JP2548553B2 - グルタミナ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はグルタミナーゼ生産能を有する酵母を培養
し、該培養物又は乾燥処理酵母菌体より高力価のグルタ
ミナーゼを効率良く得るグルタミナーゼの製造方法に関
する。

〔従来の技術〕

グルタミナーゼは、食品工業時に蛋白質を酵素的に分
解して調味食品を製造する場合に、重要な役割を果たす
ものとして知られている。又、グルタミナーゼは生化学
的、医学的分野においても近年特に注目されているもの
であり、高活性な酵素剤の製造法の確立が要望されてい
る。

従来、酵母よりグルタミナーゼを得る方法としては、
例えば特公昭49−48759号公報の耐熱性グルタミナーゼ
の製造法等が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、従来提案されているグルタミナーゼの
製造法に於いては、例えばグルタミナーゼ生産菌の培養
菌体を磨砕、破砕あるいは自己消化する等の処理により
酵素を菌体外に溶出させているが、これらの方法では細
胞璧と結合しているグルタミナーゼはごくわずかしか菌
体外へ溶出されない為、高力価のグルタミナーゼを効率
良く得ることが出来ないと言う問題があつた。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者は高力価のグルタミナーゼを効率良く得る方
法を開発すべく鋭意研究をおこなつた結果、グルタミナ
ーゼ生産能を有する酵母を培養し、該酵母菌体の細胞璧
を溶解すればグルタミナーゼが効率良く習得できること
を見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ブレラ属又はクリプトコッカス
属に属するグルタミナーゼ生産能を有する酵母を培養
し、その培養物又はこれから別された酵母菌若しくは
その乾燥処理物に、リゾープス属に属する細胞璧溶解酵
素生産菌又はその培養物若しくはこれから得られた細胞
璧溶解酵素を作用せしめて上記酵母菌体の細胞璧を溶解
し、得られた細胞璧溶解処理物中からグルタミナーゼを
採取することを特徴とするグルタミナーゼの製造法を提
供するものである。

本発明を実施するには、まず、グルタミナーゼ生産能
を有する酵母を培養し、これからその培養物又はこれか
ら別された酵母菌若しくはその乾燥処理物を得る。

本発明に用いられるグルタミナーゼ生産能を有する酵
母としては、例えばブレラ・アルバIFO 1192、ブレラ・
デルキシーJCM 5280、クリプトコッカス・アルビダスIF
O 0378等が好適な例として挙げられる。

このグルタミナーゼ生産能を有する酵母の培養法とし
ては、通常の液体培養法が用いられ、例えばフラスコに
よる振盪培養法や通気撹拌装置の付いたジヤーフアーメ
ンター、タンクフアーメンター等による好気的な培養法
等が挙げられる。培養温度は15〜40℃程度で、好ましく
は20゜〜30℃程度である。

また、使用する培地としては、種々の栄養源を添加し
た通常の液体培養培地が用いられる。即ち、上記した培
地の炭素源としては、例えばグルコース、マルトース等
の単糖類や小糖類のその他グリセリン等が用いられ、ま
た、窒素源としては、例えばペプトン、肉エキス、酵母
エキス、カザミノ酸、脱脂大豆抽出液、小麦グルテンの
加水分解物、アンモニウム塩、硫酸塩等が用いられる。
この他マグネシウム、カルシウム、カリウム、リン酸塩
等の塩類微量栄養物質等を添加しても良い。

斯くして得られた培養物は、そのまま、又はこの培養
物を過、遠心分離等の常法に従って集菌して培養菌体
若しくはアセトン菌体とするか、更にこれを凍結乾燥し
た乾燥処理物とした後、リゾープス属に属する細胞璧溶
解酵素生産菌または該細胞璧溶解酵素生産菌の培養物も
しくは該培養物より得られる酵素液等で処理し、上記酵
母菌体の細胞璧が溶解し、グルタミナーゼを可溶化す
る。

リゾープス属に属する細胞璧溶解酵素生産菌として
は、このような作用を有する酵素を生産することのでき
る菌株で、リゾープス属に属するものであれば何れを用
いても良く、例えばリゾープス・デレマールIAM 6254、
リゾープス・テレマールIFO 4775、リゾープス・ニベウ
スIFO 4810、リゾープス・ニベウスIAM 6035等が挙げら
れる。

また、上記した細胞璧溶解酵素生産能を有するリゾー
プス属に属する菌株培養物を得るための培養法として
は、固体培養法、液体培養法のいずれを採用してもよ
い。例えば、固体培養法を用いる場合には、常法により
加熱変性した▲麩▼にリゾープス属の菌の接種し、培養
温度20〜40℃で通常２〜８日程度培養するのが望まし
く、また、液体培養法を用いる場合には培養温度20〜40
℃培養pH4.5〜7.0で、通常１〜８日程度通気培養するの
が望ましい。この液体培養培地としては、通常の液体培
養培地が用いられ、炭素源としては例えばグルコース、
マルトース等の単糖類や少糖類、デキストリン等の多糖
類が用いられる。窒素源としては例えばペプトン、酵母
エキス、カザミノ酸、無機アンモニウム塩、硝酸塩等が
用いられ、その他リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化カルシウム、硫酸マンガン等の無機塩類を適宣添加
した培地が用いられる。

さらに、細胞璧溶解酵素としては、リゾープス属の細
胞璧溶解酵素生産菌から得られ、一般に市販されている
糖質分解酵素を用いることができる。

前記した細胞璧溶解酵素生産菌、その培養物もしくは
該培養物より得た糖質分解酵素、例えば水等により抽出
して得た粗酵母素液、これより常法例えば有機溶媒によ
る沈殿法等を用いて得た粗酵素剤、さらにこれを精製し
た生計酵素剤等を作用させておこなう細胞璧溶解処理、
すなわち、グルタミナーゼの可溶化する際の温度は30〜
50℃、好ましくは35〜45℃であり、pHは３〜７、好まし
くはpH4〜６、時間は２〜48時間程度、好ましくは８〜2
4時間程度である。また、作用時の細胞璧溶解酵素含有
濃度は0.1％（w/v）以上、好ましくは0.5〜1.5％（w/
v）程度である。

斯くして得られる細胞璧溶解処理物中からグルタミナ
ーゼを採取する手段としては、例えば、常法によりグル
タミナーゼ含有液を遠心分離して菌体を除去し、更に必
要により透析、イオン交換樹脂、キトパールBCW−3000,
キトパールBCW−3500樹脂に吸着、溶出させる方法、ゲ
ル過等により精製する方法が挙げられる。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば、著しく高力価のグルタミナーゼ
を効率良く得ることが出来るので、本発明は産業上極め
て有意義である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ グルコース１％（w/v）、酵母エキス0.31％（w/v）、
麦芽エキス0.3％（w/v）、ペプトン0.5％（w/v）を含み
pH5.5に調整した液体培地３を５容ジヤーフアーメ
ンターに仕込み、115〜120℃の温度で20分間殺菌後、あ
らかじめ同培地を用い25℃で48時間振盪培養を行なつた
ブレラ・アルバIFO 1192の種培養液200mlを接種し、通
気量１／分、撹拌回転数300r.p.m.25℃の温度で48時
間好気培養を行なつた。この培養液を常法により遠心分
離し、培養菌体を得た。

得られた菌体のうち、15gを0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）
100mlに懸濁し、これに第１表に示す種々の細胞璧溶解
酵素含有酵素標品を該標品の添加濃度が0.5％（w/v）と
なるように夫々加え、40℃で16時間振盪せさた後、遠心
分離（10,000r.p.m.で10分間）して、その上清液を得、
上清液のグルタミナーゼ活性を下に示す方法で予め求め
た。この値をグルタミナーゼの可溶化に変換したものを
第１表に示す。なお、可溶化率（％）は、上記の菌体濃
度〔15％（w/v）〕におけるグルタミナーゼ活性を100と
し、これに対する該上澄液のグルタミナーゼ活性の比較
値を％で表わした値である。

グルタミナーゼ活性測定法： 250mML−グルタミン酸溶液4.0mlに0.4Mリン酸緩衝液
1.0ml（pH7.5）及び本酵素5mlを加え、30℃で30分間反
応させた後、沸騰水中で10分間加熱して反応を停止させ
る。次にベーリンガー社製Ｌ−グルタミン酸測定用キツ
トにより、上記の反応液0.2mlにトリエタノールアミン2
00mMを含む25mMリン酸緩衝液2.3ml（pH8.6）、6.7mMNAD
⁺溶液0.2ml、1.19mMヨードニトロテトラゾリウムクロラ
イド溶液0.2ml、0.1％（w/v）ジアホラーゼ溶液0.05ml
及びグルタミン酸脱水素酵素0.05mlを添加し、室温で反
応させ、分光光度計により492nmにおける吸光度値を測
定する。更に予め作成したＬ−グルタミン酸の検量線よ
りその生成量を求め、30℃、１分間当り１マイクロモル
のＬ−グルタミン酸を生産する酵素量を１単位とした。

試料1:グルクザイム6000（リゾープス・デレマール由来
の細胞璧溶解酵素含有糖質分解酵素剤；天野製薬（株）
製） 試料2:マツラーゼＡ−500（リゾープス属由来の細胞璧
溶解酵素含有糖質分解酵素剤：松谷化学（株）製） 試料3;グルクＳ（リゾープス属由来の細胞璧溶解酵素含
有糖質分解酵素剤；天野製薬（株）製） 試料4:ドリセラーゼ（担子菌由来の細胞璧溶解酵素含有
酵素剤；協和発酵（株）製） 試料5:セルラーゼＴ「アマノ」（トリコデルマ・ヒリデ
由来の細胞璧溶解酵素含有糖質分解酵素剤；天野製薬
（株）製） この結果から明らかなように、リゾープス属菌株由来
の細胞璧溶解酵素を用いる本発明方法によれば、他の細
胞璧溶解酵素を用いる対照方法に比べ高活性のグルタミ
ナーゼを極めて収率良く得ることができる。

実施例２ グルコース１％（w/v）、酵母エキス0.3％（w/v）、
麦芽エキス0.3％（w/v）、ペプトン0.5％（w/v）を含み
pH5.5に調製した液体培値３を５容ジアーフアーメ
ンターに仕込み、115〜120℃の温度で20分間殺菌後、あ
らかじめ同培値を用いて25℃で48時間振盪培養を行なつ
たクリプトコツカス・アルビダスIFO 0378の種培養液20
0mlを接種し、通気量１／分、撹拌回転数300r.p.m.、
25℃の温度で48時間好気培養を行なつた。この培養液を
常法により遠心分離し培養菌体を得た。

得られた菌体のうち15gを0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）10
0mlに懸濁し、これにマツラーゼＡ−500（松谷化学社
製）を1.0％（w/v）となるように添加し、40℃で16時間
振盪させた後、遠心分離（10,000r.p.m.10分間）して、
その上澄液を得た。

上記の上澄液のグルタミナーゼ活性を求めたところ、
0.014単位/mlであつた。また、細胞璧溶解酵素処理前の
菌体懸濁液のグルタミナーゼ活性は0.019単位/mlであつ
たので、可溶化率73％と好収率でクルタミナーゼが得ら
れた。

実施例３ グルコース3.0％（w/v）、酵母エキス0.5％（w/v）、
リン酸１カリウム0.05％（w/v）、硫酸マグネシウム0.0
5％（w/v）を含み、pH5.5に調整した液体培地３を５
容ジヤーフアーメンターに仕込み、これに115〜120℃
の温度で48時間振盪培養を行なつたブレラ・デルキシー
JCM5878の種培養液200mlを接種し、通気量１／分、撹
拌回転数300r.p.m.、25℃の温度で48時間好気培養を行
なつた。この培養液を常法により遠心分離し培養菌体を
得た。

得られた菌体のうち15gを0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）10
0mlに懸濁し、これにグルクザイム6000（天野製薬社
製）を0.8％（w/v）となるように添加し、40℃で12時間
振盪させた後、遠心分離（10,000r.p.m.10分間）して、
その上澄液を得た。上記の上澄液のグルタミターゼ活性
を求めたところ0.409単位/mlであつた。また、細胞璧溶
解酵素処理前の菌体懸濁のグルタミナーゼ活性は0.487
単位/mlであつたので、可溶化率84％と収率よくグルタ
ミナーゼが得られた。

実施例４ グルコース２％（w/v）、酵母エキス0.5％（w/v）、
麦芽エキス0.3％（w/v）、ペプトン0.5％（w/v）を含み
pH5.5に調整した液体培地３を５容ジヤーフアーメ
ンターに仕込み115〜120℃の温度で20分間殺菌後あらか
じめ同培地を用い、25℃で48時間振盪培養を行なつたブ
レラ・デルキシーJCM5878の種培養液200mlを接種し、通
気量１／分、撹拌回転数300r.p.m.、25℃の温度で48
時間好気培養を行なつた。この培養液を常法により遠心
分離し培養菌体を得た。

得られた菌体を常法により凍結乾燥し、凍結乾燥菌体
を得た。得られた凍結乾燥菌体のうち1.0gを0.2M酢酸緩
衝液（pH5.0）100mlに懸濁し、これに第２表に示す種々
の細胞璧溶解酵素含有酵素標品を該標品の添加濃度が1.
0％になるよう夫々に加え40℃で16時間振盪させた後、
遠心分離（10,000r.p.mで10分間）して、その上澄液を
得た。上清液のグルタミナーゼ活性を求めた後、この値
をグルタミナーゼの可溶化率に変換したものを第２表に
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 俊夫 神戸市兵庫区石井町８−１−14 (72)発明者 原 文雄 川越市大字的場947−３ (72)発明者 祢宜 博 埼玉県入間郡大井町緑ケ岡２−23−16 (56)参考文献 特開 昭50−46886（ＪＰ，Ａ) 特公 昭49−48759（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ブレラ属又はクリプトコッカス属に属する
   グルタミナーゼ生産能を有する酵母を培養し、その培養
   物又はこれから別された酵母菌若しくはその乾燥処理
   物に、リゾープス属に属する細胞璧溶解酵素生産菌又は
   その培養物若しくはこれから得られた細胞璧溶解酵素を
   作用せしめて上記酵母菌体の細胞璧を溶解し、得られた
   細胞液溶解処理物中からグルタミナーゼを採取すること
   を特徴とするグルタミナーゼの製造法。