JPH06169769A

JPH06169769A - ペクチン分解酵素

Info

Publication number: JPH06169769A
Application number: JP32416092A
Authority: JP
Inventors: Setsuko Uchida; 節子内田; Susumu Maeda; 進前田; Satoshi Watabe; 聡渡部
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1992-12-03
Filing date: 1992-12-03
Publication date: 1994-06-21
Anticipated expiration: 2015-10-23
Also published as: JP3101640B2

Abstract

(57)【要約】【目的】低分子ペクチンを生産できるペクチン分解酵素
を提供すること。【構成】ペクチン及びペクチン酸を分解するペクチン分
解酵素であって、（１）サッカロマイセス属から生産さ
れるエンド型ポリガラクツロナーゼ、（２）至適ｐＨが
４．０、（３）安定ｐＨ領域が４．０から８．０、
（４）至適温度が４５℃、（５）４５℃まで酵素活性が
安定、（６）分子量が３８，０００であるペクチン分解
酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ペクチンを分子量２か
ら８万の低分子ペクチンに分解することができるペクチ
ン分解酵素に関する。特に、分解酵素が、エンド型ポリ
ガラクツロナーゼであるものに関する。

【０００２】

【従来の技術】食物繊維は、人の消化酵素では消化され
ない食物中の難消化成分と定義付けられており、セルロ
ース、リグニン、ペクチン等の植物細胞壁成分のみなら
ず、広くキチンやキトサン等の不消化有機物を含むもの
である。近年、これらは、便通改善効果をはじめ、血中
コレステロール低下作用等の種々の作用を有し、成人病
の予防などにも重要な役割を果たしていることが明らか
になってきた。

【０００３】これら食物繊維の中でも、ペクチンやペク
チン酸等のペクチン質は、食物繊維としての活性が強
く、便通改善、血中コレステロールレベルの上昇抑制効
果、胆石形成の抑制効果、高血圧抑制効果など種々の効
果が報告されている。従来、ペクチン質は、食品工業に
おいて、安定剤として、ジャム、フルーツゼリー、ドリ
ンクヨーグルト、乳酸菌飲料などに用いられてきたが、
以上のような効果を有することから、食品繊維として飲
食品に添加することも期待される。

【０００４】ペクチン質は、未熟の果実或いは植物体中
でセルロースと結合して、プロトペクチンという複合体
の形で存在し、特に、柑橘類、リンゴ、かりん等に多量
に含まれている。このプロトペクチンは、不溶解性であ
るが、果実が成熟すると加水分解されて可溶性のペクチ
ン又はペクチン酸を生じる。

【０００５】このうち、ペクチンは、ガラクツロン酸の
ポリマーであるガラクツロナンを主成分とし、ラムノー
ス、アラビノース、キシロース、ガラクトースなどを微
量に含む分子量２００，０００以上の多糖である。

【０００６】ところが、一般に、ペクチンは、溶解性が
低く、高粘度で、ゲル化能が強いという性質を有してい
る。従って、ペクチンは、上記のような種々の効果を有
するにもかかわらず、その性質故に、飲食品に少量しか
添加できず、食物繊維としての活性が期待できるだけの
量を飲食品に含有させることが困難であった。

【０００７】従って、この問題を解決するためには、低
粘度、高溶解性を有し、且つ繊維としての生理活性を保
持した低分子量ペクチンが必要となる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記の事情に鑑み、本
発明の目的は、低分子ペクチンを生産できるペクチン分
解酵素を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ペクチン分
解酵素によってペクチンを低分子化することによって、
低粘度で且つ溶解性の高いペクチンが得られると考え、
多くのペクチン分解酵素を検討した。その結果、発明者
らは、エンド型ポリガラクツロナーゼをペクチンに作用
させた場合、分解限度まで作用させても、分解によるペ
クチンの分子量の低下は２万程度までしか進行しないこ
とを見い出した。また、反応条件を制御することによ
り、２〜８万程度の分子量を有する低分子ペクチンが得
られることも見いだした。

【００１０】従って、本発明の課題は、以下の手段を用
いることによって解決される。

【００１１】即ち、この手段は、以下の（１）から
（６）までの性質を具備するペクチン及びペクチン酸を
分解するペクチン分解酵素である。

【００１２】（１）該ペクチン分解酵素が、サッカロマ
イセス属から生産されるエンド型ポリガラクツロナーゼ
である。

【００１３】（２）３５℃で２０分間反応させた場合の
至適ｐＨが、４．０である。

【００１４】（３）３５℃で６０分間加温した場合の安
定ｐＨ領域が４．０から８．０である。

【００１５】（４）ｐＨ５．０で反応させた場合の至適
温度が４５℃である。

【００１６】（５）ｐＨ５．０の条件下において６０分
間加温した場合、４５℃まで酵素活性が安定である。

【００１７】（６）分子量が３８，０００である。

【００１８】本発明者らは、ペクチン分解酵素を産出す
る種々の微生物について検討を行った結果、サッカロマ
イセス属に属する酵母（サッカロマイセスバヤヌス(Sac
charomyces bayanus) 、ＪＴＦ−４）が、上記エンド型
ポリガラクツロナーゼを生産することを始めて見い出し
た。

【００１９】尚、本酵母を平成４年７月９日付で工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した（微工研条寄第３
９１６号）。

【００２０】以下に本発明を詳細に説明する。

【００２１】一般に、エンド型ポリガラクツロナーゼ
は、微生物、高等植物等に存在するが、これらから酵素
を精製するためには多くの工程が必要である。すなわ
ち、微生物等の培養液から菌体を除去した培養上清を硫
安沈殿処理に供して蛋白質のみを塩析させ、これをイオ
ン交換体を用いて電荷により分離し、更にゲル濾過によ
って分子量により分離するという一般の酵素精製工程に
より精製する。

【００２２】上記ＪＴＦ−４から得られた本発明のエン
ド型ポリガラクツロナーゼは、菌体外に分泌される菌体
外酵素であるので、その培養上清をそのまま粗酵素液と
して用いることができる。通常、培養上清は、上記酵母
を寒天培地で種培養し、これを更に本培養に供して大量
培養し、得られた培養物を遠心分離して菌体を除去する
ことによって得ることができる。このようにして、上記
酵母から得られた培養上清は、酵素反応に直接用いるこ
とができ、これにより酵素精製工程の簡略化を図ること
ができるので好ましい。

【００２３】前記培養上清に透析、限外濾過、イオン交
換、又はゲル濾過などの簡単な処理を施すことは、本酵
素を用いた反応において、より液色を透明にすることが
できるのでより好ましい。

【００２４】以下に本発明のエンド型ポリガラクツロナ
ーゼ（以下ＪＴＦＰ−４と称する）の理化学的性質につ
いて述べる。

【００２５】本発明の酵素であるＪＴＦＰ−４は、ペク
チン及びペクチン酸に作用してこれらを加水分解するも
のであり、以下の性質を有する。

【００２６】（１）基質特異性本発明のＪＴＦＰ−４は、ペクチン及びペクチン酸を分
解するが、可溶性澱粉、デキストリン及びキシランを分
解しない。

【００２７】（２）至適ｐＨ本発明のＪＴＦＰ−４は、ｐＨ４付近に至適ｐＨを有す
る。

【００２８】（３）安定ｐＨ領域本発明のＪＴＦＰ−４は、ｐＨ４〜８で安定である。

【００２９】（４）酵素活性本発明のＪＴＦＰ−４の酵素活性は、３３．９ユニット
／ｍｇ蛋白である。

【００３０】（１ユニット：ペクチン酸の加水分解にお
いて、３５℃で１分間に加水分解物の還元基が１μmol
生成する酵素量）（５）至適温度本発明のＪＴＦＰ−４は、４５℃付近に至適温度を有す
る。

【００３１】（６）安定温度本発明のＪＴＦＰ−４は、４５℃までは安定である。

【００３２】（７）金属イオン及び阻害剤の影響本発明のＪＴＦＰ−４は、塩化バリウムで６９％阻害さ
れるが、硫酸マグネシウムでは阻害されない。また、Ｅ
ＤＴＡによって７４％阻害される。

【００３３】（８）分子量本発明のＪＴＦＰ−４の分子量は、３８，０００であ
る。

【００３４】（９）アミノ酸組成本発明のＪＴＦＰ−４は、分子中にグルタミン及びグル
タミン酸を最も多く含有する（１分子当たり１３０残
基）。

【００３５】以下に本発明の酵素をペクチンに作用させ
る場合について述べる。

【００３６】ペクチンに本発明のエンド型ポリガラクツ
ロナーゼ（ＪＴＦＰ−４）を作用させるにあたっては、
精製物、培養上清（粗酵素液）或いはその処理物のいず
れを用いてもよい。

【００３７】低分子ペクチンは、上述のようにして得ら
れた精製物、培養上清、或いはその処理物を、ペクチン
を酢酸等の緩衝液に懸濁した懸濁液と反応させることに
より得られる。

【００３８】この酵素分解反応は、反応時間が１２〜４
８時間、ペクチン１重量部に対する酵母培養上清の量的
割合が５〜２０重量部の条件下で行われることが好まし
い。また、反応温度及びｐＨは、反応が十分に進行し、
かつエンド型ポリガラクツロナーゼが失活しない温度及
びｐＨ、すなわち３０〜５０℃、ｐＨ４．０〜８．０が
それぞれ好ましい。

【００３９】この反応は分解限度で行ってもペクチンの
分解は分子量２万程度で止まるが、上記反応時間等の反
応条件を制御することにより、２〜８万程度の範囲の任
意の分子量を有する低分子ペクチンを得ることができ
る。

【００４０】本発明の低分子ペクチンは、２〜８万程度
の分子量を有し得るが、食物繊維としての生理活性保持
及び飲食品への添加容易性の観点から５〜７万程度の分
子量を有することが好ましい。最も好ましいのは６万程
度の分子量を有する低分子ペクチンである。

【００４１】このようにして得られたペクチンの分解物
は、そのまま乾燥して使用してもよく、また、更に処理
を施してもよい。

【００４２】更に処理を施す場合は、分解物中のガラク
ツロン酸やそのオリゴ糖、及び酵素反応時の緩衝液とし
て使用した酢酸を除去するために、ペクチンの分解物を
透析、限外濾過などの精製工程に付し、その後、生成し
た分解物をエタノール、アセトンなどの有機溶媒による
沈殿工程、或いは凍結乾燥、噴霧乾燥などの乾燥工程に
より粉末化し使用に供する。

【００４３】上記方法により得られた低分子ペクチン
は、その分子量が食品添加物としての既存のペクチンや
アガロースなどの多糖と、マルトオリゴ糖やフラクトオ
リゴ糖などのオリゴ糖の間に位置するものである。ま
た、この低分子ペクチンは、元のペクチンに対してかな
り低粘度であり、かつ溶解度が高いにもかかわらず、食
物繊維の生理活性の一つである便通改善効果を保持して
いる。

【００４４】一方、本発明の低分子ペクチンは、上記性
質を有することから、従来は不可能であった、食物繊維
としての生理活性を保持できる程度の量、すなわち０．
０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜５重量％を、ジ
ュース、キャンディー、食パン、ジャム等種々の飲食品
に含有させることができる。

【００４５】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。

【００４６】実施例１ＪＴＦ−４の培養法サッカロマイセスバヤヌス（ＪＴＦ−４）をショ糖２％
を含むジャガイモ煎汁寒天斜面培地（ｐＨ５．０）で２
８℃の条件下で３日間培養した。その後、斜面培地に増
殖した本菌体を１白金耳採り、２００ｍｌの三角フラス
コに入った液体培地５０ｍｌ（ブドウ糖５％、リン酸ア
ンモニウム０．２％、リン酸１カリウム０．１％、硫酸
マグネシウム０．１％及び酵母エキス０．４％、ｐＨ
５．０）に接種し、更に２８℃で３日間静置培養した。
この培養物を同じ組成の培地１リットルを含む３リット
ルの三角フラスコに接種し、更に２８℃で３日間培養し
た。培養終了後、この培養物を８，０００ｒｐｍで１０
分間遠心分離し、菌体を除去して培養上清を得た。

【００４７】実施例２ＪＴＦＰ−４の調製方法及び分子量の測定実施例１で得られた培養上清をミリポアフィルター（ポ
アサイズ０．４５μ）を用いて濾過し、菌体を完全に除
去した。次に、培養瀘液を０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）中で５℃条件下、一晩透析を行った。透析済み
培養上清約６００ｍｌをイオン交換カラム(S-Sepharos
e) に吸着させ、食塩水による密度勾配法によって溶出
した。活性のあった画分を集め、０．０２Ｍの酢酸緩衝
液を溶出液に用いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー(Sephadex G-75) を行った。このクロマトグラムは、
１本の活性の高いピークを示した。この活性の高い部分
の画分を集め、蒸留水で一晩、５℃条件下で透析を行っ
た後、ゲル濾過によって５ｍｌに濃縮した。培養上清６
００ｍｌからタンパク質として約１ｍｇの精製酵素を得
た。

【００４８】酵素活性（１ユニット）は、ソモギ−ネル
ソン法を用いて、酵素反応によってできる加水分解物の
還元基の生成量を測定することによって定量した。即
ち、１ユニットは、３５℃で１分間に加水分解物の還元
基が１μmol 生成する酵素量である（生成した還元基の
量はガラクツロン酸の量として換算した）。測定の結
果、本発明の酵素活性は、３３．９ユニット／ｍｇ蛋白
であった。

【００４９】また、該サンプルを用いてＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動を行ったところ、単一バンドとして
検出された。

【００５０】実施例３本発明の酵素の性質を調べるために以下の実験を行っ
た。

【００５１】（１）基質特異性本酵素の基質特異性を調べるために、下表１に示した基
質との反応性を調べた。

【００５２】０．２Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に最
終濃度が０．２％となるように各基質を添加した。これ
らの溶液０．１５ｍｌに、酵素液を０．１ｍｌ添加し、
３５℃条件下で２０分間反応させソモギ−ネルソン法、
即ち、酵素分解によって生じた還元末端量を測定するこ
とによって、基質分解活性の有無を検定した。各基質に
対する分解活性を表１に示した。表１において、○は本
酵素により分解されたものを、×は分解されなかったも
のを表わす。

【表１】表１からわかるように、本酵素は、ペクチン及びペクチ
ン酸は分解するが、可溶性澱粉、デキストリン及びキシ
ランは分解しない。

【００５３】（２）至適ｐＨ最終濃度が０．２％となるようにペクチン酸を含有した
ｐＨ２〜７のマックイルベイン緩衝液０．２３ｍｌに、
酵素液を０．０２ｍｌ加え、３５℃で２０分間反応さ
せ、活性をソモギ−ネルソン法で測定した。酵素活性値
は最大活性値を１００％として、相対活性で表わした。
図１に示すように、ソモギ−ネルソン法から求めた相対
活性をｐＨに対してプロットし、至適ｐＨを求めた。図
１からわかるように、本酵素の至適ｐＨは４付近であっ
た。

【００５４】（３）安定ｐＨ領域緩衝溶液は、０．２Ｍのマックイルベイン緩衝液（ｐＨ
３〜７）及びリン酸緩衝液（ｐＨ７〜１０）を使用し
た。

【００５５】ｐＨ３〜１０の各緩衝溶液０．１２５ｍｌ
に本酵素０．０２５ｍｌを加え、３５℃で１時間処理し
た。次いで、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を０．
１５ｍｌ加え、ｐＨを５．０に調製した。この溶液にペ
クチン酸を最終濃度が０．２％になるように加え、３５
℃で２０分間反応させ、活性をソモギ−ネルソン法で測
定した。酵素活性値は最大活性値を１００％として、相
対活性で表わした。図２に示すように、ソモギ−ネルソ
ン法から求めた相対活性をｐＨに対してプロットし、安
定ｐＨ領域を求めた。図２からわかるように、本酵素
は、ｐＨ４〜８で安定であった。

【００５６】（４）至適温度０．２％のペクチン酸を含む０．２Ｍのマックイルベイ
ン緩衝液（ｐＨ５．０）０．２３ｍｌに本酵素０．０２
ｍｌを添加し、２０から８０℃の温度で５分間反応さ
せ、活性をソモギ−ネルソン法で測定した。酵素活性値
は最大活性値を１００％として、相対活性で表わした。
図３に示すように、ソモギ−ネルソン法から求めた相対
活性を温度に対してプロットし、至適温度を求めた。図
３からわかるように、本酵素は、４５℃付近に至適温度
を有する。

【００５７】（５）安定温度領域０．５Ｍのマックイルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）０．
１３ｍｌに本酵素０．０２ｍｌを添加し、２０から６５
℃の温度で６０分間熱処理した。氷冷後、各処理液にペ
クチン酸の０．５％水溶液０．１ｍｌを加え、３５℃で
２０分間反応させ、活性をソモギ−ネルソン法で測定し
た。酵素活性値は最大活性値を１００％として、相対活
性で表わした。図３に示すように、ソモギ−ネルソン法
から求めた相対活性を温度に対してプロットし、安定温
度領域を求めた。図４からわかるように、本酵素の相対
活性は、４５℃までは７３％であったが、６５℃では約
２０％まで低下した。この結果から、本酵素の安定温度
領域は４５℃までであるとした。

【００５８】（６）金属イオン及び阻害剤の影響金属イオン及び阻害剤が本酵素に与える影響について検
討した。

【００５９】精製した酵素液を０．００２ｍｌ含む０．
１５ｍｌの０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、下記
の表２の各種金属イオン及び阻害剤を１ｍＭとなるよう
に添加した。各溶液を３５℃で５分間反応させた後、ペ
クチン酸の０．５％水溶液を０．１ｍｌ添加し、更に３
５℃で２０分反応させ、阻害率をソモギ−ネルソン法で
測定した。結果を表２に示した。阻害率は、金属又は阻
害剤を添加しない場合を基準（０％）とした相対値であ
る。

【００６０】

【表２】表から明らかなように、本酵素は、ＥＤＴＡによって最
も阻害（７４％）された。金属イオンでは、バリウムイ
オン（塩化バリウム）で６９％阻害されたが、マグネシ
ウムイオン（硫酸マグネシウム）では全く阻害されなか
った。

【００６１】（７）分子量実施例２で得られた本酵素の分子量を、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動により測定したところ３８，０００
であった。

【００６２】（８）アミノ酸組成本発明の酵素を６Ｍ塩酸で１０５℃、２４時間加水分解
した。このものをアミノ酸アナライザー（日立製、８３
５型）で分析し、構成アミノ酸量を測定した。測定を３
回繰り返し、各アミノ酸の比率を計算することによっ
て、アミノ酸組成を計算した。結果を表３に示す。

【００６３】

【表３】表からわかるように、グルタミン及びグルタミン酸が最
も多く、次にセリンが多かった。

【００６４】実施例４（１）ＪＴＦ−４培養上清による低分子ペクチンの調製レモンペクチン（和光純薬工業）１００ｇを０．０２５
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）４リットルに懸濁し、これ
に実施例１で製造したＪＴＦ−４の培養上清（ＪＴＦＰ
−４含有）１リットルを加え、４０℃で２４時間反応さ
せた。得られた反応液をロータリーエバポレーターを用
い、６０℃で濃縮後、試料溶液の１００倍量の脱イオン
水に対し一晩透析し、更に凍結乾燥することにより分子
量約６万６千の低分子ペクチン７０．４ｇを得た。

【００６５】（２）便通改善効果４週齢のＳＤ系雄性ラットを固形飼料（オリエンタル酵
母固形飼料ＭＦ）で４日間飼育した後、これを５匹ずつ
４群に分けた。その後、それぞれの群に、下記表４に示
す配合の飼料、及び固形飼料を与え、９日間飼育し、９
日目の糞便を回収した。得られた結果を下記表５に示
す。固形飼料の糞便の軟度を基準とし、硬化したものを
−、軟化したものを＋とした。

【００６６】

【表４】

【表５】表５に示した結果から、本発明の酵素によって製造した
低分子ペクチンは、ペクチンと同様に便の軟化作用を持
ち、便通改善に効果のあることがわかった。

【００６７】

【発明の効果】本発明で得られた酵素は、体外に分泌さ
れる菌体外酵素であるので、その培養上清をそのまま粗
酵素液として用いることができ、酵素反応に直接用いる
ことができるので、酵素精製工程の簡略化を図ることが
できるという利点を有する。また、本発明の酵素はペク
チンを低分子ペクチンに容易に分解することができ、し
かも、得られた低分子ペクチンは、低粘度、高溶解性で
あり、かつ便通改善などの食物繊維の生理活性を保持し
ているため、飲食品に食物繊維としての生理活性を付加
できる程度に容易に添加することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の至適ｐＨを決定するためのｐＨと相対
活性との関係を示した図。

【図２】本酵素の安定ｐＨ領域を決定するためのｐＨと
相対活性との関係を示した図。

【図３】本酵素の至適温度を決定するための温度と相対
活性との関係を示した図。

【図４】本酵素の安定温度範囲を決定するための温度と
相対活性との関係を示した図。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年７月１４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６０】

【表２】表から明らかなように、バリウムイオン（塩化バリウ
ム）で６９％阻害されたが、マグネシウムイオン（硫酸
マグネシウム）では全く阻害されなかった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ペクチン及びペクチン酸を分解するペク
チン分解酵素であって、（１）該ペクチン分解酵素が、
サッカロマイセス属から生産されるエンド型ポリガラク
ツロナーゼであること、（２）３５℃で２０分間反応さ
せた場合の至適ｐＨが、４．０であること、（３）３５
℃で６０分間加温した場合の安定ｐＨ領域が４．０から
８．０であること、（４）ｐＨ５．０で反応させた場合
の至適温度が４５℃であること、（５）ｐＨ５．０の条
件下において６０分間加温した場合、４５℃まで酵素活
性が安定であること、（６）分子量が３８，０００であ
ること、とを具備したペクチン分解酵素。