JP3057221B2

JP3057221B2 - 特異な粘性特性を有する新規多糖体及びその製造方法

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Publication number: JP3057221B2
Application number: JP9025713A
Authority: JP
Inventors: 和彦岡村; 英司簗瀬
Original assignee: 通商産業省基礎産業局長
Priority date: 1997-01-27
Filing date: 1997-01-27
Publication date: 2000-06-26
Anticipated expiration: 2017-01-27
Also published as: JPH10204103A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、粘性特性の調節可
能な新規多糖体及び細菌を用いるその製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来より、微生物由来の多糖体、例えば
キサンタンガム、レバン等は、それらの特異な物性に基
づき、食品、化粧料及び飼料等の添加剤、さらに産業用
材料として用いるられている。例えば、キサンタンガム
は細菌キサントモナス・カンペストリクス（Xanthomona
s campestrics）が菌体外に産生する高分子多糖で、１,
４-β-Ｄ-グルコシド結合の連鎖に一つのグルクロン酸
と二つのマンノースからなる側鎖を有する多糖体であ
る。その水溶液は、室温付近では殆ど非ニュートン性の
粘性液体として挙動し、熱やアルカリ、酸にも比較的安
定である。具体的には、キサンタンガムはこのような特
性を利用して、食品や化粧料の粘性特性の改善等の目的
で使用されてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、キサン
タンガムを初めとする従来の多糖体は、それらの粘性特
性に基づき多岐の分野で使用されている。しかしなが
ら、これらの多糖体は、一般に、濃度変化により粘性の
程度を変動させることができるとはいえ、流動性のある
粘性領域と固化（ゲル化）領域との中間的な性質（ゾ
ル）を維持することが困難であった。また、高温時の固
化安定性、pＨ安定性についても必ずしも満足できるも
のではなかった。

【０００４】従って、例えば食品形態等の多様化が図ら
れている近年の技術的背景を考慮すれば、濃度変化によ
り、単に粘性の程度を変動しうるだけでなく、粘性溶液
からゲル化状態にまで変動しうる多糖体を提供すること
が望まれるであろう。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、各種培地
での各種微生物の生育や生産物について研究してきたと
ころ、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌
が、増粘性とゲル化能を併せもつ多糖体を産生すること
を見い出した。また、この多糖体は従来技術文献に未載
でもある。

【０００６】従って、本発明によれば、上記課題を、
（Ａ）ゲルろ過カラムを用いる高速液体クロマトグラフ
ィーにより測定した場合の分子量が約１６０万であり、
（Ｂ）構成成分として、１：１のモル比でグルコースと
マンノース残基を含んでおり、そして（Ｃ）５℃ないし
１０℃において、０.５（重量／容量）％の水溶液は粘
性溶液となるが、１（重量／容量）％の水溶液はゲル化
状態となる、ことを特徴とする粘性特性の調節可能な多
糖体、の提供により解決できる。

【０００７】また、本発明によれば、前記多糖体を効率
よく製造するための方法も提供される。具体的にはこの
方法は、該多糖体を産生しうるシュードモナス（Pseudo
monas）属細菌を栄養培地で培養し、培養物から該多糖
体を採取することを特徴とするものである。

【０００８】

【発明の具体的な態様】本発明に従う多糖体は、上記
（Ａ）ないし（Ｃ）の特徴を有するが、さらにその溶液
の粘性特性を詳述すると、次のとおりである。すなわ
ち、該多糖体は、通常の室温下では、約０.５〜約１.０
（重量／容量）％の水溶液が粘性溶液の状態にあるが、
約２（重量／容量）％の水溶液ではゲル化状態になる。
さらに、該多糖体の約３（重量／容量）％の水溶液は、
さらなる高温度においてもゲル化状態になる。また、一
旦こうして形成されたゲル化状態は、その後１００℃で
３０分間インキュベートしてもゲル化状態を安定に保ち
得る。その上、前記ゲル化状態は、酸性からアルカリ性
までの広い範囲において安定であり、例えば室温では、
強酸性（０.５規定塩酸）条件下でもゲル化状態を保持
する。

【０００９】以上のように、本発明に従う多糖体は、増
粘性に加えて、既知のキサンタンガムやレバン等には見
られない極めて特異な物性を示すので、食品、化粧料、
飼料等の分野で広範に利用することができるであろう。

【００１０】前記本発明に従う多糖体は、本発明のもう
一つの態様であるシュードモナス（Pseudomonas）属細
菌を栄養培地で培養する方法によって効率よく製造する
ことができる。シュードモナス属細菌は、シュードモナ
ス属に属し、該多糖体を産生しうるものであれば、その
種、株を問わず使用することができる。しかし、その中
でも、本発明者らにより、鳥取県鳥取市の土壌からエタ
ノール資化性菌として分離された細菌であって、工業技
術院生命工学工業技術研究所に平成９年１月７日付で寄
託され、受託番号FERM P−１６０２５が付された、シュ
ードモナス・スツツェリ（Pseudomonas stutzeri) ＢＬ
５８株が特に好ましいものとしてあげられる。

【００１１】本菌の多糖体産生用の栄養培地としては、
一般にシュードモナス属細菌を生育することのできる、
炭素源、窒素源、酵母エキス及び金属塩類を含むいかな
る培地を用いてもよい。

【００１２】通常、炭素源としてグルコース、フルクト
ース、シュークロース、グリセロール、植物油脂類、エ
タノール、プロパノール、ブタノール等を用いることが
できる。最適の炭素源はエタノールであり、初発濃度
０.１〜８％（v/v）、好ましくは１〜４％（v/v）で用
いられる。エタノールは培養開始時、あるいは培養中に
遂次添加する方法がとられる。

【００１３】窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、
アミノ酸混合液、無機アンモニウム塩、アンモニア等を
０.０５〜５％、好ましくは０.１〜２％で用いることが
できる。

【００１４】無機金属塩としては、カリウム、マグネシ
ウムのりん酸塩または硫酸塩が１００〜１,５００mg/l
で、カルシウム、亜鉛、鉄、マンガンの硫酸塩、塩酸塩
又はりん酸塩を各成分が１mg〜１００mg/lの範囲で用い
ることができる。

【００１５】ビタミン等の微量要素を酵母エキスの０.
０５〜１g/lの割合で添加することもできる。

【００１６】培養は、振とう培養又は深部通気撹はん培
養等の好気条件により、通常１〜１０日間行う。培養温
度は１５〜４５℃、好ましくは２５〜３７℃がよく、p
Ｈは７〜１２、好ましくは９〜１０がよい。培養終了後
は、適宜希釈して粘度を下げ、遠心分離、膜ろ過等によ
り除菌後、真空凍結乾燥、噴霧乾燥、加熱真空乾燥等を
行い、本発明に従う多糖体を提供できる。

【００１７】なお、本発明に従う好ましい菌株である上
記ＢＬ５８株は、以下の菌学的性質をもつことにより、
シュードモナス・スツツェリ（Pseudomonas stutzeri）
と同定された。

【００１８】（菌学的性質）ＢＬ５８株をバージェイズ
マニュアルオブシステマティクバクテリオロジ
ー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）第
１巻（１９８４）の記載に基づいて分類学的性質を調べ
た結果を以下に示す。

【００１９】性質物性形態学的性質コロニー形態大小不同、波状緑、クリーム色、でこぼこ、不透明、低凸状直径２ｍｍ運動性＋胞子形成 − グラム染色 − 生理学的性質生育温度 (３７℃) ＋ (４１℃) ＋ (４５℃) ＋カタラーゼ＋オキシダーゼ＋ウレアーゼ＋グルコースの発酵性 − ＮＯ₃還元 − インドール生産 − グルコース由来の酸 − アルギニンジヒドロラーゼ − エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 − β-ガラクトシダーゼ − グルコース同化＋アラビノース同化 − マンノース同化 − マンニトール同化 − Ｎ-アセチルグルコサミン同化 − マルトース同化＋グルコン酸同化＋カプリン酸同化＋アジピン酸同化 − リンゴ酸同化＋クエン酸同化＋酢酸フェニル同化 − シトクロムオキシダーゼ＋マレイン酸培養液のアルカリ化＋ Tween８０ − デンプン＋フェニルアラニンデアミナーゼ＋以上の結果、ＢＬ５８株を上述のとおり同定した。

【００２０】

【実施例】本発明を実施例により、さらに詳細に説明す
る。

【００２１】例１：ＢＬ５８株の分離鳥取県鳥取市の土壌より採取した土壌試料０.１gを５ml
の下記表Ｉの培地に懸濁し、３０℃で５日間振とう培養
を行う。この培養液０.１mlを同じ新しい培地５mlに植
菌して、３０℃で５日間振とう培養する。この操作を３
回繰り返して集積培養し、同組成の寒天平板培地上でコ
ロニーを形成させることによってエタノール資化性微生
物を単離する。これらの取得微生物の中で最も多糖類生
産力の高い菌株としてＢＬ５８株を選抜した。従って、
本発明の多糖体の生産は、本特異的方法によって得られ
る他の微生物によっても可能である。

【００２２】表Ｉ：培地 C₂H₅OH 3％(v／v) (NH₄)₂SO₄ 1.5g／l (NH₄)₂SO₃ 1.5g／l NH₄NO₃ 1.5g／l KH₂PO₄ 1.5g／l K₂HPO₄ 0.67g／l MgSO₄・7H₂O 0.3g／l CaCl₂・2H₂O 0.01g／l ZnSO₄・7H₂O 0.01g／l FeSO₄・7H₂O 0.01g／l MnSO₄・7H₂O 0.001g／l酵母エキス 0.5g／l 上記表Ｉの培地組成からみられるように、ＢＬ５８株
は、天然土壌試料からエタノール資化性菌として得られ
たものである。このような特異的培地を用い、上記方法
に従えば、当分野の技術に習熟した者であれば、本発明
に使用できる菌株を容易に取得できる。

【００２３】例２：ＢＬ株による多糖体産生条件例１にＢＬ５８株の分離に用いた表Ｉの培地組成は、Ｂ
Ｌ５８株による多糖体の産生にも適したものである。以
下、かかる培地組成を基本とする培地でＢＬ５８株を培
養する例を示す。なお、実施例中でパーセンテージを表
示する際の「％（v/v）」及び「％（w/v）」は、それぞ
れ（容量／容量）％及び（重量／容量）％を意味する。

【００２４】スラント保存培地より１白金耳量を１００
mlの培地（エタノール１％（v/v））を入れた坂口フラ
スコ中に植菌し、３０℃、２４時間培養した。この培養
液１mlをエタノール（３％（v/v））を含む同培地に接
種し、３０℃で培養した。初発培地pＨを７〜１１で実
施した結果を図１に示した。pＨ８において生育は速い
が、多糖体の産生による粘度増加は認められなかった。
一方、pＨが９以上では生育のための誘導期が認められ
るものの、培養液の粘度増加が顕著であり、pＨ１０〜
１１の条件では培養液は完全にゲル化した。本菌株はア
ルカリ性条件下でのみ、多糖体を効率よく産生した。

【００２５】次に、培地中のエタノール濃度の影響につ
いて調べた。初発エタノール濃度を１〜８％（v/v）ま
で変えて生育を調べた結果を図２に、また多糖体の産生
量（全糖量にて表示）を図３に示した。

【００２６】炭素源としたエタノール濃度が１〜２％
（v/v）ではＢＬ５８株は速やかに生育したが、エタノ
ール濃度を高くするに従って、生育の誘導期が長くな
り、７％（v/v）以上のエタノール濃度では生育は認め
られなかった。エタノール濃度が４％（v/v）までは多
糖体の産生量も増加する傾向にあり、エタノール濃度２
〜５％（v/v）では培養液はゲル化し、高い多糖体の産
生を示した。エタノール濃度が５％（v/v）以上では多
糖体の産生量は低下した。

【００２７】（各種炭素源の影響）ＢＬ５８株の多糖体
の産生に及ぼす炭素源としてのアルコール類と糖類の影
響を図４に示す。本菌は０.５％（v/v）のプロパノール
やブタノールを炭素源として利用したが、メタノールで
の生育は認められなかった。また、本菌は３％（w/v）
のグリセロール、グルコース及びフルクトースを炭素源
として生育したが、ラクトースでは生育しなかった。多
糖体の産生においては、エタノールの場合は０.５％（v
/v）濃度においても培養液の粘度の増加が観察された
が、他のアルコール類では培養液粘度の増加はほとんど
認められなかった。一方、糖質を炭素源とした多糖体の
産生は、対象とした３％（v/v）エタノールでは培養液
は完全にゲル化するのに対し、３％（w/v）のグルコー
スやフルクトースの場合には培養液の粘度増加のみが観
察され、ゲル化するまでには至らなかった。

【００２８】例３：多糖体標品の調製及びその特性ＢＬ５８株を上記表Ｉに示す培地１００mlを入れた坂口
フラスコ合計１０本に培養し（３０℃、５日間、初発p
Ｈ１０.０）、ゲル化した培養液に蒸留水を添加して希
釈した後、その遠心分離上清を蒸留水に対して透析し
た。多糖体を透析液の凍結乾燥標品として調製した。以
後の分析は、多糖体凍結乾燥標品を用いた結果を示す。

【００２９】（多糖体の化学構造）ＢＬ５８株が産生す
る多糖体の分子量を、ＳｈｏｄｅｘＧＳ−７１０（商
標）のゲルろ過カラムを用いて高速液体クロマトグラフ
ィーにより測定した、既知分子量のデキストリンを分子
量マーカーとして用いて測定した結果、ＢＬ５８株の産
生する多糖体の分子量は約１６０万と推定された。

【００３０】本多糖体の構成成分はグルコースとマンノ
ースが１：１の割合からなり、微量の有機酸を含んでい
た。本多糖体の組成成分は以下の方法を用いて分析し
た。

【００３１】１％（w/v）の多糖体を２規定のＴＦＡ
（トリフルオロ酢酸）存在下で酸加水分解（１００℃、
１２時間）した後、その分解物を薄層クロマトグラフィ
ーと高速液体クロマトグラフィーを用いて分析した。薄
層クロマトグラフィーの結果を図５に示した。

【００３２】ゲル化に及ぼす多糖体濃度と温度の影響を
調べた。０.５〜３.０％（w/v）濃度の多糖体溶液を調
整し、各濃度でのゲル化を観察した。１％、２％及び３
％（w/v）の多糖体水溶液では、それぞれ１０℃、３０
℃、５５℃まで完全に固化しており、ゲル化状態を保つ
ことができた。また、多糖体濃度を調節することによ
り、ゲル化温度を微妙に制御できる特性を示した。これ
らの結果を表IIに示す。

【００３３】（有機溶媒分散効果）１％（w/v）のＢＬ５８株由来の
多糖体水溶液に対して、エタノールやアセトンを１：１
の割合で添加して、ゲル化に及ぼす影響を検討した。通
常の微生物多糖体は有機溶媒により沈殿を生じる。しか
し、ＢＬ５８株の生産する多糖体は５０％のエタノール
やアセトン存在下においても沈殿は観察されず、寧ろ多
糖体溶液中に有機溶媒が分散され、ゲル化を促進した。

【００３４】（金属イオンのゲル化効果）ＢＬ５８株由
来の多糖体１％（w/v）溶液に種々の金属塩を添加した
後、ゲル化に及ぼす金属塩の添加効果を検討した。２価
金属塩の添加により、多糖体のゲル化が促進された。特
に、Ｍｎイオンは低温条件下でのゲル化に有効であっ
た。

【００３５】（多糖体の安定性）ＢＬ５８株由来の多糖
体３％（w/v）溶液は安定なゲルを形成する。そこで、
酸性やアルカリ性条件下での安定性を検討した。pＨ３.
０〜１１.０では安定なゲルを形成したが、pＨ３.０あ
るいはpＨ１１.０に調整して煮沸するとゲルは液化状態
となった。

【００３６】例４：本発明の多糖体に由来するゲルの安
定性例３において調製した多糖体を用いてゲルの温度安定性
を調べた。キサンタンガムとレバンはシグマケミカル
社（Sigma Chemical Co.,USA)の製品を用いた。ポリマ
ーサンプルをそれぞれ蒸留水に３％あるいは５％(w/v)
に溶解し、５０〜１００℃で３０分間保持後、観察した
結果を表IIIに示す。本発明に従う多糖体は５０〜１０
０℃においてゲル化状態を保ったが、キサンタンガムで
はペースト状であり、レバンは粘性を帯びた溶液状を呈
するのみであった。

【００３７】表III ＢＰキサンタンガムレバン温度３％５％３％５％３％５％ 50℃ ＧＧＰＰＳＳ 60℃ ＧＧＰＰＳＳ 70℃ ＧＧＰＰＳＳ 80℃ ＧＧＰＰＳＳ 90℃ ＧＧＰＰＳＳ 100℃ ＧＧＰＰＳＳＧ：ゲル化Ｐ：ペースト状Ｓ：低粘性例５：本発明の多糖体のpＨ安定性例３において調製した多糖体、キサンタンザム（シグマ
ケミカル社製）、レバン（シグマケミカル社製）の
各３％水溶液を１規定塩酸あるいは１規定水酸化ナトリ
ウムによりpＨ２〜１１の各pＨに調整、２５℃、６時間
保持後に観察した。表IVに示すように、本発明による多
糖体はpＨ２〜１１の間において安定なゲル化状態を維
持し、物性の変化は認められなかった。同条件下でキサ
ンタンガムはペースト状になり、レバンは粘性を帯びた
溶液状になりゲル化することはなかった。

【００３８】表IV pＨＢＰキサンタンガムレバン２ＧＰＳ３ＧＰＳ４ＧＰＳ５ＧＰＳ６ＧＰＳ７ＧＰＳ８ＧＰＳ９ＧＰＳ 10 ＧＰＳ11 ＧＰＳＧ：ゲル化Ｐ：ペースト状Ｓ：低粘性次に、３％（w/v）の各多糖体溶液を強酸性（０.５規定
塩酸）、あるいは強アルカリ性（０.５規定水酸化ナト
リウム）条件下で、室温あるいは煮沸（３０分間）を行
い物性変化を観察した。表Ｖに結果を示すように、本発
明になる多糖体は０.５規定塩酸中でも室温でゲルを形
成した。煮沸あるいは０.５規定水酸化ナトリウム水溶
液中では強い粘ちょう液となり、キサンタンザム、レバ
ンよりも明らかに高粘性を保った。

【００３９】表Ｖ溶液ＢＰキサンタンガムレバン 0.5N HCI 室温ＧＰＳ煮沸(30分) ＶＰＳ 0.5N NaOH 室温ＶＰＳ煮沸(30分) ＶＰＳＧ：ゲル化Ｖ：高粘性Ｐ：ペースト状Ｓ：低粘性

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、多糖体の水溶液中の濃
度を調節することにより、低粘性から高粘性、さらにゲ
ル化状態を任意に調節することができる多糖体が提供で
きる。かかる、本多糖体によるゲルは、耐高温性、耐酸
性、耐アルカリ性を有しており、医薬・食品の粘性・品
質改善、化粧料の保湿性・粘性の改善、トイレタリー製
品への応用、建築資材の改良、石油の３次回収への応用
等が計れるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＬ５８株の生育に及ぼす培地pＨの影響。

【図２】ＢＬ５８株の生育に及ぼすエタノール濃度の影
響を示す図。

【図３】培養培地中の初発エタノール濃度と多糖体生産
量の関係を表す図。

【図４】多糖体生産に及ぼす炭素源の影響。

【図５】酸加水分解物の薄層クロマトグラフィーの図。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（Ａ）ゲル濾過カラムを用いる高速液体
クロマトグラフィーにより測定した場合の分子量が約１
６０万であり（Ｂ）構成成分として１：１のモル比でグルコースとマ
ンノース残基を含んでおり、そして（Ｃ）５℃ないし１０℃において０．５（重量／容量）
％の水溶液は粘性溶液となるが、１（重量／容量）％の
水溶液はゲル状となり、かつシュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）属細菌が産生しうることを特徴とする
粘性特性の調節可能な多糖体。
【請求項２】請求項１記載の多糖体の製造方法であっ
て該多糖を産生しうるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）属細菌を栄養培地で培養し、培養物から該多
糖体を採取することを特徴とする多糖体の製造方法。
【請求項３】シュードモナス属細菌がシュードモナス
・スツツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅ
ｒｉ）ＢＬ５８株（ＦＥＲＭＰ−１６０２５号）であ
る請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】栄養培地が炭素源、窒素源、酵母エキス
及び金属塩類を含んでなる請求項２または３記載の製造
方法。
【請求項５】炭素源の全てもしくは一部がエタノール
である請求項２ないし４のいずれかに記載の製造方法。