JPS6394974A - グルタミナ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 グルタミナーゼ生産能を有する酵母を培養し、該培養物
より高力価のグルタミナーゼを効率良く得るグルタミナ
ーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

グルタミナーゼは、食品工業特に蛋白質を酵素的に分解
して調味食品を製造する場合に、重要な役割を果たすも
のとして知られている。又、グルタミナーゼは生化学的
、医学的分野においても近年特に注目されているもので
あり、高活性な酵素剤の製造法の確立が要望されている
。

従来、酵母よりグルタミナーゼを得る方法としては、例
えば特公昭４９−４８７５９号公報の耐熱性グルタミナ
ーゼの製造法等が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来提案されているグルタミナーゼの製造法に於いては
、例えばグルタミナーゼ生産菌の培養菌体を磨砕、破砕
あるいは自己消化する等の処理により酵素を国体外に溶
出させているが、これらの方法では細胞壁と結合してい
るグルタミナーゼはほとんど菌体外へ溶出されない為、
高力価のグルタミナーゼを効率良く得ることが出来ない
と言う問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、これら従来方法の問題点を解決するためにな
されたものであって、高力価のグルタミナーゼを効率良
く得る方法を提供するものである。

即ち、本発明はグルタミナーゼ生産能を有する酵母を培
養し、培養物又は該培養物より濾別した酵母菌に、トリ
コデルマ属に属する細胞壁溶解酵素生産菌またはその処
理物を作用させて該酵母菌体の細胞壁を溶解し、得られ
た細胞壁溶解処理物よりグルタミナーゼを採取すること
を特徴とするグルタミナーゼの製造法。

そして上記のトリコデルマ属に属する細胞壁溶解酵素生
産菌の処理物としては該菌の培養液もしくは該培養液か
ら得られる細胞壁溶解酵素が用いられる。

さらに、この細胞壁溶解酵素としては、トリコデルマ属
の細胞壁溶解酵素生産菌から得られた市販の細胞壁溶解
酵素を用いることができる。

先ず、本発明に用いられるグルタミナーゼ生産能を有す
る酵母としては、例えばクリプトコツカス属、キャンデ
イダ属、サツカロミセス属等に属するグルタミナーゼ生
産能を有する酵母であれば何れを用いても良く、具体的
にはクリプトコツカス・アルビダスＡＴＣＣ２０２９３
、クリプトコツカス・アルビダス＾ＴＣＣ２０２９４、
サツカロミセス・ルキシーＡＴＣＣ１３３５６等が好適
な例として挙げられる。

次に、上記したグルタミナーゼ生産能を有する酵母の培
養法としては、通常の液体培養法が用いられ、例えばフ
ラスコによる振盪培養法や通気攪拌装置の付いたジャー
ファーメンタ−、タンクファーメンタ−等による好気的
な培養法等が挙げられる。培養温度は２０〜４０℃程度
で、好ましくは２５〜３５℃程度である。

また使用する培地としては、種々の栄養源を添加した通
常の液体培養培地が用いられる。

即ち、上記した炭素源としては、例えばグルコース、マ
ルトース等の単糖類や少糖類、その他グリセリン等が用
いられる。窒素源としては例えばペプトン、肉エキス、
酵母エキス、コーンステーブリカー、カザミノ酸、脱脂
大豆抽出液、小麦グルテンの加水分解物、アンモニウム
塩、硝酸塩等が用いられる。この他マグネシウム、カル
シウム、カリウム、リン酸塩等の塩類、微量栄養物質等
を添加しても良い。

次に、前記したグルタミナーゼ生産能を有する酵母を培
養して得られる培養液もしくは該培養液を濾過、遠心分
離等による常法により固液分離し、これを集菌して得ら
れる培養菌体に、トリコデルマ属に属する細胞壁溶解酵
素生産菌または該細胞壁溶解酵素生産菌の培養液もしく
は該培養液より得られる酵素液等の処°理物を作用させ
て該酵母菌体の細胞壁を溶解し、グルタミナーゼを可溶
化、すなわち、菌体外へ溶出可能とさせる。

上記したトリコデルマ属の菌株としては、細胞壁溶解酵
素生産能を有するトリコデルマ属の菌株ならば何れを用
いても良く、例えばトリコデルマ・リーゼイＡＴＣＣ１
３６３１、トリコデルマ・リーゼイＡＴＣＣ２４４４９
、トリコデルマ・ビリデＡＴＣＣ３２０９Ｂ、トリコデ
ルマ・ビリデＡＴＣＣ３２０８６等が挙げられる。

なお、上記した細胞壁溶解酵素生産能を有するトリコデ
ルマ属に属する菌株の培養法としては、固体培養法でも
良いが、工業的には液体培養法を用いるのが有利である
。

即ち、液体培養法を用いる場合には、培養温度２０〜４
０℃、培養ＰＨ４，５〜６．５で、通常６〜８日程度通
気培養するのが望ましい。

上述の液体培養培地としては、通常の液体培養培地が用
いられ、炭素源としては例えば濾紙粉末、微結晶性セル
ロース、紙類、パルプ粕等の植物繊維質のものが用いら
れ、また窒素源としては無機アンモニウム塩、硝酸塩、
肉エキス、ペプトン、蛋白質原料の分解物等が用いられ
、その他燐酸カリ、硫酸アグネシウム、塩化カルシウム
、硫酸鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等の無機塩類等を適
宜添加した培地が用いられる。

又、前記した細胞壁溶解酵素生産菌の培養液もしくは該
培養液より得られる酵素液を作用させて、グルタミナー
ゼを可溶化する際の温度は３０〜５０℃、好ましくは３
５〜４５℃、ｐＨ３，５〜６．５、好ましくは４．５〜
５．５、時間は２〜２４時間程度、好ましくは８〜１６
時間程度であり、作用時の細胞壁溶解酵素含有濃度は０
．２χ（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは０．４〜１．０χ（
Ｗ／Ｖ）程度である。

上記操作により得られたグルタミナーゼを含有する細胞
壁溶解酵素処理物よりグルタミナーゼを採取する手段と
しては、例えば常法によりグルタミナーゼ含有液を遠心
分離して菌体を除去し、更に必要により透析、熱処理、
イオン交換樹脂に吸着、溶出させる方法、ゲル濾過等に
より精製する方法が挙げられる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、著しく高力価のグルタミナーゼを効率
良く得ることが出来るので、本発明は産業上極めて有意
義である。

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

〔実施例〕

実施例１ グルコース４０χ（Ｗ／Ｖ）、コーンステイープリカー
６χ（Ｗ／Ｖ）、リン酸１カリウムＯ，ｌχ（Ｗ／Ｖ）
、硫酸マグネシウム０．１　Ｘ（Ｗ／Ｖ）を含み、ｐＨ
５，５に調整した液体培地１５１を、３０１容ジャーフ
ァーメンタ−に仕込み、１）５〜１２０℃で２０分間加
熱殺菌後、あらかじめ同培地を用い２５℃で４２時間、
振盪培養を行なったクリプトコツカス・アルビダスＡＴ
ＣＣ２０２９３の種培養液４５０ｒｎｌを接種し、通気
量１２０β／分、攪拌回転数３０Ｏｒ、ｐ、ｍ、、２５
℃の温度で３０時間好気的に培養を行なった。この培養
液を常法により遠心分離し、培養菌体を得た。

得られた菌体のうち、４ｇを０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐ　
Ｈ６，０）　Ｌｏｏｒｎｌに懸濁し、これに第１表に示
す種々の細胞壁溶解酵素含有標品を該標品の添加濃度が
０．２χ（Ｗ／Ｖ）となるように夫々加え、３７℃で２
０時間振盪させた後遠心分離（１０，００Ｏｒ、ｐ、ｍ
、で１０分間）して、その上澄液を得、上澄液のグルタ
ミナーゼ活性を予じめ求めた後、この値をグルタミナー
ゼの可溶化率に変換したものを第１表に示す。

なお、可溶化率（％）は、上記の菌体濃度〔４χ（Ｗ／
Ｖ）　）におけるグルタミナーゼ活性を１００とし、こ
れに対する該上澄液のグルタミナーゼ活性の比較値を、
％で表した値である。

又、グルタミナーゼ活性の測定は、２Ｘ（−ハ）Ｌ−グ
ルタミン溶液１．０−に、０．２　Ｍ酢酸緩衝液２．０
−及び本酵素液１．０　ｍＺを加え、３７℃、３０分間
反応させた後、０．７５Ｎ過塩素酸液１．０−を添加し
て反応を停止させ、これに１．５Ｎ水酸化ナトリウム液
０．５−を加え、反応液を中和する。

更に、上記の反応液１．０−に、５０ｍＭのＥＤＴＡ・
Ｎａを含む０．１　Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン緩衝液１
．０　ｍ（ｐＨ８，０）　、２０ｍＭのＮＡＤ＋溶液１
．０−及び５００単位／−のグルタミン酸脱水素酵素液
５０μｌを添加し、３７℃で３０分間反応させ、分光光
度計により３４０ｎｍにおける吸光度値を測定した。

そして、予め作成したし一グルタミン酸の検量曲線より
、その生成量を調べておき、３７℃、１分間光たり１マ
イクロモルのし一グルタミン酸を生産する酵素量を１単
位とした。

第　　　１　　　表 試料１；セルラーゼ・オノズカ３ｓ（トリコデルマ・ビ
リデ由来の細胞壁溶解酵素含有酵素剤、ヤクルト本社・
株・製）。

試料２；セルラーゼ・オノズカＲ−１０（）リコデルマ
・ビリデ由来の細胞壁溶解酵素含有酵素剤、ヤクルト本
社・株・製）。

試料３；ドリセラーゼ（担子菌由来の細胞壁溶解酵素含
有酵素剤、協和醗酵・株・製）。

試Ｒ４；セルラーゼＡＰ−３（アルペルギルス・ニガー
由来の細胞壁溶解酵素含有酵素剤、天野製薬・株・製）
。

試料５；セルラーゼ・ナガセ（アルベルギルス・ニガー
由来の細胞壁溶解酵素含有酵素剤、ナガセ生化学工業・
株・製）。

上記の結果より、トリコデルマ属由来の酵素液（本発明
）を使用した場合、対照に比し著しく、高活性のグルタ
ミナーゼを収率良く得ることが出来る。

実施例２ グ／Ｉ／２−ス３．Ｏ！（−八）、酵母エキス０．５２
（Ｗ／Ｖ）、リン酸１カリウム０．１　％（Ｗ／Ｖ）、
硫酸マグネシウム０．１χ（Ｗ／Ｖ）を含み、ｐＨ５，
５ニ調整シタｆｉ体培地１５１を、３０ｊ２容ジャーフ
ァーメンタ−に仕込み、１）５〜１２０℃で２０分間加
熱殺菌後、予め同培地を用い２５℃で４２時間振盪培養
を行なった、サツカロマイセス・ルキシーＡＴＣＣ１３
３５６の種培養液４５〇−を接種し、通気量２０１／分
、攪拌回転数３０Ｏｒ、ｐ、ｍ。

２５℃の温度で３０時間好気的に培養を行なった。この
培養液を常法により遠心分離し、培養菌体を得た。

得られた菌体のうち、Ｌｏｇを０．２　Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ５，０）１００ｒｎ１に懸濁し、これニセルシーセ
・オノヅカＲ−１０（ヤクルト本社製）を０．８χ（Ｗ
／Ｖ）となるように添加し、４２°Ｃで１２時間振盪さ
せた後、遠心分離（１０＋００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、　ｔｏ
骨分間して、その上澄液を得た。

上記の上澄液のグルタミナーゼ活性を求めたところ、０
．１３単位／ｄであった。また、細胞壁溶解酵素処理前
の菌体懸濁液のグルタミナーゼ活性は、０．１８単位／
ｄであったので、可溶化率７２％と収率よくグルタミナ
ーゼを得た。

出願人　食品産業バイオリアクター 技術研究組合

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルタミナーゼ生産能を有する酵母を培養し、培
   養物又は該培養物より濾別した酵母菌に、トリコデルマ
   属に属する細胞壁溶解酵素生産菌またはその処理物を作
   用させて該酵母菌体の細胞壁を溶解し、得られた細胞壁
   溶解処理物よりグルタミナーゼを採取することを特徴と
   するグルタミナーゼの製造法。
2. （２）トリコデルマ属に属する細胞壁溶解酵素生産菌の
   処理物が該菌の培養液もしくは該培養液から得られる細
   胞壁溶解酵素であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載のグルタミナーゼの製造法。