JP3721521B2 - 多糖類、微生物及びその獲得方法、それを含む組成物及びその利用 - Google Patents

Description

本発明は、新しい多糖類、微生物及びその獲得方法、それを含む組成物及びその利用に関する。
微生物個体群が新しい分子の利用にとっての大きな貯蔵源を構成していることがわかっている。穀物植物の根圏内に存在する細菌についての記述がまず最初に、大部分が麦、ヒマワリ、米及びトウモロコシの根に結びついている窒素固定力をもつ種を明らかにすることを可能にした。これらの種の分離には、特異的な分離方法を完成させることが必要であった。すなわち、根圏に最も適合した細菌の選択を可能にする

及び一部の種の特異的抗体を利用した免疫トラッピング法である。これらの細菌は同様に、根の付着及びコロニー化メカニズムにも関与している。
数年前から、研究の焦点は、根の表面及び根圏内に存在する細菌の大部分がもつエキソ多糖類（ＥＰＳ）産生能力にあてられていた。これらの重合体が、細菌による根のコロニー化及び根のまわりの土壌の凝集において１つの役割を果たしていることは、充分に実証されてきている。
最近の研究努力は、ヒマワリ及び麦の根のまわりの土壌の凝集を刺激するその能力のため、菌株の研究に向けられている。
本発明の目的は、利用が簡単で当然のことながら病原性がなく遺伝的に安定した農業原料（麸の水解物、小麦ペプチド、グルコース糖液、でんぷん製造工場の同時産物の水解物など）をベースとする条件の厳しくない培地上で急速に成長し、ゲロース入り培地上でエキソ多糖類を産生する微生物を提供することにある。
したがって、ｒＲＮＡ １６Ｓについてコードするその遺伝子の地図及び配列付けから、それが

に属するものであることが示されている１つの菌株が明らかにされた。菌株ＹＡＳ３４の染色体のこの領域の核酸（ｒＤＮＡ １６Ｓ）の類似性百分率は、Rhizobiumetliとは９７．２％、Rhizobium leguminosarum（菌株 ＬＭＧ９５１８）とは９６．２％である。遺伝子nodＤ内での根瘤菌（sensulato）の特異的オリゴヌクレオチドプローブでのＹＡＳ３４コロニー上でのハイブリダイゼーションは、陽性であることが判明した（デジョン国立農業研究所のG.Laguerreによる個人的報告）。
遺伝子nodＤの存在及び、根瘤菌属に属する種とｒＲＮＡ１６Ｓについてコードする遺伝子の類似性百分率は、同様に、ＹＡＳ３４菌株が根瘤菌であると断定することを可能にするデータである。
３つの異なるプライマセット（ＲＥＰ、ＥＲＩＣ及びＢＯＸ）を利用したrep−ＰＣＲによるＹＡＳ３４菌株の遺伝子型フィンガプリントは利用可能である。
ＹＡＳ３４は、１９９７年１月１５日にパスツール研究所のＣＮＣＭにＩ−１８０９という番号で寄託されている。
このＹＡＳ３４菌株は、４葉段階で採取したヒマワリ（Helianthus annuus cv Albena）の根の表面（根面）から分離された。利用された種子は、殺菌殺虫剤を用いて処理されてなく、播種前に滅菌された。土壌は、その主要な交換可能陽イオンがカルシウムである壌土質タイプであった。
このＹＡＳ３４菌株は、グラム陰性、好気性カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性菌である。これは、ＲＣＶ−グルコース培地（４ｇ/ｌ）上で白色半透明の弾性コロニーを形成する可動性棒状物である。
ＹＡＳ３４菌株は、好ましくは同化された炭素供給源を含む培地の存在下での発酵により多糖類の生合成を実現する。
多糖類の成長及び産生に関して最も性能の良い含炭素供給源は、グルコース、フルクトース、サッカロース及びガラクトースであることが実証された。
数多くのグリコシドを同化させるこの適性のため、小麦、ジャガイモ及びブドウといった農業材料の分画に由来する植物性の異なる培地上でこの菌株の発酵能力を研究するに至った。以下の表には、テスト対象の異なる培地がまとめられており、一方表IIは、得られた結果を示している。

麸に由来するＦＡＭと呼ばれる培地は、同時に１２ｇ/Ｌのグルコースと５．２５ｇ/Ｌの含窒素材料を含み、菌株の成長（μ max ０．４７ｈ−１）及び多糖類の生合成（培養の終りで４００ｃｐｓに近に粘度）の両方について最も性能が高いものであることが判明した。
特に以下の組成のものを含む異なる合成培地が研究された。
ＲＣＶｓ
グルコース ２０ｇ
酵母エキス １．７２ｇ
緩衝液（２） １５ml
無機溶液（１） ５０ml
浸透水 １リットル十分量
ＤＳＭ
グルコース ２０ｇ
トウモロコシ浸し液 ５ｇ
ＮａＮＯ３ ２ｇ
Ｋ₂ＨＰＯ₄ １ｇ
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．５ｇ
溶液Ｅ（３） ２．５ml
浸透水 １リットル十分量
無機溶液（１）、緩衝液（２）及びＥ（３）の組成。
（１）無機溶液
ＥＤＴＡ（トリトリプレックスII） ０．４ｇ
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２ｇ
ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ２ｇ
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．４４ｇ
元素溶液 ２０ml
浸透水 １リットル十分量
元素溶液
ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ４３０mg
ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １３００mg
Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ７５０mg
Ｈ₃ＢＯ₃ ２８００mg
ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ２２．５mg
ＣｏＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ７０mg
浸透水 １リットル十分量
（２）緩衝液
ＫＨ₂ＰＯ₄ ４０ｇ
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ６０ｇ
浸透水 １リットル十分量
（３）溶液Ｅ
ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ３ｇ
硝酸鉄III １ｇ
ＭｎＳＯ₄ ０．２ｇ
ＺｎＣｌ₂ ０．１ｇ
ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｇ
Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏ ０．０２ｇ
ＣａＣｌ₄ ０．００４ｇ
Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．０１ｇ
浸透水 １リットル十分量
ＮＡ
肉エキス ３ｇ
ペプトン ５ｇ
浸透水 １リットル十分量
表IIIは、得られた結果をまとめている。

この表IIIから、ＮＡ培地といったような窒素が豊富で炭素が欠乏した（Ｃ/Ｎ低）培地が菌株の成長に有利に作用するものの多糖類の産生を可能にしないということがわかる。これに対して、窒素及び炭素を含有する基質が豊富なＲＣＶ及びＤＳＭ培地は、菌株の優れた成長及び多糖類の合成を可能にしながら最良の妥協を実現する。これらの試験は同様に、菌株の成長と多糖類の産生を切り離すことが可能であるということを実証した。
このようにして７．５％の接種体について以下のような組成を菌株の成長のために最適化された予備培養用培地が決定された。
Ｏpt２−ns
グルコース（別途滅菌済み） ２０ｇ
酵母エキス ２．５ｇ
硫酸アンモニウム １ｇ
無機溶液（１） ７０ml
緩衝液 （２） ２０ml
浸透水 １リットル十分量
接種体 ７．５％
同様にして、重合体の産生速度を最大限にするため、エキソ多糖類の産生のために最適化された培地の開発が研究されてきた。したがって、以下でＭＰ１と呼ぶ組成が最も性能のよいものとして規定された。
ＭＰ−１
グルコース ２０ｇ
酵母エキス １．７ｇ
無機溶液（１） ７０ml
浸透水 １リットル十分量
表IVでは、ＲＣＶＳ培地を単独で（基準）又は上述の２つの最適化された培地Opt２−ns及びＭＰ１を利用することによる成長及び産生の結果をまとめた。

以上に説明したように発酵により菌株が産生した多糖類を回収するためには、２つの方法を利用することができる。
第１の方法に従うと、粗製ウワートをまずエタノールでの沈殿に、次に真空下での乾燥に付し、粗製多糖類を含む乾燥産物を得る。得られた産物を１％の溶液の形に戻したものは、増粘特性をもつ。７０〜９５℃（好ましくは８５〜９５℃）の間に含まれる温度で加熱されたこの溶液は、以下の第２の方法に従って得られる精製多糖類から調製された溶液と同じゲル化特性を示す。
この第２の方法に従うと、発酵ウワートを澱抜きし、それを１〜1/20の間、好ましくは１〜1/10の間で希釈する。その後、得られた溶液を７０℃〜９５℃の間に含まれる温度に対する。好ましくはこの熱処理は８５℃〜９５℃の間で実施される。実際には、９０℃の温度での熱処理は、大気温への冷却後でさえ発酵ウワートの液化を誘発する。約１時間９０℃での処理のためには、ゲル化又は冷却温度は２０℃未満である。
熱処理が９０℃未満の温度で実施される場合、これは冷却の後、初期のウワートよりもさらに粘性の高い産物を提供することになる。
したがって、このような熱処理は、特に遠心分離により細胞／重合体の分離を容易にすることができると思われる。
熱処理に由来する産物を、例えば１３０００ｇで遠心分離し、これを接線方向ろ過に付す。
このようにして得られた上清を平板フィルタ上で０．２μｍでの前方ろ過に付す。このような前方ろ過は実際、６００ｎｍにおける光学密度（OD）がほとんどゼロであるきわめて純粋なろ液を得ることを可能にする。

回収したろ液を既知の要領で処理する：すなわちこれを濃縮し、エタノールでの沈殿に付し、次に真空下で乾燥させて、精製済みエキソ多糖類を含む乾燥産物を得る。
以上で言及してきた通り、このエキソ多糖類はその性質面でもその特性面でも新規のものである。
このようにしてNMRスペクトルによって得られた多糖類の構造の見極めが、図１及び２の目的である。こうして、側鎖を有する反復単位の大部分が７個の糖で構成されていることを見極めることができた。すなわち、
− グルコース及びガラクトースを含む６個の中性糖
− １個の酸性糖
である。
同様に、ピルビン酸塩及び酢酸塩置換基の存在も明らかにされた。ピルビン酸塩及び酸性糖の充てん剤は、この多糖類に対し高分子電解質特性を付与する。
利用に際して、２ｇ/ｌを上回る本発明の多糖類濃度について、この多糖類溶液はゲルに変化する。ゲルは、水又はあらゆる食塩水の中に溶解させることによって得られる。この溶解は、本発明の多糖類の溶液を好ましくは６０℃以上まで加熱することによって有利になる。
本発明に従った多糖類は、１％の溶液状態で「クリスタル品質」の完璧な清澄度を呈し、このためこれは、A.MULLER社によりAMIGELのブランドで又はTAKEDA社によりCURDLANの商品名で市販されているもの、KELCO社により市販されているキサンタン及びSANOFI社により提案されているアルギン酸ナトリウムといった既知の製品に比べて特に重要な地位を得ている（以下の表VIを参照）。

なお、本発明に従った多糖類は、既知のものに比べて、最も迅速な溶解状態復帰を示す

本発明に従った多糖類ゲルの機械的特性の研究により、このゲルが強い弾性をもつことを示すことができた：図３は、本発明に従った多糖類ゲルの弾性係数Ｇ′及び損失係数Ｇ″及び複合粘度ｎ^*に対する周波数（Hz）の影響に関するものである（多糖類濃度は０．１０ｇ/ｌでありＮａＣｌ濃度は０．１Ｍである）。
同様にして、多糖類１％（重量/重量）でのゲルの弾性係数に対するイオン強度の影響についても研究された：図４は、１０ｇ/ｌの濃度での本発明に従った多糖類ゲルの０．１３Hzの周波数で測定された弾性係数に対する塩（ＮａＣｌ）濃度の影響に関するものである。
０．０４Ｍを上回るＮａＣｌ濃度以降が、少なくとも０．４Ｍに至るまでの塩濃度でその特性がほとんど変動しなくなった弾性ゲルが得られることが確認される。非常に近い係数か、ＣａＣｌ₂の存在下で得られる。形成されたゲルは、９０℃未満での熱処理について熱可逆性をもつ：図５は、本発明に従った多糖類ゲルの弾性係数Ｇ′及び損失係数Ｇ″及び複合粘度ｎ^*に対する温度の影響に関するものである（多糖類濃度は１０ｇ/ｌでありＮａＣｌ濃度は０．１０Ｍである）。
しかし得られた結果は、処理温度及び処理時間の関数であり、過度に高い処理温度及び処理時間についてはゲルが破壊する可能性がある。ゲルの温度は、イオン強度及びイオンの性質（例えばＮａ^-、Ｃａ²⁺など）によりほとんど左右されない。
塩を含む環境内でのこのレオロジー挙動は、自然に塩を含む３つの環境に関連する数多くの産業部門における利用の展望を提供することから、きわめて興味深いものである。
− 味覚（gout）（約１．５ｇの塩/Ｌ） 食品分野
− 生理的的食塩水（約７．５ｇの塩/Ｌ） 農業、化粧品製薬部門
− 海洋環境（約２５ｇの塩/Ｌ） 石油化学、化粧品（海洋製品レンジ）など。
これらの異なる分野を例示するため、以下では本発明に従った多糖類の応用及び処方例を示すが、これらは何ら制限的な意味をもつものではない。
Ｉ− 化粧品
本発明に従った多糖類には、以下のものとしての利用分野がある。
− クリーム及び乳液の中のヒアルロン酸といったような既知の水分補給剤と混合した状態又は単独での水分補給剤、
− ローション、トニックローション、クリーム及び乳液（白色化粧品）における粘稠剤及び結着剤、
− しわとりゲル、サンフィルターにおける懸濁化剤及び結着剤、
− ヘヤスタイリングジェル、ひげそり前後用ジェル、洗浄用ジェル（シャンプー及びフォームバス剤）におけるゲル化剤。
以下では、いくつかのタイプの利用分野を示す。
モイスチュアライジングクリーム（乾燥材料の重量/重量％）
− 乳化剤 ４％
− 保存料 ０．５％
− グリセロール ５％
− 本発明の多糖類 ０．２５％
− ＮａＣｌ ０．５％
− 水 １００％十分量
この利用分野については、本発明の多糖類は、油性、展延易性及び爽快感レベルで、競合するいくつかの製品に比べ特に有利な物性をもたらす。ろ過能、接着能、被膜形成作用、皮ふの艶及び流動性の減少に対する著しい効果が、図６に示されているように観察された。
メーキャップ落しローション（乾燥材料の重量/重量％）
− ドデシル−テトラデシルガラクツロン酸ナトリウム ０．５％
− ヒアルロン酸ナトリウム ０．２％
− 本発明の多糖類 ０．４％
− ヤグルマギク水 ５．０％
− 保存料 十分量
− 香料、着色料 十分量
− 水 １００％ 十分量
しわとりジェル（乾燥材料の重量/重量％）
− 本発明の多糖類 ０．７５％
− ＮａＣｌ ０．５％
− カルボキシメチルセルロース ０．５％
− 粉砕アンズ果核 ２．０％
− 保存料、着色料、香料 十分量
− 水 １００％ 十分量
洗浄用ジェル（乾燥材料の重量/重量％）
− デシル−ドデシルガラクツロン酸ナトリウム ４．０％
− ラウリルベタイン ３．０％
− Laureth（２）硫酸塩 ３．０％
− アシレートペプチド（Ｃ１２） ２．０％
− エトキシル化カプリン酸/カプリル酸モノ/オリグリセリド １．０％
− スルホルコハク酸２ナトリウムラウリル １．０％
− 本発明の多糖類 ０．５％
− ＮａＣｌ ０．２５％
− 保存料、香料、着色料 十分量
− 水 １００％ 十分量
II− 洗剤
本発明に従った多糖類には、以下のものとしての利用分野がある：
＊ クリームクレンザーにおける結着剤及び懸濁化剤、
＊ 消臭及び消毒用ジェルにおける、ゲル化剤、
＊ 食器洗い用洗剤における結着剤。
クリームクレンザーの場合、考えられる処方は以下の通りである：
− 本発明の多糖類 １．０％
− ＮａＣｌ ０．５％
− 焼成ケイ酸アルミニウム ２５．０％
− ラウリル硫酸ナトリウム ５．０％
− カプリロアンホプロピオネート １．０％
− 防腐剤、着色量、香料 十分量
− 水 １００％ 十分量
III− 食料品
本発明に従った多糖類には以下のものとしての利用分野がある。
＊ 牛乳入りデザート、ドレッシング、ソース（マヨネーズその他）、ゼリー及びジャム、アスピック及びテリーヌにおける結着剤、ゲル化剤及び懸濁化剤。
＊ 特別食用飲料、糖果における粘着剤。
例えば、冷製チョコレートプリンを作るための材料構成（乾燥材料の重量/重量％）は以下のとおりである：
− ロングライフミルク ８３．０％
− 本発明の多糖類 １．２％
− ＮａＣｌ ０．１％
− 砂糖 ８．０％
− ココア粉末 ３．０％
− 脱脂粉乳 ２．０％
− 植物油 ０．７％
− バニラエッセンス 十分量
− 卵 ２．０％
IV− 発酵
この分野では、本発明に従った多糖類は、半固体ゲロース入り培地に対しゲル化されたテクスチュアをもたらす。半固体ゲロース入り培地のための処方例は、乾燥材料の重量/重量％で以下のとおりである：
− ペプトン １％
− グルコース ０．５％
− ＮａＣｌ ０．５％
− 本発明の多糖類 ０．７５％
− 水 １００％ 十分量
Ｖ− 農業
農業では、本発明に従った多糖類には、以下のものとしての利用分野がある：
＊ 土壌凝集剤、
＊ 保水剤、土壌の水ポテンシャル維持への寄与及び干ばつ保護剤、
＊ 種子コーティング剤。
このようにして、ヒマワリの種子上への根瘤菌株の接種は、土壌が予め滅菌されていたか否かに関わらず根の強いコロニー化を得ることができるようにする（それぞれ合計微小植物相の９０％及び１０％）。この接種の結果は、根に付着する土壌の質量の増加（＋５０％）及びこの根圏土壌の多孔性の変化（高透気性の増大）に関するものである。これらの結果は、ＹＡＳ３４菌株により産生されたエキソ多糖類が一方では土壌の団粒の集結に寄与し（「付着」効果）そのため植物に向かっての水の移送用孔の分布度を増加させ、他方ではゲル化された多糖類相の水を保持することを示しているように思われる。
重合体の保水機能を確認するため、「土壌＋１％の精製多糖類」の混合物を調製した。結果は、ｐＦ２．５（畑での容量）で、多糖類が土壌の保水量を５０％増大させ、同様に、重合体の付加（１％）が、土壌を乾燥させるための２倍のエネルギーの適用の必要性という形で現われる、ということを示している。
添付図面として以下の図が提供されている：
図１−脱アセチル化された本発明の多糖類。
ＮＭＲ'Ｈスペクトル（３００ＭHz）、Ｄ₂Ｏ中溶液、Ｔ＝３５８°Ｋ。
図２−本発明の多糖類。ＮＭＲ'Ｈ（３００ＭHz）、Ｄ₂Ｏ中溶液、Ｔ＝３５８°Ｋ。
図３−本発明の多糖類の弾性係数（Ｇ′）及び損失係数（Ｇ″）及び複合粘度ｎ^*に対する周波数の影響。多糖類濃度１０ｇ/Ｌ。ＮａＣｌ濃度０．１Ｍ。
図４−１０ｇ/Ｌの濃度での本発明の多糖類のゲルの、０．１３Hzで測定された弾性係数に対する食塩（ＮａＣｌ）濃度の影響。
図５−本発明の多糖類の弾性係数（Ｇ′）及び損失係数（Ｇ″）及び複合粘度ｎ^*に対する温度の影響。多糖類濃度１０ｇ/Ｌ。ＮａＣｌ濃度０．１Ｍ。
図６−０．２５％の本発明の多糖類及び塩化ナトリウムを含む本発明のモイスチュアライジングクリームの処方（本発明）と先行技術のモイスチュアライジングクリームの処方（先行技術）の感覚比較試験。
最後に、本発明に従った多糖類には塗料における結着剤、粘稠剤及び懸濁化剤としての利用分野もある。

Claims (17)

1. ＣＮＣＭに１−１８０９の番号で寄託されている根瘤菌により合成された、１個の側鎖を有し、グルコース及びガラクトースを含む６個の中性糖及び１個の酸性糖を含む反復単位を有する多糖類であって、その０．２重量％を超える溶液が透明でかつ弾性を有するゲルを形成する多糖類。
2. その溶解がほぼ瞬時であることを特徴とする、請求項１記載の多糖類。
3. ０．２重量％の濃度での水溶液状態でかつ塩の存在下で、透明でかつ弾性を有する懸濁性のゲルを形成することを特徴とする、請求項１記載の多糖類。
4. ＣＮＣＭに１−１８０９の番号で寄託されている根瘤菌であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の多糖類を合成することのできる微生物。
5. ａ）グルコース及び含窒素材料を含む培地上でＣＮＣＭに１−１８０９の番号で寄託されている根瘤菌を培養する段階、
   ｂ）発酵用ウワートの回収段階、
   ｃ）沈殿による粗製多糖類の直接的捕獲段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の多糖類の産生方法。
6. 段階ｂ）に由来する発酵用ウワートが、
   ｄ）７０〜９５℃の間の温度での希釈後の該ウワートの熱処理、
   ｅ）遠心分離、
   ｆ）例えば前方ろ過による段階ｄ）に由来する上清のろ過、
   ｇ）乾燥した形で多糖類を得るためのろ液の処理、
   によって処理されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
7. 段階ａ）で、予備培養用と呼ばれるものと産生用のものと２つの培地を利用することを特徴とする、請求項５記載の方法。
8. いわゆる予備培養用培地が、
   グルコース（別途減菌済み） ２０ｇ
   酵母エキス ２．５ｇ
   硫酸アンモニウム １ｇ
   無機溶液（１） ７０ml
   緩衝溶液（２） ２０ml
   浸透水 １リットル十分量
   接種材料 ７．５％
   の組成を有することを特徴とする、請求項５記載の方法。
9. いわゆる産生用培地が、
   グルコース ２０ｇ
   酵母エキス １．７ｇ
   無機溶液（１） ７０ml
   浸透水 １リットル十分量
   の組成を有することを特徴とする、請求項５記載の方法。
10. 熱処理が７０〜９５℃の温度で行なわれることを特徴とする、請求項５記載の方法。
11. 化粧品の分野における水分補給剤（ヒアルロン酸といった既知の水分補給剤との混合物としてか又は単独で）、粘稠剤、ゲル化剤、懸濁化剤としての、請求項１〜３のいずれか１項記載の多糖類の利用。
12. 洗浄の分野におけるゲル化剤、懸濁化剤としての、請求項１〜３のいずれか１項記載の多糖類の利用。
13. 食料品における結着剤及び懸濁化剤としての、請求項１〜３のいずれか１項記載の多糖類の利用。
14. ゲロース入り発酵培地中のゲル化剤としての、請求項１〜３のいずれか１項記載の多糖類の利用。
15. 農業分野における土壌凝集剤、保水剤及び種子コーティング剤としての、請求項１〜３のいずれか１項記載の多糖類の利用。
16. 塗料における結着剤、粘稠剤及び懸濁化剤としての、請求項１〜３のいずれか１項記載の多糖類の利用。
17. 粘稠剤、ゲル化剤、懸濁化剤、結着剤及び保水剤としての、請求項２記載の多糖類の利用。

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