JPH05308985A - ポリフラクタンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アスペルギルス・シドウィの分生胞子をスク
ロースに作用させてポリフラクタンを製造するに際し、
分子量の高いポリフラクタンを高速度で高収率で製造す
る方法を開発する。 【構成】 酵素反応条件として反応媒体へのＬ−システ
イン添加及び／又は高濃度緩衝液を採用し、更に超音波
処理の任意的併用を採用することを特徴としている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はスクロースを原料とする
ポリフラクタンの製造方法に関し、更に詳しくは、フラ
クトース転移酵素活性を有するアスペルギルス・シドウ
ィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓｙｄｏｗｉ）の分生胞
子をスクロースに作用させてポリフラクタンを製造する
に際し、酵素反応条件として反応媒体へのＬ−システイ
ン（ＣｙｓＨ）添加及び／又は高濃度緩衝液の使用を採
用し、更に超音波処理の任意的併用を採用して分子量の
向上したポリフラクタンを高速度で高収率で製造する方
法に関する。本発明の方法によって製造されるポリフラ
クタンは、例えば、従来のものに較べてより難消化性で
あるのでより高機能の食物繊維として利用される。

【０００２】

【従来技術】１９２０年にＮ．Ｋｏｐｅｌｏｆｆ ｅｔ
ａｌ．により、アスペルギルス・シドウィの分生胞子
がインベルターゼ活性を有し、スクロースからレバンタ
イプのフラクタンを生成することが報告されたが（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１７１，（１９２
０））、後に、Ｊ．Ｒ．Ｌｏｅｗｅｎｂｅｒｇ ｅｔ
ａｌ．により、この多糖はフラクトースのβ−２→１結
合からなるイヌリンタイプの構造を有することが明らか
にされた（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３，６
４３，（１９５７））。

【０００３】その後、１９７３年にＧ．Ｋａｗａｉ ｅ
ｔ ａｌ．らは、アスペルギルス・シドウィＩＡＭ２５
４４株（ＩＡＭ２５４４は東京大学応用微生物研究所の
保存菌Ｎｏ）の分生胞子をスクロースと共にインキュベ
ートするとポリフラクタン及びオリゴフラクタンがイン
キュベーションミクスチャー中に生成されたこと；この
ポリフラクタンには末端グルコースは存在しないと推定
され、フラクトースのみから構成され、高等植物にみら
れるイヌリンのようにβ−２→１結合からなる直鎖状ポ
リフラクタンであること；このポリフラクタンの分子量
は、超遠心分離及び固有粘度より推定を行った結果、高
等植物イヌリンよりもはるかに大きな、微生物レバンの
分子量に匹敵する２０００万程度であること；などを報
告している（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３
７，（９），２１１１，（１９７３））。

【０００４】しかしながら、ポリフラクタンの工業的ス
ケールにおける生産を目的とした場合、分生胞子による
生産方法は分生胞子の大量調製に大きな困難が予想され
るとして、中久喜氏らは、スクロースをアスペルギルス
・シドウィの菌体で処理し、オリゴフラクタンと高分子
フラクタンを得る方法を提案している（特開昭６１−１
８７７９７）。因みに、この高分子フラクタンは、末端
グルコースを有するフラクトースがβ−２→１結合した
直鎖状ポリフラクタンで、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓ−８０８カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分子量
を測定した結果は、分子量は１．８×１０^５〜１．４×
１０^７の範囲にあるという。

【０００５】

【発明が解決しょうとする課題】しかして、前記中久喜
氏らの方法には、次のような問題点がある。すなわち、
酵素源である菌体に分生胞子が含まれていないためにポ
リフラクタンの生成活性が低く、対スクロース収率は５
％程度であり、製造コスト面等で問題を有している。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記のような問題点を解
消すべく本発明者は鋭意研究の結果、アスペルギルス・
シドウィの分生胞子をスクロースに作用させてポリフラ
クタンを製造するに際して、酵素反応条件として反応媒
体へのＬ−システイン添加及び／又は高濃度緩衝液使用
を採用し、更に超音波処理の任意的併用を採用してより
分子量の高いポリフラクタンを高速度で高収率で製造す
る方法を開発した。本発明によれば、分生胞子の大量調
製法は別途開発するにしても、少量の分生胞子でもポリ
フラクタンの大量製造が可能となった。

【０００７】以下、本発明の方法を詳述する。まず、ポ
リフラクタンを製造するに際し、当業者であれば検討す
るであろう製造条件を説明する。

【０００８】本発明の実施に当たり使用する分生胞子の
製造には特別の制限はなく、アスペルギルス・シドウィ
の、例えば、寒天培養、液体培養又は小麦フスマ培養に
よることができる。寒天培養の場合は、例えば、ポテト
エキス２００ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、寒天１７
ｇ／Ｌの組成の寒天培地（ｐＨ５．５）にアスペルギル
ス・シドウィを植菌し、３０℃で１週間培養した後、生
じた分生胞子は、培養面に水を注いで寒天表面より胞子
を含む液をとり、ガーゼ等で濾過し、濾過液から遠心分
離により集める。液体培養の場合は、例えば、培地成分
として寒天を加えないことを除いては寒天培地に準じる
が、液体振盪培養では分生胞子が生じないので液体静置
培養を行う必要がある。生じた分生胞子は、ペレット状
を呈するのでワーリングブレンダー等の粉砕機で粉砕
後、ガーゼ等で濾過し、濾液から遠心分離により集め
る。小麦フスマ培養の場合は、例えば、小麦フスマに水
６０％、グルコース０．５％、酵母エキス（ＹＥ）０．
０５％を添加混合して調製した培地にアスペルギルス・
シドウィを植菌し、３０℃で１週間培養した後、生じた
分生胞子を、水を加えて攪拌後、ガーゼ等で濾過し、濾
液から遠心分離により集める。集めた分生胞子は直ちに
使用しないときは、例えば、減圧乾燥、凍結乾燥により
乾燥して保存するとよい。

【０００９】なお、本発明の分生胞子を採取するのに使
用されるアスペルギルス・シドウィとしては、例えば、
東京大学応用微生物研究所の保存株であるＩＡＭ２５４
４株、ＩＡＭ２５１４株、ＩＡＭ２０７８株、ＩＡＭ２
０９９株を挙げることができる。

【００１０】本発明ではアスペルギルス・シドウィの分
生胞子をそのままポリフラクタン生成酵素源として用い
るが、このような形態のポリフラクタン生成酵素をスク
ロースに作用させてポリフラクタン（Ｆｎ）を製造する
酵素反応は、前掲先端技術から理解されるように、水、
緩衝液等の水性酵素反応媒体中で行われる。酵素反応系
に雑菌が混入してスクロースがそれに喰われる恐れがあ
る時はトルエン、アルコール等を添加するが、このよう
な添加を行った酵素反応媒体ももちろん本発明の水性酵
素反応媒体に包含される。

【００１１】酵素反応の至適ｐＨ及び至適温度に関して
は、例えば、１０ｍＭのＫＨＰ系（リン酸水素カリウム
系）緩衝液に１０ｇ／ｄｌの濃度となるようにスクロー
スを溶解した溶液１０ｍｌをとり、これに分生胞子１０
ｍｇ（乾物換算）を加えて酵素反応を行い、その際ｐＨ
を変化させたり、温度を変化させたりしたところ、ポリ
フラクタンはｐＨ約４〜８の範囲及び温度約２０〜６０
℃の範囲でポリフラクタンの対スクロース収率は約２０
重量％に達した。因みに、ｐＨ範囲及び温度範囲は、こ
れらの範囲内で本発明を実施すべき事を意味するもので
はない。

【００１２】基質であるスクロースの濃度も、ポリフラ
クタンの酵素反応ブロスの単位体積当り生成量及び対ス
クロース収率に影響を及ぼす。例えば、１０ｍＭのＫＨ
Ｐ緩衝液に種々の濃度となるようにスクロースを溶解し
た溶液１０ｍＬ（ｐＨ５．５）に分生胞子５０ｍｇを加
えて４０℃に１７５時間維持した後、反応液を事前処理
として０．４５μｍのミクロフィルターで濾過後、濾液
を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析し
たところ、表１に示す結果を得た。因みに、この高速液
体クロマトグラフィーは、旭化成工業社製のモデルＧＳ
−７１０カラムを用いて行い、溶媒は、水であった。

【００１３】

【表１】

【００１４】表１から、基質濃度を高めれば、ポリフラ
クタンの収量は向上するものの、収率は低下することが
わかる。因みに、この酵素反応条件では、分生胞子の使
用量が多く、かつ、反応時間も１７５時間という長時間
なので、Ｆｎ収率が約１７％と高くても、工業的ではな
い。

【００１５】酵素源（分生胞子）添加量も、ポリフラク
タンの収率に影響を及ぼす。例えば、１０ｍＭのＫＨＰ
緩衝液に５ｇ／ｄｌの濃度となるようにスクロースを溶
解した溶液５ｍｌ（ｐＨ５・５）に種々の量の分生胞子
を加えて３０℃に１００時間維持した後、同様の分析を
したところ、表２に示す結果を得た。

【００１６】

【表２】

【００１７】表２から、分生胞子の添加量が増加するに
従いＦｎ収率が増大するが、ある値（この例では、８０
ｍｇ）以上になるとＦｎ収率がほとんど変化なく、した
がって、その値以上の量で分生胞子を使用することは無
益であることがわかる。

【００１８】さて、以上の説明は、本発明の特徴を説明
するのに先立ち、アスぺルギルス・シドウィの分生胞子
を酵素源として使用して、これを基質スクロースに作用
させてポリフラクタンを酵素反応により製造する方法に
おいて通常考えられる酵素反応条件の検討を通して、そ
のような製造方法の概念の理解に供するために行ったも
のである。

【００１９】しかして、本発明に係わる方法の特徴は、
上述のような酵素反応条件に加えて、酵素反応媒体への
Ｌ−システイン添加及び／又は高濃度緩衝液使用を採用
し、更に超音波処理の任意的併用を採用することにあ
る。以下、実施例により本発明の特徴によりもたらされ
る効果を詳述する。

【００２０】

【実施例１】まず、酵素反応媒体である緩衝液または水
にＬ−システインを添加した場合の効果について説明す
る。

【００２１】（１ａ）１０ｍＭのＫＨＰ緩衝液（ｐＨ
５．５）に１０ｇ／ｄｌの濃度となるようにスクロース
を溶解し、更に種々の量のＬ−システインを添加してそ
の濃度を種々にした溶液１０ｍｌに２５ｍｇの分生胞子
を加え３０℃に４４時間維持した後、反応液を前述の高
速液体クロマトグラフィで分析したところ、表３に示す
結果を得た。

【００２２】

【表３】

【００２３】表３から、Ｌ−システインの添加量従って
濃度を増加していくと、ある濃度（ここでは約１０ｍ
Ｍ）までは、クロマトグラムにおけるＦｎ保持時間（Ｒ
ｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ＲＴ）が減少していくこ
と、従って、ポリフラクタンの分子量が増大していくこ
と、また、Ｆｎ収率が増大することがわかる。

【００２４】（１ａａ）酵素反応媒体を緩衝液に代えて
水とした以外は全く同様の条件で（１ａ）の実験を繰り
返したところ、表３ａに示す結果を得た。

【００２５】

【表３ａ】

【００２６】表３ａから、酵素反応溶媒が水の場合も、
Ｌ−システインの添加量従って濃度を増加していくとあ
る濃度（ここでも約１０ｍＭ）までは、クロマトグラム
におけるＦｎ保持時間が減少していくこと、従って、ポ
リフラクタンの分子量が増大していくこと、また、Ｆｎ
収率が増大することがわかる。

【００２７】（１ｂ）Ｌ−システインは、またポリフラ
クタンの生成速度を増大し、従って、所与の酵素反応条
件での最大生成量に達する時間を著しく短縮すること
は、次のようにしてわかった。すなわち、（１ａ）と同
様の条件で酵素反応を行い、その時間経過をみたとこ
ろ、表４に示す結果を得た。

【００２８】

【表４】

【００２９】表４から、Ｌ−システインはポリフラクタ
ンの生成速度を増大し、所与の酵素反応条件での最大生
成量に達する時間を短縮することが理解されよう。

【００３０】（１ｂａ）（１ａａ）と同様の条件で酵素
反応を行い、時間経過をみたところ表４ａに示す結果を
得た。

【００３１】

【表４ａ】

【００３２】表４ａから、Ｌ−システインは、酵素反応
溶媒が水の場合も緩衝液の場合と同様に、ポリフラクタ
ンの生成速度を増大し、所与の酵素反応条件での最大生
成量に達する時間を短縮することがわかる。

【００３３】（１ｃ）Ｌ−システインの添加量（濃度）
は添加による効果、コスト等を考慮して２〜４０ｍＭ、
好ましくは１０〜２０ｍＭ程度とするのが有利である。

【００３４】

【実施例２】次に、酵素反応媒体である緩衝液の濃度を
高めた場合の効果について説明する。

【００３５】（２ａ）種々の濃度のＫＨＰ緩衝液（ｐＨ
５．５）に１０ｇ／ｄｌの濃度となるようにスクロース
を溶解した溶液１０ｍｌに１０ｍｇの分生胞子を加え３
０℃に６日間維持した後、反応液を分析して表５に示す
結果を得た。

【００３６】

【表５】

【００３７】表５から、緩衝液の濃度が高まるに従い、
Ｆｎ保持時間が減少していくこと、従って、ポリフラク
タンの分子量が増大していくことがわかる。しかも、ク
ロマトグラム上Ｆｎ保持時間が２つ又は３つ現れたとい
うことは、２種又は３種のポリフラクタンが生成したこ
とがわかる。又、緩衝液の濃度が高まるに従い、Ｆｎ収
率の向上していくことがわかる。

【００３８】緩衝液の濃度を高めた場合の効果は、上記
のＫＨＰ緩衝液に固有のものでなく、他の緩衝液につい
ても同様であることは、表５ａに示す上と同様な条件の
酵素反応の結果から理解されよう。

【００３９】

【表５ａ】

【００４０】（２ｂ）酵素反応の媒体である緩衝液の高
濃度化はまたポリフラクタンの生成速度を増大し、従っ
て、所与の酵素反応条件での最大生成量に達する時間を
著しく短縮することは、次のようにしてわかった。すな
わち、各種濃度のＫＨＰ緩衝液（ｐＨ５．５）に１０ｇ
／ｄｌの濃度となるようにスクロースを溶解した溶液１
０ｍｌに分生胞子１０ｍｇと防腐剤であるＮａＮ_３１ｍ
ｇを加え、３０℃に維持して酵素反応を行い、その時間
経過をみたところ表６に示す結果を得た。

【００４１】

【表６】

【００４２】表６から、上記効果の奏されることがわか
る。

【００４３】（２ｃ）スクロースにアスペルギルス・シ
ドウィの分生胞子を作用させてポリフラクタンを製造す
る際の酵素反応媒体は水又は緩衝液であることは前述し
たが、緩衝液を使用する場合ではその濃度は従来は高く
てもせいぜい１０ｍＭ程度であった。本発明者は、これ
より著しく高濃度即ち１００ｍＭ程度以上でポリフラク
タンの分子量が更に高まり、ポリフラクタンの生成速度
と生成収率が著しく増加することを発見したのである。
緩衝液の濃度を高めればよいといっても、酵素反応終了
ブロスからの塩の除去、コストなどを考慮すると、５０
０ｍＭ〜１Ｍ程度の濃度とするのが有利である。

【００４４】

【実施例３】第３に、緩衝液酵素反応媒体中で、スクロ
ースにフラクトース転移酵素活性を有する、アスペルギ
ルス・シドウィの分生胞子を作用させてポリフラクタン
を製造する際に、該反応媒体にＬ−システインを添加し
かつ高濃度の該反応媒体を使用すると、本発明の効果、
即ち、より分子量の向上したポリフラクタンを高速度で
しかも高収率で製造できるという本発明の効果がより容
易に達成できるが、これについて説明する。

【００４５】Ｌ−システイン濃度と緩衝液（ＫＨＰ系）
濃度との種々の組合せの酵素反応媒体にスクロースが１
０ｇ／ｄｌとなるように溶解した溶液１０ｍｌに分生胞
子１０ｍｇを加え、温度３０℃に４日間維持して酵素反
応を行った。このようにして得た酵素反応ブロスを分析
した結果を表７に示す。

【００４６】

【表７】

【００４７】表７から、ＣｙｓＨと緩衝液とがある範囲
内でともに高濃度であるとき、相乗効果の奏することが
理解されよう。

【００４８】

【実施４】最後に、超音波処理の効果について説明す
る。超音波処理による効果は、以下の酵素反応実験から
わかるように、ポリフラクタンの高分子化にはほとんど
役にたたないが、ポリフラクタン生成の初速度を増大さ
せるものであることがわかる（表８の酵素反応４６時間
後の結果を参照）。

【００４９】（４ａ）Ｌ−システインを２０ｍＭの濃度
で含有する、濃度が１０ｍＭの緩衝液（ＫＨＰ系、ｐＨ
５・５）にスクロースを１０ｇ／ｄｌの濃度になるよう
に溶解した溶液１０ｍｌに分生胞子２５ｍｇを加え、３
０℃で２分間超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｃ
ｐｏｗｅｒ社製、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ３５
０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ 使用）をおこない、引続き同温
度に維持して酵素反応を続行した。結果を表８に示す。

【００５０】

【表８】

【００５１】（４ａａ）酵素反応媒体を緩衝液に代えて
水とした以外は全く同様の条件で（４ａ）の実験を繰り
返したところ、表８ａに示す結果を得た。

【００５２】

【表８ａ】

【００５３】（４ｂ）種々の濃度のＫＨＰ系緩衝液（ｐ
Ｈ５．５）にスクロースを１０ｇ／ｄｌの濃度となるよ
うに溶解した溶液１０ｍｌに１０ｍｇの分生胞子を加
え、３０℃で種々の時間前記した超音波発生機を使用し
て超音波処理した後、引続き同温度に維持して酵素反応
を続行した。結果を表９に示す。

【００５４】

【表９】

【００５５】（４ｃ）Ｌ−システインを２０ｍＭ濃度で
含有する１ＭＫＨＰ緩衝液にスクロースが１０ｇ／ｄｌ
となるように溶解した溶液１０ｍｌに分生胞子２５ｍｇ
を加え、３０℃で種々の時間前記の超音波発生機を利用
して超音波処理した後、引続き同温度に維持して酵素反
応を続行した。結果を表９ａに示す。

【００５６】

【表９ａ】

【００５７】以上、本発明の特性を実施例で説明した
が、酵素反応ブロスから目的のポリフラクタンを分離す
るには、特に困難はなく、限外濾過膜などの各種の膜処
理、アルコール添加により分別沈澱（オリゴフラクタン
が副製していて、これを除去するときなど）等公知の適
宜な分離精製手段により行える。

【００５８】なお、本発明においてポリフラクタンの分
子量は前記の高速液体クロマトグラフィーにより測定し
た。この分折条件によるとＦｎの保持時間と分子量との
関係は、前出のＫａｗａｉらのポリフラクタンについて
は、１８．８および２００万程度であり、一方、本発明
のものは、１２・０および１０００万程度と推定され
る。

【００５９】

【発明の効果】フラクトース転移酵素活性を有するアス
ペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙ
ｄｏｗｉ）の分生胞子をスクロースに作用させてポリフ
ラクタンを製造するに際し、酵素反応条件として反応媒
体へのＬ−システイン（ＣｙｓＨ）添加及び／又は高濃
度緩衝液の使用を採用し、更に超音波処理の任意的併用
を採用して分子量の向上したポリフラクタンを高速度で
高収率で製造する工業的方法を完成した。

【００６０】また、本発明の方法によって製造されるポ
リフラクタンは、例えば、従来のものに較べてより難消
化性であるので高機能の食物繊維として利用される。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水性酵素反応媒体中で、スクロースにフ
   ラクトース転移酵素活性を有する、アスペルギルス・シ
   ドウィの分生胞子を作用させてポリフラクタンを製造す
   る際に、該酵素反応媒体にＬ−システインを添加するこ
   とを特徴とするポリフラクタンの製造方法。
2. 【請求項２】 該水性酵素反応媒体が緩衝液又は水であ
   ることを特徴とする請求項１のポリフラクタンの製造方
   法。
3. 【請求項３】 水性酵素反応媒体中で、スクロースにフ
   ラクトース転移活性を有する、アスペルギルス・シドウ
   ィの分生胞子を作用させてポリフラクタンを製造する際
   に、該酵素反応媒体として濃度１００ｍＭ以上の高濃度
   緩衝液を使用することを特徴とするポリフラクタンの製
   造方法。
4. 【請求項４】 該高濃度緩衝液酵素反応媒体にＬ−シス
   テインを添加することを特徴とする請求項３のポリフラ
   クタンの製造方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかの方法におい
   て、更に超音波処理を行うことを特徴とするポリフラク
   タンの製造方法。