BR112012014626B1

BR112012014626B1 - Processo para a preparação de um polímero compreendendo um polissacarídeo contendo fucose

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Publication number: BR112012014626B1
Application number: BR112012014626-2A
Authority: BR
Inventors: Rui Manuel Freitas Oliveira; Maria Filomena Andrade De Freitas; Victor Manuel Delgado Alves; Maria D'ASCENSÃO CARVALHO FERNANDES DE MIRANDA REIS
Original assignee: 73100 - Setenta E Três Mil E Cem, Lda
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2020-05-26
Also published as: RU2012124803A; CA2782989A1; JP2013513397A; EP2513325A2; MX344228B; PT104888A; AU2010331906B2; PL2513325T3; JP5969390B2; HUE050490T2; AU2010331906A1; BR112012014626A2; KR101919395B1; RU2573574C2; MX2012006944A; DK2513325T3; WO2011073874A2; CN102971432A; ES2806933T3; EP2513325B1

Abstract

biopolímero bacteriano contendo fucose. a presente invenção diz respeito a um biopolímero microbiano que compreende fucose na sua composição. este biopolímero consiste em um polissacarídeo que compreende fucose, que representa pelo menos 10% da sua composição. este polissacarídeo contendo fucose tambpem contpem componentes que não contém açúcar, isto é, substituintes do grupo acila. esta invenção também diz respeito ao processo de produção do biopolímero, que é obtido por cultivo da bactéria enterobacter a47 (dsm 23139), usando glicerol ou misturas ricas em glicerol como fontes de carbono. o biopolímero contendo fucose da presente inveção pode ser usando em vários tipos de aplicações industriais (por ex. nas indústrias farmacêutica, cosmética e agroalimentar) e no tratamento de resíduos industriais (por ex. na recuperação de óleo e metal).

Description

“PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM POLÍMERO COMPREENDENDO UM POLISSACARÍDEO CONTENDO FUCOSE

Domínio técnico da invenção

A presente invenção diz respeito a um biopolímero microbiano que contém fucose na sua composição. Além disso, a presente invenção se refere ao processo para a produção do biopolímero contendo fucose pela bactéria Enterobacter (DSM 23139). Desta forma, esta invenção é aplicável em vários tipos de indústrias, (por ex. nas indústrias farmacêutica, cosmética e agroalimentar) e no tratamento de resíduos industriais (por ex. na recuperação de óleo e metal).

Antecedentes da invenção

Os polissacarídeos são biomateriais poliméricos de elevado peso molecular (104-107), formados através da polimerização de unidades repetitivas de monossacarídeos. Possuem uma grande diversidade estrutural, resultante da diversidade das unidades repetitivas, do tipo de ligações glicosídicas envolvidas e do grau de ramificação. Muitos polissacarídeos possuem componentes que não contêm açúcar, tais como grupos acila orgânicos, (por ex. acetato, succinato, piruvato) e grupos inorgânicos (por ex. fosfato, sulfato) (Sutherland, 2001).

Por outro lado, os polissacarídeos formam, frequentemente, estruturas terciárias através de ligações intra ou intermoleculares, não covalentes, que conferem maior rigidez às macromoléculas e desempenham um papel importante na determinação das propriedades do polímero no estado sólido e em solução (Kumar et al, 2007).

Devido às suas propriedades físicas e químicas, ou seja, sua capacidade de retenção de água, reologia e/ou formação

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2/38 de filmes, os polissacarídeos são utilizados em uma grande variedade de aplicações alimentares e industriais, incluindo têxteis, tintas, papel, produtos farmacêuticos e cosméticos, como agentes emulsionantes, estabilizantes ou espessantes (Moreno et al, 1998). Por serem materiais obtidos a partir de organismos vivos, os polissacarídeos geralmente não apresentam toxicidade e são biodegradáveis, o que os tornam biomateriais adequados a um desenvolvimento sustentável.

As principais aplicações dos polissacarídeos comercializados, tanto de origem natural (por ex. alginato, carragenina, goma de Guar, pectinas, xantano e gelano) como de derivados semissintéticos (por ex. metilcelulose, carboximetilcelulose e hidroxipropilguar) se baseiam na sua capacidade de modificar as propriedades físicas de sistemas aquosos (hidrocolóides - compostos capazes de modificar as propriedades físicas de sistemas aquosos), sendo usados principalmente na indústria alimentícia, seguido pelas indústrias petrolífera e farmacêutica. Alguns destes polissacarídeos (por ex. alginato, pectinas, pululano, derivados de amido, derivados de celulose) possuem adicionalmente a capacidade para formar filmes biodegradáveis sendo usados na fabricação de embalagens, recipientes e folhas, bem como em várias aplicações agroalimentares, farmacêuticas ou industriais.

Atualmente, a maior parte dos polissacarídeos usados na indústria são obtidos a partir de plantas (por ex. goma de Guar, goma-arábica), algas (por ex. alginato, carragenina), ou de crustáceos (por ex. quitina), com os polissacarídeos obtidos por via microbiana (por ex. xantano, gelano e alginato bacteriano) representando apenas uma pequena

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3/38 fracção do mercado de biopolímeros (Canilha et al, 2005). No entanto, nos últimos anos, verificou-se um interesse crescente na identificação e no isolamento de novos polissacarídeos microbianos que possam competir com os polissacarídeos tradicionais devido às suas melhores propriedades físico-químicas, isto é, uma maior atividade emulsionante e floculante, maior resistência a solventes orgânicos, atividade biológica (por ex. como anticancerígenos ou efeitos imunoestimuladores) e melhores propriedades reológicas (por ex. viscosidade mais elevada para menores concentrações de polímero, maior estabilidade quando sujeito a faixas mais alargadas de temperatura, pH e força iónica (Kumar et al, 2007; Sutherland, 2001).

A produção de polissacarídeos por via microbiana apresenta vantagens em relação à sua obtenção a partir de plantas, algas ou animais, uma vez que os microrganismos em geral exibem taxas de crescimento mais elevadas e a manipulação das respectivas condições de cultivo são muito mais fácil (Moreno et al, 1998). As plantas, algas e animais têm ciclos de vida de um ou mais anos, sendo o ciclo de produção, geralmente, sazonal. Por outro lado, as taxas de crescimento dos microrganismos são da ordem de horas ou alguns dias, enquanto as das plantas, algas e animais são da ordem de meses ou anos.

O principal fator limitante da produção comercial de polissacarídeos por via microbiana é o custo elevado dos substratos utilizados, sobretudo açúcares, em particular glucose, amido e sacarose. Nesses bioprocessos, o custo do substrato representa cerca de 20-40% dos custos de produção (Kumar e Mody, 2009).

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Assim, a procura de substratos menos dispendiosos e com produtividade comparável é determinante para a redução dos custos de produção. O glicerol, um subproduto de vários processos industriais, principalmente do processo de produção de biodiesel, é um bom candidato. Devido ao enorme crescimento da indústria do biodiesel nos últimos anos, o mesmo é produzido em quantidades muito além do seu consumo atual nas aplicações de glicerol tradicionais. Para a indústria do biodiesel, ou para qualquer outra que tenha o glicerol como subproduto, o mesmo representa um ônus por causa do seu baixo valor comercial e pelo fato de que a sua eliminação é um processo associado ao custo. Desse modo, há uma necessidade urgente em desenvolver aplicações interessantes para este subproduto industrial, fazendo uso do fato do glicerol ser um composto não tóxico e biodegradável (Çelik et al, 2008).

Além da sua capacidade de modificar as propriedades físicas de sistemas aquosos, os polissacarídeos contendo fucose têm um elevado potencial para aplicações industriais industrial devido ao fato de que a fucose é um dos raros açúcares difíceis de obter. Por outro lado, a presença de fucose reduz a possibilidade de ocorrência de reações alérgicas, o que potencia a utilização destes biopolímeros em aplicações tais como, por ex., farmacêuticas e cosméticas.

A fucose pode ser sintetizada por sua conversão química a partir de outros monossacarídeos mais comuns, tais como a galactose ou a glucose. No entanto, a maioria dos processos químicos são complexos, envolvendo vários intermediários, e têm um baixo rendimento. Uma das alternativas à síntese química de fucose é a sua obtenção por hidrólise química ou

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5/38 enzimática de polissacarídeos que contêm fucose. Estes polímeros podem ser encontrados em plantas, algas e microrganismos.

Nas plantas, a fucose (L-fucose e fucose metilada) ocorre, por ex. nas paredes das células da batata e do kiwi, em sementes de soja, na mucilagem de folhas jovens de Plantago lanceolata, nas raízes de Lepidium sativum e de Glycyrrhiza uralensis, em exsudados de Astragalus microcephalus, A. gummifer e A. kurdicus, e em folhas de Lupinus albus (Vanhooren e Vandamme, 1999).

Nas algas, a fucose pode ser encontrada sob a forma de fucoidan que é um homopolissacarídeo composto de L-fucose sulfatada. A fucose pode ser extraída de algas, tais como por ex. Pelvetia canaliculata, Fucus vesiculosus e Ascophyllum nodosum. Nestas espécies, o teor de L-fucose varia entre 9,0 e 11,2%. O rendimento da extração global de L-fucose a partir de algas é relativamente baixo (cerca de 7,6%) (Vanhooren e Vandamme, 1999).

Vários microrganismos, isto é, bactérias, fungos e microalgas, sintetizam polissacarídeos extracelulares (EPS) que contêm L-fucose. Esses polímeros incluem homo e heteropolissacarídeos, mas estes últimos são mais comuns, contendo quantidades variáveis de fucose, bem como outros resíduos de açúcar (por ex. glucose, galactose, manose, ramnose e/ou arabinose). EPS que contêm L-fucose são produzidos por bactérias de vários gêneros, incluindo, Aerobacter, Nitrogêniobacter, Klebsiella, Erwinia, Enterobacter, Pseudomonas, Clavibacter, Bacillus e Salmonella, entre outras. Entre os fungos, a fucose pode ser encontrada em EPS produzidos por espécies que pertencem aos

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6/38 gêneros Candida, Mucor, Polyporus, Rhodotorula e

Sporobolomyces, entre outros.

Nas últimas décadas foram descritos, a produção de polissacarídeos contendo L-fucose para vários gêneros, principalmente dos gêneros Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas e Clavibacter.

Várias estirpes de Klebsiella pneumoniae sintetizam vários EPS diferentes contendo L-fucose, D-galactose e ácido galacturônico, que diferem entre si pelo grau de acetilação da cadeia polimérica. Os EPS produzidos por K. pneumoniae I1507 (US 5876982), encontrou aplicação na indústria de cosméticos, devido às suas qualidades psicosensoriais, hidratantes e auto-emulsionantes (Guetta et al, 2003a). Foram descritos outros EPS com composição muito semelhante, ou seja, os EPS produzidos por Klebsiella K-63 (Joseleau e Marais, 1979) e por K. pneumoniae ATCC 31646 (US 4298691). O polímero desta invenção difere destes EPS pelo fato de que, além de fucose e galactose, também contém glucose. Por outro lado, o polímero desta invenção tem na sua composição quantidades significativas de grupos acila substituintes (até cerca de 25% do seu peso seco), que não são referidos como componentes de EPS de Klebsiella.

K. pneumoniae ATCC 12657 (anteriormente conhecida como Aerobacter aerogenes estirpe A3) produz um EPS composto de fucose, glucose, galactose e ácido glucurônico, em quantidades equimolares (Vanhooren e Vandamme, 1999). A fucose representa 18,9% do peso de EPS purificado (Guetta et al, 2003b). Este polissacarídeo difere do polímero desta invenção pelo alto teor de ácido glucurônico e pela presença de grupos acila que não foram descritos para o EPS de K.

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7/38 pneumoniae ATCC 12657 EPS. Além disso, o processo descrito na presente invenção não usa espécies do gênero Klebsiella para o cultivo microbiano.

Estirpes de Enterobacter também foram descritas como produtoras de EPS contendo fucose, galactose, glucose e ácido glucurônico. Exemplos incluem: Enterobacter sp. CNCM 1-2744, que produz um EPS no qual os monómeros estão presentes nas proporções 2:2:1:1 (FR2840920); Enterobacter sp. SSYL (KCTC

0687BP), que produz um EPS com peso molecular entre 10⁵ e 10⁶, no qual a fucose representa 8-10% do teor de açúcar, sendo o ácido glucurônico o principal componente (40-70%) (US2002115158); e E. sakazakii, estirpes ATCC 53017, ATCC 29004 e ATCC 12868, que produzem um EPS com peso molecular de 2x10⁶, no qual a fucose representa 13-22% e o teor de manose é até 8%, respectivamente (US4806636). Estes polissacarídeos diferem do polímero desta invenção pelo seu conteúdo diferente em monómeros e pelos grupos acila. Além disso, o polímero desta invenção tende a ter um peso molecular tipicamente mais alto, na ordem de 10⁶-10⁷.

Várias estirpes de Clavibacter michiganensis foram descritas como produtoras de EPS contendo L-fucose. Esses EPS contêm outros açúcares neutros, tais como galactose, glucose e/ou manose, e grupos acila substituintes, tais como piruvato, succinato e/ou acetato. C. michiganensis subsp michiganensis Cm 542 (NCPPB 1064) produz um EPS de elevado peso molecular (10⁶-10⁷) composto por fucose, galactose e glucose, na proporção de 2:1:1, e piruvato, succinato e acetato, na proporção 1:0.5:1.5 (van den Bulk et al, 1991). O polímero desta invenção, apesar de possuir uma composição semelhante difere do EPS de C. michiganensis pela proporção

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8/38 relativa dos grupos acila. A maior quantidade de succinato do polímero desta invenção confere-lhe um carácter aniônico mais acentuado.

No documento WO2008/127134 é descrito um processo para a produção de um polissacarídeo rico em galactose a partir de culturas de Pseudomonas oleovorans usando substratos ricos em glicerol. No entanto, o EPS obtido nesse processo contém apenas quantidades residuais de fucose (0-4%).

Desta forma, a presente invenção descreve um biopolímero contendo fucose, de elevado peso molecular, como um caráter polieletrolítico, produzido por culturas microbianas, preferencialmente usando Enterobacter A47 (DSM 23139), e o processo para a sua obtenção. O referido processo permite a obtenção do polímero da invenção usando substratos de baixo custo e de um modo fácil. O polímero da invenção pode ser usado em várias indústrias, tais como a indústria agroalimentar, tratamento de águas residuais e indústria farmacêutica devido às suas propriedades reológicas, capacidade para formar filmes, carácter polieletrolítico, e capacidades emulsionante e floculante.

Descrição Geral da Invenção

A presente invenção se refere à produção de um biopolímero, cujo principal componente é um polissacarídeo de elevado peso molecular (106-107), no qual a fucose representa pelo menos 10% da sua composição, e que possui grupos acila substituintes, incluindo piruvato, succinato e acetato. O biopolímero é obtido por cultivo microbiano, preferencialmente pela bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139), usando glicerol ou substratos contendo glicerol como as fontes de carbono preferenciais.

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Do mesmo modo, a presente invenção proporciona um processo para preparar um polímero que compreende as etapas de cultivo microbiano da estirpe de bactéria Enterobacter A47 (DSM 23139) e proporcionar a referida cultura com uma fonte de carbono que compreende glicerol.

1. Caracterização da cultura microbiana

O polímero contendo fucose da presente invenção é produzido por bactérias dos gêneros Pseudomonas, Klebsiella, Methylobacterium, Erwinia, Alcaligenes ou Enterobacter, preferencialmente, pela bactéria Enterobacter A47 depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), de acordo com o Tratado de Budapeste, com o número DSM 23139. Adicionalmente o microrganismo usado na presente invenção é caracterizado pelo fato de outros aspectos, tais como o perfil bioquímico, a sequência genética e o dendrograma filogenético apresentados nas Tabelas 1 e 2 e na Figura 1, respectivamente.

O microrganismo usado nesta invenção, pode ser uma estirpe selvagem, uma variante ou um mutante, desde que possua a capacidade de sintetizar o polímero contendo fucose. É possível usar uma cultura pura ou uma cultura mista de vários microrganismos, pelo menos um é capaz de produzir o polímero contendo fucose, preferencialmente, a bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139).

2. Caracterização do processo para a produção do polímero

O polímero da presente invenção é produzido em um biorreator em um meio aquoso agitado e aerado. O meio de cultura contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos. A fonte de carbono preferencial é o

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10/38 glicerol ou substratos contendo glicerol. No entanto, o processo de produção do polímero da invenção prevê o uso de outras fontes de carbono, em alternativa ao glicerol ou em mistura com o mesmo, tais como por ex. açúcares, álcoois, ácidos orgânicos ou alcanos, assim como o uso de resíduos ou subprodutos alimentícios ou industriais, tais como por ex. subproduto de glicerol da indústria de biodiesel, melaços de cana-de-açúcar, soro de leite ou resíduos da produção de azeite.

O processo para a produção do polímero contendo fucose consiste no cultivo do microrganismo em um meio nutriente aquoso, aerado. A temperatura é controlada entre 15 e 45 °C, preferencialmente, entre 26 e 37 °C. O pH é controlado entre 5,0 e 9,0, preferencialmente entre 6,5 e 7,0.

No início do cultivo, a concentração em oxigênio dissolvido no meio de cultura é estabelecido acima de 70%.

Depois, a concentração de oxigênio dissolvido diminui gradativamente, concomitante com o crescimento celular, sendo controlada a valores inferiores a 30%, ou preferencialmente, inferiores a 20%, ou mais preferencialmente inferior a 10% ou mesmo em condições anaeróbicas. O polímero contendo fucose é produzido em condições de limitação da fonte de nitrogênio, tal como em uma quantidade inferior a 0,3 g/L ou inferior a 0,2 g/L, ou inferior a 0,01 g/L ou mesmo sem uma fonte de nitrogênio e disponibilidade de carbono, simultaneamente com baixa concentração de oxigênio dissolvido, conforme descrito acima. A disponibilidade de carbono é garantida pelo fornecimento à cultura com um meio de cultura contendo uma alta concentração de glicerol (>100 g/L). O caudal de adição

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11/38 de tal meio durante esta fase descontínua alimentada tem de

ser ajustada	de	modo a igualar	o consumo	de	carbono	da
cultura.
O caldo	de	cultivo obtido	no final	do	cultivo	no
biorreator pode	ser usado di	retamente,	sem qualquer

tratamento, ou após secagem. Alternativamente, o polímero contendo fucose pode ser precipitado do caldo de cultivo pela adição de um agente precipitante (por ex. etanol, acetona), que produzem um polímero nativo.

O processo de extração do polímero da invenção consiste na remoção de células (por ex. por centrifugação do caldo de cultivo), seguida pela precipitação do polímero por adição de um agente precipitante. A purificação do polímero envolve o uso de um ou vários processos adicionais (por ex. diálise).

Dependendo das condições de cultivo no biorreator, o tempo de cultivo e os procedimentos usados para extrair/purificar o polímero, o processo rende 50 g/L de polímero nativo ou 20 g/L de polímero purificado.

3. Caracterização do polímero

Tipicamente, o polímero da invenção tem um teor de fucose que representa pelo menos 10% da sua composição de açúcar. O polímero contendo fucose tem na sua composição outros açúcares neutros, ou seja, glucose e galactose, e pode conter também, em quantidades vestigiais (<5%), outros açúcares, tais como por ex. manose, ramnose, arabinose, frutose, ácido glucurônico e/ou glucosamina.

4. Aplicações do polímero

O polímero desta invenção apresenta atividades floculante e emulsionante, forma soluções aquosas de elevada viscosidade, com comportamento de fluido pseudoplástico, e

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12/38 produz filmes biodegradáveis em mistura com outros polímeros. Assim sendo, pode substituir outros polissacarídeos, tais como por ex. xantano, alginato, carragenina, goma de Guar e goma-arábica, nas suas numerosas aplicações, ou seja, nas indústrias agroalimentar, farmacêutica e cosmética, como agente espessante, texturizante ou ligante. Adicionalmente, a presença de fucose no polímero da invenção potencia a sua utilização em aplicações médicas e cosméticas. Adicionalmente, a presença de resíduos de piruvato e succinato confere um carácter aniônico ao polímero. Como consequência, este é capaz de imobilizar metais tóxicos.

Descrição das Figuras

Figura 1 - Representa o dendrograma filogenético da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139).

Figura 2 - Representa a viscosidade aparente de uma solução aquosa (0,8% p/v) do polímero contendo fucose (medição realizada à temperatura ambiente).

Figura 3 - Representa a evolução do consumo da fonte de carbono (glicerol) e da fonte de nitrogênio (amónio), da produção de biomassa e de EPS contendo fucose, durante o processo de cultivo para a produção do polímero da invenção.

Descrição detalhada da invenção

1. Caracterização do microrganismo

O polímero contendo fucose é obtido através de cultivo da bactéria Enterobacter A47 (DSM 23139). O microrganismo pode ser uma estirpe selvagem, uma variante ou um mutante, desde que possua a capacidade de sintetizar o polímero contendo fucose. Pode ser usada uma cultura pura ou, alternativamente, pode ser usada em que, pelo menos, um

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13/38 microrganismo é capaz de produzir o polímero da invenção.

O microrganismo preferido para a obtenção do polímero da invenção é a bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) com as características descritas a seguir. A caracterização bioquímica e genética do microrganismo foi realizada pelo DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).

1.1. Caracterização morfológica da bactéria

Enterobacter A47 (DSM 23139)

A bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) é um bacilo com as seguintes dimensões: 0,7-0,8 pm x 1,2-2,5 pm. É uma bactéria Gram negativa, móvel.

1.2. Perfil bioquímico da bactéria Enterobacter A47 (DSM 23139)

A bactéria Enterobacter A47 (DSM 23139) tem o seguinte perfil bioquímico, o qual é típico de bactérias do gênero Enterobacter (Tabela 1):

Tabela 1: Perfil bioquímico da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) (+ e “-“ representam uma reação positiva ou negativa, respectivamente, ao teste realizado).

Teste	Resultado
Lise por KOH a 3%	+
Aminopeptidase (Cerny)	+
Catalase	+
Crescimento anaerobiótico	+
Produção de gás a partir de glucose	+
Produção de H2S	-
Produção de indol	-
Vermelho de metilo	-
Degradação de:

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Gelatina	-
Tween 80	-
DNA	-
Ureia	+
Citrato (Simmons)	+
Utilização de malonato	+
VP	+
ONPG	+
ADH	+
LDC	-
ODC	+
Produção de ácido a partir de:
Glucose	+
Frutose	+
Manose	+
Maltose	+
D-Xilose	+
Sacarose	+
Trealose	+
L-Arabinose	+
Ramnose	+
Galactose	+
Adonitol	+
Dulcitol	-
Eritritol	-
Inositol	-
Glicerol	+

1.3. Sequenciamento genético do rDNA 16S da bactéria

Enterobacter A47 (DSM 23139)

A sequência genética do rRNA 16S da bactéria

Enterobacter sp. A47 (DSM 23139) (Tabela 2) foi determinada por sequenciamento direto de rDNA 16S amplificado por PCR.

A extração de DNA genômico, a amplificação mediada por PCR

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15/38 (Reação em Cadeia de Polimerase) do rDNA 16S e a purificação dos produtos de PCR foi realizada como descrito por Rainey et al (1996). Os produtos de PCR purificados foram sequenciados usando o kit CEQ^TMDTCS-Quick Start (Beckman

Coulter) segundo o protocolo indicado pelo fabricante. As reações das sequências foram sujeitas a eletroforese usando o sistema de análise CEQ^TM8000 Genetic Analysis System. Os dados resultantes da sequência foram introduzidos no editor de alinhamento (“alignment editor”) ae2 (Maidak et al, 1999), 10 alinhados manualmente e comparados com sequências genéticas do rDNA 16S representativas de organismos pertencentes a Enterobacteriaeceae (Maidak et al, 1999). As sequências para comparação foram obtidas das bases de dados da EMBL, RDP e DSMZ.

Tabela 2: Sequência genética do rDNA 16S da bactéria

Enterobacter A47 (DSM 23139) - SEQ ID NO 1

1	TGATCCTGGC TCAGATTGAA CGCTGGCGGC AGGCCTAACA CATGCAAGTC GAACGGTAAC
61	AGGAAGCAGC TTGCTGCTTC GCTGACGAGT GGCGGACGGG TGAGTAATGT CTGGGAAACT
121	GCCTGATGGA GGGGGATAAC TACTGGAAAC GGTAGCTAAT ACCGCATAAY GTCGCAAGAC
181	CAAAGAGGGG GACCTTCGGG CCTCTTGCCA TCGGATGTGC CCAGATGGGA TTAGCTAGTA
241	GGTGGGGTAA CGGCTCACCT AGGCGACGAT CCCTAGCTGG TCTGAGAGGA TGACCAGCCA
301	CACTGGAACT GAGACACGGT CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA
361	ATGGGCGCAA GCCTGATGCA GCCATGCCGC GTGTATGAAG AAGGCCTTCG GGTTGTAAAG
421	TACTTTCAGC GGGGAGGAAG GCGATAAGGT TAATAACCTT GTCGATTGAC GTTACCCGCA
481	GAAGAAGCAC CGGCTAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGGAGGGT

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	GCAAGCGTTA
541	ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCACGCA GGCGGTCTGT CAAGTCGGAT GTGAAATCCC
601	CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATTCGAAAC TGGCAGGCTA GAGTCTTGTA GAGGGGGGTA
661	GAATTCCAGG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG AGATCTGGAG GAATACCGGT GGCGAAGGCG
721	GCCCCCTGGA CAAAGACTGA CGCTCAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT
781	ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC GACTTGGAGG TTGTGCCCTT GAGGCGTGGC
841	TTCCGGAGCT AACGCGTTAA GTCGACCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG TTAAAACTCA
901	AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG ATGCAACGCG
961	AAGAACCTTA CCTACTCTTG ACATCCAGAG AACTTTCCAG AGATGGATTG GTGCCTTCGG
1021	GAACTCTGAG ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTTGTGAAAT GTTGGGTTAA
1081	GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATCCTTT GTTGCCAGCG GTYAGGCCGG GAACTCAAAG
1141	GAGACTGCCA GTGATAAACT GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA
1201	CGAGTAGGGC TACACACGTG CTACAATGGC GCATACAAAG AGAAGCGACC TCGCGAGAGC
1261	AAGCGGACCT CATAAAGTGC GTCGTAGTCC GGATTGGAGT CTGCAACTCG ACTCCATGAA
1321	GTCGGAATCG CTAGTAATCG TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT
1381	ACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG
1441	GGAGGGCGCT TACCACTTTG TGATTCATGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTAACCGTA
1501	GGGAACCTGC GGGCTGGATC ACC

1.4. Dendrograma filogenético da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139)

O dendrograma filogenético da bactéria Enterobacter A47

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17/38 (DSM 23139) foi construído usando o pacote ARB (Pruesse et al, 2007). Com base nos valores de distância evolucionária, o dendrograma foi construído usando o método de agrupamento por vizinhança ( neighbor-joining) (Jukes e Cantor, 1969), usando as correções de Saitou e Nei (1987). A raiz do dendrograma foi determinada incluindo a sequência de rRNA 16S de Klebsiella pneumoniae na análise. A barra de escala abaixo do dendrograma indica a substituição de 1 nucleotídeo por cada 100 nucleotídeos.

A sequência genética de rDNA 16S da bactéria Enterobacter A47 (DSM 23139) demonstrou a mais alta semelhança com as bactérias Enterobacter pyrinus (98,3%), Enterobacter hormaechei (99,0%) e Enterobacter asburiae (98,9%). O critério para a identificação de um dado microrganismo em uma espécie conhecida é definido como tendo uma semelhança de, pelo menos, >99,0% ou, idealmente, >99,5% com a estirpe de referência para essa espécie (Janda e Abbott, 2007).

Desta forma, a cultura microbiana a ser utilizada no processo para a produção do polímero da invenção pode ser qualquer microrganismo que compartilha uma semelhança de pelo menos 99,0±0,5%, com a SEQ ID NO 1 da Enterobacter sp. A47 (DSM 23139), de acordo com a Tabela 2, obtida por manipulação genética, mutação, variantes ou diretamente da natureza.

2. Caracterização do processo para a produção do polímero

O polímero da presente invenção é produzido em um biorreator agitado e aerado, com controle de pH e temperatura. O processo para a produção do polímero é

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18/38 iniciado pela inoculação do microrganismo em um meio nutriente aquoso contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos. O processo compreende uma fase descontínua inicial, seguida por uma fase descontínua alimentada, durante a qual o meio mineral é introduzido no biorreator.

2.1. Meio de cultura

O meio de cultura para a produção do polímero contendo fucose consiste em um meio nutriente aquoso, contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos.

2.1.1. Fonte de carbono

A fonte de carbono preferida é glicerol ou misturas contendo glicerol. Alternativamente, a fonte de carbono pode ser um açúcar monomérico, dimérico ou oligomérico, um álcool, um ácido orgânico, um alcano, ou misturas contendo dois ou mais compostos dos grupos referidos.

A fonte de carbono pode ser, também, um resíduo ou subproduto alimentício ou industrial, contendo um ou vários dos compostos referidos acima, tal como por ex. o subproduto glicerol da indústria do biodiesel, melaço de cana-deaçúcar, soro de leite ou resíduos da produção de azeite. O subproduto glicerol da indústria do biodiesel é composto principalmente por glicerol não purificado, contendo metanol em quantidades variáveis (5-50%), além de outros contaminantes reminiscentes do processo industrial (por ex. NaOH, gordura/óleos, alguns ésteres, enxofre, proteínas e minerais). O melaço-de-cana de açúcar é um subproduto da indústria de refinaria do açúcar, rico em açúcares (sacarose, glucose e frutose) (>50%). O soro de leite é um subproduto da indústria queijeira, composto principalmente por lactose.

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A fracção orgânica do resíduo da produção de azeite inclui açúcares, taninos, polifenóis, poliálcoois, pectinas e lipídeos. Outros resíduos ou subprodutos alimentícios ou industriais que possuam na sua composição açúcares, álcoois, ácidos orgânicos, alcanos e/ou lipídeos podem ser usados como substratos para o cultivo microbiano e produção do EPS contendo fucose.

No processo para a produção do polímero contendo fucose, de acordo com a invenção, a fonte de carbono deve representar entre 2 e 10% (p/v) do meio nutriente aquoso, durante a fase descontínua, a fim de proporcionar adequadamente o crescimento celular. Durante a fase em descontínuo alimentado subsequente, a fonte de carbono deve ser mantida acima de 0,1% (p/v), preferencialmente acima de 0,5% (p/v), a fim de proporcionar disponibilidade de carbono a síntese de polímero.

2.1.2. Fonte de nitrogênio

A fonte de nitrogênio para o cultivo microbiano pode ser um sal inorgânico (por ex. (NH4HHPO4, NH4OH, (NH4HSO4, NH4Cl) ou um composto de nitrogênio orgânico (por ex. ureia, aminoácidos), suas misturas ou um resíduo ou subproduto alimentício ou industrial contendo compostos de nitrogênio (por ex. farinha de soja, extrato de levedura, farelo de trigo).

No processo para a produção do polímero contendo fucose, a fonte de nitrogênio deve ter uma concentração inicial entre 0,6 e 3,0 g/L, durante a fase descontínua, de modo a garantir o crescimento celular. Durante a fase descontínua alimentada subsequente, a fonte de nitrogênio deve ser mantida inferior a 0,3 g/L, preferencialmente inferior a 0,1 g N/L, criando

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20/38 assim uma limitação de nitrogênio. Deste modo, durante a fase descontínua alimentada, o crescimento celular é limitado ou restrito pelo nitrogênio que, concomitantemente com a manutenção da disponibilidade de carbono, induz a síntese do polímero contendo fucose.

2.1.3. Sais inorgânicos

O meio de cultivo também inclui, em quantidades vestigiais, cátions metálicos, ou seja, sódio, potássio, magnésio, ferro, manganésio, cobalto, cálcio, cobre e zinco. Cada um destes cátions deve estar presente no meio de cultivo em concentrações entre 0,001 e 100 mM, à exceção do sódio que pode estar presente em quantidades superiores especialmente para controle do pH.

2.2. Condições de cultivo

O cultivo em biorreator é iniciado pela inoculação do microrganismo no meio nutriente aquoso, descrito acima, aerado com ar comprimido. O volume de inóculo deve representar entre 10 e 30% do meio de reação total no início do cultivo.

Ao longo do processo de cultivo, a temperatura é controlada entre 15 e 45 °C, preferencialmente entre 26 e 37 °C, e o pH é controlado entre 5,0 e 9,0, preferencialmente entre 6,5 e 7,0.

A concentração em oxigênio dissolvido no meio de cultura é elevada (>70%), no início do cultivo, mas, ao longo da fase descontínua diminui gradualmente, concomitante com o crescimento celular. Durante a fase descontínua alimentada a concentração de oxigênio dissolvido é controlada a baixo de 30%, preferencialmente abaixo de 10% ou ainda em condições anaeróbicas. O caudal de ar pode ser mantido constante, entre

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0,1 e 2,0 vvm, sendo a concentração de oxigênio dissolvido controlada pela variação automática da velocidade de agitação entre 0 e 2000 rpm, preferencialmente, entre 400 e 800 rpm. Em alternativa, o caudal de ar pode variar ao longo do processo de cultivo, entre 0 e 2,0 vvm, enquanto a taxa de agitação permanece constante. A concentração de oxigênio dissolvido durante a fase descontínua também pode ser controlada pela adição de substrato. Neste caso, tanto a velocidade de agitação como o caudal de ar podem ser mantidos constantes em um valor entre 0 e 2000 rpm, e entre 0 e 2,0 vvm, respectivamente.

A síntese do polímero é iniciada durante a fase contínua, mas ocorre principalmente durante a fase descontínua alimentada, quando o crescimento celular abranda ou cessa devido à limitação de nitrogênio imposta ao biorreator. Durante a fase descontínua alimentada, o meio nutriente é introduzido no biorreator, o que criou condições de disponibilidade de carbono e limitação de nitrogênio. A concentração da fonte de nitrogênio nessa fase é mantida abaixo de 0,3 g N/L, preferencialmente abaixo de 0,1 g N/L. Nestas condições, o crescimento celular é restrito e o polímero é produzido desde que haja disponibilidade de carbono de modo a igualar o consumo de carbono pela cultura.

A síntese do polímero no biorreator pode ser mantida por 4 a 7 dias, ou até ao momento em que o caldo se torna muito viscoso que já não é possível manter uma distribuição homogênea de oxigênio, temperatura e nutrientes. Esta situação ocorre quando a viscosidade aparente do caldo atinge um valor de cerca de 2,0 Pa.s (medidos à temperatura de 30 °C, com uma taxa de cisalhamento de 5 s^-1).

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Alternativamente, a produção do polímero da invenção pode ser mantida em um processo contínuo ou em um processo descontínuo alimentado repetido. No processo contínuo, o meio nutriente é continuamente introduzido no biorreator, sendo o caldo removido também continuamente. No processo descontínuo alimentado repetido, o modo de funcionamento do biorreator descrito acima (uma fase inicial descontínua, seguida de uma fase descontínua alimentada), é ciclicamente repetido. Cerca 10-30% do volume do caldo são deixados no biorreator e servem de inóculo para o ciclo seguinte. Estes dois modos alternativos de operação do biorreator permitem uma otimização do processo, já que são eliminados períodos de tempo não produtivos, isto é, a preparação de novo inóculo e preparação do biorreator.

2.3. Extração e purificação dos produtos de cultivo

O caldo de cultivo obtido no final do cultivo pode ser utilizado diretamente, sem qualquer processamento.

Alternativamente, o polímero em bruto pode ser obtido por secagem do caldo de cultivo a temperaturas até 80 °C ou por liofilização.

Alternativamente, uma forma nativa do polímero pode ser recuperada do caldo no final do cultivo, preferencialmente por precipitação, o que pode ser conseguido por meio da adição de um solvente miscível com água no qual o polímero é insolúvel, tal como por ex. um álcool (por ex. etanol, isopropanol) ou uma cetona (por ex. acetona). O polímero contendo fucose é precipitado pela adição de 1 a 3 volumes de agente precipitante por cada litro de caldo. O polímero coprecipita com as células, proteínas, sais e outros componentes do caldo que são insolúveis no agente

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23/38 precipitante. O agente precipitante ser seco a temperaturas até 80 °C ou liofilizado. Este polímero nativo, tal como o caldo e o polímero em bruto descritos anteriormente, podem ser utilizados em aplicações, como por ex. no tratamento de águas residuais ou em alimentação animal.

Em um procedimento de extração alternativo, o polímero da invenção pode ser parcialmente purificado em um processo que envolve a remoção das células por centrifugação (10.00020.000 rpm, 30-60 minutos), seguido pela adição de um agente precipitante (1-3 litros de agente precipitante por cada litro de caldo). O agente precipitante pode ser qualquer dos solventes acima referidos (por ex. etanol, isopropanol, acetona).

O caldo de cultivo é muito viscoso no final do cultivo, desse modo, a separação das células é facilitada por diluição (adição de 1-4 litros de água desionizada por cada litro de caldo) antes da centrifugação. O polímero precipitado pode ser seco a uma temperatura até 80 °C ou liofilizado. Este polímero semipurificado pode ser utilizado em diversas aplicações, tais como por ex. nas indústrias agroalimentares, cosmética, do papel, das tintas ou do petróleo, entre outras.

Um polímero puro pode ser obtido usando adicionalmente um ou mais dos seguintes métodos:

1) Reprecipitação do polímero a partir de soluções aquosas poliméricas semipurificadas (0,1-5,0 g/L), sendo o grau de pureza aumentando com o número de reprecipitações realizadas;

2) Precipitações sequenciais com diferentes agentes precipitantes, ou seja, etanol, acetona e/ou isopropanol, ou

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24/38 misturas destes, deste modo promovendo a eliminação de diferentes contaminantes solúveis em cada solvente;

3) Lavagem do polímero semipurificado com solventes nos quais este seja insolúvel (por ex. hexano), mas que solubilize um ou mais dos contaminantes;

4) Uso de enzimas proteolíticas (por ex. tripsina), adição de agentes que precipitam proteínas (por ex. ácido tricloroacético) ou desnaturação de materiais proteicos por aquecimento a temperaturas entre 60 e 80 °C;

5) Diálise, ultrafiltração ou diafiltração de soluções poliméricas aquosas semipurificadas, com concentrações reduzidas (0,1-5,0 g/L), o que resulta em um elevado grau de pureza, uma vez que o polímero de elevado peso molecular é separado de todos os contaminantes de baixo peso molecular.

O polímero puro obtido por qualquer destes procedimentos pode ser seco a temperaturas até 80 °C ou liofilizado. O alto grau de pureza deste polímero permite que possa ser utilizado nas indústrias alimentícias, farmacêutica e cosmética, entre outras.

Podem ser usadas várias combinações diferentes dos métodos referidos para extrair/purificar o polímero contendo fucose, de acordo com o grau de pureza e a aplicação específica a que este se destina.

3. Caracterização do polímero

3.1. Composição

O polímero da presente invenção é constituído principalmente por um polissacarídeo de elevado peso molecular (10⁶-10⁷), com um teor de fucose de pelo menos 10% do teor total de açúcar. Este polímero é também composto por

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25/38 glucose e galactose (20-70% e 10-40% do teor total de açúcar, respectivamente). A proporção relativa dos referidos açúcares no polímero, fucose, glucose e galactose é dependente do tempo de cultivo e das condições de operação do biorreator.

Além disso, o polímero desta invenção pode, também possuir outros açúcares em quantidades mínimas (<5%), tais como por ex. manose, ramnose, xilose, ribose, arabinose, ácido glucurônico e/ou glucosamina.

O referido polímero possui, também, componentes que não contêm de açúcar, isto é, grupos acila, que representam até 25% peso seco do polímero. Os principais grupos acila detectados foram succinato, piruvato e acetato.

Tipicamente, o acetato e o piruvato representam entre 0,5 e 5% do peso seco do polímero, enquanto que o succinato está presente em quantidades mais elevadas, normalmente entre 1 e 20%. A composição do polímero da invenção em termos de cada grupo acila é dependente das condições de operação do reator e do tempo de cultivo. A presença de piruvato e succinato confere ao polímero um carácter aniônico. Em consequência, o polímero é capaz de imobilizar metais tóxicos, possibilitando a sua utilização na remoção de metais tóxicos (metais pesados e radionucleotídeos) de solos e meios aquáticos contaminados.

Dependendo do método de extração/purificação, o polímero obtido pode apresentar, além do polímero contendo fucose, outros componentes presentes no caldo de cultivo, tais como proteínas e compostos inorgânicos. O conteúdo máximo nestes componentes foi detectado no polímero nativo (15-30% e de proteínas e 25-40% de compostos inorgânicos)

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26/38 enquanto a quantidade mínima (<1%) foi detectada no polímero purificado obtido por diálise.

3.2. Peso molecular médio do polímero

O peso molecular médio do polímero purificado, determinado por Cromatografia de Permeação em Gel, é da ordem de 10⁶-10⁷. Normalmente, quando a síntese é iniciada durante a fase de crescimento microbiano, o seu peso molecular médio é na ordem de 105, aumentando ao longo do tempo de cultivo até atingir um valor relativamente constante na ordem de 10⁶10⁷.

3.3. Propriedades do polímero

3.3.1. Solubilidade

O polímero da invenção não é solúvel em uma ampla variedade de solventes orgânicos à temperatura ambiente, incluindo acetona, isopropanol, DMSO, hexano, dietiléter, xileno e tetracloroetileno, entre outros. Esta característica do polímero abre a possibilidade da sua aplicação na preparação de membranas resistentes a solvente a serem usadas em processos de separação. No entanto, observou-se que o polímero é solúvel em alguns solventes orgânicos, como por ex. tetracloroetano.

O polímero da invenção é estável em contato com os solventes orgânicos testados, mantendo a sua composição tanto em termos dos açúcares constituintes como dos grupos acila depois de serem expostos a estes solventes. Além disso, o peso molecular médio também não foi afetado.

3.3.2. Viscosidade do polímero em meio aquoso

As soluções aquosas preparadas com o polímero da invenção não são fluidos Newtonianos, apresentando um comportamento pseudoplástico (Figura 2). A viscosidade

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27/38 aparente de uma solução aquosa do polímero a 0,8% (p/v), é de 0,21 Pa.s medida a 25 °C, para uma taxa de cisalhamento de 5 s^-1, diminuindo para 0,02 Pa.s, para uma taxa de cisalhamento de 500 s^-1. Uma vez que a viscosidade é recuperado imediatamente quando a taxa de cisalhamento é reduzida, não são observados fenómeno de histerese. conferelhe a este material a capacidade de modificar as propriedades físicas de sistemas aquosos, e o potencial de ser aplicado como agente espessante ou texturizante, principalmente nas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica.

A viscosidade aparente das soluções aquosas do polímero diminui com o aumento da temperatura, mantendo-se, no entanto, o comportamento pseudoplástico. A viscosidade aparente de uma solução do polímero, a 0,8% (p/v), medida a uma taxa de cisalhamento de 5 s^-1, é de 0,32 Pa.s a 15 °C, diminuindo para 0,05 Pa.s a 65 °C.

Foi estudado o efeito das etapas de aquecimento e resfriamento sequenciais sobre as propriedades dinâmicas e de cisalhamento estável da solução de EPS purificado, realizando ciclos consecutivos de aquecimento e resfriamento. Depois de registrar o espectro mecânico e os dados de estado estável a 25 °C, a mesma amostra foi aquecida até 40, 55, 70 e 80 °C. Observou-se que a viscosidade aparente e os módulos dinâmicos (G' e G''), registrados a 25 °C no final de cada ciclo, eram praticamente coincidentes. Disto, podemos concluir que a amostra de polímero é bastante estável sob flutuações de temperatura, mantendo as suas propriedades em testes oscilatórios e de estado estável a 25 °C, depois de ser exposta a temperaturas crescentes até 80°C. Estas características nos fazem pensar que o polímero pode

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28/38 ser usado em formulações aquosas (por exemplo, produtos alimentícios) que são submetidas a flutuações de temperatura durante o seu processamento.

No que diz respeito às propriedades viscoelásticas, as soluções aquosas do polímero contendo fucose apresentam um comportamento de um líquido viscoso (G''>G' em toda a faixa de frequências estudada). Não foi detectada formação de gel nas condições testadas.

3.3.3. Atividade emulsionante

O polímero da invenção possui atividade emulsionante, o que significa que é capaz de estabilizar emulsões de gotículas de água em compostos hidrofóbicos, tais como óleos (por ex. azeite, parafina) e hidrocarbonetos (por ex. hexano, tolueno). Deste modo, o polímero pode ser usado como bioemulsionante ou agente estabilizador, e tem o potencial de substituir emulsionantes sintéticos em uma ampla faixa de aplicações tais como nas indústrias petrolífera, de detergentes, têxtil, papel, tintas, cosmética, farmacêutica e alimentícia, entre outras.

A atividade emulsionante não está confinada ao polímero purificado. Outras formas, como por exemplo, em bruto, nativo, e semipurificado, revelaram a capacidade de estabilizar emulsões de água em compostos hidrofóbicos. Esta capacidade foi verificada usando soluções do polímero da invenção com uma concentração entre 0,05 e 1,5%, quando misturadas com vários hidrocarbonetos (por ex. hexadecano, hexano, tolueno e xileno) e óleos (por ex. azeite, parafina). As emulsões formadas eram bastante estáveis por várias semanas. Além disso, demonstraram ser muito estáveis à temperatura, resistindo ao aquecimento desde a temperatura

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29/38 ambiente até 40, 50, 60 e 100 °C.

3.3.4. Atividade floculante

O polímero da invenção também apresenta uma significativa atividade floculante, e pode ser usado como biofloculante natural. Os agentes floculantes são úteis na promoção de agregação de células e colóides, sendo largamente utilizados em aplicações industriais, tais como, tratamento de águas residuais, tratamento de água potável, produtos alimentícios, entre outras. A biodegradabilidade e segurança do polímero da invenção representa vantagens sobre os floculantes sintéticos que são perigosos para a saúde humana e a cuja degradação no ambiente é difícil.

A atividade floculante do polímero da invenção diminui de 70 para 60% com o aumento da concentração de polímero de 0,1 para 0,8% (p/v), à temperatura ambiente e pH neutro.

Esta atividade floculante foi comparada com a dos polissacarídeos comerciais, por exemplo, xantano, alginato, goma de Guar e carboximetilcelulose. O polímero da invenção revelou ser um bom agente floculante, com um desempenho floculante semelhante ao dos produtos comerciais, para a mesma concentração em polímero.

3.3.5. Formação de filmes biodegradáveis

O polímero contendo fucose pode ser usado em mistura com outros polímeros biodegradáveis, como por ex. amido, pectina, alginato, carragenina, glúten, gelano e quitosano, na produção de filmes compósitos biodegradáveis. Estes filmes podem ser aplicados como membranas em processamento de solventes orgânicos e materiais de embalagem.

Polissacarídeos como o quitosano, o amido e a goma de Guar foram testados na preparação de microesferas para a

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30/38 libertação controlada de fármacos. O polímero desta invenção pode ser usado, isoladamente ou em conjunto com outros biopolímeros, para o mesmo efeito.

4. Utilizações do polímero da presente invenção

O polímero desta invenção apresenta atividade floculante e emulsionante, e forma soluções aquosas de elevada viscosidade, com comportamento de fluido pseudoplástico. Assim sendo, pode substituir outros polissacarídeos, tais como o xantano, alginato, carragenina, goma de Guar goma-arábica em uma ampla faixa de aplicações, como por exemplo, como espessante, intensificador de textura ou agente ligante nas indústrias agroalimentar, farmacêutica e cosmética.

O polímero contendo fucose pode ser usado para produzir filmes compósitos biodegradáveis por mistura com outros polímeros tais como amido, pectina, alginato, carragenina, glúten, gelano e quitosano. Estes filmes podem ser aplicados como membranas no processamento de solventes orgânicos (por ex. desidratação de solvente por pervaporação) e em materiais de embalagem, como embalagens para produtos alimentícios, tendo em conta a sua baixa permeabilidade a gases (oxigênio e dióxido de carbono).

O polímero contendo fucose pode ainda ser usado como fonte de oligossacarídeos, obtidos a partir do polímero original usando tratamentos físicos (por ex. microondas, calor, irradiação e ultrassonicação), processos químicos (por ex. hidrólise ácida), tratamentos enzimáticos (por ex. com hidrolases e liases) ou processos biológicos (usando agentes microbianos capazes de degradar o polímero, e usar todos os açúcares como fonte de carbono exceto a fucose). A

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31/38 fucose e os fuco-oligossacarídeos obtidos, assim como o polímero original, isoladamente ou em conjunto, têm grande potencial aplicação médica como agentes anticancerígenos e anti-inflamatórios, no tratamento de artrite reumatoide, para indicar apenas alguns (Vanhooren e Vandamme, 1999; Péterszegi et al, 2003b). Além disso, devido à presença de fucose na sua composição, o polímero da invenção também tem grande potencial de aplicação para ser usado em cosméticos, como hidratante ou aditivo antienvelhecimento (Péterszegi et al, 2003a).

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção do polímero contendo fucose a partir de glicerol, subproduto da indústria do biodiesel, por cultivo da bactéria Enterobacter sp. A47 (DSM 23139)

Uma cultura de Enterobacter A47 (DSM 23139) foi inoculada em 8 litros de meio de cultura com a composição apresentada na Tabela 3. O biorreator (BioStat B-plus, Sartorius) foi operado nas seguintes condições: temperatura controlada a 30 °C; pH controlado a 6,80±0,05, por adição automática de NaOH 1 M e uma taxa de aeramento constante de 1,6 L/min (0,2 vvm). À medida que tem lugar o crescimento microbiano, a concentração de oxigênio dissolvido diminuiu de 80% de saturação, no início do cultivo, para cerca de 20%, ao fim de 1 dia.

A partir desse momento, uma alimentação contínua (de cerca 20 mL/h) foi introduzida no reator. A sua composição era aquela apresentada na Tabela 3, mas com uma concentração de glicerol diferente (200 g/L) . Estas condições de operação limitaram a concentração de nitrogênio no caldo de fermentação (inferior a 0,1 g N/L) e permitiram

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32/38 simultaneamente uma boa disponibilidade de fonte de carbono.

Tabela 3: Composição do meio de cultura.

componente	concentração
Glicerol subproduto	25 g/L
K2HPO4	5,8 g/L
KH2PO4	3,7 g/L
(NH4) 2HPO4	3,3 g/L
Solução mineral⁽¹⁾	1,0 mL/L
MgSO4 100 mM	10 mL/L
⁽¹⁾ composição da solução mineral (para 1 litro de
HCl 1 N): FeSO4-7H2O, 2,7	8 g; MnCl2-4H2O, 1,98 g;
CoSO4-7H2O, 2,81 g; CaCl2’2H2O, 1,67 g; CuCl2’2H2O,
0,17 g; ZnSO4-7H2O, 0,29 g)

A concentração de oxigênio dissolvido diminuiu gradualmente para 10% de saturação, valor alcançado ao fim de 2 dias de cultivo. A partir desse momento, a concentração em oxigênio dissolvido foi controlada abaixo de 10%, por variação automática da velocidade de agitação entre 400 e

800 rpm. Ao fim de 1 dia nestas condições, verificou-se o aumento muito rápido da viscosidade do caldo de fermentação, o que foi relacionado com a produção do polímero.

Ao fim de 4 dias de cultivo a concentração do polímero foi de aproximadamente 13,3 g/L, o que se refere ao polímero 15 extraído e quantificado na sua forma semipurificada (Figura 3). A viscosidade do caldo de fermentação aumentou significativamente entre o dia 4 e o dia 7, embora a produção de polímero tenha diminuído. A produtividade alcançou o valor de 3,6 g L^-1 dia^-1 e o rendimento em glicerol foi de 0,47 g

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33/38 g^-1, considerando o intervalo de tempo durante o qual teve lugar a produção do polímero (do dia 1 ao dia 4).

O cultivo foi terminado no dia 7, quando a viscosidade do caldo de fermentação atingiu 3,0 Pa.s, a uma taxa de cisalhamento de 5 s^-1, e T = 30 °C.

Exemplo 2: Extração e purificação do polímero contendo fucose produzido por Enterobacter sp. A47 (DSM 23139), a partir de glicerol, subproduto da indústria do biodiesel

No final do processo de cultivo descrito no Exemplo 1, o polímero contendo fucose foi recuperado do caldo de fermentação, na forma de três produtos diferentes com três diferentes graus de pureza: polímero nativo, semipurificado e purificado.

O polímero, na sua forma nativa, foi obtido pela adição de acetona diretamente no caldo de fermentação (3:1). A concentração do polímero nativo foi de 20,6 g/L.

Para a obtenção do polímero semipurificado, o caldo de fermentação foi primeiro diluído para reduzir a viscosidade (2 litros de água desionizada para cada litro de caldo de fermentação) e depois a biomassa foi separada por centrifugação (20 000 rpm, 30 minutos). Em seguida, o sobrenadante sem células foi adicionado lentamente a acetona (3:1) com agitação suave. O precipitado foi dissolvido em água desionizada e liofilizado. A concentração do polímero semipurificado foi de 11,6 g/L.

Com o objetivo de obter o polímero purificado, uma solução aquosa do polímero semipurificado foi processada por diálise em contato com água desionizada, durante 24 horas usando uma membrana de 3500 MWCO (SnakeSkinTM Pleated Dialysis Tubing 68035 - Thermo Scientific). Foi adicionada

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34/38 azida de sódio (6 ppm) para prevenir a degradação microbiana do polímero. Após a diálise, o polímero foi precipitado pela adição de acetona, redissolvido em água e liofilizado A concentração do polímero purificado foi de 5,5 g/L.

Como alternativa, o polímero pode ser extraído/purificado usando a seguinte metodologia: diluição do caldo de fermentação e separação da biomassa por centrifugação; aquecimento a 60°C durante 1 hora, para inativação das enzimas presentes no sobrenadante e que podem ser responsáveis pela degradação parcial do polímero; diálise do sobrenadante em contato com água desionizada e finalmente liofilização. Com este método foram recuperados 5,0 g/L de polímero purificado.

Exemplo 3: Análise química do polímero contendo fucose produzido por Enterobacter A47 (DSM 23139)

A composição do polímero produzido como descrito no Exemplo 1 e extraído como descrito no Exemplo 2 foi caracterizado em termos da sua composição química, ou seja no que diz respeito à sua composição em açúcar, o teor de grupos acila e a quantidade de resíduos que não contêm açúcar (proteínas e cinzas), usando os métodos descritos por Freitas et al (2009). Foi realizada ao longo do tempo a análise da composição química de todos os graus de pureza do polímero (nativo, semipurificado e purificado por diálise) durante o ciclo de cultivo.

Ao fim de 1 dia de cultivo o polímero era constituído principalmente por glucose (77%) e galactose (15%), com quantidades menores de (6%). Ao longo do cultivo, a proporção relativa entre estes monómeros de açúcar variou significativamente: a quantidade de glucose no polímero

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35/38 diminuiu gradualmente para 40% no dia 4, e a quantidade relativa de galactose e fucose aumentou para 26% e 28%, respectivamente.

A composição em açúcares manteve-se praticamente inalterada durante os três últimos dias de operação. De fato, nesse período de tempo, a composição em açúcares manteve-se praticamente inalterada (glucose, 40-44%; fucose, 26-30%; galactose, 28-29%).

Observou-se ainda uma variação na proporção relativa dos grupos acila ao longo do tempo: variou de 2,4% de succinato, 0,2% de piruvato e 0,3% de acetato no dia 1 para 20% de succinato, 2,4% de piruvato e 2,0% de acetato no dia 4. Depois no dia 7 observou-se uma diminuição no teor de succinato para 3,9%, juntamente com um aumento de piruvato (4,9%) e acetato (3,6%).

A composição em termos de açúcar e grupos acila constituintes é semelhante para os polímeros de graus de pureza diferentes. O mesmo não acontece para o caso de proteínas e cinzas. O teor desses componentes diminui do polímero nativo para o semipurificado, e deste último para o polímero purificado.

Exemplo 4: Produção do polímero contendo fucose a partir de glicerol, subproduto da indústria do biodiesel, por cultivo da bactéria Enterobacter A47 (DSM 23139) em diferentes condições de pH e temperatura

A bactéria Enterobacter A47 (DSM 23139) foi cultivada em biorreatores de 2 L, como descrito no exemplo 1, exceto pelo fato da temperatura e do pH terem sido controlados a diferentes valores, de acordo com a Tabela 4. No final de cada ensaio, os polímeros foram recuperados como descrito no

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36/38 exemplo 2.

Tabela 4: Valores de pH e temperatura testados.

ensaio	Temp (°C)	pH	μ (h^-1)	^Xmax (g/L)	^EPSmax (g/L)	^rP (g/L,d)	^Yp/S ⁽g.g^-1)
1	30,0	7,0	0,30	7,14	8,37	5,00	0,17
2	30,0	7,0	0,32	7,58	10,13	4,94	0,21
3	20,0	6,0	0,14	7,41	0,82	0,19	0,01
4	40,0	6,0	0,34	9,20	2,59	0,81	0,03
5	20,0	8,0	0,13	8,39	4,40	2,54	0,10
6	40,0	8,0	0,22	5,63	1,62	1,34	0,04
7	15,9	7,0	0,08	8,17	1,12	0,33	0,02
8	44,1	7,0	—	0,21	0,23	0,06	0,02
9	30,0	5,6	0,10	10,62	7,50	2,05	0,09
10	30,0	8,4	0,07	3,01	2,67	2,38	0,09

Constatou-se que as condições que maximizam o crescimento celular, a produção de polímero e a sua produtividade são temperatura entre 25 e 34°C, e pH controlado entre 6,5 e 7,5 (Tabela 4). Adicionalmente, nestas faixas de temperatura e pH, o conteúdo do polímero em fucose 10 é máximo. Fora destas faixas, a cultura sintetizou polímeros com composições diferentes, tais como, por exemplo: redução do teor de fucose (<14%), concomitante com um aumento do teor de glucose (>50%) e o aparecimento de novos monómeros (por ex. ramnose e glucosamina) como componentes principais 15 (até 20% e até 10%, respectivamente). O ácido glucurônico também foi detectado nestes polímeros com um teor de até

15%. O teor em grupos acila também foi afetado pela temperatura e pelo pH durante o cultivo, tendo sido reduzidos

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37/38 para teores inferiores a 10% da massa seca do polímero.

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Claims

1. Processo para a preparação de um polímero compreendendo um polissacarídeo contendo fucose caracterizado pelo fato de que o processo compreende:

a) uma fase descontínua compreendendo cultivar uma cultura microbiana em um meio de cultura em um biorreator agitado e aerado, em que o meio de cultura compreende uma fonte de carbono compreendendo glicerol ou misturas contendo glicerol, uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos;

b) uma fase descontínua alimentada compreendendo cultivar a cultura microbiana sob condições de disponibilidade de carbono e limitação de nitrogênio, em que a cultura microbiana compreende microrganismos do gênero Enterobacter A47 (número de acesso DSM 23139);

c) extração do polímero; e

d) purificação.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura na fase descontínua tem uma concentração inicial de oxigênio dissolvido superior a 70%, em que a concentração de oxigênio dissolvido é controlada para níveis inferiores a 30% na fase descontínua alimentada, em que a fonte de nitrogênio é limitada a quantidades inferiores a 0,3 g/L na fase descontínua alimentada, e em que a fonte de carbono é fornecida durante a fase descontínua alimentada para coincidir com sua taxa de consumo microbiano.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que meio mineral é introduzido no biorreator durante a fase descontínua alimentada.

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4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura da cultura microbiana é controlada entre 15 e 45 °C, e o pH é controlado entre

5,0 e 9,0.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma etapa de secar a cultura microbiana a uma temperatura até 80 °C, ou liofilizar a cultura microbiana.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de extração compreende uma etapa de extração e uma etapa de precipitação compreendendo adição de 1-3 volumes do agente precipitante para cada volume de meio de cultura.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificação compreende a purificação do polímero por diálise, ultrafiltração ou diafiltração.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o volume de inóculo é entre 10 e 30% do do meio de reação total no início da fase descontínua.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é um resíduo ou subproduto alimentício ou industrial.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é entre 2 e 10% (p/v) do meio de cultura durante a fase descontínua, e superior a 0,1% (p/v) na fase descontínua alimentada.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração inicial da

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3/3 fonte de nitrogênio na fase descontínua é entre 0,6 e 3,0 g/L, e inferior a 0,3 g/L na fase descontínua alimentada.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero tem um peso molecular médio de 10⁶ - 107, e em que o polímero compreende fucose em uma quantidade de pelo menos 10% do teor total de carboidrato e os grupos acila representam até 25% do peso seco do polímero.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os grupos acila são succinato, piruvato, acetato ou combinações dos mesmos.

14. Processo, de acordo a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o polímero compreende uma quantidade de glicose entre 20%-70% do teor total de carboidrato e uma quantidade de galactose entre 10%-40% do teor total de carboidrato.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o succinato compreende os até 20% do peso seco do polímero, piruvato compreende até 5% do peso seco do polímero, e acetado compreende até 5% do peso seco do polímero.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o polímero tem um comportamento de fluido pseudoplástico em meios aquosos, com uma viscosidade estável a temperaturas até 80 °C, pH entre 3-10 e força iônica de até 20% de NaCl.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o polímero é insolúvel em solventes orgânicos.