JP2001333793A - キトサンの低分子化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 キトサンの有効な低分子化方法、特に、脱ア
セチル化度が５０〜１００％のキトサンを効率よく低分
子化する方法の提供。 【解決手段】 エンテロバクター・Ｇ−１株（微工研条
寄第３１４０号）が生産するキチナーゼとマツエバクタ
ー・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナ
ーゼとを用いて、脱アセチル化度５０〜１００％のキト
サンを分解して、低分子化する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、キトサンの低分子化方法に係
り、特に、脱アセチル化度が５０〜１００％のキトサン
を効率的に分解して、その低分子量化物を有利に得る方
法に関するものである。

【０００２】

【背景技術】近年において、キトサンは、次世代のバイ
オマスとして注目されており、その生体適合性や生分解
性を応用した製品の開発が様々な分野で進められてい
る。特に、高分子量のキトサンを低分子化して得られる
キトサンオリゴマーは、抗菌性やエリシター活性等の様
々な生理活性を有しているところから、注目度も高く、
そのため、キトサンオリゴ糖の研究が盛んに行なわれて
きているのである。

【０００３】ところで、キトサンオリゴマーの製造方法
としては、従来から、カニやエビ等の甲殻類から抽出し
たキチンを化学的に脱アセチル化してキトサンを得、そ
して該キトサンを塩酸等の酸によって加水分解して低分
子化し、キトサンオリゴマーを製造する方法が知られて
いるが（例えば、特公平１−２４１２１号公報、特開平
３−８３５８４号公報、特開平３−２７７２７７号公報
等）、その何れの方法にあっても、効率よく、キトサン
オリゴマーを製造するには至っていない。

【０００４】さらに、種々の微生物から単離・精製され
た種々のキトサナーゼがこれまでに報告されているが、
脱アセチル化度５０〜１００％キトサンを基質とするキ
トサナーゼについての報告はほとんどない。これまでに
単離・精製されたキトサナーゼとしては、例えば、脱ア
セチル化度７０〜９０％キトサンを基質とする Acineto
bacter sp. CHB101 株由来のキトサナーゼ、脱アセチル
化度４０〜９９％キトサンを基質とする Streptomyces
sp. N174 株由来のキトサナーゼ、脱アセチル化度７０
〜１００％キトサンを基質とする Fusarium solani f.s
p. phaseoli 由来のキトサナーゼ、脱アセチル化度８１
％キトサンを基質とする Bacillus megaterium P1 株由
来のキトサナーゼ、脱アセチル化度１００％キトサンを
基質とする Amycolatopsis sp. CsO-2 株由来のキトサ
ナーゼ、脱アセチル化度７０％キトサンを基質とする N
ocardia orientalis由来のキトサナーゼ、脱アセチル化
度７０％キトサンを基質とする Penicillium islandicu
m 由来のキトサナーゼ等が報告されている。

【０００５】また、本願出願人にあっても、先に、脱ア
セチル化度８０％のキトサンを基質とする Enterobacte
r ・Ｇ−１（微工研条寄第３１４０号）株由来のキチナ
ーゼを用いて、キトサンを分解し、それを低分子量化す
る手法を明らかにしたが、その作用部分がキトサンポリ
マー中に存在するキチン部分のみであるために、かかる
低分子量化反応が、重量平均分子量が約１００００〜２
００００程度のところで止まってしまい、それ以下の分
子量のものを得ることは困難であった。

【０００６】このような状況の下において、キトサン、
特に脱アセチル化度が５０〜１００％のキトサンを効率
よく低分子化して、重量平均分子量で１００００以下、
更には５０００以下のものと為し得る有効な方法の開発
が、切望されるに至っているのである。

【０００７】

【解決課題】このため、本発明の課題とするところは、
キトサンの有効な低分子化方法、特に、脱アセチル化度
が５０〜１００％のキトサンを効率よく低分子化する方
法を提供することにある。

【０００８】

【解決手段】かかる状況下、本発明者らは、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、エンテロバクタ
ー（ Enterobacter ）・Ｇ−１株が生産するキチナーゼ
と、マツエバクター・キトサノタビダス（ Matsuebacte
r chitosanotabidus）・３００１株が生産するキトサナ
ーゼとを併用すると、キトサナーゼ活性が相乗的に増大
することを見出したのであり、特に、驚くべきことに、
エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼは、
脱アセチル化度が１００％のキトサンに対しては全くキ
トサナーゼ活性を有しないにも拘わらず、マツエバクタ
ー・キトサノタビダス・３００１株が生産するキチナー
ゼと併用すると、マツエバクター・キトサノタビダス・
３００１株が生産するキトサナーゼを単独で用いる場合
よりも、脱アセチル化度が１００％のキトサンに対する
キトサナーゼ活性が増大することを見出したのである。

【０００９】本発明は、かくの如き知見に基づいて完成
されたものであって、その要旨とするところは、エンテ
ロバクター・Ｇ−１株（微工研条寄第３１４０号）が生
産するキチナーゼとマツエバクター・キトサノタビダス
・３００１株が生産するキトサナーゼとを用いて、キト
サンを分解して、低分子化することを特徴とするキトサ
ンの低分子化方法にある。

【００１０】このように、本発明にあっては、特定の２
種の微生物が生産する酵素を組み合わせてなる複合酵素
において、高分子量のキトサンに作用せしめることによ
り、かかるキトサンを高いキトサナーゼ活性をもって効
率的に分解せしめ、また重量平均分子量が１００００以
下の、更には５０００以下の低分子量化物を容易に形成
し得ることとなったのである。

【００１１】なお、そのような本発明に従う方法におい
て、キトサンとしては、有利には、脱アセチル化度が５
０〜１００％のキトサンが対象とされることとなる。

【００１２】

【発明の実施の形態】ところで、かかる本発明において
用いられる、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキ
チナーゼには、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産する
キチナーゼと同様の理化学的性質を有する全てのキチナ
ーゼが含まれることが理解されなければならない。従っ
て、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼ
には、エンテロバクター・Ｇ−１株自体から得られるキ
チナーゼの他、例えば、エンテロバクター・Ｇ−１株由
来のキチナーゼ遺伝子を導入し、発現させた宿主から得
られるキチナーゼも含まれるものである。また、前駆型
キチナーゼから成熟型キチナーゼに至る全ての段階のキ
チナーゼも含まれることとなる。ここで、前駆型キチナ
ーゼとは、翻訳後修飾を受けていないキチナーゼを意味
し、成熟型キチナーゼとは、全ての翻訳後修飾を受けた
キチナーゼを意味する。

【００１３】なお、このエンテロバクター・Ｇ−１株が
生産する成熟型キチナーゼの理化学的性質は、以下の通
りである。 （１）分子量：５０ｋＤａ （２）至適ｐＨ：７．０ （３）ｐＨ安定性：４．０〜８．０ （４）至適温度：５０℃ （５）温度安定性：２０〜５０℃ （６）等電点：ｐＩ６．６ （７）切断様式：エンド型 （８）基質特異性：脱アセチル化度８０％キトサン

【００１４】また、かかるエンテロバクター・Ｇ−１株
が生産するキチナーゼとしては、例えば、エンテロバク
ター・Ｇ−１株の菌体を物理的に破砕して又は化学的に
処理して細胞内容物を抽出した後、該細胞内容物からキ
チナーゼ活性を指標として単離・精製して得られるキチ
ナーゼを用いることが出来る。その際、菌体の物理的な
破砕、菌体の化学的な処理、細胞内容物の抽出、細胞内
容物からのキチナーゼの単離・精製は、例えば、細胞内
容物を常法に従って脱塩処理、硫安分画した後、適当な
クロマトグラフィーを用いて行なうことが出来る。クロ
マトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水
性クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸着クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフ
ィー等を用いることが出来る。

【００１５】さらに、エンテロバクター・Ｇ−１株が生
産するキチナーゼとしては、エンテロバクター・Ｇ−１
株の培養物を遠心分離し、その遠心上清からキチナーゼ
活性を指標として単離・精製して得られるキチナーゼを
用いることも出来る。エンテロバクター・Ｇ−１株の培
養は、常法に従って行なうことが出来る。培地として
は、資化可能な炭素源、窒素源、無機物及び必要な生育
促進物質を含有する培地であれば、合成培地及び天然培
地の何れを用いてもよく、例えば、２％粉末キチン培
地、１％コロダイルキチン培地等の培地を用いることが
出来る。培養に際しては、温度を２５〜３５℃、好まし
くは３０〜３５℃、ｐＨを６．５〜８．０、好ましくは
ｐＨ７．０〜８．０に維持するのが望ましい。以上のよ
うな条件で６〜７日間培養すると、培養液中にキチナー
ゼが分泌される。培養物の遠心分離は、例えば６０００
〜８０００ｒｐｍで１０〜３０分間行なえばよい。培養
物の遠心上清からのキチナーゼの単離・精製は、上記と
同様にクロマトグラフィーを用いて行なうことが出来
る。

【００１６】更にまた、エンテロバクター・Ｇ−１株が
生産するキチナーゼとして、エンテロバクター・Ｇ−１
株由来のキチナーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを
適当な宿主に導入して発現させた後、該宿主から単離・
精製して得られるキチナーゼを用いることも出来る。

【００１７】なお、エンテロバクター（ Enterobacter
）・Ｇ−１株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に、微工研条寄第３１４０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１４
０）として寄託されており（昭和６３年１１月１４日に
寄託された微工研菌寄第Ｐ−１０３９２号より移管）、
その菌学的性質等については、本願出願人によって特公
平６ー６０号公報に詳細に明らかにされているところで
あって、公知のものである。

【００１８】また、このエンテロバクター・Ｇ−１株が
生産するキチナーゼは、精製して用いるのが好ましい
が、未精製のまま用いることも可能である。例えば、エ
ンテロバクター・Ｇ−１株又はエンテロバクター・Ｇ−
１株由来のキチナーゼ遺伝子を導入した宿主を物理的に
破砕して又は化学的に処理して得られる細胞内容物をそ
のまま用いてもよいし、エンテロバクター・Ｇ−１株又
はエンテロバクター・Ｇ−１株由来のキチナーゼ遺伝子
を導入した宿主の培養物を遠心分離して得られる遠心上
清をそのまま用いてもよい。更に、かかるエンテロバク
ター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼは、常法に従って
固定化し、固定化酵素として用いることも可能である。

【００１９】一方、本発明において、上記したエンテロ
バクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼと組み合わせ
て用いられる、マツエバクター・キトサノタビダス・３
００１株が生産するキトサナーゼには、マツエバクター
・キトサノタビダス・３０００１株が生産するキトサナ
ーゼと同様の理化学的性質を有する全てのキトサナーゼ
が含まれることが理解されなければならない。従って、
マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株自体か
ら得られるキトサナーゼの他、例えば、マツエバクター
・キトサノタビダス・３００１株由来のキトサナーゼ遺
伝子を導入し、発現させた宿主から得られるキトサナー
ゼも含まれるものである。また、前駆型キトサナーゼか
ら成熟型キトサナーゼに至る全ての段階のキトサナーゼ
も含まれることとなる。ここで、前駆型キトサナーゼと
は、翻訳後修飾を受けていないキトサナーゼを意味し、
成熟型キトサナーゼとは、全ての翻訳後修飾を受けたキ
トサナーゼを意味する。

【００２０】なお、かかるマツエバクター・キトサノタ
ビダス・３００１株が生産する成熟型キトサナーゼの理
化学的性質は、以下の通りである。 （１）分子量：３４ｋＤａ （２）至適ｐＨ：４．０ （３）ｐＨ安定性：４．０〜８．０ （４）至適温度：３０℃ （５）温度安定性：３０〜４０℃ （６）等電点：ｐＩ９．６ （７）酵素阻害物質：Ａｇ⁺ （８）切断様式：エンド型 （９）基質特異性：脱アセチル化度９０％キトサン、グ
リコールキトサン

【００２１】また、このマツエバクター・キトサノタビ
ダス・３００１株が生産するキトサナーゼとしては、例
えば、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株
の菌体を物理的に破砕して又は化学的に処理して細胞内
容物を抽出した後、該細胞内容物からキトサナーゼ活性
を指標として単離・精製して得られるキトサナーゼを用
いることが出来る。その際、菌体の物理的な破砕は、例
えば、乳鉢にマツエバクター・キトサノタビダス・３０
０１株の菌体の他、アルミナ、ガラス粉末、海砂、ケイ
砂等を加えて、磨砕することにより、行なうことが出来
る。市販の乳鉢式電動磨砕機を使用すれば、大量の菌体
を容易に破砕することが出来る。菌体の化学的な処理
は、例えば、細胞壁を分解する酵素（例えば、卵白リゾ
チーム等）や界面活性剤（例えば、Triton X-100、Teep
ol XL ）で菌体を処理することにより、行なうことが出
来る。細胞内容物の抽出は、適当な緩衝液（例えば、リ
ン酸緩衝液、Tris HCl buffer 、Mcllvaine buffer等）
を用いて行なうことが出来る。細胞内容物からのキトサ
ナーゼの単離・精製は、例えば、細胞内容物を常法に従
って脱塩処理、硫安分画した後、適当なクロマトグラフ
ィーを用いて行なうことが出来る。クロマトグラフィー
としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラ
フィー、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等を用いる
ことが出来る。

【００２２】また、マツエバクター・キトサノタビダス
・３００１株が生産するキトサナーゼとしては、マツエ
バクター・キトサノタビダス・３００１株の培養物を遠
心分離して、その遠心上清から、キトサナーゼ活性を指
標として単離・精製して得られるキトサナーゼを用いる
ことが出来る。

【００２３】その際、マツエバクター・キトサノタビダ
ス・３００１株の培養は、常法に従って、行なうことが
出来る。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無
機物及び必要な生育促進物質を含有する培地であれば、
合成培地及び天然培地の何れを用いてもよく、例えば、
０．５％粉末キトサン培地、０．５％液体キトサン培
地、０．５％コロダイルキトサン培地等の培地を用いる
ことが出来る。また、かかる培養に際しては、温度を２
５〜３５℃、好ましくは３０〜３５℃、ｐＨを４．０〜
７．０、好ましくはｐＨ４．０〜５．０に維持するのが
望ましい。以上のような条件で６〜７日間培養すると、
培養液中にキトサナーゼが分泌される。培養物の遠心分
離は、例えば６０００〜８０００ｒｐｍで１０〜３０分
間行なえばよい。培養物の遠心上清からのキトサナーゼ
の単離・精製は、上記と同様にクロマトグラフィーを用
いて行なうことが出来る。

【００２４】さらに、マツエバクター・キトサノタビダ
ス・３００１株が生産するキトサナーゼとしては、マツ
エバクター・キトサノタビダス・３００１株由来のキト
サナーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを適当な宿主
に導入して発現させた後、該宿主から単離・精製して得
られるキトサナーゼを用いることも出来る。

【００２５】なお、かかるマツエバクター・キトサノタ
ビダス・３００１（ Matsuebacterchitosanotabidus 30
01 ）株は、「 IAM Catalogue of Strains 1998」に「
IAM14711t 」として掲載されており、ＩＡＭより容易に
入手可能である。また、マツエバクター・キトサノタビ
ダス・３００１株の菌学的性質は、以下に示す通りであ
る。

【００２６】 １．形態学的特徴 （１）形 態 運動性のある桿菌 （２）サイズ ０．４〜０．７×２．０〜４．０μｍ （３）グラム染色 陰 性 ２．生理学的特徴 （１）Ｏ−Ｆテスト（グルコース） 糖を分解しない （２）硝酸塩の還元 陽 性 （３）オキシターゼの生産 陽 性 （４）カタラーゼの生産 陽 性 （５）ウレアーゼの生産 陰 性 （６）インドールの生産 陰 性 （７）Ｖ．Ｐテスト 陰 性 （８）メチルレッドテスト 陰 性 （９）硫化水素の生産 陽 性 （10）３−ケトラクトースの生産 陰 性 （11）ジオキシアセトンの生産 陰 性 （12）Tween 40、60、80の分解 陽 性 （13）キングの培地Ａ＆Ｂを用いた蛍光色素の生産 陰 性 （14）２−ケトグルコン酸の生産 陰 性 （15）光合成テスト 陰 性 （16）溶解性色素 陰 性 （17）生育ｐＨ ｐＨ５．０〜９．０ （18）生育温度 ２０〜３０℃ （19）主要なキノン ユビキノン８ （20）ゲノムＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（mol%） ６９．５ （21）主要な脂肪酸組成 パルミトオレイン酸 パルミチン酸 ミリスチン酸

【００２７】そして、このマツエバクター・キトサノタ
ビダス・３００１株が生産するキトサナーゼは、精製し
て用いるのが好ましいが、未精製のまま用いることも可
能である。例えば、マツエバクター・キトサノタビダス
・３００１株又はマツエバクター・キトサノタビダス・
３００１株由来のキトサナーゼ遺伝子を導入した宿主を
物理的に破砕して又は化学的に処理して得られる細胞内
容物をそのまま用いてもよいし、マツエバクター・キト
サノタビダス・３００１株又はマツエバクター・キトサ
ノタビダス・３００１株由来のキトサナーゼ遺伝子を導
入した宿主の培養物を遠心分離して得られる遠心上清を
そのまま用いてもよいのである。また、マツエバクター
・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナー
ゼは、常法に従って固定化し、固定化酵素して用いるこ
とも可能である。

【００２８】ところで、上記した二つの特定の酵素を複
合酵素として、本発明に従ってキトサンを分解して低分
子量化せしめるに際して、用いられるキトサンの脱アセ
チル化度は、特に限定されるものではないが、好ましく
は５０〜１００％であり、更に好ましくは８０〜１００
％であり、最も好ましくは９０〜１００％である。ま
た、そのようなキトサンの分子量も特に限定されるもの
ではないが、通常１０万〜１００万程度であり、好まし
くは５０万〜１００万程度であり、更に好ましくは５０
万程度である。

【００２９】また、本発明におけるエンテロバクター・
Ｇ−１株が生産するキチナーゼの使用量は、基質である
キトサンの量や反応条件等に応じて適宜に調整し得るも
のであるが、キトサンの０．５〜１ｇ／ｍＬに対して、
通常、０．５〜１ｍｇ／ｍＬ程度であり、好ましくは
０．７５〜１ｍｇ／ｍＬ程度であり、更に好ましくは１
ｍｇ／ｍＬ程度である。

【００３０】さらに、本発明におけるマツエバクター・
キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼ
の使用量は、前記エンテロバクター・Ｇ−１株が生産す
るキチナーゼの使用量に対して、一般に、１〜５０重量
％程度であり、好ましくは１０〜２０重量％程度であ
り、更に好ましくは１０重量％程度である。

【００３１】そして、そのような複合酵素を用いたキト
サンの低分子量化のための反応条件は、一般的な加水分
解反応と同様の条件であれば、特に限定されるものでは
ないのである。また、反応温度は、通常２０〜４０℃程
度であり、好ましくは３０〜４０℃程度である。ｐＨ
は、通常４．０〜８．０程度であり、好ましくは４．０
〜６．０程度である。更に、反応時間は、通常６〜１２
時間程度であり、好ましくは６時間程度である。反応媒
体としては、加水分解反応を行ない得る溶媒であれば特
に限定されず、例えば、希塩酸、酢酸、アスコルビン酸
溶液等を用いることが出来る。

【００３２】なお、本発明において、低分子化とは、グ
ルコサミンのポリマーである高分子量のキトサンを、グ
ルコサミンのオリゴマーであるキトサンオリゴマーに分
解することを意味している。キトサンオリゴマーにおけ
るグルコサミンの重合度は、通常２〜７程度である。ま
た、キトサンオリゴマーの分子量は、通常、４４２〜１
５４７程度である。

【００３３】また、かかる本発明に従ってキトサンを低
分子化して得られるキトサンオリゴマーは、反応液か
ら、次のようにして単離・精製することが出来る。即
ち、反応液中のキトサンオリゴマーを活性炭カラム又は
イオン交換カラムに吸着させ、イオン交換水で洗浄した
後、エタノールで回収し、濃縮乾固することにより、白
色結晶として、キトサンオリゴマーを得ることが出来る
のである。

【００３４】かくして得られる、低分子化されたキトサ
ンは、例えば、医用材料、抗菌剤、化粧品、農業資材等
として有用であり、従来と同様にして、各種の用途に有
利に用いられることとなる。

【００３５】

【実施例】以下に、本発明の幾つかの実施例を示し、本
発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明
が、そのような実施例の記載によって、何等の制約をも
受けるものでないことは言うまでもないところである。
また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記
した具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限
りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々なる変更、
修正、改良等を加え得るものであることが理解されるべ
きである。

【００３６】実施例 １ ［Ａ］マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株
が生産するキトサナーゼと市販のキトサナーゼとの、脱
アセチル化度８０〜１００％のキトサンに対するキトサ
ナーゼ活性の比較 （１）マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株
が生産するキトサナーゼの単離・精製 キトサンを基質として、マツエバクター・キトサノタビ
ダス・３００１株を培養して得られた培養液から、遠心
分離により、キトサンの残渣物や菌体を除去して、濁り
のない茶色溶液を上清液として得た。そして、その上清
液に、硫酸アンモニウムを４７２ｇ／Ｌ（７０％飽和）
になるように、少しずつ加えた後、遠心分離（８０００
ｒｐｍ×３０分）して、生じた沈殿物を回収した。その
上清を捨て、得られた沈殿物を、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液に
溶解させた。このようにして回収された沈殿物の溶液
を、透析チューブに収容し、０．０１〜０．５Ｍ Tris
塩酸緩衝液中で、４℃×２４時間の透析を行ない、硫酸
アンモニウムを排除せしめた。そして、その得られた沈
殿物の容液を、フリーズドライして、長期保存可能なキ
トサナーゼ粗酵素を得た。

【００３７】次いで、かかるキトサナーゼ粗酵素を用い
て、イオン交換法により、キトサナーゼの精製を行なっ
た。具体的には、カラムとして、HiLoad 16/10Q Sephar
oseFF（スウェーデン国：ファルマシア社製）を用い、
また緩衝液としては、０．１Ｍ Tris （ｐＨ：８．０）
を用いて、流速４ｍＬ／分にて、下記のグラジエントを
行ない、酵素活性を有する画分を取り出すことにより、
精製を行なった。即ち、グラジエントは、緩衝液濃度を
５０％（０．０５Ｍ）として、カラム体積の１０倍量を
流した後、緩衝液濃度を１００％（０．１Ｍ）にして、
カラム体積の２倍量の緩衝液を流すことにより、行なっ
た。

【００３８】（２）マツエバクター・キトサノタビダス
・３００１株が生産するキトサナーゼ及び市販のキトサ
ナーゼの各酵素液の調製 マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産
するキトサナーゼ及び市販のキトサナーゼをそれぞれ M
cllvaine Buffer （ｐＨ：７．０）に溶解し、各酵素液
を調製した。この際、市販のキトサナーゼとしては、バ
チルス・パミルス（ Bacillus pumilus ）ＢＮ−２６２
株が生産するキトサナーゼ（和光純薬工業株式会社製）
を使用した。

【００３９】（３）各酵素液中のタンパク質含量の定量 各酵素液中のタンパク質含量を、ＢＩＯ ＲＡＤ社製の
プロテイン・アッセイ・キットを使用して、以下のよう
に定量した。

【００４０】先ず、１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（アルブミ
ン）を、０、０．５、1 、2 、3 、１０μｌずつ採り、
それぞれ、最終容量が８００μｌとなるように滅菌水を
加えて、サンプルとした。そして、各サンプルにプロテ
イン・アッセイ溶液を２００μｌずつ加え、暗所にて１
５分間放置した。その後、各サンプルの吸光度ＯＤ_{59 5}
を測定した。この際、滅菌水のみのサンプル（１０ｍｇ
／ｍＬ ＢＳＡ ０μｌ）を、ブランクとして使用し
た。横軸をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）、縦軸をＯＤ
₅₉₅ として、検量線を作成した。

【００４１】ＢＳＡの代わりに各酵素を用いて、上記と
同様にして、吸光度ＯＤ₅₉₅ を測定し、検量線に基づい
て、各酵素液中のタンパク質含量を定量した。

【００４２】（４）Schales 変法を用いたキトサナーゼ
活性の測定 各試験管に、０．１Ｍ クエン酸及び０．２Ｍ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄ を含む Mcllvaine Buffer （ｐＨ：７．０）を
１ｍＬずつ分注した後、各試験管に同様の Buffer で適
当に希釈した各酵素液を０．５ｍＬずつ加えた。コント
ロールとして使用する試験管は、酵素を失活させるため
に１５分間煮沸し、その間、他の試験管は氷中に放置し
た。その後、各試験管に、基質である０．５％キトサン
８Ｂ又は１０Ｂ塩酸溶液（ｐＨ：５．２）０．５ｍＬを
加えた。なお、キトサン８Ｂは脱アセチル化度８０％の
キトサンを意味し、キトサン１０Ｂは脱アセチル化度１
００％のキトサンを意味する。

【００４３】各試験管を３０℃で３０分間インキュベー
トした後、煮沸により酵素を失活させた。次いで、室温
において３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、その遠
心上清１．５ｍＬを別の試験管に移した。更に、この遠
心上清を移した各試験管に、Schales 試薬（組成：Ｋ₃
Ｆｅ（ＣＮ）₆ ０．２５ｇ／０．５Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ ₃
５００ｍＬ）２ｍＬを加え、軽く攪拌した後、１５分
間煮沸した。次いで、室温にて３５００ｒｐｍで１５分
間遠心分離し、得られた遠心上清の吸光度ＯＤ ₄₂₀ を測
定した。

【００４４】そして、上記条件で毎分１μｍｏｌのグル
コサミンに相当する還元糖量を生成する酵素量を１単位
（Ｕ）とし、キトサンの場合のＫｍを２．０７として、
各酵素液のキトサナーゼ活性を、以下の式に従って計算
した。 ［（Ｃ−Ｓ）×２］／［Ｋｍ×Ｘ（ｍＬ）］ ＝μｍｏｌ／ｍＬ酵素／基質反応時間（分） ＝Ｕ／ｍｇ／ｍＬ ＝Ｕ／ｍｇ protein

【００４５】なお、式中、「Ｃ」はコントロールのＯＤ
₄₂₀ を表わし、「Ｓ」は各サンプルのＯＤ₄₂₀ を表わ
し、「Ｘ」は各酵素液量を表わす。

【００４６】（５）各酵素のキトサン１０Ｂ及びキトサ
ン８Ｂに対するキトサナーゼ活性 各酵素のキトサン１０Ｂ及びキトサン８Ｂに対するキト
サナーゼ活性を、表１に示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】かかる表１に示されるように、キトサン８
Ｂ［脱アセチル化度（Ｄａｃ）８０％のキトサン］及び
キトサン１０Ｂ［脱アセチル化度（Ｄａｃ）１００％の
キトサン］に対するキトサナーゼ活性は、マツエバクタ
ー・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナ
ーゼの方が、バチルス・パルミス ＢＮ−２６２株が生
産するキトサナーゼよりも約３倍程度高かった。

【００４９】この結果により、マツエバクター・キトサ
ノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼが、脱
アセチル化度８０〜１００％キトサンに対して優れたキ
トサナーゼ活性を有することが明らかとなった。即ち、
マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産
するキトサナーゼを利用することにより、脱アセチル化
度８０〜１００％キトサンを効率よく低分子化出来るこ
とが明らかとなったのである。

【００５０】［Ｂ］マツエバクター・キトサノタビダス
・３００１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクタ
ー・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとを複合した場合の
キトサナーゼ活性の変化 （１）エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナー
ゼの単離・精製 キチンを基質として、エンテロバクター・Ｇ−１株を培
養して得られた培養液から、遠心分離により、キチンの
残渣物や菌体を除去することによって、濁りのない黒褐
色溶液を得た。次いで、この溶液に、硫酸アンモニウム
を５６ｇ／Ｌ（１０％飽和）となるように、少しずつ加
えた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×１５分）を行な
い、生じた沈殿物を除去して、上清液を回収した。次い
で、その得られた上清液に、硫酸アンモニウムを４０６
ｇ／Ｌ（７０％飽和）となるように、少しずつ加えた
後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×３０分）を実施し、そ
の上清を捨てる一方、沈殿物をＴｒｉｓ塩酸緩衝液に溶
解させることにより、生じた沈殿物を溶液として回収し
た。そして、その回収した沈殿物の溶液を透析チューブ
に入れて、０．０１〜０．５Ｍ Tris 塩酸緩衝液中で、
４℃×２４時間、透析を行ない、硫酸アンモニウムを排
除した。その後、かかる透析処理された沈殿物の溶液を
フリーズドライして、長期保存可能なキチナーゼ粗酵素
を得た。

【００５１】次いで、かかるキチナーゼ粗酵素に対し
て、以下の精製操作を施し、キチナーゼの精製を行なっ
た。先ず、カラムとしては、HiLoad 16/10Q Sepharose
FF（スウェーデン国：ファルマシア社製）を用い、また
緩衝液としては、０．１Ｍ Tris （ｐＨ：８．０）を使
用すると共に、流速４ｍＬ／分にて、以下のグラジエン
トを行ない、酵素活性を有する最初の素通り画分を取り
出すことにより、精製酵素溶液を分離、採取した。即
ち、グラジエントは、緩衝液濃度を５０％（０．０５
Ｍ）として、カラム体積の１０倍量を流した後、緩衝液
濃度を１００％（０．１Ｍ）にして、カラム体積の２倍
量の緩衝液を流すことにより、行なった。

【００５２】（２）各酵素と複合酵素とのキトサナーゼ
活性の比較 キトサン８Ｂ（脱アセチル化度８０％のキトサン）及び
キトサン１０Ｂ（脱アセチル化度１００％のキトサン）
に対するキトサナーゼ活性を、マツエバクター・キト
サノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼを単
独で使用した場合、エンテロバクター・Ｇ−１株が生
産するキチナーゼを単独で使用した場合、マツエバク
ター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサ
ナーゼとエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナ
ーゼとを併用した場合において、比較した。

【００５３】各酵素液中のタンパク質含量の定量、並び
に各酵素液のキトサナーゼ活性の測定は、前記と同様に
して行なった。

【００５４】各酵素及び複合酵素のキトサン１０Ｂ及び
キトサン８Ｂに対するキトサナーゼ活性を、下記表２に
示す。

【００５５】

【表２】

【００５６】かかる表２に示される結果より明らかなよ
うに、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナー
ゼは、キトサン１０Ｂ（脱アセチル化度１００％のキト
サン）に対して全くキトサナーゼ活性を示さないにも拘
わらず、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１
株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ−１
株が生産するキチナーゼとを併用する場合には、マツエ
バクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキ
トサナーゼを単独で使用する場合と比較して、キトサン
８Ｂ（脱アセチル化度８０％のキトサン）及びキトサン
１０Ｂ（脱アセチル化度１００％のキトサン）に対する
キトサナーゼ活性が１０〜１５％以上増大しているので
ある。即ち、マツエバクター・キトサノタビダス・３０
０１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ
−１株が生産するキチナーゼとを併用することにより、
キトサナーゼ活性が相乗的に増大することが、明らかと
なったのである。

【００５７】実施例 ２ 実施例１において得られたエンテロバクター・Ｇ−１株
が生産した精製キチナーゼと、マツエバクター・キトサ
ノタビダス・３００１株が生産した精製キトサナーゼを
用い、下記の４種の試料溶液を調製した。

【００５８】対 照：蒸留水２ｍＬ＋１％キトサン−
ＨＣｌ ８ｍＬ＝１０ｍＬ キチナーゼ単独：精製キチナーゼ２ｍＬ＋１％キトサ
ン−ＨＣｌ ４ｍＬ＝６ｍＬ キトサナーゼ単独：精製キトサナーゼ溶液２ｍＬ＋１
％キトサン −ＨＣｌ ４ｍＬ＝６ｍＬ 複合酵素（キチナーゼ＋キトサナーゼ）：精製キチナ
ーゼ溶液１ｍＬ＋精製キトサナーゼ溶液１ｍＬ＋１％キ
トサン−ＨＣｌ ８ｍＬ＝１０ｍＬ

【００５９】上記の４種の試料溶液に対して、それぞ
れ、３０℃×１２０分の酵素反応操作を実施した後、２
０分間煮沸することにより、酵素活性を失活せしめ、そ
の後、下記条件にてゲル濾過クロマトグラフィー法（Ｇ
ＰＣ）により、分子量測定を行なった。

【００６０】ＧＰＣ分子量測定条件 ・カラム： Shodex OHpak ＳＢ−Ｇ＋ＳＢ−８０６Ｈ
Ｑ＋ＳＢ−８０５ＨＱ ・移動相：０．５Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液 ・流 量：１．０ｍＬ／ｍＬ ・検出器：ＲＩ ・カラム温度：４０℃ ・注入量：２００μＬ（約０．０５％濃度の溶液とし
て） ・標 品： Shodex Pullulan Ｐ−５、Ｐ−１０、Ｐ−
２０、Ｐ−５０、 Ｐ−１００、Ｐ−２００、Ｐ−４００、Ｐ−８００

【００６１】かくして得られたＧＰＣ分子量測定の結果
を、下記表３に示すが、その結果から明らかなように、
本発明に従って複合酵素（キチナーゼ＋キトサナーゼ）
を用いた場合にあっては、キトサンが効果的に分解せし
められて、分子量のより小さな低分子が形成されている
のである。

【００６２】

【表３】

【００６３】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
に従って、マツエバクター・キトサノタビダス・３００
１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ−
１株が生産するキチナーゼとを併用することにより、キ
トサナーゼ活性が相乗的に増大せしめられ得て、キトサ
ンを効率よく低分子化出来るのである。特に、エンテロ
バクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼは、脱アセチ
ル化度１００％のキトサンに対して全くキトサナーゼ活
性を示さないにも拘わらず、マツエバクター・キトサノ
タビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとエンテ
ロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとを併用す
ることにより、マツエバクター・キトサノタビダス・３
００１株が生産するキトサナーゼを単独で使用する場合
よりも、効率よく、脱アセチル化度の高いキトサンを低
分子化出来るのである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B064 AF21 CA21 CB07 CC03 CD19 DA01 DA10 DA16

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エンテロバクター・Ｇ−１株（微工研条
   寄第３１４０号）が生産するキチナーゼとマツエバクタ
   ー・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナ
   ーゼとを用いて、キトサンを分解して、低分子化するこ
   とを特徴とするキトサンの低分子化方法。
2. 【請求項２】 前記キトサンが、脱アセチル化度５０〜
   １００％のキトサンであることを特徴とする請求項１記
   載のキトサンの低分子化方法。