 30,000, followed by centrifugation. It can be used as an enzyme solution for application.
  • sucrose acts on sucrose, including enzymes derived from Bacillus sp. 217C-11, to produce inulin, but has no effect on kestose, manoletose, lactose, trehalose, cellobiose, and substrate specificity.
  • Inulin synthase having properties has the following physicochemical properties.
  • Thermal stability It gradually deactivates when the temperature exceeds 45 ° C, and shows a residual activity of 70% at 50 ° C and 40% at 60 ° C.
  • pH stability Stable at pH 6 and above.
  • the concentration of inulin synthase may be a concentration that can sufficiently utilize sucrose (substrate) in the reaction solution. For example, when sucrose is 40 to 60% (w / w), the activity of inulin synthase is reduced. It is preferable to set the concentration to be 0.4 unit / ml reaction solution.
  • reaction solution in the pH range of 6 to 8.
  • a phosphate buffer may be used to maintain the pH of the reaction solution.
  • the reaction time can be appropriately changed depending on the amount of inulin synthase used and the like, but is usually 0.1 to 100 hours, preferably 0.5 to 72 hours.
  • the average degree of polymerization of the obtained inulin can be analyzed as follows.
  • the degree of polymerization is the number of saccharide units (phenolic and darcos units) in inulin, and the average degree of polymerization is, for example, as follows, using ordinary HPLC, GC, HP AEC, etc.
  • the top of the peak of the analysis result obtained by the analysis method can be regarded as the average degree of polymerization.
  • ULTRON PS-80N (8 X 30 Omm) (solvent; water, flow rate; 0.5 ml / min, temperature; 50 ° C) manufactured by Shinwa Kako, or TSK-GE L G3000PWXL (T0S0H) 7.8 X 300 mm) (solvent; water, flow rate: 0.5 ml / min, temperature: 50 ° C), and the degree of polymerization of inulin produced by using a differential refractometer as a detector was determined as a standard.
  • rafterin ST average degree of polymerization 11
  • rafterin HP average degree of polymerization 22
  • Olafti plant-derived inulins.
  • the analysis of the polymerization degree of inulin can be carried out with reference to the literature of Critical Review in Food Science and Nutrition, 35 (Riha 525-552 (1995)).
  • the average polymerization of inulin produced by performing the following steps in the method for producing inulin (1) adjusting the sucrose concentration, (2) adjusting the temperature at which the inulin synthase is brought into contact with sucrose, and (3) adding sucrose. The degree can be adjusted.
  • the sucrose concentration is adjusted by adjusting the sucrose concentration by adjusting the sucrose concentration in the method of producing inulin by contacting inulin synthase with sucrose.
  • the concentration of sucrose used in the present invention is, for example, in the range of 3 to 68% (w / w), preferably 10 to 60% (w / w), but the sucrose concentration should be set low within the above range.
  • the average degree of polymerization of the obtained inulin can be increased. For example, when the reaction temperature is 15 ° C, the average degree of polymerization of inulin obtained when the sucrose concentration of the raw material is 50% is 10, whereas it is obtained when the sucrose concentration of the raw material is 20%.
  • the average degree of polymerization of inulin is 18.
  • the reaction temperature is 37 ° C
  • the average degree of polymerization of inulin obtained when the sucrose concentration of the raw material is 60% is 9, whereas it is obtained when the sucrose concentration of the raw material is 20%.
  • the average degree of polymerization of inulin is 20. Therefore, by appropriately setting the sucrose concentration, inulin having a desired average polymerization degree can be obtained.
  • the adjustment of the temperature when the inulin synthase is brought into contact with sucrose is carried out in the method for producing inulin by contacting the inulin synthase with sucrose to produce inulin.
  • a method for producing inulin, wherein the average polymerization degree of inulin is adjusted by adjusting the temperature at the time of the contact.
  • the reaction temperature when the inulin synthase is brought into contact with sucrose is 20 to 70 ° (: preferably 40 to 50 ° C, but by setting the reaction temperature to a higher temperature within the above range,
  • the average degree of polymerization of inulin obtained is higher, for example, when the concentration of sucrose is 50%, the average degree of polymerization of inulin is 10 when the reaction temperature is 15 ° C, and when the reaction temperature is 37 ° C.
  • the average polymerization degree of inulin is 14.
  • the sucrose concentration is 30%
  • the average polymerization degree of inulin is 15 when the reaction temperature is 15 ° C, and when the reaction temperature is 37 ° C,
  • the average polymerization degree of inulin is 19. Accordingly, a desired average polymerization degree of inulin can be obtained by appropriately setting the reaction temperature.
  • sucrose as a third method for adjusting the average degree of polymerization of inulin is a method of producing inulin by contacting inulin synthase with sucrose to produce inulin, wherein the sucrose is consumed by the inulin synthase.
  • a method for producing inulin characterized in that sucrose is additionally added when the equilibrium state is reached, and the reaction for producing inulin is continued.
  • Sucrose is added after the inulin production is started by bringing sucrose into contact with inulin synthase, and the activity of inulin synthase is observed, and the consumption of sucrose has progressed to some extent due to the reaction. However, particularly preferred is when the synthesis reaction has reached equilibrium. The progress of the reaction can be confirmed by component analysis by HPLC.
  • the number of additions of sucrose is not particularly limited as long as the activity of the inulin synthase remains and the synthesis reaction continues, and can be arbitrarily set according to a desired average polymerization degree. In order to obtain inulin having a high average polymerization degree, it is preferable to increase the number of additional additions of sucrose.
  • inulin having a predetermined average polymerization degree can be obtained.
  • Inulin with a given average degree of polymerization sets the optimal temperature, contact temperature and / or additional sucrose to obtain inulin with any desired average degree of polymerization between 8 and 25 degrees of polymerization Can be obtained. For example, by setting the sucrose concentration to 50% and the contact temperature to 15 ° C, or the sucrose concentration to 60% and the contact temperature to 45 ° C, or the reaction at the sucrose concentration of 60% and the contact temperature to 50 ° C. And inulin having an average degree of polymerization in the range of from 8 to 12 can be obtained.
  • Inulin having an average degree of polymerization in the range of 3 to 18 can be obtained.
  • inulin having an average degree of polymerization in the range of 19 to 25 is used.
  • the inulin of the present invention thus obtained is inulin having a small degree of variation in the distribution of the degree of polymerization of the fructose chain length and maintaining a constant quality showing a sharp distribution indicating a high ratio to a specific degree of polymerization.
  • the term "polymerization degree distribution" refers to the range of dispersion of the polymerization degree of the fructose chain length of inulin from the maximum value to the minimum value, and the inulin of the present invention has an average polymerization degree of ⁇ 20.
  • inulin has a polymerization degree range of the maximum value to the minimum value of 35 or less, preferably 30 or less.
  • Bacillus sp. 217C-11 strain (FERE BP-7450) was replaced with sucrose 0.5 to 2% (w / v), peptone 1%, yeast extract 0.5%, dipotassium phosphate 0.2 The mixture was shake-cultured at 30 ° C for 18 hours in a liquid medium containing 7% magnesium sulfate and 0.05% pH7 to pH8.
  • the inulin synthase prepared in Example 1 was 2 u / ml, phosphate buffer (pH 7.0) 10 mM, and the sucrose concentration was 20% (w / w) and '30% (w / w) in final concentration, respectively.
  • Water was adjusted to 40% (w / w), 50% (w / w) and 60% (w / w) to obtain a reaction solution.
  • Each reaction solution was placed in a thermostatic water bath set at 15 ° (37 ° C, 45 ° C, 50 ° C) and reacted for 48 hours.
  • the average polymerization degree of the produced inulin was determined. This is shown in Figure 1.
  • Example 1 40 g of sucrose, 30 u / ml of inulin synthase prepared in Example 1 2.4 to 4 g of water was added to make 100 g of the reaction solution was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, and the reaction was carried out with stirring at 150 rpm. (Hereinafter, referred to as the first reaction). When the consumption of sucrose almost stopped, 40% (w / w) sucrose was added to the first reaction solution in an amount of 20 to 100 g, and the reaction was continued until the consumption of sucrose stopped again , The second reaction). Since the inulin synthase was diluted by the additional addition of sucrose, the amount of the enzyme added in the first reaction was varied and adjusted in order to make the final concentration of the enzyme constant.
  • Table 1 shows the amount of inulin synthase added in the first reaction, the reaction time, the analysis value of the reaction solution components, and the average degree of polymerization of inulin produced.
  • Table 2 shows the amount of added sucrose, the reaction time, the analysis values of the reaction solution components, and the average polymerization degree of the formed inulin in the second reaction.
  • FIG. 2 shows the difference in the average polymerization degree of the formed inulin due to the difference in the added amount of sucrose.
  • FIGS. 5 and 6 show the results of rafterin ST (average degree of polymerization 11) and rafterin HP (average degree of polymerization 22), respectively.
  • the inulin of the present invention (average degree of polymerization 17) has a narrower peak width and a higher peak height than the plant-derived inulin used as the standard substance.
  • the inulin of the present invention having an average degree of polymerization of 17 has a polymerization degree distribution of 4 to 4.
  • the distribution of rafterin HP having an average degree of polymerization of 22 is about 8 to 60
  • the dispersion range of the chain length of inulin of the present invention is about 1/2 of rafterin HP. I found it.
  • the inulin of the present invention has a small degree of variation in the degree of polymerization and shows a distribution showing a high ratio to a specific degree of polymerization, so that it is clear that the inulin has a constant quality.
  • Industrial applicability in a method for producing inulin, wherein inulin is produced by contacting inulin synthase with sucrose, the reaction conditions such as sucrose concentration and / or reaction temperature are adjusted, or sucrose is added once.

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Description

明 細 書 ィヌリンの製造方法
技術分野
本発明はィヌリン合成酵素をスクロースに作用させてィヌリンを製造する方法 において、 スクロースの濃度を調整すること、 反応時の温度を調整すること、 及 び Z又はスクロースを追添加することによってィヌリンの平均重合度を調節する ことを特徴とするィヌリンの製造方法に関する。また、該製造方法によって得られ る、 所定の平均重合度を有するィヌリンに関する。 背景技術
ィヌリンとは多糖類の一種で、広く 自然界に分布しており、ダリア、キクイモ、 ォグルマなどのキク科植物の塊茎やチコリの根などにコロイ ド状で存在している ことが知られている。その性質は、澱粉とは異なり温水に溶け、その構造はスクロ 一スのフラタ トース側に D-フラク トフラノースが jS - (2→1) 結合で順次脱水重 合したものである。 その重合度はフラク トースの鎖長により異なり、 植物由来の ィヌリンの場合、重合度は約 8から 60の範囲にあり、また、その重合度の平均（平 均重合度） は、 生物学辞典 （岩波書店、 第 2版（1978) ) によれば 32〜34、 理化学 辞典 （岩波書店、 第 3版（1979) ) によれば約 30と記載されている。
ィヌリンは、 水溶性の難消化性の食物繊維であるため、 ダイエタリーファイバ 一として着目されており、 さらにビフィズス菌の増殖効果などがあるため、 近年 の健康志向ブームとあいまって需要は伸びつつある。従来、ィヌリンは主として海 外で生産されている。海外では、チコリゃキクイモといつた植物を栽培してその根 茎からの搾汁液を乾燥することにより製造され、 一般的な食材として利用されて いる。一方、 わが国においてはそれらの植物の商業的栽培が困難であるため、ィヌ リンは製造されていない。
そのため、 ィヌリンの入手は輸入に頼らざるを得ず、 価格も国産の類似機能を 有する物質よりも高価であり、 産業利用上の障壁となっている。 また、 植物由来 ,のィヌ リンは、 抽出原料が植物であるがゆえに収量が作柄によって左右され、 そ の上収穫後直ちに抽出を行わなければ自己消化などによりィヌリン含量が目減り するといつた問題を有する。
さらに、 植物由来のィヌリンの場合、 植物搾汁液を大雑把に分画した後、 噴霧 乾燥して商品化したものであるため、 ィヌリンの重合度が植物本来の性質に左右 され、フラク トース鎖長の重合度分布の範囲が広く、ばらつきのある重合度値（重 合度範囲 ：約 8〜60) を有するィヌリンが得られ、 均一性に欠けるといった課題 力 ¾あ《0。 列 Jま、 Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35 (b , 5 25 - 552 (1995)には、 各種植物 （ダリア、 チコリ、 キクイモ） 由来のィヌリンの H PAEC-PAD クロマ トグラフィーによるィヌ リ ンの重合度範囲を示す結果が記載さ れているが、いずれの植物由来のィヌリンにおいても、重合度約 10〜60の広範囲 にわたつて多数のピークが確認され、 均一性に欠けることが明確である。 この課 題を解決するには、 使用目的に応じた、 特定の重合度に高い割合を示す重合度分 布を示すィヌリンを生成することができればよいが、 これは非常に困難である。 また、 ィヌリンの利用上の問題においては、 あまりにも重合度の高い画分を用 いる場合、 水に対する溶解性が悪く、 実利用において好ましくない状況を引き起 こすといった課題もある。
ところで、ィヌリンを製造する方法としては、先述した植物からの抽出以外に、 ィヌリン合成酵素を利用して化学的にィヌリン又はィヌリン類似物を製造する方 法がある。 例えば、 植物から抽出して得られた酵素を使用してスクロースからィ ヌリンを生成する方法が M. Luscherらによって報告されている （FEBS letter 38 5, 39 (1996) )。 この方法は、 スクロース ： スクロース 1ースノレク トシルトランス フェラーゼ (SST) 及び ]3 - (2→1 ) フルクタン： β (2→1) フルクタン 1—フル ク トシルトランスフェラーゼ （FFT) の 2種の酵素の共同作用によるものである。 し力 しながら、 植物体から酵素を大量に調製するのは時間と労力を要し、 工業規 模での利用は現実的ではない。
また、微生物の酵素を作用させたィヌリン類似物の製造方法が報告されている。 例えば、 ァスペルギルス ' シドウイ （Aspergi llus sydowi ) の分生胞子又は菌体 処理してィヌリンタイプの構造を有する物質を得る方法が開示されている （J. Bi ol. Chem. , 43, 171 (1920) ； Agri c. Biol. Chem. , 37, (9)， 2111, (1973) ; 特開昭 61-187797； 特開平 5- 308885)。 さらに、 ァスペルギルス （Aspergil lus) 属又は フザリ ウム （Fusarium) 属に属する微生物の産生する酵素がィヌリン類似物を生 成すること、 ストレプトコッカス ' ミュータンス （Streptococcus mutans) に属 する微生物の産生する酵素がィヌリン類似物を生成することが報告されている (特願昭 55- 40193； Acta. Chera. Scand. , Β28, 589)。 しかしながら、 これらの微 生物によって産生される酵素を用いて生成される物質は、 ィヌリン構造に類似し た物質ではあるが、 植物由来のィヌリンと比べてその分子が巨大であるか、 結合 形式が異なる物質であり、 ィヌリンを生成する方法ではない。 微生物由来の酵素を利用してィヌリンを生成する方法としては、 本発明者らが 出願した PCT/JP01/01133に記載の方法がある。これは、スクロースを原料として、 これに新規ィヌリン合成酵素を作用させて比較的重合度のそろったィヌリンを製 造する方法である。この方法では、微生物由来の酵素を利用してィヌリンを生成す るという目的が達成され、 植物から抽出したィヌリンと比べて比較的均一な平均 重合度のィヌリンを得ることができた （平均重合度 8〜2 0 ) 、 所定の重合度 のィヌリンに限定してそれを効果的に得る手段については確立されていなかった。 発明の開示
本発明はィヌリン合成酵素をスクロースに作用させてィヌリンを製造する方法 において、 所定の平均重合度を有するィヌリンを製造することを可能にする手段 を提供することを課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 ィヌリン合 成酵素を使用してスクロースからィヌリンを製造する反応において、 スクロース 濃度、 ィヌリン合成酵素とスクロースの接触の際の温度、 スクロースを反応途中 で追添加することによりィヌリンの平均重合度を調節することができることを見 出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の （1 ) 〜 （9 ) を提供する。
( 1 ) ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリンを生成するィヌリ ンの製造方法において、 スクロースの濃度を調整することによってィヌリンの平 均重合度を調節することを特徴とするィヌリンの製造方法。
( 2 ) ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリ ンを生成するィヌリ ンの製造方法において、 前記接触の際の温度を調整することによってィヌリンの 平均重合度を調節することを特徴とするィヌリンの製造方法。
(3) ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリ ンを生成するィヌリ ンの製造方法において、 前記スクロースが前記ィヌリン合成酵素によって消費さ れ、 平衡状態に達した段階でスクロースを追添加し、 さらにィヌリンの生成反応 を継続することによってィヌリンの平均重合度を高めることを特徴とするィヌリ ンの製造方法。
(4) スクロースの追添加を繰り返し行うことを特徴とする （3) に記载のィ ヌリンの製造方法。
(5) ィヌリン合成酵素が、 スクロースに作用してィヌリ ンを生成するが、 ケ ス トース、 マノレトース、 ラク トース、 トレノヽロース、 セロビ才ースには作用しな い作用及び基質特異性を有するものであることを特徴とする （1) 〜 （4) のい ずれかに記載のィヌリンの製造方法。
(6) ィヌリン合成酵素が、 該酵素を産生する微生物の培養液若しくは培養菌 体、 又はその処理物であることを特徴とする （1) 〜 （5) に記載のいずれかに 記載のィヌリンの製造方法。
(7) (1)、 （2) 又は （3) に記載の方法を 2種以上組み合わせて行うこと を特徴とするィヌリンの製造方法。
(8) (1) 〜 （7) のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、 所 定の平均重合度を有するィヌリンの製造方法。
(9) (1) 〜 （7) のいずれかに記載の方法を用いることによって得られる 所定の平均重合度を有するィヌリン。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2001-293067号の明細書 及ぴノ又は図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 スクロース濃度及ぴ反応温度とィヌリンの平均重合度との関係を示す 図である。
図 2は、スクロースの追添加とィヌリンの平均重合度との関係を示す図である。 図 3は、 スクロースの追添加の回数とィヌリンの平均重合度との関係を示す図 である。なお、 図中、 矢印は追添加の時期を示す。
図 4は、本発明のィヌリン （平均重合度 1 7 ) の HPLCによる分析結果を示す図 である。
図 5は、植物由来のラフテリン S T (平均重合度 11、 オラフティ社製） の HPLC による分析結果を示す図である。
図 6は、植物由来のラフテリン H P (平均重合度 22、 オラフティ社製） の HPLC による分析結果を示す図である。
発明を実施するための形態
本発明のィヌリンの製造方法について、 以下にさらに詳しく説明する。
本発明の方法は、 ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリンを生成 するィヌリンの製造方法において、 ィヌリンの平均重合度を調節するための各種 方法である。
本発明において、ィヌリンとは、スクロースのフラク トース側に D-フラク トフ ラノースが 0 - (2→1)結合で順次脱水重合した多糖類であって、 グルコースに 2 分子以上のフラク トースが重合したものを意味し、 2〜4分子のフラク トースが 重合した低重合度のフラク トオリゴ糖をも含む。
上記において、 ィヌリン合成酵素を 「スクロースに接触させる」 とは、 スクロ ースを炭素源として含有する培地等にィヌリン合成酵素を添加し、 これらが反応 液中でスクロースを基質としてィヌリンを生成し得る条件下で反応させることを 意味する。
ここで、 ィヌリン合成酵素は、 スクロースをィヌリンに変換することができる 基質特異性を有する酵素であればいずれの酵素をも使用することができる。 その 一例として、 スクロースに作用してィヌリンを生成するが、 ケストース、 マルト ース、 ラタ トース、 トレハロース、 セロビオースには作用しない作用及ぴ基質特 異性を有するィヌリン合成酵素が挙げられる。 .
また、 ィヌリン合成酵素としては、 該酵素を産生する微生物の培養液若しくは 培養菌体、 又はその処理物も含まれる。 ここで、 培養菌体とは、 適切な条件下で 培養された前記微生物を意味し、 生菌であっても凍結乾燥されていてもよく、 あ るいはまたアセ トンパウダー等の形態であってもよい。 また、 培養菌体処理物と は、 本発明の酵素をその機能を失うことなく採取できるものであれば特に限定さ れないが、 例えば、 上記培養菌体の破砕物、 菌体抽出液、 固定化菌体等を意味す る。 ここで、 培養菌体の破碎物及ぴ菌体抽出液とは、 該菌体を公知の破砕方法、 例えば、 超音波破砕法、 ダイノミル破砕法、 フレンチプレス破砕法により破砕し て得られる物質及び抽出液を意味する。また、固定化菌体とは、公知の固定化法、 例えば、 包括法、 担体結合法で前記菌体を固定化し、 必要に応じて架橋したもの を意味する。 包括法としては、 カラギーナンやアルギン酸等の天然高分子を用い る方法が挙げられる。
上記ィヌリン合成酵素のうち、 スクロースに作用してィヌリンを生成するが、 ケス トース、 マノレトース、 ラク トース、 トレハロース、 セロビ才ースには作用し ない作用'及び基質特異性を有するィヌリン合成酵素微生物から得られるィヌリ ン 合成酵素としては、 具体的には、 PCT/JP01/01133に記載されているバチラス sp. 217C- 11 株 （FERM BP - 7450) の培養液若しくは培養菌体又はその処理物から得ら れるものを用いることができる。
このバチラス （Bacillus) sp. 217C-11 株の培養及び酵素の調整方法について、 以下に簡単に説明する。
培地に添加する炭素源としては、 通常使用されるものを適当な濃度で使用すれ ばよい。 例えば、 スクロース、 グルコース、 フラクトース、 マノレトースなどの糖 質を単独又は混合して用いることができる。 本菌を用いて、 スクロースを基質と してィヌリンを生成させる酵素を調製する上で、 最も好ましい炭素源はスクロー スであり、 これを主炭素源とした液体培地を用いて培養を行うことにより該酵素 活性は向上する。 当然のことながら、 粗糖、 廃糖蜜等のスクロース含有物を用い てもよい。
窒素源としては、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーン 'スティープ . リ カー等の有機窒素源のほか、 硫酸、 硝酸、 リン酸のアンモニゥム塩などの無機窒 素源を単独又は混合して用いることができる。 無機塩類としては、 カリウム、 ナ トリウム、 カルシウム、 マグネシウム、 マンガン、 鉄等の硫酸塩、 塩酸塩、 炭酸 塩、硝酸塩、リン酸塩等をそれぞれ単独で又は組み合わせて用いることができる。 さらに必要に応じて、 アミノ酸、 ビタミンなど通常の培養に用いられる栄養源を なども適宜用いることができる。 本発明の方法において使用するのに適した培地 としては、 スクロース 0. 5〜2°/。 (w/v) , ペプトン 1%、 酵母エキス 0. 5%、 リン酸 2 カリウム 0. 2%を含む pH7〜8の液体培地を用いることが適当である。
培養は、 振とう培養又はジャー · ファーメンターを用いて通気条件下で行うこ とができる。 培地の pHは 6〜9の範囲が好ましく、 培養温度は 25°C〜37°Cの範囲 が好ましく、 培養時間は微生物が増殖し得る以上の時間であればよく、 5〜96 時 間、 好ましくは 15〜72時間である。
バチラス （Bacillus) sp. 217C- 11株を先に示した培地で培養後、 遠心分離によ り除菌し、 その後培養上清を分画分子量 30000の限外濾過膜を用いて濃縮し、 反 応用の酵素液として使用することができる。
なお、 バチラス （Bacillus) sp. 217C- 11株由来の酵素を含む、 スクロースに作 用してィヌリンを生成するが、 ケス トース、 マノレトース、 ラクトース、 トレハロ ース、 セロビオースには作用しない作用及び基質特異性を有するィヌリン合成酵 素は、 以下の理化学的性質を有するものである。
分子量： 4 5， 0 0 0〜 5 0 , 0 0 0
至適温度： 4 0〜 5 0 °C
熱安定性： 4 5 °Cを越えると徐々に失活し始め、 5 0 °Cで 7 0 %、 6 0 °C で 4 0 %の残存活性を示す。
至適 p H ： 7〜 8 ( 4 5 °C)
p H安定性： p H 6以上で安定。
ィヌリン合成酵素の濃度は、 反応液中のスクロース （基質） を十分に利用し得 る濃度であればよく、 例えば、 スクロース 40〜60% (w/w) の場合、 ィヌリン合 成酵素の活性が 0. 4 unit/ml 反応液となる濃度とするのが好ましい。
スクロースの基質としてィヌリンを生成するのに適切な pHは、 pH 6〜8の範 囲の反応液を用いるのが好ましい。さらに該反応液の pHを保っためにリン酸緩衝 液を用いることもできる。 反応時間は、 ィヌリン合成酵素の使用量等により適宜 変更することができるが、 通常、 0. 1〜100時間、 好ましくは、 0. 5〜72時間であ る。
得られるィヌリンの平均重合度の分析は、以下のようにして行うことができる。 なお、 重合度とは、 ィヌリン中のサッカライ ド単位 （フノレク トース及びダルコ一 ス単位） の数であり、 平均重合度は、 例えば、 以下のようにして、 HPLC、 GC、 HP AEC 等の通常の分析法によって求めた分析結果のピークのトップを平均重合度と することができる。 カラムとして、 例えば、 信和化工製の ULTRON PS-80N (8 X 30 Omm) (溶媒；水、 流速； 0. 5ml/min、 温度； 50°C)、 あるいは、 T0S0H製の TSK - GE L G3000PWXL (7. 8 X 300mm) (溶媒；水、 流速； 0· 5ml/min、 温度； 50°C) を用い、 検出器として示差屈折計を使用することによって確認された生成ィヌリンの重合 度を、 標準物質として、 例えば、 植物由来のィヌリンであるオラフティ社のラフ テリン S T (平均重合度 11 ) とラフテリン H P (平均重合度22) を用いて作成し た検量線により求めることができる。なお、ィヌリンの重合度の分析に関しては、 Cri t i cal Revi ews in Food Sci ence and Nutrit i on, 35 (りハ 525-552 ( 1995) の文献を参考にして実施することができる。
本発明では、 上記ィヌリンの製造方法において、 ①スクロース濃度の調整、 ② ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させる際の温度の調整、 ③スクロースの追 添加、 を行うことによって、 生成されるィヌリンの平均重合度を調節することが できる。
ィヌリンの平均重合度を調節する第 1の方法としてのスクロース濃度の調整は、 ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリンを生成するィヌリンの製造 方法において、 スクロースの濃度を調整することによってィヌリンの平均重合度 を調節することを特徴とするィヌリンの製造方法である。
本発明で使用するスクロースの濃度は、 例えば、 3〜68% (w/w) , 好ましくは 10〜60% (w/w) の範囲であるが、 スクロース濃度を上記範囲内で低く設定するこ とによって、 得られるィヌリンの平均重合度を高めることができる。 例えば、 反 応温度が 15°Cの場合、原料のスクロース濃度が 50%のときに得られるィヌリンの 平均重合度は 10であるのに対し、 原料のスクロース濃度が 20%のときに得られ るィヌリンの平均重合度は 18である。 また、 反応温度が 37°Cの場合、 原料のス クロース濃度が 60%のときに得られるィヌリ ンの平均重合度は 9であるのに対し、 原料のスクロース濃度が 20%のときに得られるィヌリンの平均重合度は 20であ る。 従って、 スクロース濃度を適宜設定することによって、 所望の平均重合度の ィヌリンを得ることができる。 ィヌリンの平均重合度を調節する第 2の方法としてのィヌリン合成酵素をスク ロースに接触させる際の温度の調整は、 ィヌリン合成酵素をスクロースに接触さ せてィヌリンを生成するィヌリンの製造方法において、 前記接触の際の温度を調 整することによってィヌリンの平均重合度を調節することを特徴とするィヌリン の製造方法である。
ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させる際の反応温度は、 20〜70° (：、 好ま しくは、 40〜50°Cであるが、 反応温度を前記範囲内で高い温度に設定することに よって、 得られるィヌリンの平均重合度が高くなる。 例えば、 スクロース濃度が 50%の場合、 反応温度が 15°Cのときにはィヌリンの平均重合度は 10であるのに 対し、 反応温度が 37°Cのときにはィヌリンの平均重合度は 14である。 また、 ス クロース濃度が 30%の場合、反応温度が 15°Cのときにはィヌリンの平均重合度は 15であるのに対し、 反応温度が 37°Cのときにはィヌリンの平均重合度は 19であ る。 従って、 反応温度を適宜設定することによって、 所望のィヌリ ンの平均重合 度を得ることができる。
ィヌリンの平均重合度を調節する第 3の方法としてのスクロースの追添加は、 ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリンを生成するィヌリンの製造 方法において、 前記スクロースが前記ィヌリ ン合成酵素によって消費され、 平衡 状態に達した段階でスクロースを追添加し、 さらにィヌリンの生成反応を継続す ることを特徴とするィヌリンの製造方法である。
スクロースを追添加する時期は、 スクロースにィヌリン合成酵素を接触させて ィヌリンの製造を開始した後であって、 ィヌリン合成酵素の活性が認められ、 か つ、 スクロースの消費が反応によってある程度進んだ時期であるが、 特に好まし くは、 合成反応が平衡に達した段階である。 反応の進行具合については、 HPLCに よる成分分析により確認することができる。
スクロースを追添加する回数は、 ィヌリ ン合成酵素の活性が残存し、 合成反応 が継続していく限り、 特に限定されず、 所望の平均重合度に応じて任意に設定す ることができるが、 高い平均重合度を有するィヌリンを得るためにはスクロース の追添加の回数を多くすることが好ましい。
なお、 これらの方法は単独で用いても、 又は 2種類以上組み合わせて用いても よい。 上記の方法を行うことにより、 所定の平均重合度を有するィヌリンを得ること ができる。 所定の平均重合度を有するィヌリ ンは、 重合度 8〜 2 5の間の任意の 所望の平均重合度を有するィヌリンを得るのに最適な温度、 接触温度、 及び, 又はスクロースの追添加を設定することにより得ることができる。 例えば、 スク ロース濃度 50%、 接触温度 15°Cの設定、 又は、 スクロース濃度 60%、 接触温度 4 5°Cの設定、 あるいは、 スクロース濃度 60%、 接触温度 50°Cの設定における反応' によって、 8〜1 2の範囲内の平均重合度を有するィヌリンを得ることができる。 また、 例えば、 スクロース濃度 30%、 接触温度 15°Cの設定、 又は、 スクロース濃 度 40%、 接触温度 37°Cの設定、 あるいは、 スクロース濃度 50%、 接触温度 45°Cの 設定において、 1 3〜1 8の範囲内の平均重合度を有するィヌリンを得ることが できる。 さらに、 例えば、 スクロース濃度 20%、 接触温度 37°Cの設定、 又は、 ス クロース濃度 30%、 接触温度 37°Cの設定において、 1 9〜2 5の範囲内の平均重 合度を有するィヌリンを得ることができる。 '
このようにして得られる本発明のィヌリンは、 フラク トース鎖長の重合度分布 においてばらつきが小さく、 特定の重合度に高い割合を示すシャープな分布を示 す一定の品質を保ったィヌリンである。なお、本明細書において重合度分布とは、 ィヌリンが有するフラク トース鎖長の重合度の最大値〜最小値の分散範囲を示す ものであって、 本発明のィヌリンは、 平均重合度 ± 2 0以内、 好ましくは平均重 合度 ± 1 5以内の重合度の範囲を有するィヌリンである。 また、 重合度分布の最 大値〜最小値の範囲の点からは、 最大値〜最小値が 3 5以下、 好ましくは 3 0以 下の重合度の範囲を有するィヌリンである。 実施例
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を限 定するものではない。
[実施例 1 ] バチラス （Bacillus) sp, 217C- 11株からの酵素液の調製
バチラス （Bacillus) sp. 217C- 11株 （FERE BP-7450) を、 スクロース 0. 5〜2% (w/v)、 ぺプトン 1%、 酵母エキス 0. 5%、 リン酸 2カリウム 0. 2%、 硫酸マグネシ ゥム 0. 05%を含む pH7〜8の液体培地にて 30°Cで 18時間振とう培養した。
次に、 その培養上清に固形の硫酸アンモニゥムを加え、 70%飽和で沈殿する画 分を遠心分離機を使用して集めた。そしてこの沈殿物を pH 7. 0の 20 mMのリン酸 緩衝液に溶解し、 透析チューブに入れた後、 同緩衝液で十分に透析して酵素の粗, 酵素液を得た。 次いで、 常法に従って東ソー株式会社製の TSKgel DEAE トヨパー ル 650、 トヨパール HW55、 フアルマシア製のセフアクリル S- 300を使用して、 該 粗酵素液をィオン交換ク口マトグラフィ一及びゲル濾過クロマトグラフィーに供 することにより、 本発明のィヌリン合成酵素を精製した。 これを反応用の酵素標 品として使用した。
[実施例 2 ] スクロース濃度及び反応温度の調整による生成ィヌリンの平均重合 度の調節
実施例 1で調製したィヌリン合成酵素を 2u/ml、 リン酸緩衝液 （ p H7. 0) 10m M、 スクロース濃度を最終濃度で各々 20% (w/w)、 '30% (w/w)、 40% (w/w) . 50% (w /w)、 60% (w/w)となるように水で調整し反応液とした。 各反応液を 15° ( 、 37°C、 45°C、 50°Cに設定した各恒温水槽に入れて 48時間の反応を行った。生成されたィ ヌリンの平均重合度を調べた結果を図 1に示した。
その結果、 いずれの反応温度の場合とも、 生成するィヌリンの平均重合度は反 応中のスクロース濃度が低くなるにつれて高くなった。又、スクロース濃度が同じ 場合、 反応温度が高くなるにつれて生成するィヌリンの平均重合度が高まること が確認された。
[実施例 3 ] スクロースの追添加によるィヌリンの平均重合度の調節効果
40g のスクロース、 実施例 1で調製した 30u/ml のィヌリン合成酵素 2. 4〜4 g に水を加えて 100gにした反応液を 500mlの三角フラスコに入れ、 150rpmで攪拌 しながら反応を行った （以下、 第 1反応と称する） 。スクロースの消費がほぼ停止 した時点で 40% (w/w) スクロースを 20〜； 100g と量を変えて第 1反応溶液に添加 し、 再度、 スクロースの消費が停止するまで反応を継続した （以下、 第 2反応と 称する） 。なお、 スクロースの追添加によりィヌリン合成酵素が希釈されるので、 酵素の最終添加濃度をすベて一定にするため、 第 1反応の段階での酵素の添加量 に変化をつけ調整した。
表 1に、 第 1反応のィヌリン合成酵素添加量と反応時間及ぴ反応液成分の分析 値と生成ィヌリンの平均重合度を示した。 また、 表 2に、 第 2反応の追添加スク ロース量と反応時間及び反応液成分の分析値と生成ィヌリンの平均重合度を示し た。さらに、図 2に、スクロースの追添加量の差による生成ィヌリンの平均重合度 の違いについて示した。その結果、第 1反応後の追添加するスクロース量が多いほ ど、 生成するィヌリンの平均重合度は高くなつていることが確認された。 第 1反応の結果
Figure imgf000014_0001
DP=平均重合度 表 2
第 2反応の結果
Figure imgf000014_0002
DP二平均重合度
[実施例 4 ] スクロースの追添加回数調整による生成ィヌリンの平均重合度の調 節効果
スクロース 5gに 0. 4M リン酸緩衝液（pH7) 0. 25ml、 30u/mlィヌ リ ン合成酵素 4g を加え、 水で 10gに調整した溶液を 60°Cで第 1反応を行った。 この第 1反応のス クロース消費が平衡に達する段階で 50% (w V)スクロース溶液（pH7)を 1回につき 5g ずつ追添加し、 第 2反応を継続した。この操作を 4回繰り返し、 各回毎の生成 ィヌリンの平均重合度を調べた。その結果を図 3に示した。図 3から明らかなよう に、 スクロースを追添加する回数が増えるにつれてィヌリンの重合度は高まり、 4回の追添加を経て得られたィヌリンの平均重合度は 23に達した。
[実施例 5 ] 重合度分布の検討
カラムとして、 T0S0H製の TSK- GEL G3000PWXL (7. 8 X 300mra) (溶媒；水、 流速； 0. 5ml/min、 温度； 50°C) を用い、 検出器として示差屈折計を使用した HPLC分析 によって確認された本発明のィヌリ ンの重合度を、 標準物質として、 植物由来の ィヌリンであるオラフティ社のラフテリン S T (平均重合度 11) とラフテリン H P (平均重合度 22) を用いて作成した検量線により求め、 本発明のィヌリンと植 物由来のィヌリンにおける重合度の分布を比較した。 本発明のィヌリンの結果を 図 4に、 ラフテリン S T (平均重合度 11) とラフテリン H P (平均重合度 22) の 結果をそれぞれ図 5と図 6に示す。 これらの結果から明らかなように、 本発明の ィヌリン （平均重合度 17) は、 標準物質として用いた植物由来のィヌリンよりも ピークの幅は狭く、 ピークの高さは高くなつている。
さらに、 本発明のィヌリンと植物由来のィヌリンであるラフテリン H Pの具体 的な重合度分布の範囲の数値を確認した結果、平均重合度が 17である本発明のィ ヌリンは重合度分布が 4〜 3 0の範囲であるのに対し、平均重合度が 22のラフテ リン H Pの分布は 8〜 6 0程度であり、 本発明のィヌリンの鎖長の分散範囲はラ フテリン H Pの約 1 / 2であることがわかった。
従って、 本発明のィヌリンは、 重合度のばらつきが小さく、 特定の重合度に高 い割合を示す分布を示すものであるため、 一定の品質を保ったィヌリンであるこ とが明らかである。 産業上の利用性 本発明により、 ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリンを生成す るィヌリンの製造方法において、 スクロースの濃度及び/又は反応温度の反応条 件を調整すること、 あるいは、 スクロースの追添加を 1回以上実施することによ り、 ある特定の平均重合度を有するィヌリンを人為的に製造することができる。 その結果、 所望する最も有効な平均重合度を有するィヌリン画分だけを状況に応 じて採取することが可能となり、 ィヌリンをさらに用途に応じて効果的に活用す ることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

1 . ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリ ンを生成するィヌリ ン の製造方法において、 スクロースの濃度を調整することによってィヌリンの平均 重合度を調節することを特徴とするィヌリンの製造方法。
2 . ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリンを生成するィヌリン の製造方法において、 前記接触の際の温度を調整することによってィヌリンの平 言
均重合度を調節することを特徴嘀とするィヌリンの製造方法。
3 . ィヌリン合成酵素をスクロースに接触させてィヌリンを生成するィヌリン の製造方法において、前記スクロースが前の記ィヌリン合成酵素によって消費され、 平衡状態に達した段階でスクロースを追添加し、 さらにィヌリンの生成反応を継 続することによってィヌリン.の平均重合度を高めることを特徴とするィヌリンの 製造方法。
4 . スクロースの追添加を繰り返し行うことを特徴とする請求項 3に記载のィ ヌリンの製造方法。
5 . ィヌリン合成酵素が、 スクロースに作用してィヌリンを生成するが、 ケス トース、 マノレトース、 ラク トース、 トレハロース、 セ口ビオースには作用しない 作用及び基質特異性を有するものであることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれ かに記載のィヌリ ンの製造方法。
6 . ィヌリン合成酵素が、該酵素を産生する微生物の培養液若しくは培養菌体、 又はその処理物であることを特徴とする請求項 1〜 5に記載のいずれかに記載の ィヌリ ンの製造方法。
7 . 請求項 1、 2又は 3に記載の方法を 2種以上組み合わせて行うことを特徴 とするィヌリンの製造方法。 -
8 . 請求項 1〜 7のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、 所定の 平均重合度を有するィヌリンの製造方法。
9 . 請求項 1〜 7のいずれかに記載の方法を用いることによって得られる所定 の平均重合度を有するィヌリン。
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