MXPA03005781A - Inulosacarasa de leuconostoc citreum. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una enzima fructosilsacarasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ??2-1 en la cadena lineal principal y ??2-6 en los puntos de ramificacion, generando un polimero de inulina de alto peso molecular, al fragmento de DNA que la codifica, a un vector para su expresion, al metodo para su produccion por un enfoque recombinante. Asi mismo, la presente invencion se refiere a variantes de la enzima, de menor tamano pero funcionalmente equivalente, los fragmentos de DNA que las codifican, los vectores para su expresion y al metodo para su produccion por via recombinante. En otro alcance de la presente invencion se reivindica un metodo para la produccion de un polimero de inulina de alto peso molecular, a partir de cualquiera de las diferentes versiones de enzima fructosiltransferasa de la presente invencion, a un metodo para la produccion de polimeros de inulina de bajo peso molecular a partir de las diferentes versiones de enzima fructosiltransferasa de la presente invencion y un metodo para la produccion de fructooligosacasidos a partir de las diferentes versiones de enzima fructosiltransferasa de la presente invencion.

Description

INULOSACARASA DE LEUCONOSTOC CITREUM CAMPO TÉCNICO La presente invención se ubica en el campo de las enzimas tipo glicosil-transferasas, más específicamente de las fructosil-transferasas. En particular se refiere a una fructosiltransferasa aislada de Leuconostoc citreum (capaz de sintetizar inulina de alto peso molecular y fructoologosacáridos a partir de sacarosa también conocida como inulinsacarasa, inulosacarasa o inulinosacarasa) y a un conjunto de fructosiltransfereasas derivadas de la misma, así como a métodos para la producción de dichas enzimas por tecnología de ADN recombinante, y la producción de un polímero de alto peso molecular tipo inulina , inulina y fructooligosacáridos a partir de sacarosa o rafinosa, por catálisis con dichas enzimas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Leuconostoc es una bacteria ácido-láctica heterofermentativa comúnmente aislada de productos lácteos, carne y productos vegetales. Debido a los diferentes metabolitos producidos durante su fermentación contribuye al desarrollo del sabor, la textura y a la conservación en alimentos. Leuconostoc es además un microorganismo Grado-Alimenticio Generalmente Reconocido Como Seguro (GRAS por sus siglas en ingles) que es capaz de producir homopolímeros extracelulares como la alternana, dextrana o levana a partir de sacarosa. Las enzimas responsables de la síntesis de estos polisacáridos son las glicosiltransferasas. Las fructosiltransferasas (FT), así como las glucosiltransferasas (GT), son ejemplos de glicosiltransferasas que catalizan la transferencia de un residuo de fructosa o glucosa de la sacarosa a una cadena creciente de polisacárido, resultando en la síntesis de polímeros de alto peso molecular de fructosa (fructanas) o de glucosa (glucanas), respectivamente. Los polímeros producidos por estas enzimas tienen diferentes tamaños y estructuras, dependiendo de la cepa que produzca la enzima. Las levanas son fructanas que contienen enlaces ß2-6 en la cadena lineal principal con enlaces ß2-1 en los puntos de ramificación, mientras que las inulinas son fructanas que con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, ambas pueden o no ser ramificadas. Las glicosiltransferasas no requieren ningún cofactor o intermediario de alta energía, ya que para la síntesis utilizan la energía liberada por la ruptura de la sacarosa. Una propiedad interesante de estas enzimas es su habilidad para catalizar la síntesis de oligosacáridos de bajo peso molecular a partir de sacarosa cuando alguna molécula aceptora eficiente es adicionada al medio de reacción. Algunos de estos oligosacáridos son utilizados como prebióticos tanto en cosméticos como en aplicaciones alimentarias ya que son altamente resistentes al ataque por enzimas digestivas, siendo sustratos sólo para una flora probiótica benéfica nativa. Los principales microorganismos productores de fructosiltransferasas son bacterias Gram-positivas tales como varias especies de Bacilhis incluyendo B. subtilis, B. circulans, B. polymyxa, B. Amyloliquefaciens, Rhanella aquatilis, y Lactobacillus reuteri. También son encontradas en algunas bacterias Gram-negativas tales como Zymomonas mobilis, Erwinia herbicola, Pseudomonas syringe pv. glycinea y P. syringe pv. Phaseolicola y Acetobacter diazotrophicus. Tanto Leuconostoc mesenteroides como Streptococci de la flora oral han sido reportados como productores de dextranas y levanas. La inulina se encuentra presente de manera natural en un gran número de plantas tales como el trigo, plátano, cebolla, agave y la achicoria, en cuyas raíces se encuentra presente en un 15 a 20%. Se trata de un polisacárido de la familia de las fructanas. Típicamente, la inulina comprende cadenas de 2 á 60 residuos de fructosa. La inulina posee propiedades funcionales y nutricionales que la hacen altamente atractiva para la formulación de alimentos preparados. Es capaz de formar microcristales cuando se mezcla con agua o leche tomando la consistencia y textura de una crema suave, por lo que ha sido exitosamente utilizada para reemplazar grasas en una amplia variedad de productos alimenticios. Algunos de sus usos que se pueden encontrar en patentes norteamericanas para la obtención de los productos bajos en o libres de grasa son: sustitutos de mantequilla y margarinas (patentes norteamericanas 6,132793; 5846,592 y 5,501,869); quesos (patente norteamericana 6,120,809); betunes pasteleros y rellenos de galletas (patentes norteamericanas 5,939,127; 5,851,576; 5,629,041 y 5,527,556); aderezos (patentes norteamericanas 5,795,614; 5,721,004 y 5,527,556); mayonesas (patente norteamericana 5,641,533); helados, productos cárnicos y rellenos cremosos (5,527,556). Tanto la inulina como los oligofructósidos, que son cadenas cortas de inulina de hasta 10 residuos de fructosa, están considerados como fibra natural con la peculiaridad de no introducir sabores ajenos al alimento y no contribuir a aumentar la viscosidad del mismo. Se utilizan como una forma alterna de adicionar fibra. Particularmente los oligofructósidos se utilizan en cereales, preparados de frutas para yogur, postres congelados y algunos lácteos. La inulina es utilizada según la patente norteamericana No. 5,792,754 como fibra natural en una composición nutritiva de alto contenido de fibras. Los oligofructósidos son también muy utilizados junto con edulcorantes de alta intensidad para dar un balance adecuado del perfil de dulzura y enmascarar el sabor que dejan el aspartame y el acesulfame K. Particularmente la inulina y los oligofructósidos poseen una propiedad nutricional: el efecto prebiótico. Precisamente el tipo de enlace ß(2-1) entre los residuos de fructosa que forman las cadenas de la inulina y los oligofructósidos, los hacen no digeribles en el estómago o intestino humanos y de algunos mamíferos, por lo que pasan intactos por el tracto digestivo hasta llegar al intestino grueso, donde favorecen la proliferación de la microflora aportando un valor calórico muy bajo a la dieta. Por otro lado, el efecto prebiótico de la inulina y los oligofructósidos en el intestino grueso consiste en favorecer el desarrollo de bacterias benéficas para el funcionamiento intestinal (probióticos). Dentro de los probióticos los más estudiados han sido los pertenecientes al grupo de las bifidobacterias. Las bifidobacterias, son capaces de desdoblar los enlaces ß(2-1) característicos de estos carbohidratos, por lo que al incluirlos en cantidades importantes, se favorece el crecimiento de la población de bifidobacterias desplazando poblaciones de otras bacterias, incluyendo algunas tóxicas o carcinogénicas. A este fenómeno se le conoce como efecto prebiótico o bifidogénico. Entre las principales bondades de las bifidobacterias están la inhibición del crecimiento de ciertas bacterias peligrosas con las que son antagónicos, el estímulo de algunos componentes del sistema inmune, la ayuda en la absorción de ciertos iones y la síntesis de vitamina B. El efecto prebiótico de la inulina es característico en diversos productos alimenticios como: suplementos (patente norteamericana No. 6,203,797), cereales y alimento balanceado para mascotas (patentes norteamericanas 6,197,361; 6,149,965; 5,968,569; 5952,033) y alimentos para bebés (patente norteamericana 5,840,361). También se busca a través de este efecto estimular la salud en combinación con probióticos en composiciones adecuadas para el funcionamiento intestinal (patente norteamericana 6,086,886); en productos nutritivos para personas con colitis ulcerante y métodos para su tratamiento (patentes norteamericanas 5,780,4 1 y 5,444,054). Adicionalmente la inulina tiene otras aplicaciones como la producción de gama-inulina para una composición farmacéutica como agente inmunoterapéutico y tratamiento antitumoral (patentes norteamericanas 4,954,622 y 5,476,844); o bien la producción de algunos derivados de la inulina como: dianhidros de fructosa (patente norteamericana 5,925,190); ésteres alifáticos de inulina (patente norteamericana 5,877,144) y carboxymetil inulina (patente norteamericana 5,777,090), entre otros. La producción industrial de inulina se realiza a partir de la extracción del polímero de plantas y raíces que contienen importantes cantidades de este polisacárido de fructosa, las cuales lo acumulan como una reserva de carbohidratos. La fuente principal es la raíz de achicoria (Chicorium intybus). La inulina es sintetizada por estos organismos mediante una combinación de al menos dos diferentes fructosiltransferasas. En un primer paso, la sacarosa-sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST) cataliza la formación del trisacárido 1-kestosa a partir de dos moléculas de sacarosa liberando glucosa. Posteriormente la fructana-fructana 1- fructosiltransferasa (1-FFT) media la transferencia reversible de los residuos fructosilo a partir de la 1-kestosa, elongando la cadena de inulina que se está formando. Dado que la inulina es altamente soluble en agua, los métodos de extracción se basan en esta propiedad. Rebanadas secas de la raíz de achicoria son molidas, adicionándose agua destilada en proporción 1 :5; se mezcla durante 50 minutos a 70°C con agitación constante y posteriormente se filtra a través de una tela de algodón. Otro método de extracción consiste en utilizar la raíz fresca lavada perfectamente, triturada, y después prensada. El jugo resultante es centrifugado (10000 X g, 20min) seguido de una microfiltración (membrana millipore, 0.45¡im). La inulina extraída de esta manera tiene diferentes grados de polimerización y según las necesidades puede posteriormente ser tratada con inulinasas para lograr los productos del grado de polimerización deseado.

La principal diferencia entre las inulinas bacterianas y las producidas por plantas, es el tamaño del polímero, ya que en plantas la inulina tiene un grado de polimerización de 2 a 60 unidades de fructosa, mientras que las bacterianas tienen pesos moleculares en el orden de millones. Las inulinas de alto peso molecular pueden ser tratadas con inulinasas para producir polímeros de diferentes grados de polimerización y la reacción de hidrólisis se puede controlar para dar grados de polimerización específicos según las distintas necesidades del mercado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Curva de crecimiento de L. citreum CW28, producción de la Inulosacarasa y seguimiento del pH durante la fermentación. (¦) DO 650 nm; (A) actividad IS y (?) pH.

Figura 2. Análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de la IS asociada a células de L. citreum CW28. Los geles fueron tratados con Tween 80 para eliminar el SDS y posteriormente incubados en buffer de fosfato de potasio pH 6.5 con sacarosa a) o rafinosa b). En la línea 1, DS y LS de L. mesenteroides B-512F; línea 2, LS de B. subtilis línea 3, IS de J. citreum CW28.

Figura 3. Electroforesis en gel de acrilamida. Carril 1. Células completas en donde se observa una banda de producción de polímero por la fructosiltransferasa de la cepa CW28. Carril 2. Células completas teñidas con coomassie. Carril 3. Marcadores de peso molecular.

Figura 4. Estrategia usada para el aislamiento del gen de la inulosacarasa de L. citreum. A: Producto de PCR de la reacción realizada con los oligonucleótidos (28IS y 29IS) diseñados a partir de los dos péptidos secuenciados de la enzima IS purificada; B: Producto de PCR amplificado con los oligonucleótidos 539IS, diseñado a partir del conocimiento de la secuencia del producto amplificado en A, y 868IS, diseñado a partir del gen de la alternansacarasa de la cepa 1355 de Leuconostoc mesenteroides, según el análisis comparativo de secuencia del producto amplificado en A; C: Producto de la reacción de PCR inversa, con los oligonucleótidos 128rIS y 421rIS, diseñados a partir de la secuencia obtenida en A, usando como templado el genoma de L. citreum CW28 digerido con Hind III.

Figura 5. Diagrama donde se representan las tres versiones de enzimas IS recombinantes, que fueron expresadas en E. coli. EIS es la enzima IS completa; EIS2 es la enzima IS a la que se le deletó la región del C-terminal con alta identidad con ASR y EIS3 es la enzima IS a la que se le deletó la misma región que a EIS2 y además la región de transición.

Figura 6. Se muestran los 3 plásmidos pCRIS, pCRIS2 y pCRIS3, obtenidos al ligar los genes EIS, EIS2 y EIS3 al plásmido pCR 4-TOPO.

Figura 7. Se representan los diferentes fragmentos de DNA (rectángulos) utilizados para expresar las enzimas IS de la presente invención, junto con el gene silvestre y los fragmentos mínimos necesarios para expresar las tres versiones mínimas de las enzimas de la presente invención . En forma paralela, se representan las enzimas IS de la presente invención (cadenas de círculos). Las áreas sombreadas representan el promotor ¡ , el péptido señal ? , el dominio catalíticoD , la zona de transición ^ y la zona de identidad con la ARS ?? . A) representa el gene silvestre y la enzima IS silvestre producida por L. citreum (el péptido señal es procesado); B) representa los fragmentos de DNA utilizados para expresar la enzima IS recombinante, con y sin promotor homólogo respectivamente, y la enzima EIS recombinante (el péptido señal no es procesado en E. coli); C) representa los fragmentos de DNA usados para expresar la enzima EIS2, con y sin promotor homólogo respectivamente, y la enzima EIS2 recombinante (el péptido señal no es procesado en E. coli); D) representa los fragmentos de DNA usados para expresar la enzima EIS3, con y sin promotor homólogo respectivamente y la enzima EIS3 recombinante (el péptido señal no es procesado en E. coli); E), F) y G) representan los fragmentos de DNA mínimos necesarios para expresar las versiones mínimas de las enzimas EIS, EIS2 y EIS 3, respectivamente, es decir sin promotor homólogo y sin péptido señal, y las enzimas EIS, EIS2 y EIS3 mínimas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El glosario que se presenta a continuación es proporcionado como una ayuda para entender ciertos términos que vienen incluidos en el presente documento. La explicación que se proporciona en el glosario es para propósitos ilustrativos y no limitan el alcance de la invención: Actividad IS, se refiere a la actividad de una enzima, ya sea soluble o inmobilizada de manera natural o artificial, que le da la capacidad de sintetizar un polímero tipo inulina, es decir con residuos de fructosa unidos con enlaces ß2-1 en la cadena en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, a partir de sacarosa o rafmosa. Similarmente, enzima IS se referirá a aquella enzima que posee dicha actividad IS. Actividad DS, se refiere a la actividad de una enzima, ya sea soluble o inmobilizada de manera natural o artificial, que le da la capacidad de sintetizar un polímero tipo dextrana, es decir con residuos de glucosa unidos con enlaces c -6 y/o ocl-3 en la cadena principal y ocl-2, al -3, al -4 o al-6 en los puntos de ramificación, a partir de sacarosa. Similarmente, enzima DS se referirá a aquella enzima que posee dicha actividad DS. Actividad LS, se refiere a la actividad de una enzima, ya sea soluble o inmobilizada de manera natural o artificial, que le da la capacidad de sintetizar un polímero tipo fructana, es decir con residuos de fructosa unidos cón enlaces ß2-6 en la cadena principal y ß2-1 en los puntos de ramificación, a partir de sacarosa. Similarmente, enzima LS se referirá a aquella enzima que posee dicha actividad LS. Unidad de actividad (U) para todas las glicosiltransferasas se define como la cantidad de enzima que produce un µt??? de fructosa o bien, glucosa por minuto. Mutación funcionalmente equivalente, cuando esté describiendo un fragmento de DNA, se referirá a cualquier fragmento de DNA que codifique para la misma proteína (para el caso de sustituciones silenciosas) o alguna variante de la misma tal que conserve la misma función. Cuando esté describiendo a una proteína, se referirá a cualquier variante de la misma, tal que conserve la misma función. La presente invención cubre una nueva enzima que tiene actividad inulosacarasa que a partir de sacarosa produce inulina de alto peso molecular (> 106) y fructooligosacáridos. Esta enzima fue inicialmente obtenida de la cepa CW28 de Leuconostoc citreum, la cual fue identificada mediante un análisis de rR A 16S. Esta cepa fue aislada del pozol (Escalante y col. Int J food Microbiol (2001) 64, 21-31). La producción de inulina por alguna especie de Leuconostoc no había sido reportada hasta ahora. Esta inulosacarasa, en Leuconostoc se produce asociada a las células. La cepa se puede cultivar en un medio como el descrito en la tabla 1. Sin embargo, como es obvio para cualquier técnico medio en el estado de la técnica, se pueden utilizar una gran variedad de condiciones de cultivo, modificando la temperatura de crecimiento, la agitación, la composición misma del medio de cultivo, etc., obteniéndose de todos modos un crecimiento celular suficiente y la producción de la actividad enzimática IS correspondiente. No obstante, es requisito insalvable para su producción con la cepa de L. citreum CW28, la presencia de sacarosa en el medio, pues su sustitución puede generar un crecimiento de células carentes de la actividad IS. La curva del crecimiento típico se muestra en la figura 1, donde se puede observar que la producción de enzima está asociada a la célula. La producción de la enzima fue claramente inducida por sacarosa mientras que no se detectó actividad r ictosiltransferasa en células de la cepa CW28 crecidas en presencia de glucosa 125 miM y sin sacarosa. La inulosacarasa o enzima IS de L. citreum CW28 tiene un peso molecular del orden de 170 kDa estimado por electroforesis en gel de poliacrilamida. Lo anterior se demostró lavando los geles exhaustivamente para remover el SDS residual, e incubándolos en presencia de sacarosa para observar las bandas del polímero formado como un resultado de la actividad IS (figura 2a). Se utilizaron enzimas LS de B. subtilis.y DS y LS de L. mesenteroides ~NKRL B-512F como controles. Adicionalmente, se llevó a cabo un gel de actividad usando rafinosa como el donador de residuos fructosilo (figura 2b). En este caso, las bandas de actividad fueron observadas sólo para las enzimas LS de B. Subtilis, LS de L. mesenteroides y la enzima IS de L. citreum CW28, apoyando la conclusión de que al igual que las enzimas LS de B. subtilis y L. mesenteroides, la actividad de la enzima producida por L. citreum CW28 es del tipo fructosiltransferasa. El peso molecular de la enzima IS de L. citreum CW28 es mucho mayor que los valores reportados para otras fructosiltransferasas (45 y 100 kDa) y que la mayoría de las LS, excepto para la enzima de Streptococcus salivar ius que produce una LS de 140 kDa.

Los estudios cinéticos con la inulosacarasa de L. citreum CW28 asociada a células muestran que tiene un pH óptimo de 6.5 y una temperatura óptima de 45°C, aunque es más estable a 30°C. Para determinar si es que la enzima inulosacarasa de L. citreum CW28 es activa también en su forma soluble se procedió a solubilizarla por tratamiento con urea, pero es obvio para un técnico medio en el estado de la técnica que se pueden emplear otros métodos para ello, tales como tratamiento con lisozima, o rompimiento de las células utilizando una prensa francesa, sonicación, congelamiento y descongelamiento, etc. En este caso la enzima muestra el mismo pH óptimo que cuando esta asociada a la pared celular. Sin embargo, la temperatura óptima en este caso es de 35°C, 10°C menor que para la asociada a células y de igual manera es más estable a 30°C. Su actividad por la técnica de DNS (Summer, 1935) fue de 5.6 U/mg de proteína. Aunque el cultivo de las células nativas de L. citreum es un posible método para producir industrialmente la enzima de L. citreum CW28, el uso de la misma asociada a la pared celular, tiene algunas limitaciones, en particular la dificultad para controlar la actividad específica. Por otro lado, si se deseara elaborar un catalizador con enzima pura, al solubilizarla, a partir de la células de L. citreum, por alguno de los métodos recién mencionados, la enzima tiende a desnaturalizarse, haciendo necesario renaturalizarla una vez libre, lo que redunda en una pérdida significativa de la actividad, pudiendo no ser muy viable económicamente el producir la enzima por este método. De ahí que la tercera opción para elaborar un biocatalizador industrialmente útil para la producción de inulina de alto peso molecular así como fructooligosacáridos, es aprovechar las herramientas de la biología molecular. De este modo, para proporcionar un método para producir industrialmente la enzima de la presente invención, abordando el enfoque de la biología molecular, se procedió a aislar, secuenciar y clonar el gene codificante de la enzima IS de la presente invención. Para ello, se inició purificando la proteína mediante electroforesis en gel de acrilamida, una parte del gel, tras ser separada, se tiñó con azul de coomassie y la otra se trató con tween 80 y sacarosa 5% para observar la actividad in situ para comprobar que la enzima teñida con coomassie es exactamente la misma que tiene la actividad productora del polímero (figura 3). Esta banda de proteína se digirió con una endo-proteasa de donde dos secuencias internas fueron identificadas a partir de los fragmentos obtenidos de la degradación: MDVWDSWALQDSK (SEQ ID NO: 1) y TAPYGEAGAQFVDYV (SEQ ID NO: 2). Con oligonucleótidos diseñados a partir de estos fragmentos se comenzó a aislar el gene y clonarlo como se describe en el ejemplo 2, obteniéndose finalmente la secuencia completa del gene de la enzima IS nativa de L. citreum CW28, que se presenta en la SEQ ID NO: 10. Una vez teniendo en mano este gene, es posible clonarlo y expresarlo en una amplia variedad de hospederos, como pueden ser células de mamífero (excepto de humano), plantas, animales, hongos, o bacterias. Para ello es necesario hacer construcciones que utilicen sistemas de expresión adecuados para el tipo de hospedero. Para ejemplificar esto, el gen codificante de la enzima IS de L. citreum CW28 fue clonado en construcciones para expresión en E. coli, tanto bajo su propio promotor, como bajo un promotor heterólogo fuerte (como se ilustra en el ejemplo 2 y más adelante en la descripción), transformando en ambos casos cepas de E. coli. Dichas cepas recombinantes fueron utilizadas para producir la enzima IS recombinante (EIS) de la presente invención, como se describe en el ejemplo 3. Las construcciones moleculares que comprendan el fragmento de DNA de secuencia SEQ ID NO: 10 codificante de la enzima IS de L. citreum CW28, así como los hospederos recombinantes que contengan dichas construcciones genéticas, son objeto del alcance de la presente invención. En general las enzimas poseen distintos dominios en su secuencia. Particularmente, la enzima IS de la presente invención, tras un análisis comparativo de secuencias, resulta poseer al menos una región variable, con alta identidad con la alternansacarasa (AS) de la cepa 1355 de Leuconostoc mesenteroides (GenBank, número de acceso: AJ250173), en el amino terminal, que va del aminoácido 1 al 138 y una región de transición del aminoácido 139 al 208; un dominio catalítico, de alta homología con otras fructosil transferasas, del aminoácido 209 al 734; otra zona de transición del aminoácido 735 al 940; y un dominio carboxiterminal de alta homología con la ASR de L. mesenteroides, del aminoácido 941 al 1490. La presente invención también se refiere a modificaciones sustanciales (mutaciones) a la secuencia primaria de la enzima IS de L. citreum tales que conserven su actividad IS (funcionalmente equivalentes) que pudieran tener ciertas ventajas respecto de la enzima no modificada. Una posible ventaja pudiera ser el tener un tamaño menor de la enzima, lo que permitiría un manejo más fácil de la misma durante su proceso de producción-purificación. Particularmente, la región carboxiterminal, que en el caso de las glucosiltransferesas (como la alternansacarasa con la que hay una alta homología en esta región) se cree que comprenden un dominio de unión al polímero (Arguello-Morales, M. et. al., 2000) puede ser un blanco interesante para una deleción, pues en las fructosiltransferasas no se ha reportado la existencia de semejante dominio. En este sentido en la presente invención se llevó a cabo exitosamente reducciones al tamaño de la enzima IS recombinante en dos construcciones, obteniendo otras 2 enzimas IS recombinantes, EIS2 y EIS3: En la primera construcción fue eliminado el dominio carboxiterminal, de alta homología con la ASR, utilizando los oligonucléotidos 11PIS (SEQ ID NO: 9) y 385IS (SEQ ID NO: 12), quedando solo un fragmento de 3363pb (SEQ ID NO: 13) (que incluyen un codón de stop que se adicionó con el oligo) (ver figura 5), del nucleótido 1 al 3333 de la construcción original, el cual se clonó en el vector pCR 4-TOPO (Invitrogen, Calsbad, CA) resultando el plásmido pCRIS2 (ver Figura 6). En una segunda construcción, se obtuvo un fragmento de 276 lpb (SEQ ID NO: 16) (que incluyen un codón de stop que se adicionó con el oligo) utilizando los oligonucléotidos 11PIS (SEQ ID NO: 9) y 384IS (SEQ ID NO: 15), este fragmento presenta una deleción que comprende la misma región de alta homología a la ASR, más la región de transición (otros 602pb) (ver Figura 5), clonándose en el vector pCR 4-TOPO (Invitrogen, Calsbad, CA) resultando el plásmido pCRIS3 (ver Figura 6). Los plásmidos pCRIS2, codificante de una enzima activa EIS2 de 942 aminoácidos (SEQ ID NO: 14), pCRIS3, codificante de una enzima activa EIS3 de 742 aminoácidos (SEQ ID NO: 17) y pCRIS, codificante de la EIS completa de L. citreum (SEQ ID NO: 11), fueron transformados en E. coli DH5a, las cepas hospederas de dichos plásmidos fueron crecidas toda la noche en medio líquido LB suplementado con kanamicina. Las células fueron separadas por centrifugación (10 min a 4°C y 5000rpm), lavadas y resuspendidas en buffer fosfatos 50mM a pH 6.5. Los extractos obtenidos a partir del tratamiento con ultrasonido de las células de E. coli DH5 /pCRIS2 y E. coli DH5a/pCRIS3, presentaron actividad IS a 30°C y pH 6.5, de 0.016U/mg de proteína total y 0.031U/mg de proteína total para EIS2 y EIS3, respectivamente, mientras que la actividad obtenida de células de E. coli DH5oí/pCRIS (con la enzima IS recombinante completa) fue de 0.015U/mg de proteína total, demostrándose claramente la formación del polímero en todos los casos, que posteriormente pudo ser digerido con inulinasa, mientras que un control de levana permaneció intacto, confirmándose que el polímero sintetizado es de inulina. Otra región de potencial interés para explorar una posible mutación que resulte funcionalmente equivalente y con un menor tamaño, es la región variable de identidad con la Alternanscarasa en el amino terminal (véase la figura 5), que corresponde a los primeros 138 aminoácidos (considerando las versiones de enzimas con péptido señal). Similarmente podría ser interesante explorar una deleción de la región variable en el extremo amino, es decir del aminoácido 139 al 209. Aunque por el momento estas posibilidades aun no fueron exploradas, no sería difícil que se obtuvieran versiones de enzimas aún más cortas que sean funcionalmente equivalentes, en cuyo caso caerían dentro del alcance de la presente invención. Adicionalmente, con el fin de expresar la enzimas recombinantes EIS, EIS2 y EIS3 bajo un promotor heterólogo, se diseñaron los oligos específicos: ISdirecto (SEQ ID NO: 18) (con base en las primeras 31 bases de la secuencia codificante del gene a partir del segundo codón), ISreverso (con base en los 33 últimas bases del gene EIS, dejando fuera el codón de término) (SEQ ID NO: 19), E2reverso (con base en las 30 últimas bases del gene EIS2, dejando fuera el codón de término) (SEQ ID NO: 20) y E3reverso (con base en las 30 últimas bases del gene EIS3, dejando fuera el codón de término) (SEQ ID NO: 21), Con estos oligonuclétidos se amplificaron versiones truncadas de las enzimas EIS, EIS2 y EIS3 de la presente invención (SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, Y SEQ ID NO:36, respectivamente) que carecen de los primeros 534 pb correspondientes al promotor homólogo de la en enzima IS de L. citreum, que se presenta en la SEQ ID NO: 29. Estos fragmentos fueron clonados en el vector pBAD/TOPO (Invitrogen, Calsbad, CA) el cual es un vector comercial de expresión que tiene un promotor fuerte inducible por arabinosa y pega colas de histidina a la proteína de expresión para facilitar su purificación. Los plásmidos resultantes se denominaron pBIS, en el caso del gen de la enzima completa EIS, pBE2 para el fragmento deletado en la zona de alta identidad con la ASR EIS2 y pBE3 para el fragmento deletado con la misma región más la región de transición EIS3. Se transformaron células de E. coli DH5a y posteriormente fueron crecidas en medio líquido LB suplementado con ampicilina y 0.02% de arabinosa como inductor. Posteriormente se trataron por sonicación. Los extractos celulares en todos los casos fueron capaces de sintetizar un polímero en presencia de sacarosa, que posteriormente pudo ser digerido con inulinasa, mientras que un control de levana permaneció intacto, confirmándose que el polímero sintetizado es de inulina. Posteriores análisis de la secuencia aminoacídica de la enzima IS solubilizada a partir de células de L. citreum mostraron que en esta cepa la enzima su&e una modificación postraduccional escindiéndosele el péptido señal, con los primeros 39 aminoácidos, por lo que la secuencia aminoacídica de la enzima IS nativa es SEQ ID NO: 22 y comprende 1451 aminoácidos. Sin embargo, el hecho de que al ser expresada en E. coli no sea procesada no impidió que la proteína de expresión fuera activa, tanto en la forma EIS como EIS2 o EIS3 tanto en la versiones expresadas bajo el promotor homólogo como bajo el promotor heterólogo. De este modo, es obvio para un experto medio en la técnica, que la región codificante del péptido señal es perfectamente prescindible para conservar la actividad enzimática IS y que es relativamente fácil diseñar y sintetizar oligonucleótidos que permitan clonar cualquiera de los fragmentos codificantes de las enzimas EIS, EIS2 o EIS3 eliminando el fragmento de DNA correspondiente al péptido señal y que inserte en el extremo amino un codón de inicio. De este modo, solo se requiere expresar el fragmento de secuencia SEQ ID NO: 23 (secuencia mínima) para producir una EIS activa mínima, sin el péptido señal (cuya secuencia aminoacídica sería SEQ ID NO: 24), mientras que se requiere apenas del fragmento de secuencia SEQ ID NO: 25 (secuencia niínima) para expresar la enzima EIS2 mínima, sin el péptido señal (cuya secuencia aminoacídica sería SEQ ID NO: 26) y del fragmento de secuencia SEQ ID NO: 27 (secuencia mínima) para expresar la enzima EIS3 mínima, sin el péptido señal (cuya secuencia aminoacídica sería SEQ ID NO: 28). En la figura 7 se representan los diferentes fragmentos de DNA que pueden ser utilizados para expresar las diversas variedad de enzimas IS de la presente invención: la enzima intacta, con y sin péptido señal, las enzimas EIS2 y EIS3 con y sin péptido señal. Es conocido que el código genético es degenerado, es decir, que para un mismo aminoácido suele haber más de un codón codificante, comúnmente, la diferencia entre esos codones es la tercera de las bases. Es obvio para un experto en el estado de la técnica, que es posible llevar a cabo sustituciones de algunas bases en cualquiera de las secuencias nucleotídicas codificantes de la enzima EIS, EIS2 o EIS3, de la presente invención, que codifiquen exactamente las mismas secuencias aminoácidas que las presentadas en las SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 28 (EIS, EIS2 y EIS3, respectivamente), generándose "mutaciones silenciosas" de las mismas. Esto puede ser particularmente útil cuando se desea expresar las enzimas de la presente invención en hospederos recombinantes distintos, pues es sabido que diferentes tipos de hospederos tienen una "preferencia" de uso hacia ciertos codones para determinados aminoácidos. Tales "mutaciones silenciosas" caen dentro del alcance de la presente invención, pues el producto de su expresión es nuevamente las mismas enzimas EIS, EIS2 y EIS3 de la presente invención. Por otro lado, también es obvio para un experto en el estado de la técnica que es posible sustituir algunos aminoácidos por otros de características semejantes, por ejemplo, un aminoácido polar por otro polar, uno aromático por otro aromático, uno cargado por otro, etc. No se espera que tales mutaciones produzcan cambios sustantivos en la actividad de la enzima, por ello aquellas mutaciones puntuales o sitio-específicas a los fragmentos de DNA codificantes de las enzimas de la presente invención, que produzcan enzimas funcionalmente equivalentes (es decir que sean capaces de producir un polímero de inulina de alto peso molecular y fructoligosacáridos a partir de sacarosa y lactosa o maltosa, en su caso) quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención. De esta manera, cualquier construcción molecular que comprenda alguna de las secuencias SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27, o cualquier mutación silenciosa o cualquier mutación sitio específica que codifique para una enzima con una actividad IS (es decir que sean capaces de producir un polímero de inulina de alto peso molecular y fructoligosacáridos a partir de sacarosa y lactosa o maltosa, en su caso) quedará comprendida dentro del alcance de la presente invención. Así pues, la presente invención también se refiere a un método para la producción de las enzimas IS de la presente invención, la EIS, EIS2 y EIS3 con o sin péptido señal, y imitantes silenciosas o sitio específicas de las mismas, que sean funcionalmente equivalentes, (es decir que sean capaces de producir un polímero de inulina de alto peso molecular), que consiste en a) cultivar, en condiciones adecuadas para su cultivo, las células de un hospedero recombinante que contenga una construcción genética adecuada para la expresión de proteínas heterólogas en dicho hospedero, la cual a su vez deberá comprender el fragmento de DNA de la SEQ ID NO: 23 , el de la secuencia SEQ ID NO: 25 o el de la secuencia SEQ ID NO:27 o mutaciones silenciosas de los mismos, o mutaciones puntuales que sean funcionalmente equivalentes, los cuales codifican para una de las enzimas IS funcionales de la presente invención; b) opcionalmente la separación de dichas células del caldo de cultivo; c) la ruptura de las células, ya sea por ultrasonido, aplicación de detergentes, por presión en un homogenizador, etc.; d) opcionalmente una separación y/o purificación de la enzima IS presente en forma de cuerpos de inclusión, lo que se puede lograr por la aplicación de uno o más métodos cromatográficos como HPLC, intercambio iónico, masa molecular, etc., o por precipitación fraccionada por la adición de sales como el sulfato de amonio, alcoholes, etc. La presente invención también cubre un método de producción del polímero de inulina de alto peso molecular usando alguna de las enzimas IS (EIS, EIS2 o EIS3, con o sin péptido señal) de la presente invención, como catalizador de la reacción de síntesis del polímero, o bien alguna muíante silenciosa o puntual funcionalmente equivalente de las mismas. Este método comprende los pasos de a) poner en contacto por un tiempo suficiente para la formación del polímero, una solución de sacarosa o rafinosa, preferentemente amortiguada a un pH cercano a 6.5, con una de las enzimas IS de la presente invención mencionadas en el párrafo anterior, de tal forma que ésta cataliza la transferencia de residuos de fructosa, de la sacarosa a una cadena creciente (iniciada con una molécula de sacarosa) de inulina, es decir a una cadena de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación. Como es sabido en general para el uso de enzimas, la temperatura de elección para la reacción compromete varios criterios, entre estos, que a mayor temperatura mayor velocidad de reacción, pero mayor también de desnaturalización de la enzima. Una temperatura que se observa adecuada para esta reacción es de entre 20 y 45°C, preferentemente entre 28 y 32°C, a pesar de ser la temperatura óptima 45 y 35°C para las enzimas IS de la presente invención; y b) opcionalmente este método puede incluir un paso de separación de la inulina de alto peso molecular sintetizada, del sistema de reacción, ya sea por que en el medio de reacción se incluye un solvente orgánico o bien por que al final de esta el polímero se precipita mediante la adición del mismo. Ejemplos de solventes usados en lareacción-extracción o en la precipitación son el etanol, 2-metil-2-butanol o propanol, entre otros. Igualmente, de manera opcional se puede incluir un paso de purificación de la inulina producida que puede ser por precipitaciones y lavados repetidos, seguidos de diálisis y/o ultrafiltración. Una aplicación de este método se ilustra en el ejemplo 4. Adicionalmente la presente invención también concierne a métodos de producción de fructooligosacáridos, conocidos como prebióticos que estimulan el crecimiento de bifidobacterias en el colon humano, ya sea mediante su síntesis con alguna de las enzimas IS de la presente invención o bien por hidrólisis de la inulina de alto peso molecular sintetizada con las mismas, tratándola ya sea con endo-inulinasas como ya se mencionó, o con exo-inulinasas en digestión parcial. El método de producción de oligofructosidos, por síntesis catalizada con alguna de las enzimas IS de la presente invención, consiste en general, en poner en contacto una solución de sacarosa, preferentemente amortiguada a un pH cercano a 6.5, con alguna de las enzimas IS de la presente invención en presencia de lactosa o maltosa, de tal forma que la enzima cataliza la transferencia del residuo de fructosa, de una molécula de sacarosa a una molécula de lactosa o maltosa formando un enlace ß2-1. Al igual que en el método de síntesis de inulina, la temperatura de elección para la reacción compromete varios criterios, entre estos, que a mayor temperatura mayor velocidad de reacción, pero mayor también la de desnaturalización de la enzima. Una temperatura que se observa adecuada para esta reacción es de entre 20 y 35°C, preferentemente entre 28 y 32°C. Opcionalmente el método de la presente invención puede incluir un paso de separación de los fructooligosacáridos sintetizados, del sistema de reacción, ya sea por precipitación con etanol, 2-metil-2-butanol o por propanol. Igualmente, de manera opcional el método de la presente invención puede incluir un paso de purificación de los fructooligosacáridos producidos que podría ser por Cromatografía de intercambio iónico. En el ejemplo 5 se ilustra la producción de fructooligosacáridos DP3, por síntesis a partir de sacarosa, usando como aceptor inicial maltosa y lactosa, reacción catalizada por las enzimas IS de la presente invención. Otro método de producción de fructooligosacáridos consiste en producir la inulina de alto peso molecular con el método mencionado con anterioridad, para posteriormente ponerla en contacto con una endo-inulinasa como la producida por Aspergillus níger DSM 2466 (Gern et. al. 2001), que hidroliza algunos de los enlaces ß2-1 entre residuos de fructosa, dando origen a oligosacáridos de diversos grados de polimerización. Opcionalmente el método incluye pasos de separación y purificación de los fructoligosacáridos. Otro método de producción de fructooligosacáridos consiste en producir la inulina de alto peso molecular con el método mencionado con anterioridad, para posteriormente ponerla en contacto con una exo-inulinasa como la producida por Aspergillus niger DSM 2466 (Gern et. al. 2001), que corta uno tras otro los enlaces ß2-1 entre residuos de fructosa, liberando moléculas de fructosa. En este caso es importante detener la reacción antes de su término a fin de obtener de cada molécula inicial de inulina una de fractooligosacárido y una solución con una alta concentración de fructosa. En este caso se puede obtener como subproducto un jarabe fructosado. Como en los métodos anteriores, este método puede incluir pasos de separación y purificación de los fructooligoscáridos. Otro método de producción de íructooligosacáridos consiste en producir la inulina de alto peso molecular con el método mencionado con anterioridad, para posteriormente ponerla en contacto primero con una endo-inulinasa como la producida por Aspergillus níger DSM 2466 (Gern et. al. 2001) que como ya se comentó da lugar a la formación de fructooligosacáridos de diversos grados de polimerización, contolando el grado de hidrólisis por el tiempo de reacción, y posteriormente tratarlos con una exo-inulinasa en una digestión parcial, a fin de reducir el grado de polimerización de los fructooligosacáridos producidos en el paso anterior. Como en los métodos anteriores, este método puede incluir pasos de separación y purificación de los fructooligoscáridos. Como se ha discutido en los antecedentes, la inulina y los oligofructósidos son polisacáridos de fructosa con un gran número de aplicaciones que continúan en aumento. Sin embargo, las fuentes naturales de donde se obtienen no son ilimitadas por lo que podrían en poco tiempo convertirse en una limitante para su creciente uso industrial. La enzima divulgada eri la presente invención, junto con el método propuesto para su producción industrial, constituye una solución a este problema, pues permite la conversión de sacarosa, el azúcar común, cuyos usos industriales están siendo sustituidos por jarabes fructosados, en inulina de alto peso molecular y en oligofructósidos, ambos productos de mayor valor agregado. A fin de ilustrar mejor la enzima de la presente invención y su modo de uso para la producción de polímeros tipo inulina y de oligofructósidos, se proporcionan los siguiente ejemplos específicos para ayudar mejor al lector en los diversos aspectos de la práctica de la presente invención. Dado que estos ejemplos específicos son simplemente ilustrativos, en ningún caso deberá considerarse las siguientes descripciones como limitantes al alcance de la presente invención: Ejemplos Ejemplo 1. Producción de la inulosacarasa de la presente invención a partir de Leuconostoc citreum CW28. La cepa de Z. citreum CW28 se mantiene en glicerol 30% v/v en congelación. Para activar al microorganismo e iniciar la fermentación, 1 mi de glicerol que contiene células viables de Leuconostoc citreum se traspasa a un matraz Erlenmeyer de 250 mi con 50 mi de un medio de cultivo como el descrito en la tabla 1, se incuba a condiciones de Temperatura y agitación dentro del rango de crecimiento para la cepa, idealmente 30°C y 200 rpm, durante 12 horas. Utilizando este inoculo se realizan fermentaciones en matraces Fernbach que contengan 450 mi del mismo medio, incubándose a las mismas condiciones, durante el tiempo que permita alcanzar una buena productividad, el cual, según se observa en la figura 1 que muestra la curva de crecimiento, es de 6 hr., aunque para fines de cinética se continuó hasta 8 horas. Como se observa, la actividad esta asociada al crecimiento celular. El pH baja por acción del ácido láctico producido durante la fermentación. Al final de la fermentación se recuperan la células (por ejemplo se centrifuga el cultivo a 5000 rpm durante 15 minutos a 4°C en una centrífuga Beckman J2-HS). Las células se lavan varias veces con buffer, idealmente a pH 6.5, el óptimo para la actividad inulosacarasa. Para ello se utilizó en este caso un buffer de fosfato de potasio 50mM pH 6.5. Finalmente, la células se resuspenden en el mismo. Las células pueden emplearse directamente libres o atrapadas en algún sustrato inerte.

Tabla 1. Composición del medio de cultivo utilizado para el crecimiento de Leuconostoc citreum y la producción de la inulosacarasa.

Se determinó la actividad enzimática por medición de azúcares reductores totales, por la técnica de DNS (Summer, 1935), encontrándose 0.25 U/mg de células.

Ejemplo 2. Aislamiento del gen de la inulosacarsa a partir del DNA de Leuconostoc citreum CW28, y su clonación para expresión en E. coli DH5oc.

Como se ha mencionado con anterioridad dos secuencias peptídicas SEQ ID No 1 y SEQ ID No 2 fueron obtenidas a partir de la proteína purificada por electroforesis en gel de poliacrilamida, mediante su digestión con una endoproteasa. De acuerdo a éstas se diseñaron dos oligonucleótidos degenerados (28IS y 29IS) (SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4), con los que se obtuvo un producto de amplificación de 3 kb aproximadamente (figura 4A) usando como templado el DNA genómico de Leuconostoc citreum CW28 (el cual fue aislado siguiendo las técnicas estipuladas en el Current Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons. Supplement 9, 1990). Este fragmento fue secuenciado y analizado mostrando una alta identidad (80%) con la parte carboxilo terminal de la secuencia de la altemansacarasa (AS) de L. mesenteroides. La AS es una glucosiltransferasa que sintetiza un polímero de glucosa con enlaces 1-6 y 1-3 alternados llamado alternana. Para conocer el extremo 3' del gen de la enzima IS de L. citreum y aprovechando la alta homología con la ASR, se decidió diseñar un oligonucleótido a partir del gen de la altemansacarasa desde el extremo 3' del gen hacia el 5 'y otro basado en la región 3' de la secuencia del fragmento de 3Kb (figura 4A) pero de 5 'a 3' (868IS y 539IS) (SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6, respectivamente). Con ellos, fue posible amplificar un fragmento de 445 pb el cual fue secuenciado (figura 4B), correspondiente a la región carboxi-terminal de la IS de L. citreum. A partir de la secuencia conocida del gen se diseñaron dos oligonucleótidos (128rIS y 421rIS) (SEQID NO 7 y SEQ ID NO 8, respectivamente) para hacer una PCR inversa utilizando una digestión total del genoma de L. citreum con la enzima de restricción HindlU. Con esta técnica se amplificaron 1600pb del extremo amino terminal (figura 4C) con lo que se obtuvo la parte faltante del gene de la IS y la región promotora. A partir de esta secuencia se diseñó un nuevo oligonucleótido (l lpIS) (SEQ ID NO 9). Utilizando los oligonucleótidos 868IS y l lpIS (SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 9, respectivamente), se amplificó un producto de 5063 pb que comprende el gen completo de la enzima IS de la presente invención junto con su propio promotor. A fin de construir el vector para la expresión de la inulosacarasa, el producto de amplificación de 5063 pb fue ligado en el vector para clonar productos de PCR llamado PCR4-TOPO (Invitrogen, Calsbad, CA) y trasformado en E. coli DH5oc ( Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. (2001) Current protocols in molecular biology. John Wiley &Sons, Inc. USA.). La trasformación fue realizada por electroporación usando un aparato de BioRad a 2.5 kV, 25 µ? y 200O, siguiendo las instrucciones del fabricante. La correcta construcción del plásmido que contiene el gen completo de la inulosacarasa fue confirmada por análisis de secuencia, el plásmido con el gen de la inulosacarasa fue denominado pISRP. Para ello, el DNA plasmídico de E. coli fue aislado usando el método de lisis alcalina de Birnboim y Doly (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 o con el Kit para purificación de plásmidos Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 3. Producción de la inulosacarasa de la presente invención en E. coli DH5a, en una construcción bajo su propio promotor. Las células de E. coli DH5 con el plásmidos pISRP obtenidas en ejemplo anterior fueron crecidas en medio LB toda la noche. El cultivo fue centrifugado y las células se lavaron dos veces con buffer de fosfatos pH 6.5. Las células fueron rotas por sonicación. Los restos celulares y las células que no se rompieron fueron removidos por centrifugación a 10000 rpm durante 30 minutos a 4°C en una centrífuga eppendorf 5810 R y el extracto celular resultante fue utilizado para el ensayo de acividad. La actividad fructosiltransferasa fue determinada en ensayos a 30°C en un buffer fosfatos 50mM pH 6.5 con sacarosa 100g l y el extracto enzimático obtenido de las células de E. coli. Se monitoreó por la producción de azúcares reductores según el método de Summer y col. (1935) J Biol Chem 108? 51-54. La actividad detectada en el extracto de E. coli DH5a fue de 0.016U/mg de proteína total detectándose claramente además, la formación de polímero.

Ejemplo 4. Síntesis de la inulina. A fin de ilustrar la síntesis de inulina con la enzima IS de la presente invención, se cargó un reactor conteniendo 100g/l de sacarosa con 50 U/1 de actividad enzimática, ya sea células completas de L. citreum libres o atrapadas en un soporte inerte, la enzima IS solubilizada a partir de células de L. citreum, o bien alguna de las enzimas IS de la presente invención obtenida por métodos recombinantes como los ilustrados en los ejemplos 2 y 3, ajustándole el pH a 6.5 e incubándose a 30°C hasta el consumo total de la sacarosa. Posteriormente, en su caso se separaron las células por filtración o centrifugación. El polímero fue recuperado por precipitación con cuatro volúmenes de etanol industrial y purificado por lavados y reprecipitaciones con etanol industrial y finalmente fue dializado contra agua destilada en membrana de celofán (cellulose membrane, dialysis tubing 12000). Un análisis de 13C-NMR fue realizado como lo describen los autores en Olivares-Illana y col. J Ind Micrbiol Biotechnol (2002) 28, 112-117. El peso molecular de la inulina así sintetizada fue determinado por cromatografía de permeación en gel utilizando las columnas ultrahydrogel linear y ultrahydrogel 500 (Waters) en línea con un sistema de HPLC. Un flujo de 0.9 ml/min, un detector de índice de refracción (Waters, 410), una fase móvil de 0.1 M NaN03 a 40°C fueron las condiciones utilizadas. La señal del detector fue procesada con el software Máxima GPC, Waters, determinándosele un peso molecular de mayor a 106.

Ejemplo 5. Síntesis del fructooligosacáridos. A fin de ilustrar la aplicación de la enzima IS de la presente invención en la síntesis de fructooligosacáridos, esta fue estudiada con células completas de Leuconostoc citreum, con la enzima aislada a partir de las células de L. citreum y del extracto de E. coli conteniendo la inulosacarasa. Se incubaron en un buffer de reacción conteniendo 100g/l de sacarosa, 50 U/1 de actividad enzimática, a pH 6.5 y 30°C empleando maltosa o lactosa como aceptor. La reacción se mantiene hasta el consumo total de la sacarosa. Posteriormente se separaron las células por filtración o centrifugación. Los productos de la reacción fueron analizados por cromatografía líquida de alta presión utilizando una columna de sílica aminada para análisis de carbohidratos NOVA-PACK Waters-Millipore, bajo las siguientes condiciones: fase móvil: acetonitrilo:agua 80:20, flujo: lml/min, detector de índice de refracción (IR 410) a 35°C, encontrándose la presencia de un fructooligosacárido con un grado de polimerización 3 (DP3) en la reacción con la enzima libre, tanto con la solubilizada a partir de células de L. citreum como con la obtenida en E. coli.

Ejemplo 6. Identificación del polímero producido por la enzima IS de L. citreum CW28 A fin de demostrar contundentemente que el polímero producido por catálisis con la enzima IS de la presente invención, este se identificó por Resonancia Magnética Nuclear ( 13 C-RMN). El espectro del polímero producido por esta cepa corresponde a un polímero de fructosa con enlaces ß 2-1 y ramificaciones en ß 2-6, que es la estructura usualmente encontrada en la inulina. Seis principales picos de resonancia en 103.6, 81.8, 77.5, 74.9, 62.7 y 61.4 ppm fueron encontrados, los cuales son similares a los reportados por Shimamura y col. en 1987 para la inulina.

Adicionalmente, el polímero fue digerido con una exo-inulinasa, hasta obtenerse solo fructosa libre, mientras que una levana permanece intacta ante la actividad de esta enzima, dando una prueba adicional de que el polímero producido por L. citreum C 28 es inulina.

REFERENCIAS 1 Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. (2001) Current protocols in molecular biology. John Wiley &Sons, Inc. USA. 2 Argüello-Morales, M., Remaud-Simeon, M., Pizzut, S., Sacrcabal, P., Willemot, R. and Monsan, P. (2000) Sequence analysis of the gene encoding alternansucrase, a sucrose glucosyltransferase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355. FEMS Microbiol. Lett. 182:(1) 81-85, 3 Escalante, A., Wacher, C, and Farrés, A. (2001) Lactic acid bacterial diversity in the traditional Mexican fermented dough pozol as determined by 16S rDNA sequence analysis. Int J Food Microbiol. 64: 21-31. 4 Gern, R. M. M., Furlan S.A., Ninow, J.L., and Joñas, R., (2001) Screening for microorganisms that produce only endo-inulinase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 632-635. 5 Miller, A., Robyt, J., (1986) Milligram to gram scale purifícation and characterization of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F. Carbohydrates Research. 147: 119-133. 6 Olivares-Illana, V., Wacher-Rodarte, C, LeBorgne, S., and López-Munguía, A. (2002) Characterization of a cell-associated inulosucrase from a novel source: A Leuconostoc citreum strain isolated from Pozol, a fermented corn beverage of Mayan origin. J Ind Microbiol Biotechnol 28: 112-117. 7 Summer, J.B., and Howell, S.F. (1935) A method for deteraiination of invertase activit . JBiol Chem 108: 51-54.

Se citan las siguientes patentes norteamericanas: 4,954,622. Cooper; Peter D. Pharmaceutical composition and method containing gamma inulin or derivative thereof. September 4, 1990. 5,444,054.- Garleb; Keith A.; Demichele; Stephen J. Method of treating ulcerative colitis. August 22, 1995. 5,476,844.- Cooper; Peter D. Gamma inulin compositions. December 19, 1995. 5,501,869.- Buliga; Gregory S.; Miller; Mark S.,; Powell; William F.; Lis; Daniel G.; Krishnamurthy; R. G.; Witte; Vernon C; Tomski; Sharon. Fat-free tablespread and method of making. March 26, 1996. 5,527,556.- Frippiat; Anne; Smits; George S. Compositions having a creamy structure and containing fructan, process for preparing these compositions and their use. June 18, 1996. 5,629,041.- Laaman; Thomas R.; Sewall; Christopher J. Low calorie sandwich cookies. May 13, 1997. 5,641,533.- Ambjerg Pedersen; Hans Christian. No and low fat mayonnaise compositions. June 24, 1997. 5,721,004.- James; Sherianne M. Method for producing fat-free and low-fat viscous dressings using inulin. February 24, 1998. 5,777,090.- Verraest; Dorine Lisa; Batelaan; Jan Gerardus; Peters; Johannes Andreas; van Bekkum; Hermán. Carboxymethyl inulin. July 7, 1998. 5,780,451.- DeMichele; Stephen Joseph; Garleb; Keith Alien; McEwen; John William; Fuller; Martha Kay. Nutritional product for a person having ulcerative colitis. July 14, 1998. 5,792,754.- Green; Ceirwen Jane; Bork; Roelof Andre; Hageman; Robert Johan Joseph; Boerma; Jan Albertus; Van Hoey-De Boer; Klaske Anne. Nutritional composition containing fibres. August 11, 1998. 5,795,614.- Krishnamurthy; Ramanathapur G.; Witte; Vernon C. Method of making a reduced fat emulsified dressing. August 18, 1998. 5,840,361.- Theuer; Richard C; Cool; Mary Beth. Fructan-containing baby food compositions and methods therefor. November 24, 1998. 5,846,592.- Alderliesten; Leendert; van Amelsvoort; Johannes Mateus María; Castenmiller; Wilhelmus Adrianus M.; de Fouw; Nanneke Joke; Schotel; Ronald Albert; Verschuren; Jozephus Johannes. Low fat spread. December 8, 1998. 5,851,576.- Abboud; Amna. Method for making a spray dried fat replacement composition containing inulin. December 22, 1998. 5,877,144.- Ehrhardt; Sonja; Haji Begli; Alireza; Kunz; Markwart; Scheiwe; Linda. Aliphatic carboxylate esters of inulin. March 2, 1999. 5,939,127.- Abboud; Amna Munji. Fat free and low fat cookie cream ñllings. August 17, 1999. 5,952,033.- Anantharaman; Helen Gillian; Ballevre; Olivier; Rochat; Florence. Gelatinized cereal product containing oligosaccharide and processes of preparing and using same. September 14, 1999. 5,968,569.- Cavadini; Christof; Ballevre; Olivier; Gaier; Walter. Pet food product containing probiotics. October 19, 1999. 5,925,190.- Richards; Geofftey N. Production of fructose dianhydride products from inulin. July 20, 1999. 6,086,886.- Guo; Peilin. Composition for promoting intestinal health. July 11, 2000. 6,120,809.- Rhodes; Ken. System and method for making enhanced cheese. September 19, 2000. 6,132,793.- Benesh; Yoel. Method of manufacturing a butterlike composition. October 17, 2000. 6,149,965.- van Lengerich; Bernhard; Larson; Merle K. Cereal products with inulin and methods of preparation. November 21, 2000. 6,197,361.- Anantharaman; Helen Gillian; Ballevre; Olivier; Rochat; Florence. Gelatinized cereal product containing oligosaccharide. March 6, 2001. 6,203,797.- Perry; Stephen C. Dietary supplement and method for use as a probiotic, for alleviating the symptons associated with irritable bowel syndrome. March 20, 2001.

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un fragmento de DNA que codifica para una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inuliña de alto peso molecular, caracterizado por que comprende la secuencia SEQ ID NO: 27 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

2. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 28

3. Un fragmento de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia SEQ ID NO: 25 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

4. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 26

5. Un fragmento de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia SEQ ID NO: 23 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

6. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 24

7. Un fragmento de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia SEQ ID NO: 16 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

8. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando- un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 17.

9. Un fragmento de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia SEQ ID NO: 13 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

10. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 14.

11. Un fragmento de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia SEQ ID NO: 10 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

12. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 11.

13. Un fragmento de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia SEQ ID NO: 36 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

14. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 37.

15. Un fragmento de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia SEQ ID NO: 34 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

16. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 35.

17. Un fragmento de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia SEQ ID NO: 32 o cualquier mutación silenciosa o sitio específica de la misma, que sea funcionalmente equivalente.

18. Una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizada por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 33.

19. Un gene que codifica para una proteína con actividad fructosiltransferasa que en presencia de sacarosa o rafinosa cataliza la transferencia de un residuo de fructosa a una cadena creciente de residuos de fructosa con enlaces ß2-1 en la cadena lineal principal y ß2-6 en los puntos de ramificación, generando un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizado por que comprende un promotor, opcionalmente una anteproteína y cualquiera de los fragmentos de las reivindicaciones 1, 3 o 5 y un codón de témino.

20. Un gene de conformidad con la reivindicación 19 caracterizado porque el promotor es heterólogo.

21. Un gene de conformidad con la reivindicación 19 caracterizado porque el promotor es homólogo con una secuencia SEQ ID NO: 29.

22. Un gene de conformidad con la reivindicación 19 caracterizado porque la anteproteína es un péptido señal con secuencia SEQ ID NO: 30.

23. Un vehículo molecular de expresión caracterizado por que comprende el gene de la reivindicación 19.

24. Una célula huésped no humana, caracterizada por que comprende un vehículo de expresión molecular adecuado para la expresión de proteínas heterólogas en ese huésped en particular, de conformidad con la reivindicación 23.

25. Un método para la producción de las proteínas de las reivindicaciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18, caracterizado por que comprende los pasos de a) cultivar las células de la reivindicación 24 en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas para su crecimiento, b) opcionalmente la recuperación del paquete celular, c) la ruptura de las células y d) opcionalmente la recuperación y purificación de la enzima IS presente en forma de cuerpos de inclusión de los cuerpos de inclusión.

26. Un método para la producción de un polímero de inulina de alto peso molecular, caracterizado por que comprende los pasos de a) poner en contacto al menos una de las proteínas de las reivindicaciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 con sacarosa o rafinosa disueltas en un medio amortiguado a un pH cercano a 6.5 . manteniendo la mezcla a una temperatura de entre 20 y 45°C y b) opcionalmente recuperar y purificar el polímero.

27. Un método para la producción de fructooligosacáridos, caracterizado por que comprende los pasos de a) poner en contacto al menos una de las proteínas de las reivindicaciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 con sacarosa o rafinosa en un medio amortiguado a un pH cercano a 6.5 y en presencia de lactosa o maltosa, manteniendo la mezcla a una temperatura de entre 20 y 45 °C y b) opcionalmente recuperar y purificar los fructooligosacáridos.

28. Un método para la producción de fructooligosacáridos o de inulina, caracterizado por que comprende los pasos de a) poner en contacto al menos una de las proteínas de las reivindicaciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 con sacarosa o rafinosa disueltas en un medio amortiguado a un pH cercano a 6.5 , manteniendo la mezcla a una temperatura de entre 20 y 45°C y b) opcionalmente recuperar y purificar el polímero de alto peso molecular, c) poner en contacto el polímero de alto peso molecular con una proteína con actividad de endo-inulinasa en un medio amortiguado, obteniéndose fructooligosacáridos o inulina del peso molecular deseado y d) opcionalmente separar y purificar los fructooligosacáridos o inulina.

29. Un método para la producción de fructooligosacáridos o de inulina r, caracterizado por que comprende los pasos de a) poner en contacto al menos una de las proteínas de las reivindicaciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 con sacarosa o rafinosa disueltas en un medio amortiguado a un pH cercano a 6.5 , manteniendo la mezcla a una temperatura de entre 20 y 45°C y b) opcionalmente recuperar y purificar el polímero de alto peso molecular, c) poner en contacto el polímero de alto peso molecular con una proteína con actividad de exo-inulinasa en un medio amortiguado, obteniéndose fructooligosacáridos o inulina del peso molecular deseado y d) opcionalmente separar y purificar fructooligosacáridos o inulina .

30. Un método para la producción de fructooligosacáridos o de inulina r, caracterizado por que comprende los pasos de a) poner en contacto al menos una de las proteínas de las reivindicaciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 con sacarosa o rafinosa disueltas en un medio amortiguado a un pH cercano a 6.5 , manteniendo la mezcla a una temperatura de entre 20 y 45 °C y b) opcionalmente recuperar y purificar el polímero de alto peso molecular, c) poner en contacto el polímero de alto peso molecular con una proteína con actividad de endo-inulinasa en un medio amortiguado, obteniéndose polímeros de un peso molecular intermedio, e) opcionalmente separar y purificar el polímero de menor peso molecular, f) poner en contacto el polímero de peso molecular intermedio con una exo-inulinasa en un medio amortiguado, obteniéndose fructooligosacáridos o inulina del peso molecular deseado y g) opcionalmente separar y purificar los fructooligosacáridos o inulina.