JPS62275A - 多糖類加水分解酵素の調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上皇■且分立 本発明は、難消化性多糖類を細胞壁の構成糖として含有
する海藻類もしくは植物の消化性を改善してその栄養価
値等を向上するのに利用される多糖類加水分解酵素の調
製法に関する。

従来ｑ茨血呵實見 近年、酵素は食品工業、発酵工業および医薬品工業等で
広く利用されている。例えば、アミラ−ゼを利用した水
飴、ブドウ糖などの製造やアルコールの製造、プロテア
ーゼを利用した味噌、醤油の速醸、チーズの製造、食肉
軟化等、セルラーゼを利用したセルロース質原料からの
アルコールの製造又はみかん缶詰製造上の剥皮処理、ア
ミラーゼおよびその他の各種酵素を利用した消化剤、プ
ロテアーゼを利用した消炎、鮮創剤がある。

一方、最近における健康食品に対する志向が高くなって
きたことに伴ない、ミネラルやビタミン類を豊富に含ん
でいる海藻類を食品素材として高度に利用する試みが行
われている。しかし、海藻類はキシラン、マンナン及び
ガラクタンのようないわゆる難消化性多糖類を細胞壁の
構成糖として含有しているため、その消化性を高めるこ
とが望まれるが、これらの多糖類を加水分解する酵素は
、前述したアミラーゼ、プロテアーゼ及びセルラーゼの
ように工業的に製造され、市販されていないので、酵素
を利用して海藻類の消化性を高めることは実際上困難で
ある。

因に、キシランを加水分解するβ−１，４キシラナーゼ
は市販されているものの、海藻類に特有的に含まれてい
るβ−１，３キシランを加水分解するβ−１，３キシラ
ナーゼは市販されていない。

、　が　°　しよ“とする。　占 本発明者は、−海藻類を食品素材として高度に利用すべ
く、海藻類に特有的に含有される多糖類であるβ−１，
３キシラン、β−１，４マンナン及びガラクタンの加水
分解酵素の工業的に有利な製造方法について検討した結
果、本発明をなすに至った。

すなわち、本発明の主要な目的は、海藻類に含有される
上記多糖類の加水分解酵素を有利に製造するための方法
を提供することにある。

以下本発明の詳細な説明する。

衾肌亘援底 本発明の特徴は、シュードモナスＫ　（Ｐｓｅｕｄｏｍ
。

ｎａｓ）に属する多ｍ類分解能を有する微生物を、β−
１，３キシロシド結合を有する２ｗ１類以上の糖、β−
１，４マンノシド結合を有する２ｙｓ類以上の糖および
β−１，３とβ−１，４ガラクトシド結合を有する３糖
類以上の糖から成る群から選択される少くとも１種の糖
を誘導物質として含有する培地中で培養することにより
、上記各部に対応するβ−１，３キシラン加水分解酵素
、β−Ｌ４マンナン加水分解酵素およびガラクタン加水
分解酵素の少くとも１種を産生させて採取することにあ
る。

本発明で利用する難消化性多糖類の分解能を有する微生
物は海水中から分離されたものであって下記に示す菌学
的性質に鑑み、シュードモナス属に属する菌株であると
同定し得る。

なお、本発明で利用する微生物の菌株シュードモナスｓ
ｐ＋（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、）ＰＴ−５は微
工研条寄１）ｈＢＰ−３３０の受託番号で工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。

菌学的性質： ｉ）形態 ＺｏＢｅｌｌ　２２１６ｔｉ培地に生育した細胞につい
て、（イ）１）［１胞の形態は桿菌で大きさは０．５〜
１μｍ×１．５〜２．５μｍ （ロ）運動性を有し、鞭毛は単極毛性 （ハ）ダラム染色性は陰性 ｉｉ）生育状態 ＺｏＢｅｌｌ　２２１６Ｂ斜面培地での培養において、
（イ）２０〜２７℃の温度で良好に生育する（口）淡黄
色の色素沈着あり （ハ）集落の形状は毛状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ）を呈する
ｉｉｉ　）生理学的性質 （イ）カタラーゼテスト　　　　　　陽性（ロ）オキシ
ダーゼテスト　　　　　陽性（ハ）グルコースよりの酸
の生成　　陽性（ニ）０−Ｆテスト　　　　　　　　　
０（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法による）（ホ）　Ｖｉ
ｂｒｏ−５ｔａｔｉｃ　Ａｇｅｎｔ（０／１２９）　　
陰性（へ）寒天液化能　　　　　　　　　十（ト）キシ
ラン分解能　　　　　　　十（チ）マンナン分解能　　
　　　　　十（す）好気性 。１−占を一ンするための 本発明では上記微生物を、β−１，３キシロシド結合を
有する２糖類以上の糖、又はβ−１，４マンノシド結合
を有する２ｙ！３類以上の零唐、もしくはβ−１，３と
β−１，４ガラクトシド結合を有する３ｍ類以上の糖、
あるいはこれらの糖の２種以上を含有する培地中で培養
することにより、これらの多糖に対応する多糖類加水分
解酵素を産生させる。ここで用いる上記多糖は、それぞ
れβ−１，３キシラン、β−１，４マンナンおよびガラ
クタンの各加水分解酵素の誘導物質として作用するもの
であるが、そのほとんどは市販されていないので、これ
らの糖はそれを含有する天然物から調製したものを用い
るが、実際上は、上記天然物自体もしくはその水解物を
用いることもできる。また、このような天然物としては
海藻類が適当である。すなわち、海藻類からのβ−１，
３キシラン、β−１，４マンナンおよびガラクタン（カ
ラゲナン、ポルフィラン）の調製が比較的簡易であり、
特にβ−１，３キシランは海藻類に特有的に含有されて
いるからである。なお、β−１，４マンノシド結合を有
する多糖（β−１，４マンナン）は海藻のほかにコンニ
ャクにも含まれているので、コンニャク粉から調製する
こともできる。

次に、これらの糖を海藻類からｍ製する手法を例示する
。

（１）　　イワヅタよりβ−１，３キシランの！！！ｉ
！！藻体を１０倍量の１．２５％カセイソーダに加え約
３０分加熱後、残渣に１０倍量の１％次亜塩素酸ソーダ
中に数時間浸漬し脱色する。水洗後、１０倍量の１．２
５％硫酸中で約３０分加熱した後水洗し、次に１０倍量
の１０％カセイソーダを加え約２４時間浸漬し、濾液に
３倍量のエタノールを加え遠心分離した沈澱をエタノー
ル、アセトン、エーテルと順次洗浄し、減圧乾燥し調製
する。

この標品を水解しくＩＮ硫酸で１２０℃、２時間）、液
体クロマトグラフィーにて組成単糖を分析するとキシロ
ースのみであり、又、過ヨウ素酸酸化及びＸ線解析の結
果、結合様式はβ−１，３結合であった。

（２）　　ミルよりβ−１，４マンナンの調製藻体を１
０倍量の１．２５％カセイソーダに加え、約３０分加熱
後、残渣に１０倍量の１％次亜塩素酸ソーダ中に数時間
浸漬し脱色する。水洗後１０倍量の１．２５％硫酸中で
約３０分加熱した後、水洗し、次に１０倍量の１０％カ
セイソーダを加え、窒素気流下にて８０℃、約５時間、
攪拌抽出した。冷却後、濾液に多糖類が完全に沈澱する
までフエーリンダ液を加え、沈澱を水洗した後、エタノ
ール、アセトンと交互に洗浄をくり返し、最後にエタノ
ール・エーテル混液で乾燥しｍ製した。この標品を上記
と同様に分析したところマンノースのみであり、β−１
，４結合を有することが確認された。

（３）　　アサクサノリよりポルフィランの調製藻体を
２０倍量の蒸留水に加え、１２０℃、１時間加熱し、冷
却後、遠心分離しその上清に終濃度１０％となるようト
リクロル酢酸を加え一夜放置後、遠心分離しその上清に
３倍量のエタノールを加え遠心分離した沈澱を蒸留水に
溶解後２４時間透析した後、３倍量エタノールを加え、
遠心分離にての沈澱をアセトンで洗った後減圧乾燥し調
製する。

この標品を上記と同様に分析したところ、ガラクトース
のみであり、β−１，３とβ−１，４結合を有すること
が確認された。

また、上述のようにして調製した多糖の水解物を誘導物
質として用いる場合は、これらの多糖を単糖にまで水解
したものは前記誘導物質としての作用をしないので、２
糖類や少糖類が混在する程度に水解したものを用いる。

このような氷解を行なうには、例えば０．ＩＮ硫酸を用
い１００℃で１時間程度処理するとよい。

上記誘導物質の培地に対する添加量は、上述のようにし
て天然物から調製して得られる多糖又はその水解物では
０．１乃至０．２重量％程度、海藻のような天然物自体
もしくはその水解物では１乃至２重量％程度が適当であ
る。

本発明で利用する上記微生物の培養に用いる培地は、炭
素源として上記誘導物質を、窒素源としてペプトンおよ
び酵母エキスを、更には無機質としてＫＪＰＯ＋４　、
ＦｅＣｌ３などを海水（もしくは人工海水）に溶解し、
緩衝液（例えばトリスバッファー）でｐＨを７．５前後
に調整したものが好ましい。

培地組成を例示すると下記のとおりである。

培地組成： 誘導物質の糖　　　　　０．１（重量％）ペプトン　　
　　　　　１．０ 酵母エキス　　　　　　０．１ ＫＪＰＯ，＋　　　　　　　　　　０．０１ＦｅＣＩ３
　　　　　　　　　　　　０．６ｍｇ／ｌトリス緩衝液
　　　　　０．１（重量％）上記割合で海水に溶解して
ｐＨを７．５に調整する。

本発明で利用する上記微生物の上記培地における培養条
件は、２５℃の温度で４日間通気、攪拌下（通気量１０
００〜２０００　ｍ　１２　／ｍｉｎ　、攪拌数１００
〜３００ｒ、ｐ、ｍ、）に行なうとよい。

上述のようにして培養して培地中に産生された酵素は、
培＃液を４℃の温度で遠心分！ｉ５Ｎ　（１０，００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、、３０分間）し、上清を取り酵素液とする
か、さらに限外濾過などにより濃縮したり、また、真空
凍結乾燥してもよい。

このようにして得られる酵素は、使用した各誘導物質に
対応した酵素活性を示す。すなわち、誘導物質がβ−１
，３キシラン、その水解物、β−１，３キシランを含む
海藻およびそめ水解物であれば、産生されるβ−１，３
キシラン加水分、解酵素であり、１β−１，４マンナン
、その水解物、β−１，４マンナンを含む海藻、および
その水解物であれば、β−１，４マンナン加水分解酵素
であり、また、ガラクタン、その水解物、ガラクタンを
含む海藻、およびその水解物であれば、ガラクタン加水
分解酵素である。

紙上のとおり、本発明によると、海藻類に主要成分とし
て含有される難消化性多糖類であるβ−１，３キシラン
、β−１，４マンナンおよびガラクタンの各加水分解酵
素を工業的に有利に調製し得る。したがって、このよう
にして得られた各酵素を利用して海藻類の消化性を高め
ることにより、海藻類を栄養的に優れた食品素材として
高度に利用することが可能となる。

し　の　Ｕと開渠 以下に実施例を示して本発明およびその効果を具体的に
説明する。

実施例１ 培地の組成 ペプトン　　　　　　１．０（重量％）酵母エキス　　
　　　０．１ に２ＨＰＯ＝ｈ　　　　　　　０．０１ＦｅＣＩ　Ｂ　
　　　　　　　０．６ｍｇ／　１２トリス緩衝液　　　
　０．１（重量％）＊誘導物質　　　　　　０．２又は
２．０（重量％）上記組成のものを海水に熔解してｐＨ
を７．５に調整して培地とした。なお、誘導物質として
下記のものをそれぞれ用い、また、各水解物はいずれも
０．ＩＮ硫酸を用いて１００℃で１時間加水分解し、中
和した後、減圧乾燥して試験に供した。

■　β−１，３キシラン　　°　　０．２（重量％）■
　β−１，４マンナン ■　ボルフイラン　　　　　　〃 ■　β−１，３キシラン水解物　　〃 ■　β−１，４マンナン水解物　　〃 ■　ボルフイラン水解物 ■　イワヅタ　　　　　　　　２．０（重量％）■　ミ
ル ■　アサクサノリ ［相］　イワヅタ水解物 ■　ミル水解物 ■　アサクサノリ水解物　　　〃 権炙 上記の各培地にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）ｓｐ、微工研条寄１ｋＢＰ−３３０を接種し、２５
℃の温度で通気下（１５００ｍ　１２　／　ｍ１ｎ）に
４日間培養を行なった。

腹粂鹿■皿盟 上述のようにして得られた各培養液を４℃の温度で１０
．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、３０分間遠心分離して、その上
清を酵素液とした。

酵素活性試験 上記各酵素液５１）ｅ宛と各基質（β−１，３キシラン
、β−１，４マンナン、ポルフィラン）　１００ｍｇ宛
および１７１５モル燐酸バッファー（ｐＨ７，５）　５
ｍ／宛をＬ型試験管に入れ、３５℃で１時間振盪（８０
ストロ一ク／分）させたのら、沸騰水浴中で１５分間加
熱し酵素反応を停止させ、ついで急冷後遠心分離し、そ
の上清中の遊離単糖類をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ
法で比色定量し、グルコース量として酵素活性を示した
。尚、対照は２ｆ８騰水浴中で１５分間加熱処理して熱
失活させた酵ｉ液にて同様に行なづた。

結果は表１に示すとおりである。

表１にみられるとおり、各誘導物質に対応した加水分解
酵素が誘導的に産生された事がわかる。

尚、アサクサノリにはボルフイランの外にβ−１，３キ
シラン、β−１，４マンナンも含有されるためそれらの
加水分解酵素も産生ずる。

実施例２ 実施例１で用いた培地組成において、誘導物質としてβ
−１，３キシラン、β−１，４マンナン、およびポルフ
ィランを各０．１重量％で混合したもの、ならびにイワ
ヅタ、ミル、およびアサクサノリを各１％正量％で混合
したものを用いる以外は実施例１の記載と同様の手順で
培養を行ない、得られた培養液から同様にして酵素液を
調製し実施例１と同様にして酵素活性試験を行なった。

結果は表２に示すとおりである。

表２にみられるとおり、使用した誘導物質に対応した加
水分解６ゲ素が産生されたことが確認される。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に
   属する多糖類分解能を有する微生物を、β−１，３キシ
   ロシド結合を有する２糖類以上の糖、β−１，４マンノ
   シド結合を有する２糖類以上の糖、およびβ−１，３と
   β−１，４ガラクトシド結合を有する３糖以上の糖から
   成る群から選択される少くとも１種の糖を誘導物質とし
   て含有する培地中で培養することにより、上記各糖に対
   応するβ−１，３キシラン加水分解酵素、β−１，４マ
   ンナン加水分解酵素およびガラクタン加水分解酵素の少
   くとも１種を産生させて採取することを特徴とする多糖
   類加水分解酵素の調製法。
2. （２）誘導物質が、上記各糖の少くとも１種を含有する
   海藻類である特許請求の範囲第（１）項記載の調製法。
3. （３）誘導物質がβ−１，３キシラン、β−１，４マン
   ナンおよびガラクタンから成る群から選択される多糖類
   の水解物である特許請求の範囲第（１）項記載の調製法
   。
4. （４）誘導物質がβ−１，３キシラン、β−１，４マン
   ナンおよびガラクタンから成る群から選択される多糖類
   を含有する海藻類の水解物である特許請求の範囲第（１
   ）項記載の調製法。