JPS63240780A - シユードモナス種 atcc 31461 の凍結乾燥培養物 - Google Patents

シユードモナス種 atcc 31461 の凍結乾燥培養物

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JPS63240780A
JPS63240780A JP63040901A JP4090188A JPS63240780A JP S63240780 A JPS63240780 A JP S63240780A JP 63040901 A JP63040901 A JP 63040901A JP 4090188 A JP4090188 A JP 4090188A JP S63240780 A JPS63240780 A JP S63240780A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 複合多糖類はある微生物によって生成されることか知ら
れている。親水性コロイドとしてまたその粘性と流動学
的性質によりこの複合多糖類の作用のいくつかが水性の
系における濃化剤として使われてきた。
科学技術の他の分野に関し、濃化、懸濁およびまたは安
定剤として有用な性質を有する新しい複合多糖類を発見
する目的の研究か継続された。これらの目的の性′ぼ金
有する=r Lい複曾多gを与えることが不発明の目的
でりる。このfr規化合物の襄遺法を与えることも目的
である。さらに濃化またr′i@濁またぼ安定剤として
このfr規複甘せ糖金含む処方の提供も目的である。ま
たさらに不発明の目的は本発明の続く記述から明確にな
るでろろう。
本発明は選ばれた炭素源上で一一の作用に工り生産され
るfr規複合多糖VC関する。−また本発明は制御さ几
た粂汗下で選ばれた炭素源と培養培地成分で細1lli
を培養することf(工り複せ多糖ft製造する新規な方
法VC関する。本発明の41曾多糖は主に炭水化物残基
と歩積の蛋白質を含む高分子量の多糖である。時々これ
は「ガム(g%惧)」と呼ばれるが複合多糖という術語
が工り正確で同碓であると考えら几る。本発明の以下の
記述iCおいて、7化合物は時にエリ複合多糖60また
ば5−60と呼ぶことにする。
この新規化合物は広範囲にわたる分類字的研究に基き、
寸までに禾記載の微生物で無爺名のシュードモナス属の
−(un外αmad Psgudo−monaz zp
gcigt )にエリ適当な栄養培地で醗酵することに
エリ製造することができる。δ亥複合多糖t−製這する
時に使用するこの微生物の拘束を受けない(%nraz
trietgd)  水入を託が1978年11月21
日にアメリカン・タイプ・カルチャー−コレクション(
AmtrietsnType C%1ture Co1
1eCtion ) VC工り受は入れ番号ATCC3
1461で行なわ几た。
シュードモナス(pzgxdomosaz)属のe1々
の分類の手がかり及びシュードモナス(pzasdo−
鴨O舊αI)kAの培養の記述はBarggy’z M
α答舊αl〔ブリード(Braid )ら、(1957
) ]の7阪及びBmrggy″z Manscal 
(ドウドロフら(Dosdoro//)ら、(1974
) )の8版、筐た他の学派による種々の出版物:ヒユ
ー(H舊σh)とギラルゲイ(GilareLi) 、
1974、シュードモナス(ptasdo−rrhon
az)、臨床微生物便覧CMassal of Cli
nicalMierC11nica1 )、2版、レン
ネット(Lanngttg)ら=、250−269ペー
ジ、アメリカ41生掬学依、ワシントンD、C9;ウェ
ーバ−(2,α−ugr )ら、1972、診もしい病
原性ダラム陰性細菌の同定(Idg?Ltiftcat
to%of UnusualPathoggnic  
Gram−Nすαtitx  Bαetmriα ) 
、イー0オー・キング(E、(/、Ki詣σ〕、疾病市
1j御のための2ンター(Center for Di
zaaza Co5troL )、アトランタ:イイズ
カ(Iizska)ら、1963、シュードモナス属の
分類の試み(Attempt ofGroμping 
thg Ggnxz Pzgscdomonaz )、
J、G−n。
Appl、Microbiotogg  9 : 73
−82:ヘンドリツク(klgndric)ら、196
6 、微生物学者のための同定方法(Itignti 
fieat*on Moth adz f6rMicr
obiologiztz)、Aの部(PαrtA)、ギ
ブス(Gihhz)ら胸、l−7ペーし、アカデミツク
・プレス(Acadgmi6 pratl)、ニューヨ
ークに見られる。
これらの手がかりと記述からA’l’CC3L461の
それと同様の形態学的及び培養上の特徴を有するシュー
ドモナスCPz−%dotPLo外at)種を捜した。
以下の考察は新しいンユードモナスCPpudomon
az)T’Mの滑川に必要かつ正当化するものである。
1 細戦形弗の特徴 単細胞、直線またはしばしば曲がった棒状、一般的VC
0,6−0,8X  2.0−3.0am、しばしば先
細になった端、培養期間を受くすると工り大さくエリ長
((0,8−1,0にン3μ風)なり、奇形細胞及び多
形性が、特に炭水化物の制限量の培地上で現わ几る。反
対に、炭水化物を含んだ培地上で生育する時には#II
l@はむしろ一定の桿菌状を保つが、培養が長くなると
再び大部分の細胞は大きくなり多形性が現われる。ダラ
ム陰性、莢膜を有せず、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸とポ
リホスフェートの顆粒が特に@素欠損培地上でのJ@寮
で見られる。極多毛性の鞭毛層性状態による運動性が、
つまり1〜4本の鞭毛がある一万の1tc7f毛及び時
には端に近い(S葛hpolaw)所から着生している
ことにエリ、見られる。
2 コロニー形幅の特徴 肉汁寒天(nutWient agar)平板上では、
小(+ii径0.8−1.1 car )及び犬(直径
3.2−3.5聰)のコロニーが現われる。コロニーは
黄色カロチノイド色素全イし、平滑、円形、凸円状から
クッション状である。大きなコロニーはしばしば同心円
状のしわを有する。コロニーの表面は硬く非粘着性の組
織で白金耳で押すとコロニー全体が除かれる。YM9.
太平板上では、比較的大きい(直径ゴ+6−7m)、黄
色、円形、平滑、粘゛直性、凸円状のただ一糎類のコロ
ニーが現われる。、粘質性で弾力のある膜がコロニーの
表面上に形成され、コロニーの表面の膜全体を除くこと
ができる。二次生育が最初のコロニーの周縁にできる。
これらのコロニーの色は周嫌エクも中心の万がLり暗黄
色であり、同心円状の色素形成が見られる。細側内黄色
カロチノイド色素に加えて、拡散性褐色色素が培養期+
b’lを長くすると自動酸化の結果として現われる。こ
の現象は肉汁嫁入(Nutria%t agar)上で
エリ容易に認めらnる。螢光性色素は生産されなかった
3 生理学的及び生化学的特徴 S−60fi株の生育範囲は約20℃から41℃までで
ある。4℃では生Yifは起きない。
3.0%NaCL は生¥fを阻止するのに充分であり
、菌株は、Mが5と11の間で生育が可能である。
はとんどすべての炭水化物から酸が生成しガスは発生し
ないが、ポリアルコールからは生成しない。ワレアーゼ
は生産される。MR。
〆P、及びインドールテストはすべて直性である。アル
ギニン、ジヒドロラーゼ、リジンとオルニチンデカルボ
キシラーゼは生産されない。リドマス・ミルクでは酸の
生成及び還元が起こる。脂肪分解性卵黄反応(lipo
Lyti。
すg yolk r−αatto%)は陰性である。ゼ
ラチンを弱く加水分解するが、カゼイン、殿粉、アルギ
ン酸、ペクチン、セルロース、キチン、DNAを加水分
解しない。
4 抗生物質に対する感受性 艷株はカナマイシン、ネオマイシン、クロールテトラサ
イクリン、エリスロマイシンに非常に感受性があり、ス
トレプトマイシンとペニシリンにはない。
5 栄養上の特徴 有窓物性の生艮因子は必要ではないし、アンモニウム塩
は単一の窒素源として要求を満たす。少なくとも35の
有機化合物、すなわ)L+−リボース、殿粉、2−ケト
グルコネート、ムケート(1nmeata)以外の大部
分の炭水化物が利用された。さらにアセテート、カプロ
エート、カブリレート、ベンゾエ−ト、スクシネート、
アゼレート、L−マレエート、DL−β−ヒドロ壬クシ
ブチレートピルグエート、エタノール、n−プロパツー
ル、2−ヒドロキシベンゾエート、フェニルアセテート
、L−α−アラニン、L−スレオニン、L−ロ身シン、
DL−インロイシン、L−アスパルテート、L−グルタ
メート、L−チロシンが利用された。
5  DNAのGC含量 DNAの評価はモル壬で〜6BCTmエリ)という結果
になった。
オキシダーゼ:Ko t+ a c” z    僧 
 加水分解能:pathotgeん 僧   ゼラチン
     +(イ)カタラーゼ          +
    カゼイン     −opテス1ト:酸化  
      +    殿粉        −グルコ
ースからのガスの生成         ペクチン  
   一硫化水素の生成:TSI    −アルギン酸
    −シスチンから 十     でルロース  
   −ペプトンカーらアンモニアノ生成   +  
   キチン       −β−ガラクトシダービ(
ONpG)   +(Apr)  DNA      
   −リジン デカルボキシラーゼ        
 諸培地上での生育オルニチン デカルホキシラーt:
!   −IEMB9j天     −トリプトファン
 デアミナーゼ   −     MacConKay
寒天 −フェニルアラニンデアミナーゼ  −SSSガ
クレアーゼ          +1上   マンニト
ール−1π嫁犬 −インドール         − 
   TCBS寒天   −MRテスト       
          Ttnzdal−岨テルル(波V
Pテスト               血o、4天 
    十硝酸塩の還元              
PIg%dozgL仏天 −亜硝酸塩の還元     
  −色素生成:脱窒反応             
   Ki%σA培地   −Nt−固定      
         KingBN地   −Bsrk培
艦ざ遵宥     +   染色性二トロゲナービ活性
             コンゴ・レッド   −ホ
スファターゼ       士 溶血反応(羊血)       − リドマス・ミルク:酸醗ム還元 3−ケトラクトース産主      −60’C,30
分の生存       −TSI:斜面培養     
色変化なし高層培養(Bstt)  色直ぬし ガス       − 卵黄反応          − 培養条件: 複合多糖5−60は無命名のシュードモナスCPf#%
dorno外αI)種の微生物の接種による制御された
東件下で適当な水性栄養培地の好気4女中に生産される
。培地は炭素、窒素、無機L!源を含む通常の培地であ
る。
一般的に、炭水化物(例えば、グルコース、フルクトー
ス、マルトース、砂糖、千シロース、マンニトールなど
)は栄養培地における同化性炭素源とqて単独あるいは
組み付せて便うことができる。培地中I/Cfvf′L
る炭素源または炭素源類の正確なtは一部分培地の他の
成分にLるが、一般的に炭水化物のtは晋通培地重tt
りたり約2%と4%の間で変化する。これらの炭素源は
個々に、またはいくつかの炭素源類を組み合せて培地し
ζ便用できる。
一般に、凝白−件の多くの・17IJ賀が培番工程甲に
おける窒素源として便つことができる。適当な窒素源は
、例えば、酵母加水分解物、生酵母、犬豆紛、綿裏粉、
カゼイン加水分解物、コーンスチーブリカー、蒸留噛残
渣のoT@性紛、トマトペーストなどを含む。′4素源
は、単独でまたは組み合せて、水性培地の重′ffあた
り約0.05係から0.2憾までの範囲の譬で使われる
培養培地に加えることができる栄4t、無機塩類はナト
リウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸
、は酸、塩素、炭酸などのイオンになり得る通常の塩類
である。コバルト、マンガン、鉄、マグネシウムの工う
な痕跡金属もまた含inる。
実施例に述べる培地は使用可能な広範囲の着地の一例に
すぎず、これに限定さ2’Lるものではないことに留意
されたい。
培養は約25℃から35℃までの間の温度範囲で行うが
、最適の結果を得るKは、約28℃から32℃までの温
度で培養を行うことが好適でめる。シュードモナス(p
zgudo犠02%ax)菌の生育及び多ms −60
の生産のための栄養培地のpH(ケ約6から8まで変え
ることができる。
新多糖5−60は表面及び欣中J@餐で生産されるが、
液中培養を行う方が好適である。
小規模の培養は菌を適当な栄誉培地IC接種、生産培地
I/C8した後、約30℃の一足温度、シェーカー上で
数日間培養を行うことに工り便利に行なわれる。
培養は糧菌の生育が培地の入った戚歯フラスコで始めら
れ、工ないしそ几以上の段階を経る。種函生青用の栄養
培地は炭素及び窒素源の適当な組み合せたものである。
種4のフラスコは約30℃の一定温朋で、1〜2日間ま
たは満足な生育が得られるまで振盪し、得られた増殖の
一部を第二段の種または生産用培地にm[することに使
われる。必要とするなら中間段]Vの橿用フラスコを要
するに同報な方法に工す増殖させる。すなわち、直前の
段階の棟用フラスコの内容物の一部が生産培地に接種す
ることに1史わnる。接種したフラスコは一定@度で数
日1”、J1振盪し、培養期の最後vCフラスコの内容
物をイソプロピルアルコールの工うfx適当なアルコー
ルで沈殿させることに工り回収する。
大きな規模の時には、撹拌器及び培養培地を通気する手
段を備えた適当なタンクで培養を行うことが好適である
。この方法によると、栄養培地はタンク内で作り約12
1℃までの温度に加熱滅函する。冷却後、滅菌した培地
に生産培地に前に生育させた4’fiを接種し、培4!
を栄養培地を攪拌及びまたは通気しながら及び約30℃
の輻媛に保ちながら、例えば2日から4日間の冶養勘間
で行う。この5−60を生産する方法は特に大音の佼造
に適している。
生産物はイソプロパツールの=うな適当なアルコールで
沈殿させることにエリ培養培地から回収する。
無命名のシュードモナス(ptmsdo情onαI)刃
にエリ王産される複合多糖はお工そ主に炭水化物、O−
グリコシド結合したエステルのアセチル基が3−4.5
壬、蛋白質10−15るからなる。
多糖5−60の炭水化物部分はウロン酸(〜12優ガム
@ iii VC対し)と中性糖のグルコースとラムノ
ースを含む。ラムノースとグルコースのおよそのモル比
ハ1.5対lである。
4.5%の/’tチル含t′は5−60樹確の0.2%
水性溶液をアルカリ性ヒドロキシルアミン試薬と処理し
、続いて酸性塩化第2鉄試薬で処理することに工り決定
し友〔ニス・ヘストリン(S、dgIjrj%)(19
49) J、 Biol、 ch、m。
180.249−2611゜ 多糖5−60の中性糖は以下の工うに決定した。生成物
10ダを2Nd、50.10 dice解し、f#、付
物を100℃4時間加熱する。得られる浴淑金冷却し水
酸化バリワムで中和後固体二酸化炭然でρ〃を5−6と
する。得られる硫aバリウムの沈殿を遠心分離に工す除
き上滑を減圧下でシロップ状になるまで讃縮する。
加水分解物の糖は3重量噛OV −225を保持したガ
スクロームQ 80/100  メツシュを210℃で
使いヒュレットーバツカード5750型グロマトグラフ
(HgsaLgtt−Packard Mode157
50 chromatrgraph)でそれらのフルト
ノニトリル酢酸エステル誘導体をガスクロマトグラフを
行うことにエリ試験的に固定する。糖は真の標準品と比
較することに工す同定・定凌する〔ジエー・ケーーベア
ード(J、LBaird)%エム・ジエー・ホルロイF
:(M、J、Ho1ro11da)、ディー−シー・エ
ルウッド(QC,EI Lsaood)(1973)C
arbohydr、Rtz、27.464−467  
) 。
多糖の種々の中性糖はまたピリジン:酢酸エチル:水(
2:5:5)の上層全溶媒とするホワットマン1番(t
rh a t ma s 41 )クロマトグラフ用l
」紙による下降法ペーパークロマトグラフを用いること
にエリ特徴づけられた。クロマトグラフは硝#銀に受ζ
K及びフタル峨−7ニリン噴霧試桑にエリ染色した。構
成糖は糖の標準品と同時クロマトグラフィーを行うこと
にエリ及びフタル酸−アニリン試薬との特異的呈色反応
にエリ固定した。
多糖のウロン酸含電は2つの異なった方法VCより決定
した。ある方法では試料を19係塩酸で脱炭酸し遊離し
た二酸化炭素を標準水酸化ナトリウムで捕捉し逆滴定に
工り〔ピー・エル・ブラウニング(aムBrowsin
I7)(1967)Mgthodz of l/’oo
d Cん−misery II 、 632−633 
)及びカルバゾール比色法にエリ〔ティー・ビター (
’I’、Bittgr)、エッチ・エム・ムアー(H。
M、&5ir) (1962) Anal、 Bioa
hgm、 4.330−3341決定した。
2紙電気泳動は上述の中和した酸加水分解物にあるウロ
ン酸の分離及び試験的同定に用いた。この分解物の一定
量及び既知のウロン喰襟I!/!品金カマグ(Cαmα
g)亀気泳妨用f祇60−011奇にのせ、区気泳勧を
カマグ(Cαmαg)モデルHVB醍気泳m装置を用い
て42.7緩衝液中礼0時間行なった。グロマトグラム
を風乾し硝暇銀授漬試薬で染色し分離したウロン酸の位
置を求めた。2つの大きな及び1つの小さなスポットが
見られた。大きなスポットの1つはグルクロンef (
/?G、、A=1. O)と同様の移動度で動きもう一
方の大きなスポット(R,、eA−0,85)及び小さ
なスポット(RGjc、4− o、 73 )はエリ小
さな移動度でめった。
こ几らと同−粂件下での既知ウロン酸の相対4動度は以
下の通りである: む グルクロンe      1.。
マンニュロン酸    0.96 ガラクツロン酸    0.65 グルロンIf0.63 自然(DS−60の赤外吸収スペクトルハKsr錠剤法
で乾燥物質について行なった。複会多mは水酸基、メチ
レン基、カルボニル基、カルボン酸塩を示す3400c
rn−,2950副 、1740cm−’、1620c
rn−’  にピークを示した。順化メチレン染料を受
けつけず、実質的に: N、 N−ジメチルホルム7ミ
ドに不溶、DMSOまたはホルムアミドに可溶である。
5−60の試料は以下の元素分析値を示す:N−2.0
0悌、C−42,62%、H−5,80壬。
多糖5−60は水に低濃寂で浴解し九時に水性溶液に粘
度を与える。この事、剪断に対する感受性及び全体の流
動学的性質の之め、これは水性の系における濃化、懸濁
及び安定剤として、例えば織物工業の捺染用糊、または
低流動水性除草剤組成物、サラダドレッシング、濃厚プ
ディング、粘着剤組成・物処方用の添加剤として有用で
ある。DI熱及び冷却後、これは弱い弾力のあるゲルを
形成する。
脱アセチル、非清澄5−60 乾燥高分子または培養液を高pH(例えば、炭酸ナトリ
ウムまたは水酸化ナトリウムを用いてpH1Oにする)
で90−100℃の高温に10分から45分1間加熱す
ると脱7セチル化が容易に起こる。得られる脱アビチル
多糖5−60は堅い弾力のないまたくもろいゲルを形成
し、工業的及び食品関係における多くの応用に有用であ
る。脱アセチル5−60の組成は主に炭水化物、蛋白質
〜17%、アセチル〜04でろる。炭水化物部分d〜1
3%のウロン酸、お工そのモル比が1.5:1の中性糖
ラムノースとグルコースから成る。
脱アでチル化樹脂のある便用法か堅くもろいゲルなので
型をつくる及び堅い構遺物として使うことができること
から、香料の工うな適当な溶液と処理した後、室内防臭
剤、または空気清浄剤などに応用を見いだす。脱7tチ
ル樹噌はまたゲルー気広励において、電子顕微説使用時
のミクロトーム用のゲル化剤にも使われる。自然の及び
脱7セチル研脂はまた放射線学におけるバリウム、菓子
類の懸濁剤として、及び工具作り、歯科学、犯罪学にお
ける型どりm質としても使われる。
K B r錠剤法で乾燥物質で測定した脱アZチル5−
60の赤外吸収スペクトルは3400rm−’、295
0m   、1740m   、1650m   、1
610o++にピークを示した。
脱7・じチル5−60の試料は以下の元素分析値を示す
: N −2,67%、C−41,89%。
#−6.07悌。
脱アでチル、清MS−60 清澄、脱アセチル5−60の組成は以”ドに示すとおり
である二〜2%蛋白質、0%アセチル、及び炭水化物、
後′4ri〜22%のウロン酸とおLそのモル比がt、
S:tの中性糖ラムノースとグルコースから成る。
KB r錠剤法で乾燥物質で測定したfftr4L、脱
アセチル5−60の赤外吸収スペクトルは3400cr
R,2950crr+−,1600cm にピークを示
した。脱7セチル、清澄5−60の試料は以下の元素分
析値を示すlN−0,424、C−36,85%、7/
−5,62優。試料は次の比旋光度全軍す。
〔α]    = −45゜ 脱アπチルm准r8L4j潴はム軸囲の培養基金ザ用す
る種々の臨床または非臨床減生4辺のための、倣生物学
での培養基における球天代+11品として特に有用でる
る。寒天v装置き換えるために必要な脱アセチル清び4
8旨の濃度は使用する培地VcLるが、約0.5から約
1.25%t(容量あたりの重量比)の節囲内である。
微生物の生胃の特徴v′i標準のが天金基にした培地の
それと全く同様である。
以Fの詳細fL実施例は本発明の代表旧な面を説明した
ものである。
実施例1 複合多tiS −60生産用の培養工程A 継代培養 無命名のシュードモナス(ptt塾datnonaz)
eli、ATCC31461dNA −E タld Y
M 寒天上テ非常Kしく生首するから、日常、これらを
継代培養用に使用する。培養源+aert3o℃である
。微生物は黄橙色のカロチノイド色素と褐色のoJm性
色老全2−5日間の培養で生至する。
B 坤丙の製造 フラスコの1菌ぽ30℃で培1にシたYM培地で作られ
る。新しい平板培養の14を接種した時、YMj@地の
培養は24時間までに良い生育と樹脂の形成を与える。
種培養容器として1ガロン発酵壱を用いる発酵用櫨培地
は最終の発酵槽の培地と同じものである。
C最終の@酵僧用培地 m1lliのナトリウム−と刀すウムー塩iri異なっ
た培地で作られる:それらは共に以下に+ 述べる。微生物は一定のfi要求しこれをナトリウム型
培養培地に加えねばならない。
(3憾デキストロースも使うことができる。
ナトリウム塩    カリウム塩 3.0%グルコース     3.0 %グルコース0
.01係Mg5O,・711,0   0.01係、「
σSO4,711,00,09憾NH4N0.    
  0.094  NH4N0゜0.05%ブロモソイ
       0.05%ブロモソイ(Fromozo
y)(Promozoy) (大兄蛋白濃縮1勿) 1 ql;/L  tioLglm−a      1
 rrtt/L  HoLaJXtALpynp・++
lppm 、、++ 0.05壬Nα、MPO40,05嗟 K、IIp04
+ 10  ppm  f pH’1llln= NaOHpHQ5@−KOHMo
L44類は酒石酸、モリブデン酸マグネシウム、CoC
L、 、 ZnCLt、CucL t %ホウ酸、塩化
ンンガン、慨醒第1妖を含む痕跡元素の溶液である。
低カルシウム生成物を目的とする時、上記の培地のいず
れかも脱イオン水で使用する。
J@養は50時間で完了し;培養液の粘度は通常500
0−8000cptである。
D 回収 生成物のゲル化する性質の九めに良好な繊維形成は普通
自然放置の沈殿では起さない。
しかし、90−95℃で10−15分間の低温6崎にエ
リ(この間に濃培養液は加熱−著しく薄くなる)、優秀
な繊維が培養液の容量の2倍量の99%イソプロパツー
ルを用いて冷却することなく培養液からの沈殿にエリ得
ら几ることがわかった。樹脂1.5’lの平均収率が2
0tと70tの発酵槽でグルコース3%にエリ得られる
E 乾燥 生成物を回収し50−55℃で1時間までVC強制通気
式トレイドライヤーで乾燥する。
F 生成物の品質 + に塩の1チ粘eは通常3000apIの範曲内にあり、
低カルシウムナトリウム塩のものでは約7000cpz
である。
実施例2 複合多糖5−60の脱アセチル化と!R化すべての便用
法において必ずしも必要ではないが樹Ijaの?f装化
は樹脂を寒天の代用品として使用するときには価値があ
る。清だ化は7脱7甘チルの前(自然のままの状態〕ま
たは後でも行うことができる。脱アセチル化は熱アルカ
リを用い′a澄化は熱い状態で行わ几るから、2つの方
法は答易Vcf利VC@合さnる。
脱アセチル化と清澄化は共に培養液または乾燥高分子の
いずれでも行うことができる。脱アセチル化では、j@
養液を開用するならば、plIをKOHで10に合わせ
@液を90℃で15分間加熱、希g、so、でPHを7
とし、CaCLt fo、2係濃度になる工うに加え冷
却する。堅くもろいゲルが得られる。
脱アセチル化と清澄化の両方法における一般的方法は以
下に示す: A、J@養液または樹脂の2優浴液を90℃に加熱する
B、  pH1−KOHで10にする。
C1培養液または溶液の温度を15分間90−95℃に
保つ。
D、  、Hを希aCtまたはH,504で6−8とす
る。
E、  10f/lのスーパーエイト(S%pgr A
td)を2遇する物質に加える。
F、 この物質全136−の面積をもつフィルター邪分
金用いて約61のスーパーエイド(Stbpgr Ai
d)の層と約20−30 psiの圧力で圧力フィルタ
一部分(予備カロ熱)を通してd4過する。
G、  f液はゲル化を防ぐためにただちにインプロパ
ツールで沈殿させ繊維を1時間またはそれより少ない時
間で50℃で乾燥する。
脱アセチル化が不必要の時は、上述の方法はpIIを上
げること以外はそのfま従う=90℃に保ち、浴液をた
だちに1過し、回収する。
渭肚化はいつもカリウム塩型で行われる;KCLは必要
なら前に作った生成物の溶液に加えることができる。
実施例3 複音多糖5−60のゲルの特徴 + 自然のままの明j盾及び脱ア2チル441+旨のに型と
Ca  型の両方の型で、カラゲニン及び寒天と比較し
たデータf!!:編果したものを下に示す:型    
  ゲルD性質  融点   固化点  ヒステリシス
自然の5−60   非常に弾性 65−70℃  6
5−70111:   なし脱アセチルS−60 K ゲル     堅い    90℃   31−4
6℃  45−60℃Cα ゲル    堅い    
90℃   45−50℃  45−50℃カッパeカ
ラゲニン  堅い  40−95℃  25−75℃ 
 15−20℃寒天★      堅vs   6o−
97’C32−39C60C★ バクテリオロジカルグ
レードのものニゲル化@度33’−39℃の範囲、融点
最低70℃(fhizt l gr”z −1ndsz
triaL Gstmz″)最低ゲル濃度 カッパ・カラゲニン         0.3%寒天 
      0.04% 脱アセチル、S−60(カルシウムゲル)     0
.054すべてのいろいろの型のゲルの固化及び融ける
ための広い範囲の温度があることC上述の工うに留意さ
ル九い。寒天では、変化は主に、fi草の梨にエリカッ
パ・カラゲニンではカリウムイオン濃度がゲルの特徴全
決定する。
脱7tチル5−60のゲルは主に説アセチル化のmev
c J:り特徴づけられる。はんの少し脱アセチル化す
るとゲルはエリ高い温度で固゛まり、エリ弾性がある:
央際゛、弾力のめるものから堅いものまで広い範囲のゲ
ルの型が脱アセチル化の程I建にエリ可能である。ゲル
は、王に固化点と融点の間の大きなヒステリシスがある
ことから、カッパーカラゲニンエリも寒天にエリ類似し
ている。それらはmかすことがむずかしく、ゲル−ゾル
の変化ta祭することがむずかしいことを強調しておく
。−万、ゲル化の始まりから固いゲルに鋭く数置でゲル
が固化することからゲル化点は容易に定義できる。
実施例4 脱アセチル非清泄S−60 S−60培養液金90℃にニア10熱しplif25憾
KOHの添加で10とする。温度を15分間維持し、さ
らに濃HC1で中和する。この培養液を発酵槽から流出
させ、熱いうちに2倍量の994IPAで回収する。脱
アセチル5−60の繊維をあつめ、55℃で1時間強制
通気式トレイドライヤーで乾燥し、粉にひく。
実施例5 脱アセチル5−60の清澄化 実施例4で製造した脱アぜチル複合多糖5−60をライ
トニン(Lightni外)混合器で1時間脱イオン水
中14濃度に再構成し50Cまで加熱しArtiBar
i%ko  で混合する。浴液は温度を40℃以上に保
ちながらSayυαttRc2−B冷凍遠心機で20分
間10.0007?、 P、 M。
(GSAヘッド(hgad))で遠心する。上清をデカ
ントしてとり次に穴が5μ、3μ、1.2μ、0.8μ
のゲルマン(GeLman)型ANHydropん1L
icAaropor膜(293m+)e通してe過する
。e液を約3−4倍量の99悌イソプロパツールに加え
、繊維をあつめ、間単1c強制通気式トレイドライヤー
で55℃で乾燥し、紛にひく。
生成物は本発明の脱アセチル清澄5−60樹8旨である
実施例6 脱アセチル化こ5−60を用いて寒天との置換いくつか
の異なった培地が以下に示す通りに作られる: 肉汁寒天 (/7)0.8% 肉汁ブロース(Nwt’ritnt
  Brot五)(Difao)1.5% 寒天(Di
fco) (fA   0.1  肉汁ブロース(Nsbtria
nt  Brot五)(Difao)0.2俤 XCt O,9嗟 S−60 (A  2,75%  トリブチコース ソイ ブロー
ス(TryptiaozaSO%l  Brotん)C
BBL) 1.5悌 寒天(Difao> (6)  2.754 トリブチコース ソイ ブロー
ス(TvyptiCoaaS6y  Brot五)(B
BL) 0.2憾  KCl 0,94  5−60 ポテト デキストロース寒天 (A  2.4%  ポテトデキストロースブロース(
Difco)1.5嗟寒天 (υ  2.44   ポテト デキストロースブロー
ス(Difao)0.2憾  KCl 0、9%  S5−6 0Y寒天 C/(12,1%  YMブロース(Difc、o)1
.5% 寒天(DJco) (a2.1%  YMブロース(Difao)0.2%
  KCl O19憾  5−60 寒天 (A3.7優  BHIブロース(Difao)1.5
% 寒天 (13,7%  Boilブロース(f)ifca)0
.2憾 (、Ct O09チ 5−60 パーク(Bsrk’z)寒天 (湧                  (υ1、5
%      9天CDi feo)      0.
2% KCLO,9憾 5−60 脱イオンをすべての培地に使った。成分を一緒にして(
パーク(/jsrk’z)k除< )121℃、151
z絋 で15−20分オートクレーブを行い55℃に冷
却、滅菌したペトリ皿に注いだ。
パーク<a襲rk’z )の成分はグルコースを除いて
一緒にし、別々にオートクレーブを行い、オートクレー
ブ後培地に加える。これらの培養養プレートが固化した
ら滅菌全検査するために室はで24時間培養した後、そ
れらに以下の14菌株ですじを引いて接種した: アグロマイセス ラモサス(4rosyag# ram
ozsy)ATCC25173ア一ス口バクター グロ
ビホルミス(Artkrobaat grglobif
o洛it) A7’(:’(:’8010オーレオバシ
デイウム プルランス(Avrgobazidi%惧p
slluLatsz)NRRL  FB−3861アゾ
トバクタ−インディカス(Azotohactgr  
indicuz)war ミクソゲネスCmyxoga
ngz)S−7菌株ATCC2L423アゾトバクタ−
ビネランデイ(Azotohactar  Vinal
andii)ATCC9047 ベイジエリンキア ラクテイコゲネス(Baij−τi
n’ekiαlaatiaoganaz)ATCC19
361ニルグイニア カルトボラ(F;rsainia
  oartovora)ATCC8061エシエリヒ
ア コリ<Ezehgrichia  coLi)EG
−47%株クレりジーラ ニューモ=(KLabzig
lLa  p@asmosiga)S−53g株 ノカルディア サルモニカラー(Noeardia  
za1mosieolorjATCC212435−6
0 ストレプトコツカス ファエ力リス(Strapt o
coaeSIjaaaaliz) トリコデルマ ロングブラキアタム(Triehoda
rmα1ongbrtxakiatsm)ATCC13
631ズーグロエア ラミゲラ(Zoogloaa r
amigara) AT CC25935プレートを3
0℃で3−5日1間培養し生育を調べた。5−60で作
った培地上にすべて石株について良い生育が得られ寒天
の代わり5−60で作った培地と寒天のものはコロニー
の形態ではほとんど差はなかった。これらの結果は5−
60が微生物学の培地における寒天の優秀な代用になる
ことを示している。
BHI 培地とTsAf除く、5−60を含むすべての
培地のゲル化点は42℃であった。
BH111天とTSAのゲル化点は52℃であった。寒
天は典型的に42−44℃でゲル化する。
実施例7 脱7tチル5−60を用いた成型香料ゲルの製造 (,41,50係  多ms −60 0,75慢  炭酸ナトリウム 0.025憾、−ヒドロキシ安息香酸メチル3、001
   バラのかおり 4.00暢  インプロパツール 2.00%  エチレングリコール 88.50%水 自然のままの多糖5−60に炭酸ナトリウムと防腐剤と
混合し70℃で水IC!解する。
溶液はさらに90℃に加熱しその温度で10分1iJ1
保ち多糖を脱アぜチルする。60℃に冷却後、溶媒に分
散させた香料を加え混合物を通常の空気清浄剤のプラス
チックの成型に入れる。混合物が38℃に冷えたらゲル
化が起こり芳香を発散する性質を持つ堅い独立したゲル
を得る。
(υ 乾燥脱アセチル多$5−60を培餐液から希水酸
化ナトリウムでρMftl 0.0とし90℃に15分
間加熱することエリ作る。溶液を8塩酸でpk17.O
Vc中和し2倍電のインプロパツールで沈殿させ、乾燥
、粉にひく。固体の空気清浄剤ゲルは以ドの方法で脱ア
セチル生成吻から作ら几る:脱7セチル多樵S−603
、Of′!il−塩化カリウム1.52及びp−ヒドロ
キシ安息香酸メチル防腐剤0.159と混会し水177
ILtを訓える。浴簑を90℃に加熱して浴解し60℃
に冷却後、はっか油の香料6、Of、イソプロパツール
8.Of、エチレングリコール4.02の混合物を加え
る。溶液をプラスチックの型に入れ室温まで冷却する。
香りの強いはつかの香りをもつ九強力な堅いゲルが形成
される。ゲルは簡鴇に変形できたわむことなくその形?
保持する。
本発明の態様を要約すると以下の様である。
1、 10−15%蛋白質、3−4.5%アセチル及び
主として炭水化物を含み、炭水化物部分が〜12%のウ
ロン酸、モル比がおよそ1.5:1であるラムノースと
クルコースからなる複合多糖5−60であって、該多糖
が塩化メチレン染料と不相溶性であり、実質的にN、N
−ジメチルホルムアミドに不溶でかつDMSOまたはホ
ルムアミドに可溶であり、3400 cm−’、295
0cm−”、1740cm−’、1620cm−’のピ
ークによって特徴づけられる赤外吸収スペクトルを有す
ることを特徴とする前記複合多糖5−60゜ 2、無命名のシュードモナス(Pseudomonas
)属微生物、AT(:(: 31461を炭素源、カリ
ウムイオン源、窒素源、痕跡無機元素、水を含む醗酵培
地で28−32℃、pH6−8において40−60時間
培養し、適当な低級アルコールによる沈殿法によりガム
を回収することから成る第1項記載の複合多酒5−60
の製法。
3、窒素源をコーン・スチーブ・リカー、アルコールを
イソプロパツールとする第2項記載の製法。
4、 無命名のシュードモナス (Pseudomon
as)菌、 八TCC:11461の凍結乾燥培養物。
5、17%蛋白質、アセチル含Ho%で、炭水化物部分
が13%のウロン酸とおよそのモル比が1.5:lであ
る中性糖ラムノースとグルコースから成る炭水化物を含
む脱アセチル化非清澄複合多糖5−60゜ 6.2%蛋白質、アセチル含量が0%で、炭水化物部分
がウロン酸22%、およそのモル比か1.5:1である
中性糖ラムノースとクルコースから成る炭水化物を含む
脱アセチル化清澄複合多@5−60゜ 7、複合多糖5−60の1−5%水性溶液を911約1
O190−100℃の温度で10分から45分加熱し、
それにより生成する生I&物を回収することからなる第
5項記載の化合物の製法。
8、約0.5−5%の脱アセチル化複合多糖5−60と
栄養物から成る微生物学的培養基。
9、脱アセチル化5−60か清澄したものである第8J
J′i記載の培養基。
10、約0.1−5%の脱アセチル化複合多糖5−60
、水及び低級アルカノールから成る香料ゲル組成物。
インコーホレーテッド

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 無命名のシユードモナス(Pseudomonas)菌
    、ATCC31461の凍結乾燥培養物。
JP63040901A 1978-12-04 1988-02-25 シユードモナス種 atcc 31461 の凍結乾燥培養物 Granted JPS63240780A (ja)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US96653878A 1978-12-04 1978-12-04
US966538 1978-12-04
US966531 1978-12-04
US47598 1979-06-08
US47505 2001-10-26

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JPS63240780A true JPS63240780A (ja) 1988-10-06
JPH0376914B2 JPH0376914B2 (ja) 1991-12-06

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JP63040901A Granted JPS63240780A (ja) 1978-12-04 1988-02-25 シユードモナス種 atcc 31461 の凍結乾燥培養物
JP63040902A Granted JPS63226292A (ja) 1978-12-04 1988-02-25 脱アセチル化非清澄複合多糖s−60及びその製法

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JP (3) JPS5579397A (ja)
KR (1) KR830002802B1 (ja)
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