MX2012006944A - Biopolimero bacteriano que contiene fucosa. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un biopolímero microbiano que comprende fucosa en su composición. Este biopolimero consiste de un polisacárido que comprende fucosa, la cual representa al menos 10% de su composición. Este polisacárido que contiene fucosa también contiene componentes no glucosídicos, es decir, sustituyentes de grupo acilo. Esta invención también se refiere al proceso para la producción del biopolímero, el cual se obtiene por crecimiento de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139), usando glicerol o mezclas ricas en glicerol como fuentes de carbono. El biopolimero que contiene fucosa de la presente invención puede ser usado en varias aplicaciones industriales (por ejemplo, industrias farmacéuticas, cosméticas y agroalimentarias) y en el tratamiento de desechos industriales (por ejemplo, recuperación de aceite y metal).

Description

BIOPOLIMERO BACTERIANO QUE CONTIENE FUCOSA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un biopolimero microbiano que contiene fucosa en su composición. Adicionalmente, la presente invención se refiere al proceso para la producción del biopolimero que contiene fucosa por la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) . De este modo, esta invención es aplicable en varias industrias (por ejemplo, industrias farmacéuticas, cosméticas y agroalimentarias) y en el tratamiento de desechos industriales (por ejemplo, recuperación de aceite y metal) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los polisacáridos son biomateriales poliméricos de alto peso molecular (104-107) , formados a través de la polimerización de unidades de repetición de monosacárido . Poseen una gran diversidad estructural como un resultado de la diversidad de las unidades de repetición, tipo de enlaces glicosidicos involucrados y el grado de ramificación. Muchos polisacáridos poseen componentes no glucosidicos , tales como grupos acilos orgánicos (por ejemplo, acetato, succinato, piruvato) y grupos inorgánicos (por ejemplo, fosfato, sulfato) (Sutherland, 2001) .

Por otro lado, los polisacáridos a menudo forman estructuras terciarias a través de los enlaces no covalentes intra o intermoleculares, los cuales confieren mayor rigidez a la macromolécula y juegan un papel importante de la determinación de las propiedades del polímero tanto en el estado sólido como en solución (Kumar et al., 2007) .

Debido a sus propiedades físicas y químicas, es decir, su capacidad de retención en agua, reología y/o capacidad de formar película, los polisacáridos se usan en una amplia variedad de aplicaciones alimenticias e industriales, incluyendo textiles, pinturas, farmacéuticas y cosméticas, como agentes emulsificantes , estabilizantes o espesantes (Moreno et al., 1998). Siendo materiales obtenidos de organismos vivos, los polisacáridos son usualmente no tóxicos y biodegradables , lo que los hace biomateriales adecuados para el desarrollo sustentable.

Las principales aplicaciones de polisacáridos comerciales, tanto naturales (por ejemplo, alginato, carragenano, goma Guar, pectinas, xantano, gelano) como derivados semi-sintéticos (por ejemplo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilguar) se basan en su capacidad para modificar las propiedades físicas de sistemas acuosos (hidrocoloides - compuestos capaces de modificar las propiedades físicas de sistemas acuosos), siendo usados principalmente en la industria alimenticia, seguida por las industrias de producción de aceite y farmacéuticas. Algunos de estos polisacáridos (por ejemplo, alginato, pectinas, pululano, derivados de almidón, derivados de celulosa) adicionalmente poseen la capacidad para formar películas biodegradables , siendo usadas en la manufacturación de envases, recipientes y láminas, asi como también en varias aplicaciones agroalimenticias , farmacéuticas e industriales.

Actualmente, la mayoría de los polisacáridos usados en la industria se obtienen de plantas (por ejemplo, goma Guar, goma Arábiga), algas (por ejemplo, alginato, carragenano) o crustáceos (por ejemplo, quitina), con polisacáridos microbianos (por ejemplo, xantano, gelano, alginato bacteriano) representando solamente una pequeña fracción del mercado de biopolímeros (Canilha et al., 2005). No obstante, en los últimos años, ha habido un interés creciente en identificar y aislar nuevos polisacáridos microbianos que puedan competir con los tradicionales, debido a sus propiedades físico-químicas mejoradas, es decir, mayores actividades emulsificantes y floculantes, mayor resistencia a solventes orgánicos, actividad biológica (por ejemplo, efectos anticancerígenos o inmunomej oradores ) y mejores propiedades reológicas (por ejemplo, mayor viscosidad de concentraciones inferiores de polímero, mayor estabilidad sobre pH, temperaturas e intervalos de fuerza iónica más amplios) (Kumar et al., 2007; Sutherland, 2001).

La producción microbiana de polisacáridos tiene ventajas sobre su extracción a partir de plantas, algas o animales, puesto que los microorganismos usualmente presentan mayores tasas de crecimiento y son más susceptibles a manipulación de las condiciones de crecimiento (Moreno et al., 1998). Plantas, algas y animales tienen ciclos de vida de uno o más años, siendo la producción de ciclo usualmente estacional. Por otro lado, las tasas de crecimiento de microorganismos son del orden de horas o algunos días, mientras plantas, algas y animales tienen tasas de crecimiento del orden de meses o años.

El factor principal que limita la producción comercial de polisacáridos microbianos es el alto costo del sustrato, principalmente azúcares, especialmente glucosa, almidón y sacarosa. En estos bioprocesos, los costos del sustrato suman 20-40% de los costos de producción total (Kumar and Mody, 2009) .

Por lo tanto, la búsqueda de sustratos menos costosos con productividad comparable es esencial para la reducción de los costos de producción. El glicerol, un subproducto de varios procesos industriales, principalmente la industria de biodiesel, es un buen candidato. Debido al enorme crecimiento de la industria del biodiesel en los últimos años, está siendo producido en cantidades mucho más allá de su consumo actual en las aplicaciones tradicionales de glicerol. Para la industria de biodiesel o para cualquier otra industria que tiene glicerol como un subproducto, representa una carga debido a su bajo valor comercial y al hecho de que su eliminación es un costo asociado al proceso. Por lo tanto, existe una necesidad urgente para el desarrollo de aplicación interesante para este subproducto industrial, haciendo uso del hecho de que el glicerol es un compuesto no tóxico y biodegradable (Qelik et al., 2008).

Además de su capacidad para modificar las propiedades físicas de sistemas acuosos, polisacáridos que contienen fucosa han incrementado el potencial para aplicaciones industriales debido al hecho de que la fucosa es uno de los azúcares raros, difíciles de obtene.r. Por otro lado, la presencia de fucosa reduce la posibilidad de reacciones alérgicas, las cuales potencian el uso de estos biopolímeros en aplicación tales como, por ejemplo, farmacéuticas y cosméticas.

La fucosa puede ser sintetizada a través de su conversión química de otros monosacáridos más comunes, tales como galactosa o glucosa. Sin embargo, la mayoría de los procesos químicos son complejos, involucrando varios intermediarios, y tienen bajo rendimiento. Una alternativa a la síntesis química de fucosa es la hidrólisis enzimática o química de polisacáridos que contienen fucosa. Estos polímeros se pueden encontrar en plantas, algas y microorganismos .

En plantas, ocurre la fucosa (L-fucosa y fucosa metilada) , por ejemplo, en las paredes celulares de papa y frutos de kiwi, en semillas de soya, en el mucílago de hojas jóvenes de Plantagc lanceolata , en las raíces de Lepidium sativum y Glycyrrhiza uralensis, en los exudados de Astragalus microcephalus, A. gummifer y A. kurdicus, y en las hojas de Lupinus albus (Vanhooren e Vandamme, 1999) .

En algas marinas, la fucosa se encuentra en fucoidano que es un homopolisacárido compuesto de L-fucosa sulfatada. La fucosa puede ser extraída de algas marinas tales como, por ejemplo, Pelvetia canaliculata , Fucus vesiculosus y Ascophyllum nodosum. En estas especies, el contenido de L-fucosa varía entre 9.0 y 11.2%. El rendimiento de la extracción global de L-fucosa de algas marinas es preferiblemente bajo (aproximadamente 7.6%) (Vanhooren e Vandamme, 1999) .

Varios microorganismos, es decir, bacterias, hongos y microalgas, sintetizan polisacáridos extracelulares (PEC) que contienen L-fucosa. Estos polímeros incluyen tanto homo como heteropolisacáridos , siendo los últimos más comunes, que contienen cantidades variables de fucosa, asi como también otros residuos de azúcares (por ejemplo, glucosa, galactosa, mañosa, ramnosa y/o arabinosa) . PEC que contienen L-fucosa son producidos por bacterias que pertenecen a varios géneros, incluyendo Aerobacter, Azotobacter, Klebsiella , Erwinia, Enterobacter, Pseudomonas , Clavibacter, Bacillus y Salmonella, entre otros. En hongos, la fucosa se puede encontrar en PEC producidos por especies que pertenecen al género Candida, Mucor, Polyporus, Rhodotorula e Sporobolomyces, entre otras.

En las últimas décadas, la producción de polisacáridos que contienen L-fucosa se ha reportado para varios géneros bacterianos, principalmente del género Klebsiella , Enterobacter, Pseudomonas y Clavibacter.

Varias cepas de Klebsiella pneumoniae sintetizan varios PEC diferentes que contienen L-fucosa, D-galactosa y ácido galcturonico, que difieren entre ellos por el grado de acetilación de la cadena polimérica. Los PEC producidos por K. pneumoniae 1-1507 (US 5876982) han encontrado aplicación en la industria cosmética debido a sus cualidades psicosensoriales, hidratación y auto-emulsificación (Guetta et al., 2003a). Otros PEC que poseen una composición muy similar, se han descrito, es decir, los PEC producidos por Klebsiella K-63 (Joseleau and Marais, 1979) y por K. pneumoniae ATCC 31646 (US 4298691) . El polímero de esta invención difiere de aquellos PEC por el hecho de que, además de fucosa y galactosa, también contienen glucosa. Por otro lado, el polímero de esta invención tiene un su composición cantidades significantes de sustituyentes de grupos acilo (hasta aproximadamente 25% del peso seco del PEC) que no son referidos como componentes de PEC de Klebsiella.

K. pneumoniae ATCC 12657 (anteriormente conocida como Aerobacter aerogenes cepa A3) produce un PEC compuesto de fucosa, glucosa, galactosa y ácido glucurónico, en cantidades aproximadamente equimolares (Vanhooren e Vandamme, 1999). La fucosa representa 18.9% del peso de PEC purificado (Guetta et al., 2003b) . Este polisacárido difiere del polímero de esta invención por el alto contenido de ácido glucurónico, y la presencia de grupos acilo que no son descritos para K. pneumoniae ATCC 12657 PEC. Sin embargo, el proceso descrito en la presente invención no usa las especies del género Klebsiella para el crecimiento microbiano.

Las cepas de Enterobacter también se han reportado por producir PEC que contiene fucosa, galactosa, glucosa y ácido glucurónico. Ejemplos incluyen: Enterobacter sp. CNCM 1-2744 que produce un PEC en el cual los monómeros están presentes en una relación de 2:2:1:1 (FR2840920) ; Enterobacter sp. SSYL (KCTC 0687BP) que produce un PEC con un peso molecular entre 105 y 106, en el cual la fucosa representa 8-10% del contenido de azúcar, siendo el ácido glucurónico el componente principal (40-70%) (US2002115158 ) ; y E. sakazakii, cepas ATCC 53017, ATCC 29004 y ATCC 12868 que producen un PEC con un peso molecular de 2xl06, en el cual la fucosa representa 13-22% y el contenido de mañosa es hasta 8%, respectivamente (US 4806636) . Estos polisacáridos difieren del polímero de esta invención por el contenido diferente de sus monómeros de azúcar y grupos acilo. Adicionalmente, el polímero de esta invención tiende a tener un peso molecular típicamente superior en el orden de 106-107.

Se han descrito varias cepas de Clavibacter michiganensis que producen PEC que contienen L-fucosa. Estos PEC contienen otros azúcares neutrales, tales como galactosa, glucosa y/o mañosa, y sustituyentes de grupos acilo, tales como piruvato, succinato y/o acetato. C. michiganensis subespecie michiganensis Cm 542 (NCPPB 1064) produce un PEC de alto peso molecular (106-107) compuesto por fucosa, galactosa y glucosa (2:1:1), y piruvato, succinato y acetato (1:0.5:1.5) (van den Bulk et al., 1991). El polímero de esta invención, aunque posee una composición similar, difiere de PEC de C. michiganensis por la proporción relativa de los grupos acilo. El mayor contenido de succinato del polímero de esta invención le confiere un carácter aniónico superior.

En el documento WO2008/127134 se describe un proceso para la producción de un polisacárido rico en galactosa por la bacteria Pseudomonas oleovorans usando sustratos ricos en glicerol. Sin embargo, el PEC obtenido en tal proceso contiene solamente cantidades residuales de fucosa (0-4%) .

En vista de esto, la presente invención describe un biopolimero que contiene fucosa de alto peso molecular, con un carácter polielectrolitico, producido por crecimiento microbiano, preferiblemente usando Enterobacter A47 (DSM 23139) y un proceso para el mismo. El proceso permite obtener el polímero de la invención usando sustratos de bajo costo en una manera fácil. El polímero de la invención puede ser usado en varias industrias, tales como industria agroalimentaria, tratamiento de aguas residuales e industria farmacéutica debido a su reología, capacidad de formar película, carácter polielectrolitico y capacidades de floculación emulsificantes .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la producción de un biopolimero cuyo componente principal es un polisacárido de alto peso molecular ( 106-107) , en el cual la fucosa representa al menos 10% de su composición, y posee sustituyentes de grupos acilo, incluyendo piruvato, succinato y acetato. El biopolimero se obtiene por crecimiento microbiano, preferiblemente por la bacteria Enterobacter A47 ( DSM 23139) usando glicerol o sustratos que contienen glicerol como las fuentes de carbono potenciales.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un proceso para preparar un polímero que comprende las etapas de crecimiento de un cultivo microbiano que comprende la cepa bacteriana Enterobacter A47 (DSM 23139) y suministrar el cultivo con una fuente de carbono que comprende glicerol. 1. Caracterización del cultivo microbiano El polímero que contiene fucosa de la presente invención se produce por la bacteria del género Pseudomonas , Klebsiella , Methylobacterium , Erwinia, Alcaligenes o Enterobacter, preferiblemente por la bacteria Enterobacter A47- depositada en el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) , bajo el Tratado de Budapest, con el número de acceso DSM 23139. Además, el microorganismo usado en la presente invención se caracteriza por otros aspectos, es decir, el perfil bioquímico, secuenciamiento genético y dendrograma filogenético presentado en las Tablas 1 y 2, y Figura 1, respectivamente.

El microorganismo usado en esta invención puede ser una .cepa de tipo nativa, una variante o una mutante, siempre y cuando posea la habilidad para sintetizar el polímero que contiene fucosa. Es posible usar un cultivo puro o un cultivo mezclado de varios microorganismos, entre los cuales, al menos uno es capaz de producir el polímero que contiene fucosa, preferiblemente la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) . 2. Caracterización del proceso para la producción del polímero El polímero de la presente invención se produce en un biorreactor en un medio acuoso aireado y agitado. El medio de cultivo contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas. La fuente de carbono preferible es glicerol o sustratos que contienen glicerol. No obstante, el proceso para la producción del polímero de la invención prevé el uso de otras fuentes de carbono, ya sea en alternativa al glicerol o en mezcla con glicerol, tales como por ejemplo, azúcares, alcoholes, ácidos o alcanos orgánicos, así como también alimentos y desechos industriales o subproductos, tales como por ejemplo subproducto de glicerol de la industria de biodiesel, melaza de azúcar, residuos de la producción de aceite de oliva o del suero de leche.

El proceso para la producción del polímero que contiene fucosa consiste en el crecimiento del microorganismo en un medio nutriente acuoso aireado. La temperatura es controlada entre 15 y 45°C, preferiblemente entre 26 y 37°C.

El pH es controlado entre 5.0 y 9.0, preferiblemente entre 6.5 y 7.0.

Al comienzo del crecimiento, la concentración de oxigeno disuelto en el medio de cultivo se establece arriba de 70%. Posteriormente, la concentración de oxigeno disuelto gradualmente se reduce, concomitante con el crecimiento celular, siendo controlado por debajo de 30%, o preferiblemente por debajo de 20%, o muy preferiblemente por debajo de 10% o aún en condiciones anaeróbicas. El polímero que contiene fucosa se produce bajo condiciones de limitación de nitrógeno, tal como en una cantidad de menos de 0.3g/l, o menos de 0.2g/l, o menos de 0.1g/l o aún sin fuente de nitrógeno y disponibilidad de carbono, simultáneamente con baja concentración de oxígeno disuelto, como se describe anteriormente. La disponibilidad del carbón es garantizada suministrando el cultivo con medio de cultivo que contiene una alta concen ración de glicerol (>100 g/1). La velocidad de flujo de la adición del tal medio durante esta fase de lote alimentado se puede ajustar para igualar el consumo de carbono del cultivo.

El caldo de cultivo obtenido al final del crecimiento en el biorreactor se puede usar directamente, sin algún tratamiento, o después de ser secado. Alternativamente, el polímero que contiene fucosa se puede precipitar del caldo por la adición de un agente de precipitación (por ejemplo, etanol, acetona), proporcionando un polímero nativo.

El proceso de extracción del polímero de la invención consiste en remoción celular (por ejemplo, por centrifugación del caldo) , seguido por la precipitación del polímero por adición de una gente de precipitación. La purificación del polímero involucra el uso de uno o varios procesos adicionales (por ejemplo, diálisis) .

Dependiendo de las condiciones de crecimiento en el biorreactor, el tiempo de crecimiento y los procedimientos usados para extraer/purificar el polímero, el proceso proporciona 50 g/1 de polímero nativo ó 20 g/1 de polímero purificado . 3. Caracterización del polímero Típicamente, el polímero de la invención tiene un contenido de fucosa que representa al menos 10% de su composición de azúcar. El polímero que contiene fucosa tiene en su composición otros azúcares neutrales, es decir, glucosa y galactosa, y también puede contener en cantidades indicadoras (<5%) de otros azúcares, tales como por ejemplo manos, ramnosa, arabinosa, fructuosa, ácido glucurónico y/o glucosamina . 4. Aplicaciones del polímero El polímero de la invención presenta actividades de floculación y emulsificación, forma soluciones acuosas altamente viscosas con comportamiento de fluido pseudoplástico, y produce películas biodegradables cuando se mezcla con otros polímeros. Por lo tanto, puede reemplazar otros polisacáridos , tales como por ejemplo xantano, alginato, carragenano, goma Guar y goma Arábiga, en sus numerosas aplicaciones, es decir, en la industria agroalimentaria, en la farmacéutica y cosmética. Además, la presencia de fucosa en el polímero de la invención además potencia su uso en aplicaciones médicas y cosméticas. Sin embargo, la presencia de residuos de piruvato y succinato confiere un carácter aniónico al polímero. Como una consecuencia, es capaz de inmovilizar metales tóxicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 - Representa el dendrograma filogenético de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) .

Figura 2 - Representa la viscosidad aparente de una solución acuosa (0.8% p/v) del polímero que contiene fucosa (medido a temperatura ambiente) .

Figura 3 - Representa el curso de tiempo del consumo de la fuente de carbono (glicerol) y fuente de nitrógeno (amonio) , la producción de biomasa y PEC que contiene fucosa, durante el proceso de crecimiento para la producción del polímero de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Caracterización del microorganismo El polímero que contiene fucosa se obtiene por crecimiento de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) . El microorganismo puede ser una cepa de tipo nativo, una variante o una mutante, siempre y cuando tenga la habilidad para sintetizar el polímero que contiene fucosa. Un cultivo puro puede ser usado o, alternativamente, se puede usar un cultivo mezclado en el cual al menos un microorganismo es capaz de producir el polímero de la invención.

El microorganismo preferido para obtener el polímero de la invención es la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) con las características descritas como sigue. La caracterización bioquímica y genética del microorganismo se realizó por el DSMZ (Deutsche Sammlung von ikroorganismen und Zellkulturen GmbH) . 1.1. Caracterización morfológica la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) La bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) es un bastoncillo con las siguientes dimensiones: 0.7-0.8 µp? x 1.2-2.5 pm. Es una bacteria móvil Gram negativa. 1.2. Perfil bioquímico de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) La bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) tiene el siguiente perfil bioquímico, el cual es típico del género Enterobacter (Tabla 1) : Tabla 1: Perfil bioquímico de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) ("+" y "-" representan una reacción positiva o negativa, respectivamente, a la prueba realizada) . 1.3. Secuencia del gen 16 ADNr de la bacteria Enterobacter A47 ( DSM 23139) La secuencia del gen 16S ARNr de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) (Tabla 2) se determinó por secuenciamiento directo de 16S ADNr amplificado por PCR. La extracción de ADN genómico, amplificación mediada por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) del 16 ADNr y purificación del producto por PCR, se llevó a cabo como se describe por Rainey et al. (1996). Los productos purificados por PCR se secuenciaron usando el Kit CEQ™DTCS-Quick Start (Beckman Coulter) como se dirige por el protocolo del fabricante. Las reacciones de secuencia fueron sometidas a electroforesis usando el Sistema de Análisis Genético CEQ™8000. Los datos de secuencia resultante se ingresaron en el editor de alineamiento ae2 (Maidak et al., 1999), alinearon manualmente y compararon con las secuencias del gel 16S ARNr representativas de organismos que pertenecen a la Enterohacteriaeceae (Maidak et al., 1999). Para comparación se obtuvieron secuencias 16S a partir de las bases de datos EMBL, RDP o DSMZ .

Tabla 2: Secuencia de gen 16S ADNr de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) - SEC ID NO 1 1 TGATCCTGGC TCAGATTGAA CGCTGGCGGC AGGCCTAACA CATGCAAGTC GAACGGTAAC 61 AGGAAGCAGC TTGCTGCTTC GCTGACGAGT GGCGGACGGG TGAGTAATGT CTGGGAAACT 121 GCCTGATGGA GGGGGATAAC TACTGGAAAC GGTAGCTAAT ACCGCATAAY GTCGCAAGAC 181 CAAAGAGGGG GACCTTCGGG CCTCTTGCCA TCGGATGTGC CCAGATGGGA TTAGCTAGTA 241 GGTGGGGTAA CGGCTCACCT AGGCGACGAT CCCTAGCTGG TCTGAGAGGA TGACCAGCCA 301 CACTGGAACT GAGACACGGT CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA 361 ATGGGCGCAA GCCTGATGCA GCCATGCCGC GTGTATGAAG AAGGCCTTCG GGTTGTAAAG 421 TACTTTCAGC GGGGAGGAAG GCGATAAGGT TAATAACCTT GTCGATTGAC GTTACCCGCA 481 GAAGAAGCAC CGGCTAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGGAGGGT GCAAGCGTTA 541 ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCACGCA GGCGGTCTGT CAAGTCGGAT GTGAAATCCC 601 CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATTCGAAAC TGGCAGGCTA GAGTCTTGTA GAGGGGGGTA 661 GAATTCCAGG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG AGATCTGGAG GAATACCGGT GGCGAAGGCG 721 GCCCCCTGGA CAAAGACTGA CGCTCAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT 781 ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC GACTTGGAGG TTGTGCCCTT GAGGCGTGGC 841 TTCCGGAGCT AACGCGTTAA GTCGACCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG TTAAAACTCA 901 AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG ATGCAACGCG 961 AAGAACCTTA CCTACTCTTG ACATCCAGAG AACTTTCCAG AGATGGATTG GTGCCTTCGG 1021 GAACTCTGAG ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTTGTGAAAT GTTGGGTTAA 1081 GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATCCTTT GTTGCCAGCG GTYAGGCCGG GAACTCAAAG 1141 GAGACTGCCA GTGATAAACT GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA 1201 CGAGTAGGGC TACACACGTG CTACAATGGC GCATACAAAG AGAAGCGACC TCGCGAGAGC 1261 AAGCGGACCT CATAAAGTGC GTCGTAGTCC GGATTGGAGT CTGCAACTCG ACTCCATGAA 1321 GTCGGAATCG CTAGTAATCG TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT 1381 ACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG 1441 GGAGGGCGCT TACCACTTTG TGATTCATGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTAACCGTA 1501 GGGAACCTGC GGGCTGGATC ACC 1.4. Dendrograma filogenético de la bacteria Enterobacter A47 { DSM 23139) Se construyó el dendrograma filogenético de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) usando el paquete ARB (Pruesse et al., 2007). Con base en los valores de distancia evolucionarios , se construyó el árbol filogenético por el método de vecino más próximo (Jukes and Cantor, 1969) , usando las correcciones de Saitou e Nei (1987) . La raíz del árbol se determinó incluyendo la secuencia del gen 16S ARNr de Klebsiella pneumoniae en el análisis. La barra de escala por debajo del dendrograma indica 1 sustitución de nucleótido por 100 nucleótidos.

La secuencia del gen 16 ADNr de la bacteria Enterobacter A47 (DSM 23139) muestra similitud más alta con la bacteria Enterobacter pyrinus (98.3%), Enterobacter hormaechei (99.0%) y Enterobacter asburiae (98.9%). El criterio para identificar un microorganismo dado dentro de una especie conocida se define por tener una similitud de al menos >90% o, idealmente, >99.5%, dentro del tipo de cepa para tal especies (Janda and Abbott, 2007).

En vista de esto, el cultivo microbiano a ser usado en el proceso para la producción del polímero de la invención puede ser cualquier microorganismo que porta una similitud de al menos 99.0 ± 0.5% con la SEC ID NO 1 de Enterobacter ?47 (DSM 23139) , de conformidad con la Tabla 2, obtenida por manipulación genética, mutación, variación o directamente de la Naturaleza. 2. Caracterización del proceso para la producción del polímero El polímero de la presente invención se produce en un biorreactor aireado agitado, con control de pH y temperatura. El proceso para la producción del polímero se inicia por la inoculación del microorganismo en un medio acuoso nutriente que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas. El proceso comprende una fase de lote inicial, seguida por una fase de lote alimentado, durante la cual el medio mineral se introduce en el biorreactor. 2.1. Medio de cultivo El medio de cultivo para la producción del polímero que contiene fucosa consiste de un medio nutriente acuoso, que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas. 2.1.1. Fuente de carbono La fuente de carbono preferida es glicerol y mezclas que contienen glicerol. Alternativamente, la fuente de carbono puede ser un azúcar monomérico, dimérico u oligomérico, un alcohol, un ácido orgánico, un alcano o mezclas que contienen dos o más de los compuestos preferidos.

La fuente de carbono también puede ser residuo o subproducto alimenticio o industrial, que contiene uno o varios de los compuestos referidos anteriormente, tales como por ejemplo, subproducto de glicerol de la industria del biodiesel, melazas de azúcar, residuos de aceite de oliva o suero de leche. El subproducto de glicerol de la industria de biodiesel está compuesto principalmente por glicerol impuro y contiene cantidades variables de metanol (5-50%), además de varios otros contaminantes reminiscentes del proceso industrial (por ejemplo, NaOH, grasas de aceite, algunos ásteres, azufre, proteínas y minerales) . Melazas de azúcar son un subproducto de refinería de azúcar rico en azúcares (sacarosa, glucosa y fructuosa) (>50%) . El suero de leche es un subproducto de la industria del queso, principalmente compuesto por lactosa. La fracción orgánica de residuos de aceite de oliva incluye azúcares, taninos, polifenoles, polialcoholes, pectinas y lípidos. Otros alimentos o desechos industriales y subproductos que tienen en su composición compuestos tales como azúcares, alcoholes, ácidos orgánicos y/o lipidos, pueden ser usados como sustratos para el crecimiento microbiano y producción del polímero que contiene fucosa .

En el proceso para la producción del polímero que contiene fucosa, de conformidad con la invención, la fuente de carbono debe representar entre 2 y 10% (p/v) del medio acuoso nutriente, durante la fase de lote, para suministrar adecuadamente para crecimiento celular. Durante la siguiente fase de lote alimentado, la fuente de carbono debe mantenerse arriba de 0.1% (p/v), preferiblemente arriba de 0.5 (p/v), para garantizar la disponibilidad de carbono para síntesis polimérica . 2.1.2. Fuente de nitrógeno La fuente de nitrógeno para el crecimiento microbiano puede ser una sal inorgánica (por ejemplo, (NH4)2HP04, NH0H, (NH4)2S0 , NH^Cl) o un compuesto de nitrógeno orgánico (por ejemplo, urea, aminoácidos), mezclas de los mismos o un residuo o subproducto alimenticio o industrial que contiene compuestos de nitrógeno (por ejemplo, soya, harina, extracto de levadura, salvado de trigo) .

En el proceso para la producción del polímero que contiene fucosa la fuente de nitrógeno debe tener una concentración inicial entre 0.6 y 3.0 g/1, durante la fase de lote, tal como para asegurar el crecimiento celular. Durante el seguimiento de la fase de lote alimentado, la fuente de nitrógeno se debe mantener por debajo de 0.3 g/1, preferiblemente por debajo de 0.1 g/1, de este modo creando una limitación de nitrógeno. Por lo tanto, durante la alimentación de lote, se limita o restringe el crecimiento celular por limitación de nitrógeno que, concomitantemente con la disponibilidad de carbono, induce la síntesis del polímero que contiene fucosa. 2.1.3. Sales inorgánicas El medio de cultivo también incluye, en cantidades indicadoras, cationes de metal, es decir, sodio, potasio, magnesio, hierro, manganeso, cobalto, cobre y zinc. Cada uno de estos cationes debe estar presente en el medio de cultivo en concentraciones entre 0.001 y 100 mM, excepto el sodio que puede estar presente en cantidades superiores, especialmente para control de pH. 2.2. Condiciones de crecimiento El crecimiento en el biorreactor se inicia por la inoculación de los microorganismos en el medio nutriente acuoso descrito anteriormente, aireado con aire comprimido. El volumen del inoculo debe representar entre 10 y 30% del medio de reacción total al inicio del crecimiento.

En todo el crecimiento, la temperatura es controlada entre 15 y 45°C, de preferencia entre 26 y 37°C, y el pH es controlado entre 5.0 y 0.9, de preferencia entre 6.5 y 7.0.

La concentración de oxigeno disuelto es alta (>70%) al inicio del crecimiento, disminuyendo gradualmente durante la fase de proceso por lote concomitante con el crecimiento celular. Durante la fase alimentación por lote, la concentración del oxigeno disuelto es controlada por debajo de 30%, de preferencia por debajo de 10% o aún bajo condiciones anaeróbicas. La velocidad de flujo de aire se puede mantener constante entre 0.1 y 2.0 vvm, siendo la concentración de oxigeno disuelto controlada por la variación automática de la velocidad de agitación entre 0 y 2000 rpm, preferiblemente 400 y 800 rpm. Alternativamente, la velocidad de flujo de aire puede variar a través del crecimiento entre 0 y 2.0 vvm, mientras se mantiene una velocidad de agitación constante. La concentración de oxigeno disuelto durante la fase de alimentación por lote también puede ser controlada por adición de sustrato. En este caso, tanto la velocidad de agitación como la velocidad de flujo de aire se pueden mantener constantes a un valor entre 0 y 2000 rpm, y entre 0 y 2.0 vvm, respectivamente.

La síntesis polimérica se inicia durante la fase de proceso por lote pero ocurre principalmente durante la fase de alimentación por lote, cuando el crecimiento celular disminuye o se detiene debido a la limitación de nitrógeno 'impuesta al biorreactor. Durante la fase de alimentación por lote, el medio nutriente se introduce en el biorreactor, lo cual crea condiciones de limitación de nitrógeno y disponibilidad de carbono. La concentración de nitrógeno en esta fase se mantiene por debajo de 0.3 g N/l, preferiblemente por debajo de 0.1 g N/l. Bajo estas condiciones, el crecimiento celular se restringe y el polímero se produce siempre que exista carbono disponible para igualar su consumo por el cultivo.

Se mantiene la síntesis polimérica en el biorreactor por 4-7 días o hasta el momento cuando el caldo se vuelve demasiado viscoso que ya no es posible mantener una distribución homogénea de oxígeno, temperatura y nutrientes. Esta situación ocurre cuando la viscosidad aparente del caldo alcanza alrededor de 2.0 Pa . s (medido a 30°C, a una velocidad de corte de 5 s"1) .

Alternativamente, la producción del polímero de la invención puede ser mantenida en un proceso continuo o en un proceso de alimentación por lote repetido. En este proceso continuo, el medio nutriente es continuamente introducido en el biorreactor, siendo el caldo que contiene el polímero también continuamente removido. En el proceso de alimentación por lote repetido, la forma de operación del biorreactor descrita anteriormente (una fase de lote inicial, seguido por una fase de alimentación por lote) es cíclicamente repetida. Aproximadamente 10-30% del volumen del caldo se queda en el biorreactor y sirve como el inoculo para el siguiente ciclo. Estas dos formas alternativas de operación del biorreactor permiten una optimización del proceso, ya que no son periodos productivos, es decir, se elimina la nueva preparación del inoculo y biorreactor. 2.2. Extracción y purificación de productos de crecimiento El caldo del crecimiento obtenido al final del crecimiento se puede usar directamente, sin algún procesamiento. Alternativamente, el polímero en bruto se puede obtener secando el caldo a una temperatura de hasta 80°C o por liofilización .

Alternativamente, se puede recuperar una forma nativa del polímero a partir del caldo al final del crecimiento preferiblemente por precipitación, lo cual se puede lograr por la adición de un solvente miscible en agua en el cual el polímero es insoluble, tal como por ejemplo un alcohol (por ejemplo, etanol, isopropanol) o una cetona (por ejemplo, acetona) . El polímero que contiene fucosa se precipita por la adición de 1-3 volúmenes del agente de precipitación por cada litro de caldo. Los polímeros se co-precipitan con células, proteínas, sales y otros componentes del caldo que son insolubles en el agente de precipitación. El polímero precipitado se puede secar a una temperatura hasta de 80°C o liofilizar. Este polímero nativo, así como también el caldo y el polímero en bruto descritos anteriormente, se pueden usar en aplicaciones tales como por ejemplo tratamiento de aguas residuales o alimentación animal .

En un procedimiento de extracción alternativo, el polímero de la invención puede ser parcialmente purificado en un proceso que incluye eliminación celular por centrifugación (10 000-20 000 rpm, 30-60 minutos), seguido por la adición de un agente de precipitación (1-3 litros del agente de precipitación por cada litro del caldo) . El agente de precipitación puede ser cualquiera de los solventes referidos anteriormente (por ejemplo, etanol, isopropanol, acetona) .

El caldo de crecimiento es altamente viscoso al final del crecimiento, de este modo la separación celular es facilitada diluyéndolo (adición de 1-4 litros de agua desionizada por cada litro de caldo) antes de la centrifugación. El polímero precipitado se puede secar a una temperatura de hasta 80°C o liofilizar. Este polímero semi-purificado se puede usar en varias aplicaciones tales como, por ejemplo, las industrias agro-alimentaria, cosmética, del papel, pintura o de aceite, entre otras.

Se puede obtener un polímero puro adicionalmente usando uno o más de los siguientes métodos: 1) Re-precipitación del polímero a partir de soluciones acuosas poliméricas semi-purificados (0.1-5.0 g/1), siendo el grado de pureza incrementado con el número de re-precipitaciones realizadas; 2) Precipitación secuencial con diferentes agentes de precipitación, es decir, etanol, acetona y/o isopropanol, o mezclas de los mismos, de este modo promoviendo la eliminación de diferentes solubles contaminantes en cada solvente ; 3) Lavar el polímero semi-purificado con solventes en el cual el polímero es insoluble (por ejemplo, hexano) pero que solubiliza uno o más de los contaminantes; 4) Uso de enzimas proteolíticas (por ejemplo, tripsina) , adición de agentes que precipitan la proteína (por ejemplo, ácido tricloroacético o desnaturalización de materiales proteínicos calentándolos a temperaturas entre 60 y 80°C; 5) Diálisis, ultrafiltración o diafiltración de soluciones poliméricas semi-purificadas acuosas, con concentraciones reducidas (0.1-5.0 g/1), lo cual resulta en un alto grado de pureza ya que el polímero de alto peso molecular se separa de todos los contaminantes de bajo peso molecular .

El polímero puro obtenido con cualquiera de estos procedimientos se puede secar a una temperatura de hasta 80°C o liofilizar. El alto grado de pureza de este polímero permite su uso en las industrias alimenticia, farmacéutica y cosmética, entre otras.

Se pueden usar varias combinaciones diferentes de los métodos referidos para extraer/purificar el polímero que contiene fucosa, de conformidad con el grado de pureza y la aplicación específica para lo cual se destina. 3. Caracterización polimérica 3.1. Composición El polímero de la presente invención está constituido principalmente por un polisacárido de alto peso molecular ( 106-107), con un contenido de fucosa de al menos 10% del contenido total de azúcar. El polímero también está compuesto por glucosa y galactosa (20-70% y 10-40% del contenido total de azúcar, respectivamente) . La composición relativa de los azúcares referidos en el polímero, fucosa, galactosa y glucosa, es dependiente del tiempo de crecimiento y de las condiciones de operación del biorreactor.

Adicionalmente , el polímero de esta invención puede también poseer otros azúcares neutrales en cantidades menores (<5%), tales como mañosa, ramnosa, xilosa, ribosa, arabinosa, ácido glucurónico y/o glucosamina.

El polímero referido posee así también componentes no de azúcar, es decir grupos acilo, los cuales representan hasta el 25% del peso seco de polímero. Los grupos acilo principales detectados son succinato, piruvato y acetato.

Típicamente, el acetato y piruvato representan entre 0.5 y 5% del peso seco del polímero, mientras el succinato está presente en grandes cantidades, normalmente entre 1 y 20%. La composición del polímero de la invención en términos de cada grupo acilo es dependiente de las condiciones de operación del reactor y del tiempo de crecimiento. La presencia de residuos de piruvato y succinato confiere un carácter aniónico al polímero. Como una consecuencia, es capaz de inmovilizar metales tóxicos, haciendo posible su aplicación en la eliminación de metales tóxicos (metales pesados y radionucleótidos ) de suelos y agua contaminados .

Dependiendo del método de extracción/purificación, el polímero obtenido puede contener, además de polímero que contiene fucosa, otros componentes presentes en el caldo de crecimiento, es decir proteínas y compuestos inorgánicos. El contenido máximo de estos componentes se detecta en el polímero nativo (15-30% de proteínas y 25-40% de compuestos inorgánicos), mientras se detecta la cantidad mínima (<1%) en el polímero purificado por diálisis. 3.2. Peso molecular promedio del Polímero El peso molecular promedio del polímero purificado, se determina por Cromatografía de Permeación de Gel, está en el intervalo de 106-107. Normalmente, cuando la producción polimérica es iniciada durante la fase de crecimiento, microbiano, su peso molecular promedio es alrededor de 10 , que se incrementa en el tiempo que dura la corrida del crecimiento hasta un valor relativamente constante en el intervalo de 106-107. 3.3. Propiedades del polímero 3.3.1. Solubilidad El polímero de la invención no es soluble en un amplio intervalo de solventes orgánicos a temperatura ambiente, que incluyen acetona, isopropanol, DMSO, hexano, éter dietílico, xileno y tetracloroetileno, entre otros. Esta característica del polímero abre la posibilidad a su aplicación en la preparación de membranas resistentes al solvente para ser usadas en procesos de separación. Sin embargo, se observa que el polímero es soluble en algunos solventes orgánicos, es decir en tetracloroetano .

El polímero de la invención es estable en contacto con los solventes orgánicos probados, manteniendo su composición en términos de constituyentes de azúcar y grupos acilo después de ser expuestos a estos solventes. Además, el peso molecular promedio tampoco es afectado. 3.3.2. Viscosidad de soluciones acuosas poliméricas Las soluciones acuosas preparadas con el polímero de la invención no son fluidos Newtonianos, que presentan un comportamiento de fluido pseudoplástico (Figura 2) . La viscosidad aparente de una solución polimérica 0.8% (p/v) es 0.21 Pa.s medido a 25°C, para una velocidad de corte de 5 s_1, disminuyendo a 0.02 Pa.s para una velocidad de corte de 500 s"1. Ya que la viscosidad es inmediatamente recuperada cuando la velocidad de corte disminuye, no se observan fenómenos de histéresis. El comportamiento del fluido pseudoplástico de las soluciones poliméricas confiere a este material la capacidad de modular las propiedades físicas de sistemas acuosos, y el potencial a ser aplicado como espesante y mejorador de textura, principalmente en las industrias alimenticia, farmacéutica o cosmética.

La viscosidad aparente de las soluciones acuosas poliméricas disminuye con el incremento de temperatura, pero se mantiene el comportamiento de fluido pseudoplástico . La viscosidad aparente de una solución polimérica 0.8% (p/v), medida a una velocidad de corte de 5 s-1 es 0.32 Pa.s a 15°C, disminuyendo a 0.05 Pa.s 65°C.

Se estudia el efecto de etapas de calentamiento y enfriamiento secuencial en las propiedades de corte constante y dinámico de las soluciones PEC purificadas, realizando ciclos de etapas de calentamiento y enfriamiento consecutivos. Después de registrar el efecto mecánico y los datos de corte constante a 25°C, la misma muestra se calienta hasta 40, 55, 70 y 80°C. Se observa que la viscosidad aparente y módulos dinámicos (G' y G' ' ) , registrados a 25°C al final de cada ciclo, son prácticamente coincidentes. A partir de esto, se concluye que la muestra polimérica es bastante estable bajo fluctuaciones de temperatura, manteniendo sus propiedades en pruebas de estado estable y oscilatorias consecutivos a 25°C, después de ser expuestas a temperaturas incrementadas hasta 80°C. Estas características hacen pensar que el polímero se puede usar en formulaciones acuosas (por ejemplo, productos alimenticios) que son sometidos a fluctuaciones de temperatura durante el procesamiento .

Con respecto a las propiedades de viscosidad, las soluciones acuosas del polímero que contienen fucosa presentan un comportamiento de un líquido viscoso (G''>G' en el intervalo completo de las frecuencias estudiadas) . No se detecta la formación de gel bajo las condiciones probadas. 3.3.3. Actividad emulsificante El polímero de la invención posee actividad emulsificante, lo cual significa que es capaz de estabilizar emulsiones de gotas de agua en compuestos hidrofobicos, tales como aceites (por ejemplo, aceite de oliva, parafina) e hidrocarburos (por ejemplo, hexano, tolueno) . Así como, el polímero se puede usar como agente bioemulsificador o estabilizante, y tiene el potencial para remplazar emulsificadores sintéticos en un amplio intervalo de aplicaciones, tales como en industrias de aceite, detergente, textil, papel, pintura, cosmética, farmacéutica y alimenticia .

La actividad emulsificante no es confinada al polímero purificado. Otras formas, es decir en bruto, nativa o semi-purificada, han relevado la capacidad de emulsiones estabilizantes de agua en compuestos hidrofobicos. Esta capacidad es verificada usando soluciones del polímero de la invención, con una concentración entre 0.05 y 1.5%, cuando se mezcla con varios hidrocarburos (por ejemplo, hexadecano, hexano, tolueno y xileno) y aceites (aceite de oliva y parafina) . Las emulsiones formadas son bastante estables por varias semanas. Además, se han mostrado por ser muy estables a temperatura, resistiendo el calentamiento de temperatura ambiente hasta 40, 50, 60 y 100°C. 3.3.4. Actividad floculante El polímero de la presente invención también tiene una actividad floculante significante, y se puede usar como un agente biofloculante natural. Los agentes de floculación son útiles en la promoción de agregación celular y coloidal, siendo ampliamente usados en aplicaciones industriales, tales como tratamiento de aguas residuales y agua para beber y productos alimenticios. La capacidad de ser biodegradable y seguridad del polímero de la presente invención tienen la ventaja sobre floculantes sintéticos, los cuales son peligrosos para la salud humana y cuya degradación en al ambiente es difícil.

A temperatura ambiental y pH neutral, la actividad floculante del polímero de la invención disminuye de 70 hasta 60% con el incremento de concentración polimérica de 0.1 hasta 0.8% (p/v) . Esta actividad floculante se compara con las de los polisacáridos comerciales, es decir, xantano, alginato, goma Guar y carboximetilcelulosa . El polímero de la invención se ha revelado por ser un buen agente floculante, con un desempeño similar al de los productos comerciales, por la misma concentración polimérica. 3.3.5. Preparación de películas biodegradables El polímero que contiene se puede usar para producir películas compuestos biodegradables mezclándolo con otros biopolímeros , tales como almidón, pectina, alginato, carragenano, gluten, gelano y quitosán. Estas películas se pueden aplicar como membranas en materiales de procesamiento y empaque de solventes orgánicos.

Se han probado polisacáridos , tales como quitosán, almidón y goma guar en la preparación de microesferas para liberación controlada de fármaco. El polímero de esta invención se puede usar también para este propósito, ya sea solo o mezclado con otros biopolímeros. 4. Aplicaciones del polímero de la presente invención El polímero de esta invención presenta actividad emulsificante y floculante, y forma soluciones acuosas de alta viscosidad con un comportamiento de fluido pseudoplástico . Como una consecuencia, puede sustituir otros polisacáridos, como xantano, alginato, goma guar y goma Arábiga, en un amplio intervalo de aplicaciones, es decir como espesante, mejorador de textura o agentes de unión, en las industrias alimenticia, farmacéutica y cosmética.

El polímero que contiene fucosa se puede usar para producir películas compuestas biodegradables mezclándolo con otros biopolímeros, tales como almidón, pectina, alginato, carragenano, gluten, gelano y quitosán. Estas películas se pueden aplicar como membranas en procesamiento de solventes orgánicos (por ejemplo, deshidratación de solvente por evaporación) , y en materiales de empacado, como empaques de alimento, en cuanto a su baja permeabilidad a gases (oxigeno y dióxido de carbono) .

El polímero que contiene fucosa también se puede usar como una fuente de oligosacárido, obtenido a partir del polímero original aplicando tratamientos físicos (por ejemplo, microondas, calor, irradiación y ultrasonicación) , procesos químicos (por ejemplo, hidrólisis acídica) , tratamientos enzimáticos (por ejemplo, con hidrolasas y liasas) o procesos biológicos (usando agentes microbianos capaces de degradar el polímero y usar todas los azúcares como fuentes de carbono, excepto fucosa) . La fucosa y fuco-oligosacárido obtenidos, así como también el polímero original, aislado o mezclados juntos, tienen un gran potencial en aplicaciones médicas como agentes anticancerígenos y anti-inflamatorios, en el tratamiento de artritis reumatoide, por nombrar algunos (Vanhooren e Vandamme, 1999; Péterszegi et al., 2003b). Además debido a la presencia de fucosa en su composición, el polímero de la invención también tiene un gran potencial para ser usado en cosméticos como aditivo hidratante y anti-envej ecimiento (Péterszegi et al., 2003a).

EJEMPLOS Ejemplo 1: Producción del polímero que contiene fucosa por crecimiento de la bacteria Enterobacter A47 ( DMS 23139) , usando subproductos de glicerol de la industria de biodiesel Se inocula un cultivo de Enterobacter A47 (DSM 23139) en 8 1 del medio de cultivo con la composición presentada en la Tabla 3. El biorreactor (BioStat B-plus, Sartorius) fue operado bajo las siguientes condiciones: temperatura controlada a 30°C; pH controlado a 6.80 ± 0.05, adición automática de NaOH 1M y una velocidad de aireación constante de 1.6 1/min (0.2 vvm) . Ya que el crecimiento microbiano se lleva a cabo, la concentración de oxígeno disuelto disminuye de 80% de saturación en el inicio de la corrida del crecimiento, hasta aproximadamente 20% después del 1 día.

A partir de este instante, se introduce una alimentación constante en el reactor (de aproximadamente 20 ml/h) . Su composición se presenta en la Tabla 3, pero con una concentración de glicerol diferente (200 g/1) . Estas condiciones de operación limitan la concentración de nitrógeno en el caldo de fermentación (por debajo de 0.1 g N/l) y permite simultáneamente una buena disponibilidad de fuente de carbono.

Tabla 3: Composición del medio de cultivo.

La concentración de oxigeno disuelto disminuye gradualmente a 10% de saturación, valor logrado después de 2 días de crecimiento. A partir de este momento, se controla por debajo de 10% de variación automática de la velocidad de agitación entre 400 y 800 rpm. Después de 1 dia bajo estas condiciones, la viscosidad del caldo de fermentación se incrementa rápidamente, lo cual se refiere a la producción polimérica .

Al final del dia 4 de crecimiento, la concentración polimérica es caso 13.3 g/1, lo cual se refiere al polímero extraído y cuantificado en su forma semi -purificada (Figura 3) . La viscosidad del caldo de fermentación se incrementa significativamente entre el día 4 y día 7, aún sin embargo cuando la producción polimérica ha terminado. La productividad alcanza el valor de 3.6 g L_1 día-1 y el rendimiento de glicerol fue 0.47 g g"1, considerando el intervalo de tiempo en el cual la producción polimérica se lleca a cabo (del día 1 hasta el día 4) .

La corrida del crecimiento se detiene en el día 7, cuando la viscosidad del caldo de fermentación alcanza 3.0 Pa.s, a una velocidad de corte de 5 s"1 y T = 30°C.

Ejemplo 2: Extracción y purificación del polímero que contiene fucosa producido por Enterobacter A47 ( DSM 23139) a partir del subproducto de glicerol.

Al final de la corrida de crecimiento descrita en el Ejemplo 1, el polímero que contiene fucosa se recupera del caldo de fermentación, en la forma de tres diferentes productos con diversos grados de pureza: polímero nativo, semi-purificado y purificado.

El polímero natico se obtiene por la adición de acetona directamente del caldo de fermentación (3:1). La concentración del polímero nativo fue 20.6 g/1.

Para obtener el polímero semi-purificado, el caldo de fermentación primero se diluye para reducir la viscosidad (2 1 de agua desionizada a 1 1 del caldo de fermentación) y después se separa la biomasa por centrifugación (20000 rpm, 30 min) . Más tarde, se agrega el sobrenadante libre de célula lentamente a la acetona (1:3) bajo agitación suave, promoviendo la precipitación del polímero. Lo precipitado se disuelve en agua desionizada y se liofiliza. La concentración del polímero semi-purificado fue 11.6 g/1.

Para obtener el polímero purificado, se procesa una solución acuosa del polímero semi-purificado por diálisis en contacto con agua desionizada durante 24 horas, usando una membrana 3500 MWCO (SnakeSkin™ Pleated Dialysis Tubing 68035 — Thermo Scientific) . Se agrega azida de sodio (6 ppm) para prevenir la degradación microbiana del polímero. Después de esto, el polímero se precipita agregando acetona, se redisuelve en agua y liofiliza. La concentración del polímero purificado fue 5.5 g/1.

Como una alternativa, el polímero puede ser extraído/purificado por la siguiente metodología: dilución del caldo de fermentación y separación de biomasa por centrifugación; calentar a 60°C por 1 h para inactivar las enzimas presentes en lo sobrenadante que pueden ser responsables por la degradación del polímero parcial; diálisis del sobrenadante en contacto con agua desionizada y finalmente liofilizarla . Con este método se recuperaron 5.0 g/1 del polímero purificado.

Ejemplo 3: Análisis químico del polímero que contiene fucosa producido por Enterobacter A47 (DSM 23139) El polímero producido como se describe en el Ejemplo 1 y extraído como se describe en el Ejemplo 2 se caracteriza en términos de su composición química, es decir con respecto a su composición de azúcar, el contenido de grupos acilo y la cantidad de residuos no de azúcar (proteínas y cenizas), usando los métodos descritos en Freitas et al. (2009) . La composición química de todos los grados de pureza del polímero (nativo, semi-purificado y purificado por diálisis) se analizan con el tiempo, durante la corrida de crecimiento.

Después del día 1 de crecimiento, el polímero está constituido principalmente de glucosa (77%) y galactosa (15%), con cantidades más bajas de fucosa (6%). Con forme el crecimiento prosigue, la proporción relativa de estos monómeros de azúcar ha cambiando significativamente: el contenido de glucosa disminuye gradualmente a 40% en el día 4, y la cantidad relativa de galactosa y fucosa se incrementa hasta 26% y 28% respectivamente.

La composición de azúcar fue prácticamente constante en los últimos 3 días de operación (glucosa, 40-44%; fucosa, 26-30%; galactosa, 28-29%) .

También se observa una variación de la proporción relativa de los grupos acilo con el tiempo: varía de 2.4% de succinato, 0.2% de piruvato y 0.3% de acetato en el día 1, hasta 20% de succinato, 2.4% de piruvato y 2.0% de acetato en el día 4. Después de esto, en el día 7 se observa una disminución del contenido de succinato a 3.9%, junto con un incremento de piruvato (4.9%) y acetato (3.6%).

La composición en términos de constituyentes de azúcar y grupos acilo es similar para los polímeros con diferentes grados de pureza. No sucede lo mismo para el caso de proteínas y cenizas. El contenido de estos componentes disminuye del polímero nativo al polímero semi-purificado, y del último al polímero purificado.

Ejemplo 4: Producción del polímero que contiene fucosa cultivando la bacteria Enterobacter A47 ( DSM 23139), usando subproducto de glicerol de la industria de biodiesel, bajo diferentes temperaturas y pH .

El cultivo de Enterobacter A47 (DSM 23139) se cultivó en biorreactores de 2 1, como se describe en el ejemplo 1, excepto por la temperatura y pH que se controlaron bajo diferentes valores, de conformidad con la Tabla 4. Al final de cada corrida, el polímero se recuperó como se describe en el ejemplo 2.

Tabla 4: Valores de temperatura y pH probados.

Las condiciones que maxímizan el crecimiento celular, producción polimérica y productividad se encontraron estar a temperaturas entre 25 y 34°C, y pH controlado entre 6.5 y 7.5 (Tabla 5). Además, dentro de estas temperaturas e intervalos de pH, el contenido de polímero en fucosa es máximo. Fuera de estos intervalos, el cultivo tiene polímeros sintetizados con diferentes composiciones, tales como, por ejemplo: reducción del contenido de fucosa (<14%), concomitante con un incremento en el contenido de glucosa (>50%) y la adición de nuevos monómeros (por ejemplo, ramnosa y glucosamina) como principales componentes (hasta 20% y hasta 10%, respectivamente). También se detecta ácido glucurónico en estos polímeros con un contenido hasta 15%. El contenido de grupos acilo también se afecta por la temperatura y pH durante el cultivo, siendo reducido a niveles por debajo de 10% de la masa seca del polímero.

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Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Polímero caracterizado porque consiste de un polisacárido que contiene fucosa, en donde la fucosa cuenta por al menos 10% del contenido total de carbohidrato y los grupos acilo representan hasta 25% del peso seco del polímero, obtenido por crecimiento de la bacteria Enterobacter A47, con número de acceso DSM 23139, usando glicerol o mezclas que contienen glicerol como fuentes de carbono .

2. Un proceso para preparar un polímero tal como se describe en la reivindicación precedente caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) crecimiento de un cultivo microbiano en un biorreactor aireado y agitado; b) suministrar el cultivo con una fuente de carbono que comprende glicerol o mezclas que contienen glicerol, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas; c) inoculación de la bacteria; d) síntesis del polímero; d) extracción del polímero; e) purificación.

3. Proceso, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque: a) la concentración inicial de oxígeno disuelto en el medio de cultivo bacteriano se encuentra arriba de 70%; b) cuando la concentración de oxígeno disuelto en el caldo alcanza 30%, entonces la concentración de oxígeno disuelto se controla a niveles por debajo de 30%, o por debajo de 20%, o por debajo de 10%, o aún en condiciones anaeróbicas, mientras se mantiene la fuente de nitrógeno limitada a cantidades de menos de 0.3 g/1, o menos de 0.2 g/1, o menos de 0.1 g/1 o aún sin fuente de nitrógeno y suministrando la fuente de carbono para igualar su tasa de consumo microbiano.

4. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-3, caracterizado porque comprende una fase por lote inicial, seguida por una fase de lote alimentado, durante la cual se introduce medio mineral en el biorreactor.

5. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque la temperatura de la etapa de crecimiento es entre 15 y 45°C, preferiblemente entre 23 y 24 °C, y el pH se encuentra entre 5.0 y 9.0, preferiblemente entre 6.0 y 7.5.

6. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque el caldo de cultivo al final de la etapa de crecimiento se seca a temperatura hasta 80°C o se seca por liofilización .

7. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-6, caracterizado porque el caldo de cultivo después de la etapa de extracción se precipita por la adición de 1-3 volúmenes de agente de precipitación para cada litro de caldo .

8. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-7, caracterizado porque el polímero es además purificado por, entre otros, diálisis, técnicas de ultrafiltración o diafiltración .

9. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-8, caracterizado porque el volumen de inoculo se encuentra entre 10 y 30% del medio de reacción total al comienzo del crecimiento .

10. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-9, caracterizado porque la fuente de carbono es un residuo o subproducto alimenticio o industrial.

11. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-10, caracterizado porque la fuente de carbono se encuentra entre 2 y 10% (p/v) del medio nutriente acuoso, durante la fase por lote, y arriba de 0.1% (p/v) en la fase de lote alimentado .

12. Proceso de conformidad con las reivindicaciones 2-11, caracterizado porque la fuente de nitrógeno tiene una concentración inicial entre 0.6 y 3.0 g/1, durante la fase por lote, y está por debajo de 0.3 g/1 en la fase de lote alimentado .

13. Un polímero con peso molecular promedio de 106-107, obtenido por el proceso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, caracterizado porque comprende fucosa en una cantidad de al menos 10% del contenido total de carbohidrato y los grupos acilo representan hasta 25% del peso seco del polímero.

14. Polímero de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque los grupos acilo son succinato y/o piruvato y/o acetato.

15. Polímero, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-14, caracterizado porque comprende una cantidad de glucosa entre 20%-70%, una cantidad de galactosa entre 10-40% y una cantidad de ácido glucurónico entre 10 y 20% del contenido total de carbohidrato.

16. Polímero de conformidad con la reivindicación 14-16, caracterizado porque los compuestos acilados comprenden cantidades de succinato hasta 20%, piruvato y/o acetato en cantidades de hasta 5% del peso seco del polímero.

17. Polímero, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado porque tiene un contenido de al menos 5% en azúcares neutrales, tales como por ejemplo ramnosa o mañosa, y/o azúcares de amina, tales como por ejemplo glucosamina, y/o azúcares acídicos, tales como por ejemplo ácido galacturónico .

18. Polímero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque tiene un comportamiento de fluido pseudoplástico en medio acuoso, con viscosidad estable bajo temperaturas hasta 80°C, pH entre 3-10 y fuerza iónica hasta 20% de NaCl.

19. Polímero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque es insoluble en solventes orgánicos.

20. Polímero, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque tiene una capacidad de estabilización y formación de emulsión contra varios compuestos hidrofóbicos, tales como aceites minerales y vegetales e hidrocarburos, siendo la emulsión estable al calentamiento a temperaturas hasta 100°C.

21. Polímero, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque tiene actividad floculante .

22. Películas, recubrimientos y envases, caracterizados porque comprenden el polímero como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 14-22.

23. Películas de compuesto biodegradable, caracterizadas porque comprenden el polímero descrito en las reivindicaciones 14-21.

24. Microesferas para liberación controlada del fármaco, caracterizadas porque comprenden el polímero descrito en las reivindicaciones 14-21.

25. Formulaciones farmacéuticas y/o cosméticas, caracterizadas porque comprenden el polímero descrito en las reivindicaciones 14-21.

26. Uso del polímero descrito en las reivindicaciones 14-21, en la industria agroalimenticia , en industrias farmacéuticas y cosméticas y/o en el tratamiento de residuos.