KR101919395B1

KR101919395B1 - 푸코오스 함유 세균성 생체 고분자

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Publication number: KR101919395B1
Application number: KR1020127018617A
Authority: KR
Inventors: 마리아 디'아스센싸로 카르발로 페르난데스 데 미란다 레이스; 루이 마누엘 프레이타스 올리베이라; 마리아 필로메나 안드라데 데 프레이타스; 알베스 비터 마누엘 델가도
Original assignee: 73100 - 세텐타 이 트레스 밀 이 셈, 엘디에이
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2018-11-16
Also published as: CA2782989A1; RU2012124803A; WO2011073874A2; JP2013513397A; WO2011073874A9; AU2010331906A1; ES2806933T3; BR112012014626A2; EP2513325A2; JP5969390B2; EP2513325B1; BR112012014626B1; DK2513325T3; KR20130001211A; PT104888B; MX2012006944A; RU2573574C2; ZA201204140B; HUE050490T2; CN102971432A

Abstract

본 발명은 조성물에 푸코오스를 포함하는 세균성 생체 고분자(microbial biopolymer)에 관한 것이다. 이 생체 고분자는 푸코오스를 포함하는 다당류로 구성되고 이 푸코오스는 상기 다당류의 조성물의 적어도 10%를 나타낸다. 또한, 푸코오스 함유 다당류는 비당 성분, 즉, 아실기 치환물을 함유한다. 또한, 본 발명은 글리세롤 또는 글리세롤이 풍부한 혼합물을 탄소원으로 이용하여 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)의 배양에 의해 수득되는 생체 고분자의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 푸코오스 함유 생체 고분자는 다양한 산업분야 (예; 제약학, 화장품 및 농식품 산업) 및 산업 폐기물의 처리분야 (예: 오일 및 금속 회수)에서 사용될 수 있다.

Description

푸코오스 함유 세균성 생체 고분자{Fucose-Containing Bacterial Biopolymer}

본 발명은 조성물에 푸코오스(fucose)가 함유된 세균성 생체 고분자(bacterial biopolymer)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 엔테로박터균(bacterium Enterobacter ) A47 (DSM 23139)에 의해 푸코오스 함유 생체 고분자(fucos-containing biopolymer)를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 다양한 산업분야 (예: 제약학, 화장품 및 농식품 산업) 및 산업 폐기물 처리 (예: 오일 및 금속회수)에서 적용가능하다.

다당류(polysaccharides)는 단당류 기본 반복단위(monosaccharide repeating units)의 중합화를 통해 형성된 고분자량(10⁴-10⁷) 의 고분자 생체재료이다. 이 다당류는 반복단위의 다양성, 관련된 글리코시드 결합의 형태, 분지형성(branching)의 정도의 결과로서 큰 구조적 다양성을 지닌다. 많은 다당류는 유기 아실 화합물(예: 아세테이트(acetate), 숙시네이트(sucinate), 피루베이트(pyruvate)) 및 무기 아실 화합물 (예: 포스페이트, 설페이트)과 같은 무당 성분(non-sugar components)을 갖고 있다 (Sutherland, 2001).

한편, 다당류는 가끔 분자내 또는 분자간 비공유 결합(intra or intermolecular non-covalent linkages)을 통해 3차 구조를 형성함으로써, 거대분자에 보다 큰 강성(rigidity)을 부여하고 고체상태 및 용액에서 고분자의 특성을 결정하는데 중요한 역할을 한다 (Moreno et al, 1998). 다당류는 통상 생명체에서 얻어진 무독성이고 생분해성인 물질이므로 이들 생체물질을 지속가능한 발전에 적합하도록 해준다.

상용화중인 다당류의 주요 응용으로서, 천연 유도체(예: 알긴산, 캐라지난, 구아검, 펙틴, 크산탄, 젤란) 및 반합성 유도체(예: 메틸셀루로오스, 카르복시메틸셀루로오스, 하이드록시프로필구아)는 수성 시스템(하이드로콜로이드-수성 시스템의 물성을 개질시킬 수 있는 화합물)을 개질시킬 수 있는 능력에 기반하고, 주로 식품산업 및 오일 및 제약학 산업에서 사용된다. 부가적으로, 이들 다당류의 일부 (예: 알긴산, 펙틴, 풀루란, 전분 유도체, 셀루로오스 유도체)는 포장, 용기 및 시트 제조분야는 물론, 여러 가지 농식품, 제약학 및 산업 응용분야에서 사용되는 생분해성 막(biodegradable films)을 형성하는 능력을 갖는다.

최근에, 산업분야에서 사용되는 대다수의 다당류는 식물(예: 구아검, 아라비아검), 조류(藻類)(예: 알긴산, 캐라지난) 또는 갑각류(예: 키틴)로부터 얻어지는 한편, 미생물 다당류 (예: 크산탄, 젤란, 박테리아 알긴산)는 생체 고분자 시장의 적은 비율만을 나타내고 있다 (Canilha et al, 2005). 그럼에도 불구하고, 과거에는 새로운 미생물 다당류의 동정(identifying) 및 분리(isolating)에 관한 관심이 증가해왔는데, 이 새로운 미생물 다당류는 향상된 물리화학적 특성, 즉 보다 높은 유화 및 응집 활성(emulsifying and flocculating activities), 보다 높은 유기용매 저항성, 생리활성(예: 항암 또는 면역증강 효과) 및 향상된 유동 특성(Rheological Properties)(예: 낮은 고분자에 대한 보다 높은 점도, 보다 넓은 Ph, 온도 및 이온 강도 범위에 대한 높은 안정성)으로 인해 종래의 다당류와 경쟁할 수 있다.

다당류의 미생물 생산은 식물, 조류(藻類) 또는 동물로부터 추출하는 것에 비해 장점을 갖는데, 그 이유는 미생물은 통상 보다 높은 성장 속도를 보이고 배양조건의 조작에 보다 순응적이기 때문이다 (Moreno et al, 1998). 식물, 조류(藻類) 또는 동물은 통상 계절적인 생산주기로서 1년 이상의 생명순환을 갖는다. 한편, 미생물은 대략 몇 시간 또는 몇 일의 성장속도를 갖는 반면, 식물, 조류(藻類) 또는 동물은 대략 몇 개월 또는 몇 년의 성장속도를 갖는다.

미생물 다당류의 상업적 생산을 제한하는 주요 인자로는, 높은 지질(substrate) 비용, 주로 설탕, 특히, 글루코스, 전분 및 자당(蔗糖)을 들 수 있다. 이들 생물공정에서, 기질 비용은 전체 생산 비용의 20-40%에 달한다 (Kumar and Mody, 2009).

따라서, 비슷한 생산성을 가지면서 덜 비싼 기질을 찾는 것이 생산비용의 감소에 필수적이다. 지난 과거 바이오디젤 산업의 큰 성장으로 인해, 종래의 글리세롤 응용분야에서 최근 소비를 훨씬 뛰어넘는 양이 생산되고 있다. 부산물로서 글리세롤이 생산되는 바이오디젤 산업 또는 다른 산업의 경우, 이 글리세롤은 낮은 상업적 가치와 비용관련 공정으로서 제거공정이 필요하다는 사실로 인해 부담이 되고 있다. 따라서, 글리세롤이 무독성의 생분해성 화합물이라는 사실에 고려하여 산업 부산물의 관심응용 분야의 개발에 대한 필요성이 절박해지고 있다 (Celik et al, 2008).

푸코오스 함유 다당류는, 수성 시스템의 물성을 개질시킬 수 있는 능력에 더하여, 푸코오스가 수득하기 어려운 희귀당 중 하나라는 사실로 인해 산업응용분야를 위한 향상된 잠재력을 갖고 있다. 한편, 푸코오스의 존재로 인하여 알레르기 반응의 가능성이 줄어들고, 이는 예컨대, 제약학 및 화장품과 같은 응용분야에서 이들 생체 고분자의 이용을 가능하게 해준다.

프코오스는 갈락토스 또는 글루코스와 같은 다른 많은 단당류로부터 화학적 변환을 통해 합성될 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 화학공정은 여러 중간물을 내포하므로 복잡하고 낮은 수율을 갖는다. 푸코오스의 화학합성에 대한 대안은 푸코오스 함유 다당류의 화학적 또는 효소적 가수분해이다. 이들 고분자는 식물, 조류(藻類) 및 미생물에서 발견될 수도 있다.

식물에서는, 예컨대 토마토 및 키위 과일의 세포벽, 대두 종자, 창질경이(Plantago lanceolata )의 어린잎의 점질물(mucilage), 큰다닥냉이(Lepidium sativum) 및 감초(Glycyrrhiza uralensis)의 뿌리, 아스트라갈루스 마이크로세팔루스(Astragalus microcephalus), 아스트라갈루스 굼미페르(A. gummifer ) 및 아트라갈루스 쿠르디쿠스(A. kurdicus)의 삼출액, 및 루피누스 알부스(Lupinus albus)의 잎에서 푸코오스 (L-푸코오스 and 메틸화된 푸코오스)가 발생한다 (Vanhooren e Vandamme, 1999).

해초에서는, 황산화 L-푸코오스로 구성된 동질 다당류(homopolysaccharide)인 후코이단(fucoidan)에서 푸코오스가 발견된다. 푸코오스는 예컨대, 채널드랙(Pelvetia canaliculata), 푸쿠스 베시쿨로수스(Fucus vesiculosus) 및 노티드랙(Ascophyllum nodosum)과 같은 해초로부터 추출될 수도 있다. 이들 종(species)에서의 L-푸코오스 함량은 0.9 내지 11.2%이다. 해초로부터 L-푸코오스의 광범위한 추출 수율은 비교적 낮다 (약 7.6%)(Vanhooren e Vandamme, 1999).

여러 가지 미생물, 즉 박테리아, 곰팡이 및 미세조류(microalgae)는 L-푸코오스를 함유하는 세포외 다당류(EPS)를 합성한다. 이들 고분자는 동질 및 이질 다당류를 포함하는데, 나중에 가변량의 푸코오스 및 당 잔류물(예: 글루코스, 갈락토스, 마노스, 람노스 및/또는 아라비노스)을 포함하는 것이 보다 일반적이다. EPS를 함유하는 L-푸코오스는 여러 종류의 속(genera), 특히 에어로박터(Aerobacter), 아조토박터(Azotobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터(Enterobacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 클라비박터(Clavibacter), 바실루스(Bacillus) 및 살로넬라(Salmonella) 에 속하는 박테리아에 의해 생산된다. 곰팡이에서는, 여러 속(genera) 중에서도 특히 칸디다(Candida), 무코(Mucor ), 폴리포루스(Polyporus ), 로도토룰라(Rhodotorula ), 스포로볼로미케스(Sporobolomyces)에 속하는 종(species)에 의해 생산된 EPS에서 발견될 수도 있다.

최근 몇 십 년 동안, L-푸코오스 함유 다당류는 여러 가지 균속(bacterial genera)에서도, 주로 클렙시엘라속, 엔테로박터속, 슈도모나스속 및 클라비박터속으로부터 생산되는 것으로 보고되어 왔다.

여러 가지 폐렴간균 균주들(Klebsiella pneumoniae strains)은 특히, 고분자 체인의 아세틸화 정도 만큼 상이한, L-푸코오스, D-갈락토스 및 갈락투론산(galacturonic acid)을 함유하는 여러 가지 상이한 EPS를 합성한다. 폐렴간균 I-1507 (US 5876982)에 의해 생산된 EPS는 정신감각 특성, 수화 및 자기유화 특성(hydrating and self-emulsifying properties)으로 인해 화장품 산업에서 응용분야를 발견하였다(Guetta et al, 2003a). 매우 유사한 조성물을 갖는 다른 EPS, 즉 클렙시엘라 K-63 (Joseleau and Marais, 1979) 및 폐렴간균 ATCC 31646 (US 4298691)에 의해 생산된 EPS가 개시된 바 있다. 본 발명의 고분자는 푸코오스 및 갈라토스 이외에 글루코르를 함유한다는 사실에 의해 종래의 EPS와는 다르다. 한편, 본 발명의 고분자는 그 조성물에 클렙시엘라 EPS라고 지칭되지 않는 상당량의 아실기 치환물(EPS 건 중량(dry weight)의 약 25%를 차지함)을 포함한다.

폐렴간균 ATCC 12657 (공식적으로 에어로박터 에어로게네스 균주 A3 로 알려져 있음)은 대략 몰 동량(equimolar amounts)의 푸코오스, 글루코스, 갈락토스 및 글루쿠론산으로 구성된EPS를 생산한다 (Vanhooren e Vandamme, 1999). 푸코오스는 정제된 EPS 중량의 18.9%를 나타낸다 (Guetta et al, 2003b). 이러한 다당류는 높은 글루쿠론산 함량, 및 폐렴간균 ATCC 12657 EPS에 대해 설명되지 않은 아실기의 존재에 의해 본 발명의 고분자와는 상이하다. 더욱이, 본 발명에 개시된 공정은 미생물 배양을 위한 클렙시엘라 속(Klebsiella genus)의 종(species)을 이용하지 않는다.

엔테로박터 균주는 푸코오스, 갈락토스, 글루코스및 글루쿠론산을 함유하는 EPS를 생산하는 것으로 보고되어 왔다. 이 엔테로박터 균주의 예로는, 단량체들이 2:2:1:1의 비율로 존재하는EPS를 생산하는 엔테로박터 sp. CNCM 1-2744 (FR2840920); 푸코오스가 8~10%의 당 함량을 나타내고 글루쿠론산을 주성분으로 하는 10⁵~10⁶ 의 분자량을 갖는 EPS를 생산하는 엔테로박터 sp. SSYL (KCTC 0687BP) (US2002115158); 및 푸코오스가 13~22%의 당 함량을 나타내며 마노스 함량이 8%이고 2x10⁶의 분자량을 갖는 EPS를 생산하는 엔테로박터 사카자키(E. sakazakii) 균주 ATCC 53017, ATCC 29004 및ATCC 12868를 들 수 있다. 이들 다당류는 당의 단량체 및 아실기의 서로 다른 함량에 의해 본 발명의 고분자와는 상이하다. 또한, 본 발명의 고분자는 통상 약 10⁶~10⁷의 고 분자량을 가는 경향이 있다.

L-푸코오스를 함유하는 EPS를 생산하는 여러 종류의 클라비박터 미시가넨시스 균주(Clavibacter michiganensis strains)가 개시된 바 있다. 이들 EPS는 갈락토스, 글루코스 및/또는 마노스와 같은 다른 중성당(neutral sugars), 및 피루베이트, 숙시네이트 및/또는 아세테이트와 같은 아실기 치환물을 함유한다. 클라비박터 미시가넨시스. 아종 미시가넨시스 (C. michiganensis subsp michiganensis) Cm 542 (NCPPB 1064)는 푸코오스, 갈락토스 및 글루코스 (2:1:1), 및 피루베이트, 숙시네이트 및 아세테이트 (1:0.5:1.5)로 구성된 고분자량의 EPS를 생산한다 (van den Bulk et al, 1991). 본 발명의 고분자는 유사한 조성을 가짐에도 불구하고 아실기의 상대적 비율에 의해 클라비박터 미시가넨시스 EPS와는 상이하다. 본 발명의 고분자의 높은 숙시네이트 함량은 높은 음이온 특성(anionic character)을 부여한다.

특허문헌 WO2008/127134에는 글리세롤이 풍부한 기질을 이용하여 슈도모나스 올레오보란스 균(bacterium Pseudomonas oleovoran )에 의한 갈락토스가 풍부한 다당류(galactose-rich polysaccharide)의 생산에 대해 개시되어 있다. 그럼에도 불구하고, 이 공정에서 수득된 EPS는 잔량의 푸코오스 (0~4%)만을 함유한다.

이러한 사실을 고려하여, 본 발명은 미생물 배양에 의해, 바람직하기로는 엔테로박터 A47 (DSM 23139)를 이용하여 생산된 고분자 전해질 특성(polyelectrolyte character)을 갖는 고분자량 푸코오스 함유 생체 고분자, 및 그 공정을 개시하고 있다. 상기 공정은 저가의 기질을 이용하여 용이한 방식으로 본 발명의 고분자의 수득을 가능하게 해준다. 본 발명의 고분자는 그 유동학, 막형성 능력(film-forming capacity), 고분자 전해질 특성, 및 유화 및 응집 능력(emulsifying flocculating abilities)으로 인해 농식품 산업, 폐수 처리 및 제약학 산업과 같은 다양한 산업분야에서 사용될 수 있다.

본 발명은 고분자량의 다당류((10⁶~10⁷)를 주성분 으로 하며 푸코오스 함량이 다당류 조성물의 적어도 10%이고 피루베이트, 숙시네이트 및 아세테이트를 포함하는 아실기 치환물을 갖는 생체 고분자에 관한 것이다. 생체 고분자는 미생물 배양에 의해, 바람직하기로는 선호되는 탄소원으로서 글리세롤 또는 글리세롤 함유 기질을 이용하여 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)에 의해 수득된다.

따라서, 본 발명은 박테리아 균주 엔테로박터 A47 (DSM 23139)을 포함하는 미생물 배양균을 배양하는 단계 및 상기 배양균을 글리세롤을 포함하는 탄소원에 공급하는 단계를 포함하는 고분자 제조 방법을 제공한다.

1. 미생물 배양의 특성분석

본 발명의 푸코오스 함유 고분자는 슈도모나스속, 클렙시엘라속, 메틸로박테리움속, 에르위니아속, 알칼리게네스속 또는 엔테로박터속 세균(the genera Pseudomonas, Klebsiella, Methylobacterium, Erwinia, Alcaligenes or Enterobacter), 바람직하기로는 부다페스트 조약하에DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된 엔테로박터균 A47 (수탁번호 DSM 23139)에 의해 제조된다. 또한, 본 발명에서 사용된 미생물은 다른 양태, 즉 표 1, 표 2 및 도1에 각각 제시된, 생화학적 프로파일(biochemical profile), 유전자 시퀀싱(genetic sequencing) 및 계통발생학적 수지도(phylogenetic dendrogram)를 특징으로 한다.

본 발명에서 사용된 미생물은, 푸코오스 함유 고분자의 합성능을 지니고 있는 한에서는 야생 균주, 변종(variant) 또는 변이체(mutant)일 수도 있다. 여러 미생물의 순수 배양균 또는 혼합 배양균을 사용하는 것이 가능한데, 그 중에서 적어도 하나는 푸코오스 함유 고분자, 바람직하기로는 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)를 제조할 수 있다.

2. 고분자 제조를 위한 방법의 특성분석

본 발명의 고분자는 통기 교반형 수용성 배지에 있는 생물 반응기에서 제조된다. 배양 배지는 탄소원, 질소원 및 무기염을 함유한다. 선호되는 탄소원은 글리세롤 또는 글리세롤 함유 기질이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 고분자 제조방법은, 예컨대 당, 알코올 또는 유기산 또는 알케인과 같은 글리세롤의 대체물 또는 글리세롤 혼합물의 다른 탄소원은 물론, 예컨대 바이오디젤 산업에서 배출되는 글리세롤 부산물, 당밀(sugar molasses), 유장(whey) 이나 올리브 또는 오일 생산 폐기물과 같은 식품 및 산업폐기물 또는 부산물의 이용을 예견하고 있다.

푸코오스 함유 고분자 제조방법은 영양분 통기 수용성 배지(nutrient aerated aqueous medium)에 있는 미생물의 배양을 포함한다. 배양 온도는 15~45 ℃, 바람직하기로는 26~37℃에서 조절된다. Ph는 5.0~9.0, 바람직하기로는 6.5~7.0에서 조절된다.

배양 초기에, 배양 배지의 용존 산소 농도는 70% 이상에서 고정된다. 이후에, 세포 성장과 함께 용존 산소 농도는 30% 미만으로, 바람직하기로는 20% 미만으로, 가장 바람직하기로는 10% 미만으로 또는 혐기성 조건에서도 점차 감소한다. 푸코오스 함유 고분자는 질소 제한 조건하에서 0.3g/L 미만, 또는 0.2g/L 미만, 또는 0.1g/L 미만의 양으로, 또는 전술한 낮은 용존 산소 농도와 함께 질소원 없이 그리고 탄소 가용성(carbon availability) 없이 제조된다. 탄소 가용성은 배양균을 고농도의 글리세롤((>100 g/L)을 함유하는 배양 배지에 공급함으로써 보장된다. 이러한 유가 배양 단계(batch phase) 중에 상기 배지의 첨가 유동속도는 배양균의 탄소 소모와 일치되도록 조절되어야 한다.

생물 반응에서 배양 종료시 수득된 배양액은 직접, 처리과정 없이 또는 건조후에 사용될 수도 있다. 이와는 달리, 푸코오스 함유 고분자는 침전제(precipitating agent) (예: 에탄올, 아세톤)의 첨가에 의해 배양액으로부터 침전되어 원형 고분자(native polymer)를 수득할 수도 있다.

본 발명의 고분자의 추출과정은 셀 제거(예: 배양액의 원심분리) 및 그 이후의 침전제의 첨가에 의한 고분자의 침전(precipitation)으로 이루어진다. 고분자의 정제(purification)는 하나 또는 몇 가지 추가 공정(예: 투석)의 사용을 포함한다.

생물 반응기에서의 배양조건, 고분자를 추출/정제하는데 사용되는 배양시간 및 배양 절차에 따라, 공정을 통해 50 g/L의 원형 고분자 또는 20 g/L의 정제된 고분자를 수득하게 된다.

3. 고분자의 특성분석

통상적으로, 본 발명의 고분자는 그 당 조성물의 적어도 10%를 나타내는 푸코오스 함량을 갖는다. 푸코오스 함유 고분자는 그 조성물에 다른 중성당, 즉 글루코스 및 갈락토스를 가지며, 또한, 예컨대 마노스, 람노스, 아라비노스, 과당, 글루쿠론산 및/또는 글루코사민과 같은 다른 당을 미량(<5%)으로 함유할 수도 있다.

4. 고분자의 응용

본 발명의 고분자는 유화 및 응집 활성을 제공하며, 의가소성 유체 거동(pseudoplastic fluid behavior)을 갖는 고점도의 수용액을 형성하고, 다른 고분자와의 혼합시 생분해성 막을 생성한다. 따라서, 본 발명의 고분자는, 수많은 응용분야, 즉 농식품 산업, 제약학 및 화장품 산업분야에서 예컨대 크산탄, 알긴산, 캐라지난, 구아검 및 아라비아검과 같은 다른 다당류를 대체할 수도 있다. 또한, 본 발명의 고분자에 함유된 푸코오스의 존재는 의학 및 화장품 분야에서의 그 이용을 가능하게 해준다. 더욱이, 피루베이트 및 숙시네이트 잔류물의 존재는 고분자에 음이온 특성을 부여한다. 결과적으로, 본 발명의 고분자는 독성금속을 고정시킬 수 있다.

도 1은 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)의 계통발생학적 수지도를 나타낸 것이다.
도 2는 (실온에서 측정된) 푸코오스 함유 고분자의 수용액의 겉보기 점도(apparent viscosity)를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 고분자 제조를 위한 배양공정 중에 탄소원(글리세롤) 및 질소원(암모늄)의 소모, 바이오매스 및 푸코오스 함유 EPS의 생산에 대한 시간의 경과를 나타낸 것이다.

1. 미생물의 특징

푸코오스 함유 고분자는 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)의 배양에 의해 수득된다. 이 미생물은 푸코오스 함유 고분자 합성능을 지니는 한 야생 균주(strain), 변종(variant) 또는 변이체(mutant)일 수도 있다. 순수 배양균이 사용될 수도 있고, 이와는 달리, 적어도 1종의 미생물이 본 발명의 고분자를 생산할 수 있는 혼합 배양균을 사용할 수도 있다.

본 발명의 고분자를 수득하기 위해 바람직한 미생물은 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)이며 그 특성은 아래에 설명된다. 이 미생물의 생화학적 및 유전학적 특성분석은 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 의해 수행되었다.

1.1. 엔테로박터균 A47 ( DSM 23139)의 형태학적 특성분석

엔테로박터균 A47 (DSM 23139)은 다음과 같은 칫수를 갖는 막대균이다: 7~0.8m x 1.2~2.5m. 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)은 그람 음성 자유이동 세균(Gram negative motile bacterium)이다.

1.2. 엔테로박터균 A47 ( DSM 23139)의 생화학적 프로파일

엔테로박터 속을 대표하는 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)은 다음과 같은 생화학적 프로파일을 갖는다 (표 1):

: 엔테로박터균 A47 (DSM 23139)의 생화학적 프로파일 ("+" 및 "-"는 수행된 시험에 대해 각각 양성 반응 또는 음성 반응을 나타낸다)

시험	결과
3% KOH 에 의한 세포용해	+
아미노펩티다아제 (Cerny)	+
카탈라아제	+
혐기성 세균성장	+
글루코스 방출 가스	+
H₂S	-
인돌	-
메틸레드	-
분해: 제라틴 트윈 80 DNA 요소	- - - +
시트라트 (시몬)	+
말로네이트 이용	+
VP	+
ONPG	+
ADH	+
LDC	-
ODC	+
(ASS)의 산: 글루코스 과당 마노스 말토스e D-크실로오스 자당 트레할로오스 L-아라비노스 람노스 갈락토스 아도니톨 둘시톨 에리트리톨 이노시톨 글리세롤	+ + + + + + + + + + + - - - +

1.3. 엔테로박터균 A47 ( DSM 23139)의 rDNA 유전자 서열

엔테로박터균 A47 (DSM 23139)의 16S rDNA 유전자 서열(표 2)은 PCR-증폭 16S rDNA의 직접 시퀀싱에 의해 결정된다. Rainey et al (1996)에 의해 설명된 바와 같이 게놈 DNA 추출, 16S rDNA의 PCR (중합효소 연쇄반응:Polymerase Chain Reaction) 매개 증폭 및 PCT 산물의 정제과정이 수행되었다. 정제된 PCR 산물은 제조업체의 프로토콜에 제시된 바와 같은 CEQ^TMDTCS-Quick Start Kit (Beckman Coulter) 를 이용하여 시퀀싱되었다. 시퀀스 반응액은 CEQ^TM8000 유전자 분석장치를 이용하여 전기영동하였다. 최종 시퀀스 데이터는 정렬 에디터 AE2 (Maidak et al, 1999)속에 입력되어 수동으로 정렬되어 엔테로박테리아세아에 ( Enterobacteriaeceae)군에 속하는 생물의 대표적인 16S rRNA 유전자 서열과 비교되었다(Maidak et al, 1999). 비교를 위해, EMBL, RDP or DSMZ 데이터베이스로부터 16S 서열을 얻었다.

: 16S rDNA 유전자 서열of the 엔테로박터균 A47 (DSM 23139) - SEQ ID NO 1

1	TGATCCTGGC TCAGATTGAA CGCTGGCGGC AGGCCTAACA CATGCAAGTC GAACGGTAAC
61	AGGAAGCAGC TTGCTGCTTC GCTGACGAGT GGCGGACGGG TGAGTAATGT CTGGGAAACT
121	GCCTGATGGA GGGGGATAAC TACTGGAAAC GGTAGCTAAT ACCGCATAAY GTCGCAAGAC
181	CAAAGAGGGG GACCTTCGGG CCTCTTGCCA TCGGATGTGC CCAGATGGGA TTAGCTAGTA
241	GGTGGGGTAA CGGCTCACCT AGGCGACGAT CCCTAGCTGG TCTGAGAGGA TGACCAGCCA
301	CACTGGAACT GAGACACGGT CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA
361	ATGGGCGCAA GCCTGATGCA GCCATGCCGC GTGTATGAAG AAGGCCTTCG GGTTGTAAAG
421	TACTTTCAGC GGGGAGGAAG GCGATAAGGT TAATAACCTT GTCGATTGAC GTTACCCGCA
481	GAAGAAGCAC CGGCTAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGGAGGGT GCAAGCGTTA
541	ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCACGCA GGCGGTCTGT CAAGTCGGAT GTGAAATCCC
601	CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATTCGAAAC TGGCAGGCTA GAGTCTTGTA GAGGGGGGTA
661	GAATTCCAGG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG AGATCTGGAG GAATACCGGT GGCGAAGGCG
721	GCCCCCTGGA CAAAGACTGA CGCTCAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT
781	ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC GACTTGGAGG TTGTGCCCTT GAGGCGTGGC
841	TTCCGGAGCT AACGCGTTAA GTCGACCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG TTAAAACTCA
901	AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG ATGCAACGCG
961	AAGAACCTTA CCTACTCTTG ACATCCAGAG AACTTTCCAG AGATGGATTG GTGCCTTCGG
1021	GAACTCTGAG ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTTGTGAAAT GTTGGGTTAA
1081	GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATCCTTT GTTGCCAGCG GTYAGGCCGG GAACTCAAAG
1141	GAGACTGCCA GTGATAAACT GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA
1201	CGAGTAGGGC TACACACGTG CTACAATGGC GCATACAAAG AGAAGCGACC TCGCGAGAGC
1261	AAGCGGACCT CATAAAGTGC GTCGTAGTCC GGATTGGAGT CTGCAACTCG ACTCCATGAA
1321	GTCGGAATCG CTAGTAATCG TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT
1381	ACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG
1441	GGAGGGCGCT TACCACTTTG TGATTCATGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTAACCGTA
1501	GGGAACCTGC GGGCTGGATC ACC

1.4. 엔테로박터균 A47 ( DSM 23139)의 계통발생학적 수지도

엔테로박터균 A47 (DSM 23139)의 계통발생학적 수지도(phylogenetic dendrogram)는 ARB package (Pruesse et al, 2007)를 이용하여 작성되었다. 계통발생수(phylogenetic tree)는, 진화 거리값(evolutionary distance values)에 기초하여, Saitou e Nei 보정 (1987)을 이용하 근린 결합법(neighbor-joining method)(Jukes and Cantor, 1969)에 의해 작성되었다. 이 계통발생수의 뿌리는 폐렴간균의 16S rRNA 유전자 서열을 분석에 포함시켜 결정되었다. 계통발생학적 수지도 아래의 스케일바(scale bar)는 100개의 뉴클리오티드당 1개의 뉴클리오티드 치환을 나타낸다.

엔테로박터균 A47 (DSM 23139)의 16S rRNA 유전자 서열은 엔테로박터 피리누스(Enterobacter pyrinus)(98.3%), 엔테로박터 호르마에체이(Enterobacter hormaechei)(99.0%) 및 엔테로박터 아스부리아에(Enterobacter asburiae)(98.9%)와 가장 높은 유사성(similarity)을 보여준다. 공지된 종(species) 중에서 소정의 미생물을 동정하기 위한 기준은 공지된 종의 타입 균주와 적어도 >90% 또는 이상적으로는 >99.5% 의 유사성을 갖는 것으로 정의된다(Janda and Abbott, 2007)..

이러한 사실을 고려하여, 본 발명의 고분자를 제조하기위한 방법에서 사용될 미생물 배양균은, 유전자 조작, 돌연변이, 변이에 의해 또는 자연에서 직접 수득되는, 표 2에 따른 서열번호 1 DA 엔테로박터 A47 (DSM 23139)과 적어도 99.0±0.5% 의 유사성을 공유하는 미생물이라면 충분히 가능하다.

2. 고분자 제조방법의 특성분석

본 발명의 고분자는 통기 교반형 생물 반응기에서 pH 및 온도를 조절하면서 제조된다. 고분자 제조방법은 탄소원, 질소원 및 무기염을 함유하는 영양분 수용성 배지에서 미생물의 접종에 의해 개시된다. 이 방법은 초기 회분배양 단계(initial batch phase)와, 그 후속 단계로서 무기물 배지가 생물 반응기내에 투입되는 유가배양 단계(fed-batch phase)를 포함한다.

2.1 배양 배지

푸코오스 함유 고분자의 제조를 위한 배양 배지는 탄소원, 질소원 및 무기염을 함유하는 영양분 수용성 배치로 구성된다.

2.1.1 탄소원

바람직한 탄소원은 글리세롤 및 글리세롤 함유 혼합물이다. 이와는 달리, 탄소원은 단량체 당, 이량체 당 또는 올리고머 당monomeric, dimeric or olygomeric sugar), 알코올, 유기산, 알케인 또는 2종 이상의 바람직한 화합물을 포함하는 혼합물일 수도 있다.

또한, 탄소원은 예컨대, 바이오디젤 산업에서 나오는 글리세롤 부산물, 당밀, 유장이나 올리브 오일 또는 폐기물과 같은 전술한 1종 이상의 바람직한 화합물을 함유하는 식품 또는 산업 폐기물이나 부산물일 수도 있다.

바이오디젤 산업에서 나오는 글리세롤 부산물은 산업공정에서 나오는 다른 여러 가지 오염물질들(예: NaOH, 지방오일, 일부 에스테르, 유황 단백질 및 광물)이 외에도, 주로 비순수 글리세롤과 가변양의 메탄올(5~50%)으로 구성된다. 당밀은 당류(자당, 글루코스 및 과장)에 풍부한 당 정제 부산물이다. 유장은 주로 락토오스에 의해 구성되는 치즈 산업의 부산물이다. 올리브 오일 또는 폐기물의 유기성분은 당, 탄닌, 폴리페놀, 다가 올코올, 펙틴 및 지질을 포함한다. 조성물에 당, 알코올, 유기산 및/또는 지질을 함유하는 다른 식품이나 산업 폐기물 및 부산물이 미생물 배양 및 푸코오스 함유 고분자 제조를 위한 기질로서 사용될 수도 있다. 본 발명에 따른 푸코오스 함유 고분자 제조방법에서, 탄소원은 회분배양 단계 중에 세포성장을 위해 충분한 공급을 위해 2~10% (w/v)의 수용성 영양 배지를 제공해야 한다. 후속되는 유가배양 단계 중에, 탄소원은 고분자 합성을 위한 탄소 가용성을 보장하기 위해 0.1% (p/v)이상에서, 바람직하기로는 0.5 (p/v) 이상에 유지되어야 한다.

2.1.2. 질소원

미생물 배양을 위한 질소원은 무기염 (예: (NH₄)₂HPO₄, NH₄OH, (NH₄)₂SO₄, NH₄Cl) 또는 유기 질소 화합물 (예: 요소, 아미노산), 이의 혼합물 또는 질소 화합물 (예: 콩가루, 효모 추출물, 밀기울)을 함유하는 식품이나 산업폐기물 또는 부산물일 수도 있다.

푸코오스 함유 고분자 제조방법에서, 질소원은 회분배양 단계 중에 세포 성장을 보장하기 위해 초기농도가 0.6~3.0 g/L이 되도록 해야 한다. 후속하여 유가배양 단계 중에, 질소원은 0.3 g/L 미만에서, 바람직하기로는 0.1 g/L 미만에서 유지되어 질소 제한을 야기시켜야 한다. 따라서, 회분배양 중에, 세포 성장은 탄소 가용성과 함께 질소제한에 의해 한정되거나 제한되고, 포코오스 함유고분자의 합성을 유도하게 된다.

2.1.3. 무기염

또한, 배양 배지는 금속 양이온, 즉 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 철, 망간, 코발트, 구리 및 아연을 미량 포함한다. 이들 금속 양이온의 각각은 0.001~100 mM의 농도로 배양 배지에 존재해야 하지만, 나트륨은 특히 pH 조절을 위해 많은 양으로 존재할 수도 있다.

2.2 배양조건

생물 반응기 배양은 전술한 수용성 영양 배지에서 미생물의 접종에 의해 개시되고 압축공기로 통기된다. 접종물의 부피는 배양 초기에 전체 반응배지의 10~30%가 되어야 한다.

배양을통해, 온도는 15~ 45℃, 바람직하기로는 26~37℃로 조절되고, pH는 5.0~9.0, 바람직하기로는 6.5~7.0으로 조절된다.

용존 산소 농도는 배양 초기에 높고(>70%), 셀 성장과 함께 회분배양 단계 중에 점차 감소한다. 유가배양 단계 중에, 용존 산소 농도는 30% 미만에서, 바람직하기로는 10% 미만에서 조절되거나 혐기성 조건하에서도 조절된다. 공기 유속은 0.1~2.0 vvm에서 일정하게 유지될 수도 있고, 용존 산소 농도는 0~2,000 rmp에서, 바람직하기로는 400~800rpm에서의 교반속도의 자동 변화를 통해 조절된다. 이와는 달리, 공기 유속은 배양과정 내내 0~2.0 vvm에서 변화할 수 있는 한편, 교반속도는 일정하게 유지된다. 또한, 유가배양 단계에서의 용존 산소 농도는 기질 첨가에 의해 조절될 수도 있다. 이 경우, 교반속도 및 공기유속은 각각 0~1,000 rpm과 0~2.0 vv에서 일정하게 유지될 수도 있다.

고분자 합성은 회분배양 단계중에 개시되지만, 주로 유가배양 단계 즈ㅜㅇ에 발생하는데, 이때 세포 성장은 생물 반응기에 부가된 질소 제한으로 인해 저하된다. 유가배양 단계중에, 영양분 배지가 생물 반응기 내부에 투입되어 탄소 가용성 및 질소 제한의 조건을 만들어 준다. 이 배양 단계에서의 질소 농도는 0.3 g N/L 미만에서, 바람직하기로는 0.1 g N/L 미만에서 유지된다. 이러한 조건하에서는, 세포 성장이 제한되고 고분자는 탄소가 배양균의 소모와 일치하도록 이용가능한 한은 생산된다.

생물 반응기내에서의 고분자 합성은 4~7일 동안 또는 배양액이 너무 끈적거려 더 이상 산소, 온도 및 영양분의 일정한 분포를 유지하는 것이 불가능해질 때까지 수행될 수도 있다. 이러한 상황은 배양액의 겉보기 점도가 약 2.0 Pa.s (5 s^-1의 전단 속도로 30℃에서 측정됨)에 도달할 때 발생한다.

이와는 달리, 본 발명의 고분자의 제조공정은 연속 배양 공정 또는 반복적인 유가 배양 공정으로 유지될 수도 있다. 연속 배양 공정의 경우, 영양분 배지는 생물 반응기 내부로 연속하여 투입되는 한편, 고분자 함유 배양액은 연속하여 제거된다. 반복적인 유가 배양 공정의 경우, 전술한 생물 반응기 동작모드(초기 회분배양단계, 및 이에 후속되는 유가배양 단계)는 주기적으로 반복수행된다. 배양액 부피의 약 10~30%는 생물 반응기내에 잔류하여 다음번 사이클을 위한 접종물 역할을 한다. 이들 두 가지 생물 반응기 동작모드는, 비생산 기간, 즉 새로운 접종물 및 생물 반응기 준비 시간이 제거되기 때문에 공정의 최적화를 가능하게 한다.

2.2 배양 산물의 추출 및 정제

배양 종료시 수득된 배양액은 임의 공정없이 직접 사용될 수도 있다. 이와는 달리, 배양액을 80℃의 온도에서 또는 동결 건조에 의해 건조시킴으로써 생고분자(raw polymer)를 수득할 수도 있다.

이와는 달리, 바람직하기로는 침전(precipitation)에 의해 배양 종료시 배양액으로부터 천연형태의 고분자를 회수할 수도 있다. 여기서, 침전은 예컨대, 알코올(예: 에탄올, 이소프로판올) 또는 케톤(예: 아세톤)과 같이 고분자가 녹지 않는 물 혼화성 용매(water miscible solvent)의 첨가에 의해 달성될 수도 있다. 푸코오스 함유 고분자는 배양액의 매 리터당 1~3부피의 침전제를 첨가하여 침전된다. 고분자는 침전제에 용해되지 않는 세포, 단백질, 염 및 다른 배양액 성분과 함께 공침(co-precipitation)된다. 침전된 고분자는 80℃의 온도에서 건조되거나 동결 건조될 수도 있다. 이러한 원형 고분자는 물론, 배양액 및 전술한 생고분자는 예컨대, 폐수처리 또는 동물사료와 같은 분야에서 사용될 수도 있다.

또 다른 추출 공정에서, 본 발명의 고분자는 원심분리(10,000~20,000 rpm, 30~60분간)에 후속한 침전제(배양액의 매 리터당 침전제 1~3 리터)의 첨가에 의한 세포 제거를 포함하는 공정에서 부분적으로 정제될 수도 있다. 침전제는 위에서 언급한 용매 (예: 에탄올, 이소프로판올, 아세톤)중 어느 것이든 가능하다.

배양액은 배양 종료시에는 점도가 높아짐에 따라 원심분리 이전에 배양액을 희석(배양액의 매 리터당 탈이온수 1~4 리터 첨가함)함으로써 세포 분리가 용이해 진다. 침전된 고분자는 80℃의 온도에서 건조되거나 동결 건조될 수도 있다. 이러한 반정제된 고분자는, 예컨대 특히, 농식품, 화장품, 종이, 도료 또는 오일산업과 같은 다양한 분야에서 사용가능하다.

순수 고분자는 다음과 같은 방법들 중 한 가지 이상의 방법을 부가적으로 이용하여 수득될 수도 있다:

1) 희석된 반정제된 고분자 수용액(0.1~ 5.0 g/L)으로부터 고분자를 재침전하고, 수행된 재침전 회수에 따라 고분자의 순도가 증가함;

2) 서로 다른 침전제, 즉 에탄올, 아세톤 및/또는 이소프로판올 또는 이의 혼합물을 이용하여 순차적으로 침전함으로써, 각각의 용매에 용해가능한 상이한 오염물질의 제거를 촉진함;

3) 반정제된 고분자를 고분자가 녹지 않지만 1종 이상의 오염물질을 용해시키는 용매(예; 헥산)로 세척함;

4) 단백질 분해효소(예: 트립신)의 이용, 단백질 침전제(예: 트라이클로로아세트산)의 첨가 또는 60~80℃의 온도로 가열에 의한 단백질 풍부 물질의 변성;

5) 반정제된 고분자 용액의 농도 (0.1~5.0 g/L)를 감소시키면서 이 고분자 용액에 투석, 한외여과 또는 정용여과를 수행하여, 결과적으로 고분자량의 고분자가 모든 저분자량 오염물질로부터 분리됨에 따라 고순도의 고분자를 수득함.

이들 과정으로 수득된 순수 고분자는 80℃의 온도에서 건조되거나 동결 건조될 수도 있다. 이러한 고분자의 고순도로 인하여 특히, 식품, 제약학 및 화장품 산업에서의 그 이용이 가능하다.

상기 바람직한 방법들의 몇 가지 상이한 조합을 이용하여 순도 및 의도한 특정 응용분야에 따라 푸코오스 함유 고분자를 추출/정제할 수도 있다.

3. 고분자 특성분석

3.1 조성물

본 발명의 고분자는 고분자량의 다당류(10⁶~10⁷)로 구성되고, 이 다당류는 전체 당 함량의 적어도 10%인 푸코오스를 포함한다. 또한, 이 고분자는 글루코스 및 갈락토스 (각각 전체 당 함량의 20~70% 및 10~40%임)에 의해 구성된다. 고분자에서 바람직한 당(sugars)과 푸코오스, 갈락토스 및 글루코스의 상대적인 화학적 조성은 배양시간 및 생물 반응기 동작조건에 좌우된다.

또한, 본 발명의 고분자는 마노스, 람노스, 크실로오스, 리보오스, 아라비노스, 글루쿠론산 및/또는 글루코사민과 같은 중성당(neutral sugars)을 소량으로 포함할 수도 있다.

언급된 고분자는 비당 성분(non-sugar components), 즉 고분자의 건 중량의 25%를 차지하는 아실 화합물을 포함한다. 검출된 주요 아실 화합물은 숙시네이트, 피루베이트 및 아세테이트였다.

일반적으로, 아세테이트 및 피루베이트는 고분자의 건 중량의 0.5~5%인 반면, 숙시네이트는 통상 1~20%로서 상대적으로 함량이 높다. 각각의 아실기를 고려해 볼 때, 본 발명의 고분자의 조성은 반응기 동작조건 및 배양 시간에 좌우된다. 피루베이트 및 숙시네이트 잔류물의 존재는 고분자에게 음이온 특성을 부여한다. 그 결과, 독성 금속을 고정화시킬 수 있어, 오염된 고체 및 물로부터 독성 금속(중금속 및 방사성뉴클리오티드)을 제거하는데 적용시킬 수 있다.

추출/정제 방법에 따라, 수득된 고분자는 푸코오스 함유 고분자이 외에도 배양액에 존재하는 다른 성분, 즉 단백질 및 무기 화합물을 함유할 수도 있다. 이들 성분의 최대 함량은 원형 고분자(단백질의 15-30% 및 무기 화합물의 25-40%)에서 검출된 반면, 최소 함량(<1%)은 투석에 의해 수득된 정제된 고분자에서 검출되었다.

3.2 고분자 평균 분자량

겔 침투 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography)에 의해 결정된 정제된 고분자의 평균 분자량은 10⁶~10⁷이다. 통상적으로, 미생물 성장 단계 중에 고분자 제조가 개시되면, 고분자의 평균 분자량은 약 10⁵이 되는데, 이는 배양 중에 시간의 경과에 따라 비교적 일정한 값인 10⁶~10⁷으로 증가하게 된다.

3.3 고분자의 특성

3.3.1 용해성( Solubility )

본 발명의 고분자는 환경온도에서, 특히 아세톤, 이소프로판올, DMSO, 헥산, 디에틸에테르, 크실렌 및테트라클로로에틸렌을 포함하는 다양한 유기용매에서 용해되지 않는다. 고분자의 이러한 특성으로 인해, 분리공정에서 사용될 용매 저항 막(solvent resistant membranes)의 제조시 응용할 수 있는 가능성이 열리고 있다. 그러나, 고분자는 일부 유기용매, 테트라클로로에탄에는 용해가능한 것으로 관찰되었다.

본 발명의 고분자는, 이들 용매에 노출된 후 당 구성성분과 아실기를 고려하여 그 조성을 유지하면서 시험을 거친 유기용매와 안정적으로 접촉한다.

3.3.2. 고분자 수용액의 점도

본 발명의 고분자와 함께 준비된 수용액은 의가소성 유체 거동(pseudoplastic fluid behaviour)(도 2)을 나타내는 뉴턴 유체가 아니다. 0.8% (w/v) 고분자 용액의 겉보기 점도는 5 s^- ¹ 의 전단 속도와 25℃에서 0.21 Pa.s로 측정되고, 500 s^- ¹ 의 전단 속도에서는 0.02 Pa.s로 감소되었다. 점도는 전단 속도의 감소시 즉시 복구되기 때문에, 히스테리시스 현상(hysteresis phenomena)이 관찰되지 않는다. 고분자 용액의 의가소성 유체 거동은, 주로 식품, 제약학 및 화장품 산업에 고분자에 수성 시스템의 물성을 개질시키는 능력은 물론, 점증제 및 직물 증강제로서의 응용 잠재력을 부여한다.

고분자 수용액의 겉보기 점도는 온도 증가에 따라 감소하지만, 의가소성 유체 거동은 유지된다. 5 s^- ¹ 의 전단 속도에서 측정된 0.8% (w/v) 고분자 용액의 겉보기 점도는 15℃에서 0.32 Pa.s 였다가 65℃에서는 0.05 Pa.s 로 감소하였다.

연속적인 가열 및 냉각 단계 사이클을 수행하면서 순차 가열 및 냉각 단계가 정제 EPS 용액의 동적 및 정상유동 특성dynamic and steady-shear properties)에 미치는 영향에 대해 연구하였다. 25℃에서 기계적 스펙트럼 및 정상상태 데이터(steady-state data)를 기록한 후, 동일 시료를 40℃, 55℃, 70℃ 및 80℃까지 가열하였다. 매 사이클 종료시 25℃에서 기록된, 겉보기 점도 및 동적 탄성계수(dynamic moduli)(G' 및 G")는 실제로 일치하는 것으로 관찰되었다. 이러한 관찰로부터, 우리는 고분자 시료가 80℃의 온도증가에 노출된 후 25℃에서 연속 발진 및 정상상태 시험(consecutive oscillatory and steady-state tests)에서 그 특성을유지하면서 온도변도 하에서도 상당히 안정적이라고 결론지을 수 있다. 이들 특성은 우리로 하여금 고분자가 처리공정 중에 온도변동을 거치는 수성제제(예: 식품류)에 사용될 수 있음을 상정하게 한다.

점탄성 특성과 관련하여, 푸코오스를 함유한 고분자의 수용액은 점성 액체(연구된 전체 주파수 범위에서 G">G')의 거동을 보여준다. 시험된 조건하에서는 어떠한 겔 형성도 검출되지 않았다.

3.3.3. 유화 활성

본 발명의 고분자는 유화 활성(Emulsifyign activity)을 지니는데, 이것은 오일 (예: 올리브 오일, 파라핀) 및 탄화수소 (예: 헥산, 톨루엔)과 같은, 소수성 화합물의 액적의 유탁액(emulsions of water droplets)을 안정화시킬 수 있다는 것을 의미한다. 이로써. 고분자는 생물 유화제(bioemulsifier) 및 안정화제로서 사용될 수 있고, 석유,세제, 직물,종이, 도료, 화장품, 제약학 및 식품 산업에서와 같이 폭넓은 응용분야에서 합성 유화제를 대체할 수 있는 잠재력을 갖고 있다.

유화 활성은 정제된 고분자에 제한되지 않는다. 다른 형태, 즉 생고분자, 원형 고분자 및 반정제된 고분자는 소수성 화합물에서 물의 유탁액를 안정화시키는 능력을 보여주었다. 이러한 능력은 여러 종의 탄화수소 (예: 헥사데칸, 헥산, 톨루엔 및 크실렌) 및 오일 (올리브 오일 및 파라핀)와의 혼합시 0.05~0.5%의 농도가 되는 본 발명의 고분자 용액을 이용하여 검증하였다. 형성된 유탁액은 몇 주 동안 상당히 안정적이었다. 더욱이, 유탁액은 환경온도에서 40, 50, 60 및 100℃까지의 가열에 저항하면서 온도에 매우 안정적이라는 것을 보여주었다.

3.3.4.응집 활성

본 발명의 고분자는 중요한 응집 활성(flocculating activity)을 제시하며, 천연 생물 응집제(bioflocculant agent)로서 사용될 수 있다. 응집제는 세포 및 콜로이드 응집의 촉진에 유용하고, 폐기물 및 음용수 처리 및 식품류와 같은 산업분야에서 널리 사용되고 있다. 본 발명의 고분자의 생분해성 및 안전성은 인체 건강에 위험하고 환경에서의 분해가 어려운 합성 응집제에 비해 장점을 제공한다

환경온도 및 중성 pH에서, 본 발명의 고분자의 응집 활성은 고분자 농도가 0.1% (w/v) 에서 0.8% (w/v)로 증가함에 따라 70%에서 60%로 감소한다. 이러한 응집 활성은 상용되는 다당류, 즉 크산탄, 알긴산, 구아검 및 카르복시메틸셀루로오스의 응집 활성과 비교되었다. 본 발명의 고분자는 동일한 고분자 농도에 대해 상용제품과 유사한 성능을 지니는 양호한 응집제로 밝혀졌다.

3,3,5. 생분해성 막의 제조

푸코오스를 함유하는 고분자는 전분, 펙틴 알긴산, 캐라지난, 글루텐, 젤란 및 키토산과 같은 다른 생체 고분자와 혼합하여 생분해성 복합막(biopolymer composite films)을 제조하는데 사용될 수도 있다. 이들 생분해성 복합막은 유기용매 처리 및 포장재에서 막(membrane)으로서 응용될 수 있다.

키토산, 전분 및 구아검과 같은 다당류는 약물 방출 제어용 미세구의 제조시 시험을 거쳤다. 본 발명의 고분자는 이러한 목적을 위해서는 물론, 단독으로 또는 다른 생체 고분자와 혼합되어 사용될 수도 있다.

4. 본 발명의 고분자의 응용

본 발명의 고분자는 유화 및 응집 활성을 제시하며, 의가소성 유체 거등을 갖는 고점도 수용액을 형성한다. 결과적으로, 이 고분자는 크산탄, 알긴산, 구아검 및 아라비아검과 같은 다당류를 다양한 응용분야에서, 즉 식품, 제약학 및 화장품 산업분야에서 점증제, 직물 증강제 또는 결합제로서 치환할 수 있다.

푸코오스 함유 고분자는 전분, 펙틴 알긴산, 캐라지난, 글루텐, 젤란 및 키토산과 같은 다른 생체 고분자와 혼합하여 생분해성 복합막(biopolymer composite films)을 제조하는데 사용될 수도 있다. 이들 생분해성 복합막은 낮은 기체 (산소 및 이산화탄소) 투과도로 인해 유기용매 처리(예: 투과기화법에 의한 용매 탈수) 및 식품류 포장과 같은 포장재에서 막(membrane)으로서 응용될 수 있다.

또한, 푸코오스 함유 고분자는 물리적 처리 (예: 마이크로웨이브, 열, 복사 및 초음파 처리), 화학공정 (예: 산성 가수분해), 효소 처리 (예: 히드롤라아제 및 리아제를 이용함) 또는 생물학적 공정 (푸코오스를 제외하고 고분자를 분해할 수 있는 세균제를 이용하고 모든 당을 탄소원으로 이용함)을 적용함으로써 원시 고분자로부터 수득된 올리고당원(source of oligosaccharides)으로서 사용될 수도 있다. 더욱이, 분리되거나 함께 혼합되는 원시 고분자는 물론, 수득된 푸코오스 및 푸코-올리고당은 항암제 및 항염증제로서 의료 분야에서, 류머티즘성 관절염의치료시 커다란 잠재력을 갖고 있다(Vanhooren e Vandamme, 1999; Peterszegi et al, 2003b). 더욱이, 본 발명의 고분자는 푸코오스가 조성물에 존재함으로써 수화 및 항노화 첨가제(hydrating and anti-ageing additive)로서 화장품에 사용될 수 있는 큰 잠재력을 지니고 있다(Peterszegi et al, 2003a).

실시예

실시예 1: 바이오디젤 산업으로부터의 글리세롤 부산물을 이용하여 엔테로박터균 A47 ( DSM 23139)의 배양에 의한 푸코오스 함유 고분자의 제조

엔테로박터 A47 (DSM 23139)의 배양균을 표 3에 도시된 조성으로 8L의 배양 배지에 접종하였다. 생물 반응기(BioStat B-plus, Sartorius)는 다음과 같은 조건하에서 가동시켰다: 조절온도는 30℃; 조절 pH는 6.80±0.05; 자동 첨가량은 NaOH 1M; 일정한 통기속도는 1.6 L/min (0.2 vvm)). 미생물 성장이 일어남에 따라, 용해 산호의 농도는 배양 초기 80% 포화수준에서 하루 경과 후 약 20%로 감소하였다.

그 순간 이후, (약 20 mL/h의) 연속 공급 배지가 반응기 내부에 투입되었다. 그 조성은 표 3에 제시되었으나, 글리세롤 농도(200 g/L)의 차이가 있었다 이들 동작조건은 발효액의 질소 농도를 제한(0.1 g N/L 미만)하였고 이와 동시에 탄소원의 양호한 가용성을 허용하였다.

: 배양 배지의 조성

성분	농도
글리세롤 병산물 K₂HPO₄ KH₂PO₄ (NH₄)₂HPO₄ 무기물 용액⁽¹⁾ MgSO₄ 100 mM	25 g/L 5.8 g/L 3.7 g/L 3.3 g/L 1.0 mL/L 10 mL/L
⁽¹⁾무기물 용액의 조성(HCl 1N의 1 리터 기준): FeSO₄ ^.7H₂O, 2.78 g; MnCl₂ ^.4H₂O, 1.98 g; CoSO₄ ^.7H₂O, 2.81 g; CaCl₂ ^.2H₂O, 1.67 g; CuCl₂ ^.2H₂O, 0.17 g; ZnSO₄ ^.7H₂O, 0.29 g)

용존 산소 농도는 배양 2일 째 되는 날에 도달한 값인 10% 포화수준으로 점치 감소하였다. 이때, 용존 산소 농도는 교반 속도를 400~800 rpm의 범위에서 자동으로 변화시켜 10% 미만으로 조절하였다. 이러한 조건하에서 하루 경과 후,발효액의 점도는 신속하게 증가하였고, 이는 고분자 제조와 관련이 있었다.

배양 4일째 되는 마지막 날에 고분자 농도는 거의 13.3 g/L이었는데, 이는 고분자가 반정제 형태로 추출되고 정량화되었음을 의미한다(도 3). 배양액의 점도는 4일과 7일 사이에 크게 증가하였으나, 고분자 생산은 중지되었다. 고분자 생산이 일어나는 기간 (1일~4일)을 고려하면, 생산성은 3.6 g L^-1 day^-1에 이르렀고, 글리세롤의 수율은 0.47 g g^-1이었다.

배양 진행은 7일 째되는 날에 중지되었고, 이때 발효액의 점도는 전단 속도가 5 s^-1이고 T=30℃일 때 3.0 Pa.s에 도달하였다.

실시예 2: 엔테로박터 A47 ( DSM 23139)에 의해 글리세롤 부산물로부터 제조된 푸코오스 함유 고분자의 추출 및 정제

실시예 1에서 설명된 배양 진행 종료시, 푸코오스 함유 고분자를 발효액으로부터 다양한 순수등급의 서로 다른 세 가지 제품, 즉 원형 고분자, 반정제된 고분자 및 정제된 고분자의 형태로 회수하였다.

원형 고분자는 발효액에 아세톤을 직접 첨가(3:1)하여 수득하였다. 원형 고분자의 농도는 20.6 g/L이었다.

반정제된 고분자를 수득하기 위해, 발효액은 먼저 희석(2L의 탈이온수 대 1L의 발효액)하여 점도를 감소시킨 다음, 바이오매스를 원심분리(20,000 rpm, 30분)에 의해 분리하였다. 그런 다음, 가볍게 교반하면서 무세포 상등액(cell-free supernatant)를 아세톤(1:3)에 천천히 첨가하여 고분자의 침전을 촉진하였다. 침전물은 탈이온수에 용해시켜 동결 건조하였다. 반정제된 고분자의 농도는 11.6 g/L였다.

정제된 고분자를 수득하기 위해, 반정제된 고분자의 수용액은 3500 MWCO 막(SnakeSkinTM Pleated Dialysis Tubing 68035 - Thermo Scientific)을 이용하여 24 시간 동안 탈이온수와 접촉시키면서 투석에 의해 처리하였다. 고분자의 미생물 분해를 방지하기 위해 아지화나트륨을 첨가(6 ppm)하였다. 그런 다음, 아세톤을 첨가하여 고분자를 첨전시키고 물속에서 재용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 정제된 고분자의 농도는 5.5 g/L였다.

대안의 방법으로서, 고분자를 다음과 같은 방법에 의해 추출/정제시킬 수도있다: 발효액의 희석 및 원심분리에 의한 바이오매스의 분리; 고분자의 부분적인 분해에 의해 야기될 수 있는 상등액에 존재하는 효소의 비활성화를 위해 1 시간 동안 60℃에서의 가열; 탈이온수와의 접촉을 통한 상등액의 투석 및 최종 동결 건조. 이러한 방법을 통해, 5.0 g/L의 정제된 고분자가 회수되었다.

실시예 3. 엔테로박터 A47 ( DSM 23139)에 의해 제조된 푸코오스 함유 고분자의 화학적 분석

실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조되고 실시예 2에서 설명된 바와 같이 추출된 고분자는 Freitas 등의 특허(2009)에 개시된 방법을 이용함에 따라 그 화학적 조성, 즉 그 당 조성에 대해 아실 화합물의 함량 및 비당 잔류물(non-sugar residues)(단백질 및 재)의 양에 그 특징이 있다. 모든 고분자 순도등급(투석에 의한 원형, 반정제 및 정제 고분자)의 화학적 조성은 배양 진행 중 시간의 경과에 따라 분석하였다. 배양한 후 1일 째 되던 날, 고분자는 글루코스(77%)와 갈락토스(15%)를 주성분으로 하고 푸코오스(6%)를 적은 양으로 함유하여 구성하였다. 배양이 진행됨에 따라, 이들 당의 단량체들의 상대적 비율이 크게 변화되었다: 글루코스 함량은 배양 4일 째 되는 날 40%로 점차 감소하였고, 갈락토스와 푸코오스의 상대적인 함량은 26% 및 28%로 각각 증가하였다.

당의 조성은 가동한 지 마지막 3일에는 실제로 일정하였다 (글루코스, 40-44%; 푸코오스, 26-30%; 갈락토스, 28-29%).

또한, 시간의 경과 따른 아실 화합물의 상대적 비율의 변화가 다음과 같이 관찰되었다: 배양 1일 째 날에 2.4% 숙시네이트, 0.2% 피루베이트 및 0.3% 아세테이트에서 배양 4일 째 날에는 20% 숙시네이트, 2.4% 피루베이트 및 2.0% 아세테이트로 변화하였다. 이후에, 배양 7일 째 날에는 피루베이트(4.9%) 및 아세테이트(3.6%)의 ℃증가와 함께 숙시네이트 함량이 3.9%로 감소된 것이 관찰되었다.

당과 아실 화합물 성분의 조성은 순도등급이 서로 다른 고분자들과 유사하다. 단백질과 재의 경우에는 동일하지 않다. 이들 성분의 함량은 원형 고분자에서 반정제된 고분자로 감소되고 반정제된 고분자에서 정제된 고분자로 감소된다.

실시예 4: 서로 다른 온도와 pH 하에서 바이오디젤 산업으로부터의 글리세롤 부산물을 이용하여 엔테로박터균 A47 ( DSM 23139)의 배양에 의한 푸코오스 함유 고분자의 제조

배양균인 엔테로박터 A47 (DSM 23139)는 표 4에 따라 서로 다른 값으로 조절된 온도와 pH를 제외하고 실시예 1에서 설명된 바와 같은 2L 생물 반응기에서 배양하였다. 매 배양 종료시에는 실시예 2에서 설명된 것과 같이 고분자를 회수하였다.

: 온도 및 pH의 시험값

	온도(℃)	pH	μ (h^-1)	X_max (g/L)	EPS_max (g/L)	r_p (g/L.d)	YP/S (g.g^-1)
1	30.0	7.0	0.30	7.14	8.37	5.00	0.17
2	30.0	7.0	0.32	7.58	10.13	4.94	0.21
3	20.0	6.0	0.14	7.41	0.82	0.19	0.01
4	40.0	6.0	0.34	9.20	2.59	0.81	0.03
5	20.0	8.0	0.13	8.39	4.40	2.54	0.10
6	40.0	8.0	0.22	5.63	1.62	1.34	0.04
7	15.9	7.0	0.08	8.17	1.12	0.33	0.02
8	44.1	7.0	----	0.21	0.23	0.06	0.02
9	30.0	5.6	0.10	10.62	7.50	2.05	0.09
10	30.0	8.4	0.07	3.01	2.67	2.38	0.09

세포 성장, 고분자 생산 및 생산성을 극대화시키는 조건은, 온도가 25~34℃이고, pH는 6.5~7.5에서 조절되는 것으로 확인되었다(표 5). 또한, 이들 온도 및 pH 범위 내에서, 푸코오스의 고분자 함량이 최대였다. 이들 범위 밖에서는, 예컨데 글루코스 함량(>50%)의 증가와 함께 푸코오스 함량(<14%)의 감소 및 새로운 단량체(예: 람노스 및 글루코사민)를 주성분(각각 20% 및 10%)으로서 첨가하는 것과 같이, 배양균이 서로 다른 조성을 갖는 고분자들을 합성시켰다. 또한, 이들 고분자에서 15%의 함량을 갖는 글루쿠론산이 검출되었다. 아실 화합물 함량은 배양 중 온도 및 pH에 의해 영향을 받아 고분자의 건 중량의 10% 미만의 수준으로 감소하였다.

DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)

DSM23139

20091120

Claims

푸코오스 함유 다당류를 포함하는 고분자를 제조하는 방법으로서,
상기 고분자는 글리세롤 또는 글리세롤 함유 혼합물을 탄소원으로서 이용하여 수탁번호 DSM 23139인 엔테로박터균 A47 을 배양하여 수득되며, 상기 방법은,
- 통기 교반형 생물 반응기 내 배양 배지에서 엔테로박터균 A47을 배양하는 것을 포함하는 회분식 배양 단계로서, 상기 배양 배지는 글리세롤 또는 글리세롤 함유 혼합물을 포함하는 탄소원, 질소원 및 무기염을 포함하고, 초기 용존 산소 농도가 70% 이상인, 단계; 및
- 탄소 가용성(carbon availability) 및 질소 제한 조건 하에서 엔테로박터균 A47을 배양하는 것을 포함하는 유가식 배양 단계로서, 질소원이 0.1g/L 미만으로 제한되고, 탄소원이 미생물 소모율과 일치하도록 공급되고, 용존 산소 농도가 30% 미만으로 조절되는, 단계를 포함하고,
상기 회분식 배양 단계 및 유가식 배양 단계의 온도는 15~45℃이고, 상기 회분식 배양 단계 및 유가식 배양 단계의 pH는 5.0~9.0 이고,
상기 유가식 배양 단계의 종료시 배양 배지가 최대 80℃의 온도에서 건조되거나 동결 건조되거나, 또는 상기 유가식 배양 단계의 종료시 배양 배지로부터 엔테로박터균 A47가 제거되고 배양 배지의 각 부피당 침전제 1~3 부피를 첨가하여 무세포 상등액(cell-free supernatant) 내 고분자가 침전되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, 유가식 배양 단계 중에 무기물 배지가 생물 반응기 내부에 투입되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 고분자는 투석, 한외여과 또는 정용여과 기법에 의해 추가로 정제되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 수탁번호 DSM 23139인 엔테로박터균 A47이 배양초기에 전체 반응 배지의 10~30%의 부피로 배지에 접종되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 탄소원이 식품 또는 산업 폐기물 또는 부산물인 방법.
제1항에 있어서, 상기 탄소원이 회분식 배양 단계 중에는 배양 배지의 2~10% (w/v)이고, 유가식 배양 단계에서는 0.1%(w/v) 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 질소원이 회분식 배양 단계 중에는 0.6~3.0 g/L의 초기 농도를 가지며, 유가식 배양 단계에서는 0.3 g/L 미만인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자는 10⁶~10⁷의 평균 분자량을 가지고, 상기 고분자는 전체 탄수화물 함량의 적어도 10%의 푸코오스 및 고분자 건 중량의 최대 25%의 아실 화합물을 포함하는 것인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 아실 화합물이 숙시네이트, 피루베이트 및 아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 고분자는 전체 탄수화물 함량에 대해 20% ~70%의 글루코스, 전체 탄수화물 함량에 대해 10%~40%의 갈락토스, 및 전체 탄수화물 함량에 대해 최대 15%의 글루쿠론산을 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 숙시네이트는 고분자의 건 중량에 대해 최대 20%이고, 상기 피루베이트는 고분자의 건 중량에 대해 최대 5%이고, 상기 아세테이트는 고분자의 건 중량에 대해 최대 5%인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 고분자가 최대 80℃의 온도, pH 3~10 및 최대 20% NaCl의 이온 세기 하에서 안정된 점도를 갖고 수용성 배지에서 의가소성 유체 거동(pseudoplastic fluid behavior)을 갖는 것인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 고분자가 유기용매에서 불용성(insoluble)인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 고분자가 소수성 화합물에 대해 유탁액 형성 및 안정화 능력을 가지며 최대 100℃로의 온도 가열에 대해 유화 안정성이 있는 고분자인, 방법.
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