JP5559032B2 - ガラクトースに富む多糖、その製造方法及びその応用 - Google Patents
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Description
本発明は、ガラクトース(50〜90%)、グルコース(1〜25%)、マンノース(1〜25%)及びラムノース(0.5〜20%)を備える高分子量(106以上)のヘテロ多糖類を主成分とする生体高分子に関する。本発明の多糖は、さらに、微量のキシロース、リボース、フコース、アラビノース又はフルクトースを含んでもよい。このようなガラクトースに富む高分子は、非糖成分として、アシル基、即ち、酢酸エステル、ピルビン酸ケタール及びスクシニル半エステル、並びに無機残渣、即ち、リン酸塩及び金属カチオンを含む。本発明の多糖の成分分析によれば、ウロン酸及びアミノ糖が存在しないことが確認された。
2.1.微生物の培養
ガラクトースに富む高分子は、微生物発酵工程により得られる。前記培養される微生物は、シュードモナス属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、エルウィニア属、アルカリゲネス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属又はラルストニア属の一つに属する細菌であるだろう。培養される微生物は、好ましくは、シュードモナス・オレボランス系統である。
微生物発酵に用いられる培地は、炭素源、窒素源及び無機塩を含む栄養水性培地からなる。炭素源は、好ましくはグリセロール又はグリセロールに富む基質である。代替的に、炭素源は、単量体の糖、二量体の糖若しくはオリゴ糖(例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース)、アルコール(例えばメタノール、エタノール、マニトール、ソルビトール)、有機酸(例えば、クエン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、オクタン酸塩)、アルカン(例えば、ヘキサン、オクタン)又はそれらの混合物であってもよい。炭素源は、例えば、糖液、バイオディーゼル生産由来のグリセロールに富む製品、乳清又はオリーブオイル生産廃棄物等の上記参照された1つ以上の化合物を含んでいてもよい。
発酵工程は、圧縮された空気による曝気下、上述した水性栄養培地に、微生物培養のための植菌を行うことにより開始される。温度は、5〜75℃の範囲の間、好ましくは26〜37℃の範囲の間に管理され、pHは、4.0〜9.0の範囲の間、好ましくは6.0〜7.5の範囲の間に管理される。曝気速度は、発酵の間、溶存酸素濃度管理として、0.1〜2.0vvmの範囲の間で一定に維持するか、又は0〜2.0vvmの範囲の間で可変にしてもよい。
発酵終了後、ガラクトースに富む高分子は、発酵ブロスを単に80℃以上の温度にして乾燥させることにより、又は凍結乾燥することにより、直接回収することができる。
本発明の高分子は、乳化活性及び凝集活性を有しており、pH、イオン強度及び温度変化に対して安定した粘度を有する粘性溶液を形成する。この方法によれば、この高分子は、アルギン酸塩、カラギーナン、グァーガム及びキサンタンガムと同一の領域、例えば、食品業界及び製薬業界と同様に、化粧品業界等の分野に適用することができる。
・スラリー爆薬中の結合材として、又は棒状火薬の防水剤として爆薬(例えば、硝酸アンモニウム、及びニトログリセリン)に、
・掘削井戸における懸濁液として石油産業に、
・染色の増粘剤として繊維工業に
・凝集剤として、水処理及び鉱業に
広く用いられる。
シュードモナス・オレボランスNRRL B−14682を表1に示す組成を有する栄養培地8Lに植菌した。生物反応器(Biostat B−plus(商品名)、Sartorius社製)の条件は、管理される温度が30℃であり、1M−NaOH又は1M−H2SO4の自動添加により、管理されるpHが6.75〜7.00の範囲の間であり、曝気速度が0.5vvmに対応する4slpm(標準リットル/分(standard liters per minute))で一定とした。細胞増殖に伴い、溶存酸素濃度を発酵開始時点における80%から徐々に低下させ、20時間以内に約50%とした。
実施例2に記載したように、発酵工程が終了した後、天然型であるガラクトースに富む高分子を、エタノールを添加(1Lの栄養ブロスに対して3Lの96%エタノール)し、その混合物を−20℃で1時間保管することにより、培養ブロスから沈殿させた。所定の時間が経過した後、沈殿された高分子を遠心分離(10000rpm、5分)によって回収し、得られた画分を37℃で48時間乾燥させ、残りを凍結乾燥(24時間)した。この高分子は、前記乾燥した高分子の脱イオン化水(1g/Lの濃度)中における分解、細胞を除去するための遠心分離(20000rpm、30分)、エタノールの添加による再沈殿、最終的な凍結乾燥により、さらに精製された。
実施例1記載の発酵工程及び実施例2記載の抽出及び精製工程により得られた高分子のグリコシル組成を、試料から酸性メタノリスによって生産された単糖類メチルグリコシドのper−O−トリメチルシリル(TMS)誘導体のガスクロマトグラフィ/質量分析(GC/MS)の組み合わせにより分析した。
培養ブロスの粘度を、ブルックフィールドデジタル粘度計を用いて、実施例1の発酵工程中に測定した。測定により得られた結果から、シュードモナス・オレボランスのグリセロール発酵により生産されたガラクトースに富む高分子は、偽塑性流体挙動を有する溶液に由来すると結論付けることができる(図3)。
実施例1で得られたガラクトースに富む高分子を、細胞を除去するために培養ブロスを遠心分離処理し、トリクロロ酢酸(TCA)(全容積である275mlに対して100%w/wTCA溶液を25ml含む)でタンパク質の沈殿を行い、遠心分離によりその分離を行い、最後に、96%の冷したエタノール(1:3)により高分子の沈殿を行い、さらに凍結乾燥(24時間)を行った。
Claims (11)
- シュードモナス・オレボランスを含む微生物培養発酵により得られる50〜90%のガラクトース、1〜25%のグルコース、1〜25%のマンノース及び0.5〜20%のラムノースを含むガラクトースに富む高分子の製造方法において、
a.炭素源、窒素源及び無機塩と、溶存酸素濃度を80%以上に維持するように曝気され、26〜37℃の範囲の温度と、6.0〜7.5の範囲のpHとを有する水性栄養培地に植菌する工程と、
b.培養ブロス中の前記溶存酸素濃度が、50%以下の水準に到達した場合に、炭素源が10〜100g/Lの範囲の濃度に維持され、窒素源が消費し尽くされるか、又は0.3g/L以下の濃度となるように、窒素源を有するか又は有さずに、炭素源及び無機塩からなる供給溶液を培養に供給する工程と、
c.生物反応器内の培養ブロス中の溶存酸素濃度が、20%以下若しくは全く存在しないように管理し、炭素源を10〜100g/Lの範囲に維持し、窒素源が消費し尽くされるか又は0.3g/l以下の濃度に維持する工程とを備えることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
細菌シュードモナス・オレボランスは、変異体、突然変異体、シュードモナス・オレボランス菌株であることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1又は請求項2に記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
細菌シュードモナス・オレボランスは、シュードモナス・オレボランスNRRL B−14682であることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1乃至3いずれか1項記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
前記微生物培養発酵は、純粋培養又は混合培養であって、微生物を少なくとも1種存在するように、いくつかの微生物を備えることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
前記炭素源は、グリセロール若しくはグリセロールに富む基質、
代替的に糖、アルコール、有機酸又はアルカン、これらの混合物、又はこれらとグリセロールの混合物であることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1又は5記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
前記炭素源は、グリセロール、糖、アルコール、有機酸及び/又はアルカンを含む食品又は産業廃棄物であることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
前記窒素源は、無機塩、有機窒素化合物又はその混合物であることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
前記窒素源は、窒素化合物を含む食品又は産業廃棄物であることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
ガラクトースに富む高分子は、乾燥若しくは凍結乾燥、
又は代替的に培養ブロスを連続的に、
a.前記培養ブロスから、遠心分離、ろ過、沈殿又はヒドロサイクルにより微生物細胞を除去する工程と、
b.アセトン、エタノール又はプロパノールから選択される極性溶媒の添加により多糖を沈殿する工程と、
c.沈殿した高分子を、遠心分離及びろ過により分離する工程と、
からなる工程により抽出することによって、前記培養ブロスから直接回収されることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項9記載のガラクトースに富む高分子の製造方法において、
ガラクトースに富む高分子は、
a.透析工程と、
b.超音波処理工程と、
c.沈殿により遊離タンパク質の除去、60〜120℃の範囲の温度による加熱処理若しくはオートクレーブ処理又はトリクロロ酢酸の添加に続く遠心分離又はタンパク質分解酵素を添加する工程と、
d.核酸分解酵素の添加による核酸の除去
からなる工程の少なくとも1つからなる精製工程によるものであることを特徴とするガラクトースに富む高分子の製造方法。 - 請求項1記載のガラクトースに富む高分子の製造と同時に、ポリヒドロキシアルカノエートの共生産を行うために請求項1乃至請求項10記載のいずれか1項記載のガラクトースに富む高分子の製造方法を用いる方法。
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