JPS63251083A - 酵母細胞壁溶解酵素およびこれを用いる酵母菌体成分の抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な酵母細胞壁溶解酵素およびこれを用いて
酵母菌体成分を抽出する方法に関する。

〔従来の技術およびその問題点〕

酵母は細胞内に各種のビタミン、酵素、蛋白質、呈味成
分全含有している。

これらの菌体成分を抽出する方法としては、従来、（１
）酸、アルカリ等で化学的に処理する方法、（２）イン
、９クト、セルミル等の物理的処理を行う方法；あるい
は（３）自己消化又は（４）溶解酵素を用いて細胞壁を
除去する方法が知られている。

しかしながら、（１）の方法は処理条件が激しいため、
抽出される蛋白質等の有効成分が変性されたり、設備が
腐蝕する等の欠点があり、（２）の方法は大規模な設備
と大きな動力を必要とし、簡単に実施し難い欠点があり
、また（３）の方法は長時間を要し、しかも抽出効率が
悪いと共に、菌体成分が変質する慣れがあるという欠点
があった。従って、溶解酵素を使用して酵母菌体の細胞
壁を溶解する（４）の方法が最も好ましい方法であるが
、酵母細胞壁は強固に形成されているので、これのみヲ
特異的に溶解することは困難でアシ、これまでにもされ
を解決するための多くの研究がなされているが、未だ６
４足し得る酵母細胞壁溶解酵素は見出されていない。

すなわち、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　）属の酵母細胞壁は、β−１，３−グルカンよりな
る繊維が作る網目状の緻密な組織を主体構造とし、その
間隙にグルコマンナン−蛋白質複合物が充填されたもの
であると推６１１１されており、これをβ−１，３−グ
ルカン分解活性を有する酵素で溶解せんとする多くの試
みがなされているが、これも熱処理をほどこした酵母細
胞壁についての溶解が認められているにすぎない。

一方、上記グルカン−マンナン型の細胞壁以外に、マン
ノース、キシロース、ガラクトース、グルコース等の数
種の構成糖よりなるヘテロ多糖類を細胞壁の構成成分と
するクリプトコツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　）
属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　）属、キ
ャンテイタ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属、ブレラ（Ｂｕｌｌ
ｅｒａ　）属、ス？リデイオｇう、ｘ、　（５ｐｏｒｉ
ｄｉｏｂｏｌｕｓ　）属、ス？ロボロマイセス（Ｓｐｏ
ｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　）属、テイレテイオゾシス（
Ｔｉ１ｌｅｔｉｏｐｓｉｓ　）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉ
ａ　）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　）属等の
担子菌類に属する酵母の細胞壁を溶解する酵素について
の報告は極めて少ない。

〔問題点を解決するための手段〕

斯かる実状において、本発明者は鋭意研究を行った結果
、リゾ−シス・プレマール（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　ｄｅｌ
ｅｍａｒ　）　ＪＣＭ　５５６４、ＪＣＭ５５６５の培
養液から単離した新規な酵素が広範囲の酵母の細胞壁を
容易に溶解する性質を有することを見出し、本発明上完
成した。

従って、本発明は、リゾーデス属に属する菌株により生
産される新規な酵母細胞壁溶解酵素を提供するものであ
る。更に、本発明は当該溶解酵素を用いて酵母菌体成分
を抽出する方法を提供するものである。

本発明の酵母細胞壁溶解酵素は、例えばリゾ−シス・プ
レマールの培養液から次の如くして製造される。

リソ−デス・プレマールの培養は公知の方法、例えば固
体培養法、液体培養法が用いられる。固体培養法として
は常法により撒水した小麦皺を加熱変性させ、リゾ−シ
ス・デレマールＪＣＭ５５６５全筬種し、培養温度２０
〜４０℃で通常２〜８日間程度培養するのが望ましく、
また液体培養法としてはバレイショ・グルコース液体培
地を滅菌後、リゾープス・プレマールＪＣＭ５５６４を
接種し、培養温度２５℃で７日間、回転振盪培養（１２
Ｏｒｐｍ／分）するのが望ましい。この液体培地として
は他に通常の液体培養培地が用いられ、炭素源としては
例えばグルコ−・ス、マルトース等の単糖類や少糖類、
デキストリン等の多糖類が用いられる。窒素源とし２て
は例えばペプトン、酵母エギス、カザミノ酸、無機アン
モニウム塩硝酸塩等が用いられ、その他リン酸カリウム
、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸マンガン等
の無機塩類を適宜添加１７た培地が用いられる。この培
養物を水に懸濁した後、ホモゾエナイズ処理後放置し、
遠心分離し、上清を酵１せ細胞壁溶解酵素抽出液とする
。

この抽出液をそのまま真空凍結乾燥するかまたは硫安、
アルコール、アセトンなどで分画し活性区分を集め、セ
ファデックスＧ〜１５により脱塩したのち真空凍結乾燥
すれば酵母細胞壁溶解酵素の粗製品を得ることができる
。

上記のｆｆｌ製品は各種のイオン交換物質、例えばＣＭ
−セルロース、ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ。

アン・ζ−ライ）ＣＧ−５０に用いる吸着溶出法：セフ
ァアクリルＳ−３００、セファデックスＧ−１００゜Ｇ
−５０などを用いるグルｐ過去；キ）　／ｉ’−ルＢＣ
Ｗ−１０００、キ）　、Ｑ　−ルＢＣ’Ｗ−３０００，
キトノＱ−ルＢＣ〜Ｖ−３５００を用いる吸着溶出法；
？リアクリルアミドゲルを用いる電気泳動法などを適宜
組み合わせて実施することにより高度て精製された精製
品とすることができる。

精製の１例を示すと、硫安またはアルコールなどで分画
して得た粗製品を０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６，
０）Ｋ溶解後、同一緩衝液であらかじめ緩衝化したＣＭ
−セファロースＣＬ−６Ｂに吸着し、吸着後回緩衝液の
食塩濃度勾配音用いて溶出する。溶出液の活性区分を集
めダイアン「コーメンブレンＵＭ　２で濃縮し、細胞壁
溶解酵素の部分精製品を得ることができる。

次に、この部分精製品をあらかじめ０．２Ｍ酢ボ緩衝液
（ｐＨ５，０）を用いて緩衝化１〜だセファアクリルＳ
−３ｏ　ｏカラムにかける。溶出は同一緩衝液で行い活
性区分子ｆ：集めてダイアフローメンブレンＵＭ　２で
濃縮し、さらに同一緩衝液を用いて緩衝化したセファデ
ックスＧ−５０カラムにかけ、溶出は同一緩衝液で行い
活性区分を集める。この操作で電気泳動的に単一の精製
酵素を得ることができる。

このようにして得られる本発明の酵母細胞壁溶解酵素は
次のような性状金有する。

■ディスク電気泳動　　　　単一ピーク０分　子　量　
　　　　　　４２００±４００（デル沖過法）■等電点
　　　ｐ１７．７±０．２ ■安定ｐＨｐＨ３〜８ ■作用至適ｐｌ（ｐＨ５ ■作用至適温度　　　５０℃ ■安　定　性　　　　　　　６０℃、３０分の処理で約
７０％の残存活性 ■基質特異性　　　　担子菌類の酵母細胞壁を溶解する
。

本発明方法において、酵母菌体成分の抽出は次の如くし
て行われる。溶解酵素としては、精製されたもの以外に
、これを含む粗酵素も使用できる。また原料の酵母菌体
としては、従来の酵素で分解できるものの他、上記のよ
うな担子菌類に属する広い範囲のものが使用される。そ
の酵母菌体は、対数増殖期及び定常期の何れのものでも
よく、また生菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体の
何れでもよい。菌体成分の抽出は、酵素として本発明の
酵母細胞壁溶解酵素を使用する以外は、自体公知の方法
によって行われる。すなわち、抽出溶媒に酵母菌体とし
て生菌体１５　Ｗ／Ｖ％と′Ｎ製した酵母細胞壁溶解酵
素をその濃度が０．００５Ｗ／Ｖ％になるように加え、
４０℃の温度で、２４時間振盪するのが好ましい。

〔発明の効果〕

本発明によれば、従来公知の溶解酵素では溶解できなか
った酵母細胞壁をも容易に溶解できるので、広い範囲の
酵母菌体の成分を変質させることなく効率よく抽出する
ことができる。更にまた、本発明の酵母細胞壁溶解酵素
は酵母細胞壁及び細胞内成分の解明のためにも極めて有
用である。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

尚実施例中において、酵母細胞壁の溶解度及び抽出され
る酵素のグルタミナーゼ活性は次のようにして測定した
。

（１）溶解度 酵母懸濁液３−（菌体濃度５１１ｇ／−）、緩衝液５　
ｍｇ　（ｐＨ７，５の場合は１／１０Ｍリン酸緩衝液、
ｐ）Ｉ　５．０の場合は１／ＩＯＭ酢酸緩衝液）、酵素
溶液１−及び水を加えて全量を１０ゴとする。これを４
０℃で２時間反応させ、６６０画における光学密度（０
，Ｄ、　）を測定する。対照として酵素液１づの代りに
水１−を加えたものを用いた。このＯ，Ｄ、　から次式
に従って溶解度を求めた。

（１１）グルタミナーゼ活性 ２５０ｍＭ　Ｌ−グルタミン酸溶液４．０−に０．４Ｍ
リン酸緩衝’Ｉ　１．　Ｏｍ１（ｐＨ７，５）及び細胞
壁可溶化処理液上清５−を加え、３０℃で６０分間反応
させた後、沸騰水中で１０分間加熱して反応を停止させ
る。次にペーリンガー社製し−グルタミン酸測定用キッ
トにより、上記の反応液０．２艷にトリエタノールアミ
ン２００ｍＭを含む２５ｍＭリン酸緩衝液２．３−（ｐ
Ｈ８，６）、６．７　ｍＭ　ＮＡＤ＋溶液０．２−１１
，１９釧ヨードニトロテトラゾリウムクロライド溶液０
．２−１０．１％（Ｗ／Ｖ）ジアホラーゼ溶液０．０５
−及びグルタミン酸脱水素酵素０．０５、、！７！ヲ添
加し、室温で反応させ、分光光度計により４９２　ｎｍ
における吸光度値を測定する。

更に予め作成したＬ−グルタミン酸の検量線よりその生
成量を求め、３０℃、１分間当り１マイクロモルのＬ−
グルタミンばを生産する酵素量を１単位とした。抽出液
のグルタミナーゼ活性を求めて可溶化率に変換（７た。

なお可溶化率（％）は対照とし５た菌体懸濁液における
グルタミナーゼ活性を１００とし、とれて対する該細胞
壁可溶化処理液上清のグルタミナ・−ゼ活性の比較値を
％で表わしまた値である。

実施例】 リゾ−デス・プレマールＪＣＭ　５５６５を１２００／
、　Ｊ散水し、常法により滅菌ｌ−九破培地にて３０℃
、７０間培なした。との培養物１，５０２を水８５０　
ｍｌで抽出シフ、この抽出液を硫安０．８飽和にて塩析
し、４℃、−夜放置後、沈澱を遠心分離機にで遠心分離
（＆０００　ｒｐｍ。

１０分間）して集めた。その沈澱物を水に溶解し、セフ
ァデックスＧ−１５カラムで脱塩し、酵母細胞壁溶解酵
素液余得た。

上記の酵母什１胞壁溶屓酵素液全０．　ＯＩ　Ｍ　ＩＪ
ン酸緩衝液（ｐ１１６．５　）で緩衝化したＣＭ−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア社製）に通１
７て酵素を吸着させ、同−一一緩衝液で良く洗浄し、続
いてＮａＣｇ　Ｏ−０，３モルの濃度勾配で溶出して活
性区分を集めた。次に、この酵素液を限外濾過装置（分
１ｉｉｉ１ｉ膜１０００、アミコン社芙）にて濃縮した
。濃縮された酵素液全０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０
）で平衡化しておいたセファアクリルＳ−３００に充填
したカラム（２，６Ｘ　１００　ｃｍ　）にかけゲルｌ
濾過しだ。

得られた活性区分全同上の限外濾過装置を用いて濃縮し
、濃縮された酵素液ｉ　０．２　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＭ　
５．０　）で平衡化しておいたセファデックスａ−ｓｏ
２光填したカラム（７−６Ｘ１００ｃＴｎ）にかけグル
濾過シフ、単一な酵母細胞壁溶解酵素４．５　ｎｑを得
た。

実施例２ クルコース１％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．
３％、ペゾトン０．５％を含むｐＨ５，５の液体培地を
用いて２５℃で４８時間振盪培養して得たブレラ・オリ
ゼー　（Ｂｕｌｌｅｒａ　□ｒｙｚａｅ　）ＪＣＭ　５
８７１の菌体を、６６０　ｎｍにおける吸光度が０４７
になるようしこ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）に
懸濁する。この菌体懸濁液（湿菌重５醇／＋ｍ）３ｒｎ
ｌに実施例１で製した酵素溶液１ｒｒＩｌ（精製酵素を
蛋白質量として２８μ２含有）を加え、更に緩衝液（０
，］。Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５，０）を加えて全ｉ’ｔｌ
Ｏｒｒ１１とし、これを４０℃にて２時間反応させ、０
．Ｄ、の減少から溶解度を算出した。その結果溶解度は
３４．２％であった。

実施例３ 第１表の酵母菌１■培地（ｐＨ５，５）で３０℃にて３
日間培養して得た菌体金、実施例２と同様に［７て酵素
液で処理し、溶解度を求めた。その結果を第１表に示す
。

第１表 実施例４ グルコース１％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．
３％、ペプトン０．５％を含ミ、ｐＨ５，５に調整した
液体培地３ｊを５ｊ容シャーファーメンタ−に仕込み、
１１５〜１２０℃の温度で２０分間殺菌後、あらかじめ
同培地を用い２５℃で４８時間振盪培養を行ったブレラ
・オリゼーＪＣＭ５８７１の種培養液２０〇−を接種し
、通気量１１！／分、攪拌回転数３００ｒｐｍ、２５℃
の温度で４８時間好気培養を行った。この培養液を常法
により遠心分離して培養菌体を得た。得られた菌体のう
ち１５？を０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）、又は０
．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　１００−に懸濁し
、これに第２表に示す種々の細胞壁溶解°酵素を該標品
の添加濃度が０．５％（Ｗ／Ｖ）となるように夫々加え
、４０℃で２４時間振盪させた後、遠心分離（１０，０
００ｒｐｍ、１０分間）してその上清液を得、上清液の
グルタミナーゼ活性を求めた。

第２表 試料１　リゾ−シス−プレマールＪＣＭ５５６５皺麹抽
出液よりの粗製細胞壁溶解酸 素（本発明） 試料２　リゾチーム（卵白由来の細胞壁溶解酵素含有酵
素剤：生化学工業■製 試料３　ザイモリエイス（アルスロバクタ−・ルーテラ
ス由来の細胞壁溶解酵素 含有酵素剤：キリンビール■製） 試料４　セルラーゼＴ（）リコデルマ・ビリデ由来の細
胞壁溶解酵素含有酵素剤二 天野製薬■製） ※１　　　ｐＨ７，５での処理結果 以上 出願人　正田醤油株式会社−１゜ ｉ［、： 代理人　弁理士　有　賀　三　幸・、′、：１１′二９
．−昔 、：−′ 弁理士　高　野　登志雄　　　１ ）ｖ−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リゾープス属に属する菌株により生産される次の性
   状、 （１）ディスク電気泳動　単一ピーク （２）分子量　４２００±４００（ゲルろ過法） （３）等電点　ｐＩ７．７±０．２ （４）安定ｐＨ　ｐＨ３〜８ （５）作用至適ｐＨ　ｐＨ５ （６）作用至適温度　５０℃ （７）安定性　６０℃、３０分の処理で約７０％の残存
   活性 （８）基質特異性　担子菌類の酵母細胞壁を溶解する を有する酵母細胞壁溶解酵素。 ２、リゾープス属に属する菌株の生産する酵母細胞壁溶
   解酵素を用いて抽出を行うことを特徴とする酵母菌体成
   分の抽出方法。