JPH02245187A - スーパーオキシドディスムターゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 スーパーオキシドディスムターゼ（以下、ＳＯＤと略す
）は組織障害を引き起こすスーパーオキシドイオンを過
酸化水素分子と酸素分子に不均化することから、医薬品
（例えば、抗炎症剤など）、化粧品、食品の酸化防止剤
など広い範囲の用途が考えられる。

従来の技術 従来、ＳＯＤの大量調製法として、微生物を用い、その
培地組成および培養条件などを検討した方法が知られて
いる（特開昭５７−２９２８５号）。

発明が解決すべき課題 しかし、公知の方法ではＳＯＤの産生が菌体蛋白の１〜
３％程度にすぎず、ＳＯＤの工業的規模での生産を考え
ると、より収量の高い菌株の開発が望まれる。組換えＤ
ＮＡ技法を用いてＳＯＤ遺伝子をクローン化し、大腸菌
、酵母菌などに導入して発現させた微生物を用いる報告
もあるが［例えば、ザ・ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジ−（Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　＋　５９巻４
１８〜４２０頁１９８４年］、実際に工業的規模でこれ
らの微生物を使用するとなると、菌株の安定性、大量生
産における安全基準などが問題となり、現状ではまだ実
用的とはいえない。

課題を解決するための手段 そこで、本発明者らはＳＯＤ生産の効率的方法について
種々検討を加えた結果、パラコートなとの活性酸素増産
剤を培地に添加するとＳＯＤの生産活性が著しく高めら
れることを見出した。また、各種活性酸素増産剤に対す
る耐性株を取得したところ、驚くべきことにパラコート
耐性株などでは親株の３〜５倍の著量のＳＯＤを生産す
ることを発見した。

本発明は、上記知見に基づいて完成されたもので、微生
物を用いるＳＯＤ生産において、活性酸素増産剤を培地
に添加して培養するか、もしくはこれらの薬剤に対する
耐性株を使用することにより、ＳＯＤを効率よく生産し
、採取することを特徴とするＳＯＤ製造法に関する。

本発明の目的物生産に用いられる微生物はＳＯＤを産生
ずるものであれば全て利用できるが、好ましくはセラチ
ア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓ）Ａ　Ｔ　ＣＣ２１０７４、エシエリヒリ・コリＢ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉＢ）ＡＴＣＣ２
９６８２などがあげられる。

法である。

このような方法を用いて取得されたパラコート耐性株の
１株、セラチア・マルセッセンスＰＱ’−２２は平成１
年１月２１日から財団法人醗酵、研究所（ＩＦＯ）に受
託番号１４８１３として、また、平成１年３月７日から
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）
にブタベスト条約の下受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２３２７
としてそれぞれ寄託されている。

本発明の特徴は培地に活性酸素増産剤を添加するか、も
しくは活性酸素増産剤に対する耐性変異株を用いること
により多量のＳＯＤを生産することにある。

目的とするＳＯＤの製造は、上記微生物を培地に培養し
、培地中に生産された目的物を採取することによって行
われる。

上記の培養に用いられる培地は上記微生物が利用し得る
栄養源を含むものであればよいが菌体を回収するのに可
溶性培地が適しており、培養は通気、撹拌、ｐＨ保持の
できる培養槽が望ましい。

活性酸素増産剤としてはパラコート、ツェナノンメトザ
ルフェート、アズールＣ１メチレンブルーなど公知のも
のが使用できるが、特に、パラコートの使用が好ましい
。通常、活性酸素増産剤は培地／Ｑ当たり、１〜１，０
００μＭ１好ましくは、１０〜１００μＭの濃度で用い
ることが望ましい。

活性酸素増産剤に対する耐性株は通常の微生物変異操作
で容易に取得できる。例えば、変異株獲得培地としては
デイビス（Ｄ　ａｖｉｓ）培地からクエン酸ナトリウム
を除き、炭素源として乳酸ナトリウムを用いた合成培地
が使用でき、変異剤にはＸ線照射、紫外線照射、人工変
異剤（例、ニトロソグアニジン、エチレンイミンなど）
を使用できる。

生育した菌体を洗浄し、トリブチカーゼ・ソイ・ブロス
（ベクトン、デイッキンソン社、米国）に懸濁し、１０
〜１０００π９／Ｑのニトロソグアニジンと２８℃にて
、１〜３時間反応させ、遠心分離して菌体を回収し、洗
浄後、活性酸素増産剤ｌ〜１００μＭを含んだ上記デイ
ビス平板培地に散布し、２８℃で生育してきたコロニー
を選択する方培地には上記微生物が利用し得る栄養源、
例えば、炭素源、窒素源、無機物質、微量栄養源が適宜
配合される。

炭素源としては澱粉、デキストリン、ブドウ糖、２−ケ
ト−グルコン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、乳
酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウ等が
挙げられる。窒素源としてはコーン・スチーブ・リカー
、酵母エキス、肉エキス、ポリペプトン、カゼイン、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の可溶性物質と脱
脂大豆粉、脱核酵母、綿実粉、大豆粉等の窒素含有化合
物が、挙げられる。無機物質としては無機塩、例えば、
ナトリウム塩（例、塩化ナトリウム）、リン酸塩（例、
リン酸ナトリウム）、カルシウム塩（例、炭酸カルシウ
ム）、カリウム塩（例、塩化カリウム）、マグネシウム
塩（例、硫酸マグネシウム）、マンガン塩（例、硫酸マ
ンガン）、鉄塩（例、硫酸鉄）、亜鉛塩（例、炭酸亜鉛
）等が挙げられる。

微量栄養素としてはビタミン類（例、ビタミンＢ６、Ｂ
２）、脂質［例、オレイン酸、ラウリル酸、カプロン酸
などのエステル（例、メチルエステル、エチルエステル
）］、核酸（例、リボ核酸、デオキシリボ核酸）、核酸
の関連化合物（例、イノシン酸、グアニル酸、アデニル
酸、）などが挙げられる。

さらに、油脂類（例、大豆油、コーン油、落花生油）、
合成消泡剤［例、トウィーン２０．６０．８０（花生、
アトラス社製）］、アクトコール（代印薬品工業社製）
等を消泡の目的で添加してもよい。

本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を
必要とする場合には、その栄養素を適量培地中に存在さ
せねばならないが、これらの物質は窒素源として例示し
た天然物に含有された状態で添加される場合もある。

培養の手段は振盪培養または通気撹拌培養の手段が挙げ
られるが、特に工業的規模に行う場合には深部通気撹拌
培養が有利である。

培養の条件は培地の状態、組成の種類、培養の手段によ
って異なるが、培養温度は約１５〜４５℃、さらに好ま
しくは２４〜３７°Ｃで、培養時間は約２４〜１４４時
間、さらに好ましくは４０〜９６どで脱塩し、凍結乾燥
することにより粗ＳＯＤ粉末を得ることができる。

精製はこの粗ＳＯＤ粉末をセファデックス（ファルマン
ア製・スウェーデン）濾過、更に、ジエチルアミノエチ
ルセルロース（セルバ社製・西ドイツ）によるカラム・
クロマトグラフィー等の手段を適宜実施することにより
分離精製できる。

このようにして任意純度のＳＯＤが分離精製される。例
えば、以下に記載の実施例３によって得られた、セラデ
ア・マルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４から誘導された
パラコート耐性株、ＰＱ−２２のＳＯＤの酵素化学的特
性、即ち、作用、基質特異性、作用至適ｐｉ（、ｐＨ安
定性、作用適温の範囲、熱安定性、分子量、元素分析、
紫外部および可視部領域の吸収スペクトル、赤外線吸収
スペクトル、分子吸光係数、アミノ酸組成と金属分析等
は特開昭 ５７−２９２８５号に開示されると同じ分子量約２．４
ＸＩＯ’のサブユニットの２量体から成り立つＭｎ型Ｓ
ＯＤであることを示した。

時間で、培養ｐＨは約６〜９、さらに好ましくは６〜８
で行い、ｐＨ６以下になる時は随時アンモニア水等を添
加して培養ｐｉ−（を６以上に保つよう調節することが
好ましい。

目的のＳＯＤは主として菌体内に蓄積される。

該ＳＯＤは公知の方法によって、分離精製でき、例えば
、特開昭５７−２９２８５号の方法により分離精製され
る。

例えば、培養終了後、培養物から遠心分離法あるいは濾
過法で集菌し、得られた菌体を、例えば超音波処理法、
ガラス・ビーズによるグラインディング破砕法、あるい
は種々の界面活性剤や溶媒など、通常用いられる方法で
破砕し、その破砕物からＳＯＤを抽出するのが有利であ
る。

すなわち、このＳＯＤ含有破砕物を遠心分離法あるいは
濾過法で破砕菌体残漬物を除去した後、上清あるいは濾
液を得、これをＳＯＤ抽出液とする。このＳＯＤ抽出液
に硫酸アンモニウムあるいはアセトンなどを加え、生じ
た沈澱物を遠心分離法で集めた後、これを少量の水に溶
解し、透析ななお、酵素力価の測定は次のようにして行
なう。

■）ケミカル・ファーマシフチカル・ブルーティン（Ｃ
ｈｅｍ、　、　Ｐ　ｈａｍ、　、　Ｂ　ｕｌｌ、）、２
２巻、２９３５〜２９４０頁１９７４年に記載の方法に
従う。即ち、光路１Ｇｌｌセルに０．５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，８）０．２ｍ（！Ｓ　１６％トライトンＸ−
１０００，１πＱ１１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナト
リウムＯｌπｇ、０　、８　ｍＭネオテトラゾリウム・
クロライド０．３πρ、水０８叶、キサンチンオキシダ
ーゼ（ベーリンガー社製、４００倍希釈）０．２ｘＱ、
測定可能な濃度に希釈した酵素液０．１ｘρを入れ、こ
れに２ｍＭヒボキサンチンを加えて直ちに３７℃で１５
分間反応させる。

反応停止液［１Ｍギ酸緩衝液（ｐＨ３，５）１００ｒｎ
Ｑ、１０％トライトンＸ−１００３６蛙、ホルムアルデ
ヒド溶液５０吋と水４００ｍＱを含む］２叶を加えて、
５４０ｎｍの吸光度を測定する（Ｖ）。また、酵素液の
代わりに上記リン酸緩衝液を加えた時の５４０ｎｍの吸
光度を測定する（ＶＯ）。

酵素力価は上記反応条件下、ネオテトラゾリウムの還元
を５０％阻害する酵素量を１単位（Ｕ）とし、次式より
算出する。

ｕ／ｍ、Ｑ＝　Ｖ　ｏ／　Ｖ　　Ｉ　Ｘ　１０　Ｘ希釈
倍数２）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２４４
巻、４４０６〜４４１２頁、１９６９年に記載の方法に
従うポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ラウリル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法および
アガロース等電点電気泳動法や、アリティル・バイオケ
ミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、４４巻、２７６〜２８７頁、１
９７１年に記載の活性染色法が適宜利用される。

蛋白質はパイオーラッド蛋白アッセイ法で定量される［
アリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂ　ｉ
ｏｃｈｅｍ、）、７２巻、２４８−２８７頁、１９７６
年］。

寒鬼鰺 以下に実施例を示すが、本発明は以下の実施例の範囲に
限定されるものではない。なお、％は特に断わらない限
りＷ／Ｖ％である。

培養終了後、それぞれの培養物１０＊Ｑを遠心分離法に
より集菌し、上記のリン酸緩衝液で洗浄後、２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，８）１０酎を加え、超音波処理（
２Ａ、５分間）で菌体を破砕した。この破砕菌体から遠
心分離法に上り上清を得た。

この上清液についてＳＯＤの力価を上記したヒボキサン
チン・キサンチンオキノダーゼ法およびポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法と活性染色法で測定した。

結果は次表に示す通りで、セラチア・マルセッセンスＡ
ＴＣＣ２１０７４のＳＯＤ比活性はパラコート、アズー
ルＣ１メチレンブルー、フェナジンメトサルフェートの
添加で著しく上昇した。

実施例　２ 実施例　１ 種培養として、炭素源にブドウ糖２％を用いたポリペプ
トン０５％、肉エキス０５％、酵母エキス０．５％、Ｎ
ａＣＱ　０．５％、硫酸マンガン０．００５％から成る
液体培地ｐＨ７，０に調製）２０ｍ１２を２００１容三
角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した
。これに上記したセラデア・マルセッセンスＡＴＣＣ２
＋０７４の凍結保存種菌液（−８０℃）０．０５ｉ１２
を接種し、２８°Ｃで毎分２４０回転のロータリー式振
盪培養機で２４時間培養した。

生産培養は炭素源に乳酸ナトリウム２％（別滅菌）を用
いたポリペプトン０５％、肉エキス０．５％、酵母エキ
ス０．５％、ＮａＣＱ　０．５％、硫酸マンガン０００
５％からなる液体基本培地（ｐｌ−（７、０に調製）２
０ｘＱをヒダ付２００好容三角フラスコに分注し、滅菌
し、これに種々活性酸素増産剤５０μＭを添加し、上記
の種培養物ＬｍＱを接種し、培養温度２４℃で毎分２４
０回転のロータリー式振盪培養機で４８時間行った。

パラコート耐性変異株の取得は下記の方法で行った。セ
ラチア・マルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４の凍結種菌
（−７０℃）をトリブチカーゼ・ソイ・アガー（ペクト
ン・デイッキンソン社、米国）培地に植継ぎ、２８℃、
２４時間培養した。生育してきた菌体を先に述べたトリ
ブチカーゼ・ソイ・ブロス（ｐＩ（７，３）に生菌数と
して、１０７個／ｍＱになるように懸濁し、それにニト
ロソグアニジン（シグマ社、米国）を０　、２　ｍｇ／
酎になるように加えて２８℃、１時間反応させた。

反応終了後、菌体を生理食塩水を用いて２回洗浄した後
、洗浄菌体をパラコート４０μＭ含んだ先述のデイビス
平板培地に塗抹した。

この平板培地を２８℃、３〜４日間培養し、生育してき
たコロニーを同濃度のパラコートを含んだ同培地に植継
ぎ、再度、２８℃で３〜４日間培養し、生育してきた菌
体をパラコート耐性変異株として選び、セラチア・マル
セッセンスＰＱ−２２を得た。これらの耐性株を分散媒
として６％スキンミルク、２％グルタミン酸ソーダーを
用いた溶液に懸澗し、−７０℃に保存し、凍結保存菌と
した。

パラコート４０μＭ耐性株の出現頻度は１Ｏ−５〜１０
−４であり、菌学的性状が親株と同一であった。

実施例　３ セラデア・マルセッセンスＡＴＣＣ２＋０７４と、これ
から誘導されたパラコート耐性変異株ＰＱ　−２２の凍
結保存種菌液０．０５ｍ１２を実施例１で使用した種培
養培地にそれぞれ接種し、２８℃にて毎分２４０回転の
ロータリー式振盪機で２４時間培養し、種培養とした。

生産培養は実施例１で使用した液体基本培地に種培養物
１πＱをそれぞれに接種し、これにパラコート１０μＭ
を添加し、２４℃で毎分２４０回転のロータリー式振盪
機で４８時間行った。

培養終了後、実施例１と同様に処理し、ＳＯＤ力価を測
定した。

結果は次表に示す通りで、セラチア・マルセッセンスＡ
’ｌ”ＣＣ２＋０７４（親株）のＳＯＤ比活性存種菌液
１ｍＱをそれぞれに接種し、培養温度２８°Ｃで内圧を
１　、５　ｋｇ／ａｍ”、毎分６０ｇの空気を送りなが
ら、通気撹拌培養を２１時間行い、種培養を調製した。

生産培地には炭素源としてグルコース６％（別滅菌）を
用いた実施例１で使用した液体基本培地＋２０１２を用
い、これを２００ρのタンクに注入し、滅菌し、これに
」１記の種培養物５ｆ２をそれぞれに接種した。培養温
度２４℃、内圧１　、５　ｋｇ／ａＩ！’で、アンモニ
ア水にて培養ｐＨ６，８以上に保持し、毎分６０Ｑの空
気を送りながら通気撹拌培養を４８時間行った。

この培養物から遠心分離法により菌体を採取し、２０℃
で凍結保存した。

それぞれの凍結保存菌体を３０°Ｃで融解し、これに３
ｇの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、８）を加え、ダイ
ノミル（ウィリー・工・バッコーフェン社製、スイス）
装置で菌体を破砕し、シャープレス遠心分離機にかけて
澄明な上清液を得た。この上清液から硫酸アンモニウム
３０〜７０％で生じてくるは添加パラコートに依存して
いるが、パラコート耐性変異株ＰＱ−２２のそれは添加
パラコートに依存せず、パラコート無添加でも親株の約
５倍量の生産活性を示した。

実施例　４ 実施例１で使用した種培養の液体培地１２０Ｑを２００
ρのタンクに注入し、滅菌し、これに上記のセラチア・
マルセッセンスＡ　Ｔ　ＣＣ２１０７４とセラデア・マ
ルセッセンスＰＱ−２２の凍結爆沈澱物を遠心分離法で
集めた。この沈澱物を少量の０．１Ｍ　　ＫＣρを含ん
だ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、セロ
ファン・デユープに入れ、同一緩衝液に対して３日間透
析した。この透析液１５０ｍρをグイアフロ−ＵＭ−５
（アミコン社製、限外濾過膜）の膜で限外濾過法により
３０ｘρにまで濃縮した。この濃縮液を予め同一緩衝液
で平衡化したセファデイクスＧ−１５０（ファルマシア
製）のカラムに負荷し、同一緩衝液で溶出し、ＳＯＤ活
性を有する両分２１０叶を集めた。

この両分に硫酸アンモニウム７０％まで加え、生じた沈
澱物を遠心分離法で集め、これを少量の水に溶解し、セ
ロファンチューブに入れ、水に対して３日間透析後、透
析内液を凍結乾燥に付し、粗ＳＯＤ標品を得た。この標
品のＳＯＤ活性を上記の方法で測定した。

結果は次表に示す通りで、変異株セラチア・マルセッセ
ンスＰＱ　−２２のＳＯＤの収量は親株をセラデア・マ
ルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４の約４倍の収量を得た
。

発明の効果 本発明によれば、ＳＯＤを効率よく、生産、採取するこ
とができ、ＳＯＤの工業的生産に適した方法が提供され
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物を用いるスーパーオキシドディスムターゼ
   の生産において、活性酸素増産剤を培地に添加すること
   を特徴とするスーパーオキシドディスムターゼの製造法
   。
2. （２）活性酸素増産剤がパラコートである請求項（１）
   記載の製造法。
3. （３）スーパーオキシドディスムターゼ生産能を有し、
   活性酸素増産剤に耐性を有する微生物を培地に培養する
   ことを特徴とするスーパーオキシドディスムターゼの製
   造法。