JPH05336962A - スーパーオキサイドディスムターゼの製造方法 - Google Patents
スーパーオキサイドディスムターゼの製造方法Info
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- JPH05336962A JPH05336962A JP17162492A JP17162492A JPH05336962A JP H05336962 A JPH05336962 A JP H05336962A JP 17162492 A JP17162492 A JP 17162492A JP 17162492 A JP17162492 A JP 17162492A JP H05336962 A JPH05336962 A JP H05336962A
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- sod
- yeast
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 食品などに利用されている酵母によるＳＯＤ
の製造方法を提供する。 【構成】 食品に利用されている酵母であるサッカロマ
イセス・エグジグーズ、クルイフェロマイセス・マルキ
シアヌス・バライティ・ラクチス、クルイフェロマイセ
ス・サーモトレランス、トルラスポラ・デルブルエキ、
キャンディダ・ミレリの中から選択される一種を好気的
に培養し、得られた菌体からＳＯＤを採取する。
の製造方法を提供する。 【構成】 食品に利用されている酵母であるサッカロマ
イセス・エグジグーズ、クルイフェロマイセス・マルキ
シアヌス・バライティ・ラクチス、クルイフェロマイセ
ス・サーモトレランス、トルラスポラ・デルブルエキ、
キャンディダ・ミレリの中から選択される一種を好気的
に培養し、得られた菌体からＳＯＤを採取する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、スーパーオキサイド
ディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔ
ａｓｅ、以下ＳＯＤと略す）に関し、特に食品に利用さ
れている酵母の生産するＳＯＤの製造方法に関する。
ディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔ
ａｓｅ、以下ＳＯＤと略す）に関し、特に食品に利用さ
れている酵母の生産するＳＯＤの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＳＯＤはスーパーオキサイドアニオンラ
ジカル（Ｏ2 - ）の不均化反応； ２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋ Ｏ2 を触媒する酵素であり、広く動植物、微生物にその存在
が知られている。ＳＯＤは活性中心に金属を有し、その
金属の種類によって銅・亜鉛−ＳＯＤ、マンガン−ＳＯ
Ｄ、鉄−ＳＯＤの３種類に大別される。銅・亜鉛−ＳＯ
Ｄは動植物や酵母等の真核生物に、マンガン−ＳＯＤは
真核生物のミトコンドリアや一部の好気性細菌に、鉄−
ＳＯＤは一般細菌に含まれている。
ジカル（Ｏ2 - ）の不均化反応； ２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋ Ｏ2 を触媒する酵素であり、広く動植物、微生物にその存在
が知られている。ＳＯＤは活性中心に金属を有し、その
金属の種類によって銅・亜鉛−ＳＯＤ、マンガン−ＳＯ
Ｄ、鉄−ＳＯＤの３種類に大別される。銅・亜鉛−ＳＯ
Ｄは動植物や酵母等の真核生物に、マンガン−ＳＯＤは
真核生物のミトコンドリアや一部の好気性細菌に、鉄−
ＳＯＤは一般細菌に含まれている。
【０００３】近年、活性酸素の様々な生理的機能が明ら
かになるのに伴い、ＳＯＤの生体防御酵素としての役割
が注目されている。ヒトのＳＯＤに関しては、主として
組換え微生物によって生産され、医薬の分野において抗
炎症剤等として利用されている。一方、食品や化粧品の
分野では、食品等の被酸化物質の酸化抑制や健康増進
剤、化粧品の一成分として皮膚、毛髪の保護、皮膚への
色素沈着抑制、皮膚に対する抗炎症作用もしくは化粧品
成分中の変敗防止作用が見出されており、今後これらの
分野における発展が期待されている。通常、ＳＯＤを工
業的規模で生産する場合、その供給源を微生物に求める
ことが一般的に考えられ、従来サッカロマイセス・セレ
ビシエ、カビ類、細菌類などについて報告されている。
かになるのに伴い、ＳＯＤの生体防御酵素としての役割
が注目されている。ヒトのＳＯＤに関しては、主として
組換え微生物によって生産され、医薬の分野において抗
炎症剤等として利用されている。一方、食品や化粧品の
分野では、食品等の被酸化物質の酸化抑制や健康増進
剤、化粧品の一成分として皮膚、毛髪の保護、皮膚への
色素沈着抑制、皮膚に対する抗炎症作用もしくは化粧品
成分中の変敗防止作用が見出されており、今後これらの
分野における発展が期待されている。通常、ＳＯＤを工
業的規模で生産する場合、その供給源を微生物に求める
ことが一般的に考えられ、従来サッカロマイセス・セレ
ビシエ、カビ類、細菌類などについて報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の微生物
は人間に対する安全性、例えば、人間に対して病原性を
有する菌であることもあり、また、その微生物の生産す
る物質が人間に対して毒性を有する場合も考えられる。
したがって、食品等にＳＯＤを添加して使用する場合に
は、永年にわたって食品や飼料等に使用されて安全性が
確認された微生物を供給源とするのが安全性の点からも
望ましい。特に、食品に添加して使用する場合には、食
品用酵母を使用することができれば、酵母菌体そのもの
が人間にとっても安全でしかも有用であるため、酵母菌
体とともに食品に添加することも可能であり、酵素及び
酵素を含む酵母菌体について幅広い用途が期待できる。
さらに、工業的規模で製造する際において、菌体収量の
多い酵母を利用することは一般に菌体内酵素であるＳＯ
Ｄを製造する際に有利である。
は人間に対する安全性、例えば、人間に対して病原性を
有する菌であることもあり、また、その微生物の生産す
る物質が人間に対して毒性を有する場合も考えられる。
したがって、食品等にＳＯＤを添加して使用する場合に
は、永年にわたって食品や飼料等に使用されて安全性が
確認された微生物を供給源とするのが安全性の点からも
望ましい。特に、食品に添加して使用する場合には、食
品用酵母を使用することができれば、酵母菌体そのもの
が人間にとっても安全でしかも有用であるため、酵母菌
体とともに食品に添加することも可能であり、酵素及び
酵素を含む酵母菌体について幅広い用途が期待できる。
さらに、工業的規模で製造する際において、菌体収量の
多い酵母を利用することは一般に菌体内酵素であるＳＯ
Ｄを製造する際に有利である。
【０００５】一方、従来よりサッカロマイセス・セレビ
シエのＳＯＤについてはその性質及び製造方法が明らか
であるが、それ以外のサッカロマイセス属の酵母及びサ
ッカロマイセス属以外の酵母のＳＯＤについては明らか
になっていない。そこで、本発明においては、上記のご
とき技術の現状に鑑みて、食品などに利用されている酵
母によるＳＯＤの製造方法を提供することを目的とす
る。
シエのＳＯＤについてはその性質及び製造方法が明らか
であるが、それ以外のサッカロマイセス属の酵母及びサ
ッカロマイセス属以外の酵母のＳＯＤについては明らか
になっていない。そこで、本発明においては、上記のご
とき技術の現状に鑑みて、食品などに利用されている酵
母によるＳＯＤの製造方法を提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明では上記技術課題
を解決するため、鋭意研究し、食品に利用されている酵
母によるＳＯＤについて検討した結果、食品に利用され
ているサッカロマイセス属（サッカロマイセス・セレビ
シエを除く）、クルイフェロマイセス属、トルラスポラ
属、キャンディダ属、チゴサッカロマイセス属に属する
酵母によりＳＯＤを製造する方法を確立するとともに、
これらのＳＯＤがサッロマイセス・セレビシエのＳＯＤ
と異なる新規な銅・亜鉛−ＳＯＤであることを見出し、
本発明に到った。すなわち、本発明では、食品に利用さ
れているサッカロマイセス・エグジグーズ、クルイフェ
ロマイセス・マルキシアヌス・バライティ・ラクチス、
クルイフェロマイセス・サーモトレランス、トルラスポ
ラ・デルブルエキ、キャンディダ・ミレリのなかから選
択される一種を好気的に培養し、得られた菌体から新規
なＳＯＤを採取することを特徴とする。また、サッカロ
マイセス属以外のクルイフェロマイセス属、トルラスポ
ラ属及びキャンディダ属から新規なＳＯＤを採取するこ
とを特徴とする。
を解決するため、鋭意研究し、食品に利用されている酵
母によるＳＯＤについて検討した結果、食品に利用され
ているサッカロマイセス属（サッカロマイセス・セレビ
シエを除く）、クルイフェロマイセス属、トルラスポラ
属、キャンディダ属、チゴサッカロマイセス属に属する
酵母によりＳＯＤを製造する方法を確立するとともに、
これらのＳＯＤがサッロマイセス・セレビシエのＳＯＤ
と異なる新規な銅・亜鉛−ＳＯＤであることを見出し、
本発明に到った。すなわち、本発明では、食品に利用さ
れているサッカロマイセス・エグジグーズ、クルイフェ
ロマイセス・マルキシアヌス・バライティ・ラクチス、
クルイフェロマイセス・サーモトレランス、トルラスポ
ラ・デルブルエキ、キャンディダ・ミレリのなかから選
択される一種を好気的に培養し、得られた菌体から新規
なＳＯＤを採取することを特徴とする。また、サッカロ
マイセス属以外のクルイフェロマイセス属、トルラスポ
ラ属及びキャンディダ属から新規なＳＯＤを採取するこ
とを特徴とする。
【０００７】本発明の製造方法に用いられる酵母として
は、食品等に利用されＳＯＤ産生能を有する酵母であれ
ばよいが、例としてサッカロマイセス・エグジグーズ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ）、ク
ルイフェロマイセス・マルキシアヌス・バライティ・ラ
クチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎ
ｕｓ ｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイフェロマイセス
・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、トルラスポラ・デルブ
ルエキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋ
ｉｉ）、キャンディダ・ミレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｉ
ｌｌｅｒｉ）、キャンディダ・バーサティリス（Ｃａｎ
ｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、チゴサッカロマイ
セス・ルキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｒｏｕｘｉｉ）に属する酵母、例えばサッカロマイセ
ス・エグジグーズ ＩＦＯ １１７０、クルイフェロマ
イセス・マルキシアヌス・バライティ・ラクチス ＡＴ
ＣＣ ８５８５、クルイフェロマイセス・サーモトレラ
ンス ＡＴＣＣ ２０３０９、トルラスポラ・デルブル
エキ ＡＴＣＣ １０６６４、キャンディダ・ウチリス
ＡＴＣＣ ９２２６、キャンディダ・ミレリ ＮＲＲ
Ｌ Ｙ−７２４５、キャンディダ・バーサティリス Ｉ
ＦＯ １００３８、チゴサッカロマイセス・ルキシィ
ＩＦＯ ０６８６等が挙げられる。
は、食品等に利用されＳＯＤ産生能を有する酵母であれ
ばよいが、例としてサッカロマイセス・エグジグーズ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ）、ク
ルイフェロマイセス・マルキシアヌス・バライティ・ラ
クチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎ
ｕｓ ｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイフェロマイセス
・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、トルラスポラ・デルブ
ルエキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋ
ｉｉ）、キャンディダ・ミレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｉ
ｌｌｅｒｉ）、キャンディダ・バーサティリス（Ｃａｎ
ｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、チゴサッカロマイ
セス・ルキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｒｏｕｘｉｉ）に属する酵母、例えばサッカロマイセ
ス・エグジグーズ ＩＦＯ １１７０、クルイフェロマ
イセス・マルキシアヌス・バライティ・ラクチス ＡＴ
ＣＣ ８５８５、クルイフェロマイセス・サーモトレラ
ンス ＡＴＣＣ ２０３０９、トルラスポラ・デルブル
エキ ＡＴＣＣ １０６６４、キャンディダ・ウチリス
ＡＴＣＣ ９２２６、キャンディダ・ミレリ ＮＲＲ
Ｌ Ｙ−７２４５、キャンディダ・バーサティリス Ｉ
ＦＯ １００３８、チゴサッカロマイセス・ルキシィ
ＩＦＯ ０６８６等が挙げられる。
【０００８】上記のＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）における菌株番号を、上記ＡＴＣＣ番号は、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）における菌株番号を、上記
ＮＲＲＬ番号は、ＡＲＳ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＮＲＲＬ）の
菌株番号を、また表３に記載したＣＢＳ番号は、Ｃｅｎ
ｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ
ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）の菌株番号をそれぞれ示
す。またこれらの変異株の使用も可能である。変異の手
段としては、紫外線照射、あるいはニトロソグアニジン
やエチレンイミン等の人工変異剤等を使用することがで
きる。
（ＩＦＯ）における菌株番号を、上記ＡＴＣＣ番号は、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）における菌株番号を、上記
ＮＲＲＬ番号は、ＡＲＳ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＮＲＲＬ）の
菌株番号を、また表３に記載したＣＢＳ番号は、Ｃｅｎ
ｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ
ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）の菌株番号をそれぞれ示
す。またこれらの変異株の使用も可能である。変異の手
段としては、紫外線照射、あるいはニトロソグアニジン
やエチレンイミン等の人工変異剤等を使用することがで
きる。
【０００９】目的とするＳＯＤの製造は炭素源、窒素
源、無機物、その他の栄養素を適当に含有する培地なら
ば合成培地、天然培地のいずれでも使用することができ
る。炭素源としては、例えばぶどう糖、蔗糖、麦芽糖、
乳糖、澱粉加水分解物、廃糖密等の糖類、酢酸などの有
機酸類及び油脂等が単独または組み合わせて用いられ
る。窒素源としては、例えばペプトン、酵母エキス、肉
エキス、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカー
などの天然含窒素物及び硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、尿素などの無機窒素化合物が単独あるいは組
み合わせて用いられる。無機塩としては、例えばリン酸
塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、マン
ガン塩、カルシウム塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩などが単独
あるいは組み合わせて用いられる。鉄または銅の添加は
ＳＯＤの生成にとって有効である。その他の微量要素と
しては、各種ビタミン、例えばチアミン、ビオチン、ニ
コチン酸、パントテン酸、イノシトール等が用いられ
る。さらに、油脂類や合成消泡剤などを消泡の目的で添
加してもよい。
源、無機物、その他の栄養素を適当に含有する培地なら
ば合成培地、天然培地のいずれでも使用することができ
る。炭素源としては、例えばぶどう糖、蔗糖、麦芽糖、
乳糖、澱粉加水分解物、廃糖密等の糖類、酢酸などの有
機酸類及び油脂等が単独または組み合わせて用いられ
る。窒素源としては、例えばペプトン、酵母エキス、肉
エキス、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカー
などの天然含窒素物及び硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、尿素などの無機窒素化合物が単独あるいは組
み合わせて用いられる。無機塩としては、例えばリン酸
塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、マン
ガン塩、カルシウム塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩などが単独
あるいは組み合わせて用いられる。鉄または銅の添加は
ＳＯＤの生成にとって有効である。その他の微量要素と
しては、各種ビタミン、例えばチアミン、ビオチン、ニ
コチン酸、パントテン酸、イノシトール等が用いられ
る。さらに、油脂類や合成消泡剤などを消泡の目的で添
加してもよい。
【００１０】培養の手段としては、菌株の種類、培地の
組成や手段によって異なるが、通常の通気攪拌培養が適
しており、回分、連続、流加いずれの培養法でも差し支
えない。培養温度は、２０〜４０°Ｃ、好ましくは２５
〜３５°Ｃである。培養時のｐＨは４〜９、好ましくは
５〜７に保持する。ｐＨの修正には、アンモニア水、水
酸化ナトリウム、水酸化カリウム、尿素、炭酸カルシウ
ムなどが用いられる。培養時間は通常の回分培養の場
合、１０〜１００時間、好ましくは２０〜４８時間であ
る。
組成や手段によって異なるが、通常の通気攪拌培養が適
しており、回分、連続、流加いずれの培養法でも差し支
えない。培養温度は、２０〜４０°Ｃ、好ましくは２５
〜３５°Ｃである。培養時のｐＨは４〜９、好ましくは
５〜７に保持する。ｐＨの修正には、アンモニア水、水
酸化ナトリウム、水酸化カリウム、尿素、炭酸カルシウ
ムなどが用いられる。培養時間は通常の回分培養の場
合、１０〜１００時間、好ましくは２０〜４８時間であ
る。
【００１１】目的の酵素は主として菌体内に蓄積され
る。したがって、培養終了後、培養液から遠心分離法あ
るいはろ過法によって集菌し、通常用いられている公知
の分離精製法によって該酵素は分離精製される。
る。したがって、培養終了後、培養液から遠心分離法あ
るいはろ過法によって集菌し、通常用いられている公知
の分離精製法によって該酵素は分離精製される。
【００１２】例えば、得られた菌体を超音波処理、溶菌
酵素処理、ガラスビーズによるグラインディング破砕
法、有機溶媒や界面活性剤による自己消化法などによっ
て酵素を抽出する。この酵素含有破砕物から遠心分離法
あるいはろ過法によって菌体などの残査物などを除去し
て、上清またはろ液を得る。この上清あるいはろ液を粗
抽出液とし、この液に硫酸アンモニウムあるいはアセト
ン等を加えて、生じた沈澱物を遠心分離法で集めた後、
これを少量の水や緩衝液で溶解し、透析などで脱塩し凍
結乾燥することにより粗酵素粉末を得ることができる。
酵素処理、ガラスビーズによるグラインディング破砕
法、有機溶媒や界面活性剤による自己消化法などによっ
て酵素を抽出する。この酵素含有破砕物から遠心分離法
あるいはろ過法によって菌体などの残査物などを除去し
て、上清またはろ液を得る。この上清あるいはろ液を粗
抽出液とし、この液に硫酸アンモニウムあるいはアセト
ン等を加えて、生じた沈澱物を遠心分離法で集めた後、
これを少量の水や緩衝液で溶解し、透析などで脱塩し凍
結乾燥することにより粗酵素粉末を得ることができる。
【００１３】酵素の精製は、前記粗抽出液あるいは粗酵
素粉末を通常の酵素の精製に用いられている手段を利用
することにより達成できる。例えば、硫酸アンモニウム
等による塩析法、有機溶媒による沈澱法、等電点沈澱
法、透析、電気透析等による膜処理法、リン酸カルシウ
ムやアルミナ等による吸着法、セファデックスやウルト
ラゲルなどによるゲルろ過法、ジエチルアミノエチルセ
ルロースなどによるイオン交換カラムクラマトグラフィ
ーなどを適宜組み合わせて精製し、使用目的に応じた任
意純度の標品に導かれる。
素粉末を通常の酵素の精製に用いられている手段を利用
することにより達成できる。例えば、硫酸アンモニウム
等による塩析法、有機溶媒による沈澱法、等電点沈澱
法、透析、電気透析等による膜処理法、リン酸カルシウ
ムやアルミナ等による吸着法、セファデックスやウルト
ラゲルなどによるゲルろ過法、ジエチルアミノエチルセ
ルロースなどによるイオン交換カラムクラマトグラフィ
ーなどを適宜組み合わせて精製し、使用目的に応じた任
意純度の標品に導かれる。
【００１４】なお、本発明における酵素活性はＭｃＣｏ
ｒｄとＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法［ザ ジャーナル オ
ブ バイオロジカルケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、２４４巻、６０４９〜６０５５頁、１９６９年］
に準じて行った。すなわち、キサンチンにキサンチンオ
キシダーゼを作用させ、活性酸素を生成させるＯ2 - 生
成系と、生成したＯ2 - によるチトクロームＣの還元速
度を測定するＯ2 - 検出系をカップリングさせ、チトク
ロームＣの還元速度を５０％阻害する酵素量を１単位と
定義する方法である。タンパク質の定量はローリー法
（ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９３巻、２６５〜２７５
頁、１９５１年）に記載の方法により行った。
ｒｄとＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法［ザ ジャーナル オ
ブ バイオロジカルケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、２４４巻、６０４９〜６０５５頁、１９６９年］
に準じて行った。すなわち、キサンチンにキサンチンオ
キシダーゼを作用させ、活性酸素を生成させるＯ2 - 生
成系と、生成したＯ2 - によるチトクロームＣの還元速
度を測定するＯ2 - 検出系をカップリングさせ、チトク
ロームＣの還元速度を５０％阻害する酵素量を１単位と
定義する方法である。タンパク質の定量はローリー法
（ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９３巻、２６５〜２７５
頁、１９５１年）に記載の方法により行った。
【００１５】また、電気泳動における活性染色は、アナ
リティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４４巻、２７６〜２８
７頁、１９７１年）に記載の方法により行った。すなわ
ち、電気泳動終了後、ゲルを２．４５ｍＭニトロブルー
テトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液に２０分間浸す（Ｍｎ−
ＳＯＤのみの検出の場合には２ｍＭシアン化カリウムを
加え、Ｃｕ・Ｚｎ−ＳＯＤを失活させておく）。次に、
３０μＭリボフラビン及び３０ｍＭテトラメチルエチレ
ンジアミンを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に浸
し、蛍光灯を照射して反応を開始する。ＳＯＤ活性のな
い部分（リボフラビンの光還元により発生したＯ2 - が
存在する）はＮＢＴが還元されてブルー・ホルマザンを
形成して青く染色されるが、ＳＯＤ活性を有する部分は
ＮＢＴは還元されず白く残る。適当なコントラストにな
った時点で蛍光灯の照射を止める。
リティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４４巻、２７６〜２８
７頁、１９７１年）に記載の方法により行った。すなわ
ち、電気泳動終了後、ゲルを２．４５ｍＭニトロブルー
テトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液に２０分間浸す（Ｍｎ−
ＳＯＤのみの検出の場合には２ｍＭシアン化カリウムを
加え、Ｃｕ・Ｚｎ−ＳＯＤを失活させておく）。次に、
３０μＭリボフラビン及び３０ｍＭテトラメチルエチレ
ンジアミンを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に浸
し、蛍光灯を照射して反応を開始する。ＳＯＤ活性のな
い部分（リボフラビンの光還元により発生したＯ2 - が
存在する）はＮＢＴが還元されてブルー・ホルマザンを
形成して青く染色されるが、ＳＯＤ活性を有する部分は
ＮＢＴは還元されず白く残る。適当なコントラストにな
った時点で蛍光灯の照射を止める。
【００１６】このようにして本発明の製造方法によって
サッカロマイセス・エグジグーズＩＦＯ １１７０、ク
ルイフェロマイセス・サーモトレランス ＡＴＣＣ ２
０３０９、クルイフェロマイセス・マルキシアヌス・バ
ライティ・ラクチス ＡＴＣＣ ８５８５、キャンディ
ダ・ミレリ ＮＲＲＬ Ｙ−７２４５、トルラスポラ・
デルブルエキ ＡＴＣＣ １０６６４から得られた５種
類のＳＯＤの酵素化学的及び理化学的性質は以下の通り
であり、表１にその概要を示す。また、表２には各ＳＯ
Ｄのアミノ酸組成の分析結果を示す。なお、参考まで
に、同様の方法によってサッカロマイセス・セレビシエ
ＩＦＯ ２０４４から得られたＳＯＤの理化学的性質
及びアミノ酸組成も併せて表１及び表２に示す。
サッカロマイセス・エグジグーズＩＦＯ １１７０、ク
ルイフェロマイセス・サーモトレランス ＡＴＣＣ ２
０３０９、クルイフェロマイセス・マルキシアヌス・バ
ライティ・ラクチス ＡＴＣＣ ８５８５、キャンディ
ダ・ミレリ ＮＲＲＬ Ｙ−７２４５、トルラスポラ・
デルブルエキ ＡＴＣＣ １０６６４から得られた５種
類のＳＯＤの酵素化学的及び理化学的性質は以下の通り
であり、表１にその概要を示す。また、表２には各ＳＯ
Ｄのアミノ酸組成の分析結果を示す。なお、参考まで
に、同様の方法によってサッカロマイセス・セレビシエ
ＩＦＯ ２０４４から得られたＳＯＤの理化学的性質
及びアミノ酸組成も併せて表１及び表２に示す。
【００１７】（ａ）作用 スーパーオキサイドイオンを過酸化水素水分子と酸素分
子とに不均化する。 （ｂ）基質特異性 スーパーオキサイドイオンに作用する。 （ｃ）作用至適ｐＨ 各ＳＯＤの作用至適ｐＨは表１に示すとおりである。 （ｄ）ｐＨ安定性 各ＳＯＤのｐＨ安定性の範囲は表１に示すとおりであ
る。 （ｅ）熱安定性 １％ウシ血清アルブミンを含む各ＳＯＤ試料溶液（０．
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を各温度にて
１時間作用させた後、ＳＯＤの活性測定を行った結果に
より作成した熱安定性曲線から９０％以上活性が残存す
る温度を算出した。その結果は表１に示すとおりであ
る。 （ｆ）吸収スペクトル 紫外吸収スペルトルの一例を図１に示す。各ＳＯＤは表
１に示す極大吸収及び極小吸収を示す。 （ｇ）分子吸光係数 各ＳＯＤの２８０ｎｍにおける分子吸光係数は表１に示
す通りである。 （ｈ）分子量 本ＳＯＤの分子量は、カラムとしてプロテインパック３
００（内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、２カラム、ウォ
ーターズ社製）を用い、溶出溶媒として０．１Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）を用いて、ゲルろ過高速液体クロマトグラフィ
ーを使用して測定した。また、ラウリル硫酸ナトリウム
（以下、ＳＤＳと略す）で処理した後、ＳＤＳ存在下の
ポリアクリルアミド電気泳動を使用して測定した。その
結果を表１に示す。表記したＳＯＤのうち、サッカロマ
イセス・エグジグーズ ＩＦＯ １１７０以外に由来す
るＳＯＤは２個のサブユニットからなる二量体であり、
また、サッカロマイセス・エグジグーズ ＩＦＯ １１
７０由来のＳＯＤは高塩濃度では四量体でも存在してい
た。 （ｉ）等電点 等電点電気泳動により測定した。結果を表１に示す。 （ｊ）Ｎ末端アミノ酸の種類 キャンディダ・ミレリ ＮＲＲＬ Ｙ−７２４５のＳＯ
Ｄのみアラニンであり、その他のＳＯＤはバリンであっ
た。 （ｋ）アミノ酸組成 各ＳＯＤを６Ｎ−ＨＣｌ、１００°Ｃで一定時間（２４
〜７２時間）加水分解した後、アミノ酸分析装置により
構成アミノ酸を定量する。表２の値は、算出された分子
量から換算したＳＯＤサブユニットあたりの各アミノ酸
残基数で示す。アスパラギンは加水分解によりアスパラ
ギン酸として検出され、グルタミンはグルタミン酸とし
て検出される。なお、トリプトファンの残基数はＭＣＤ
スペクトルにより求めたものである。 （ｌ）原子吸光分析 サブユニット当たりＣｕ、Ｚｎが各１原子存在している
ことがわかった（表示せず）。 （ｍ）結晶構造及び元素分析 結晶は得られていない。元素分析はまだ測定していない
ため不明である。
子とに不均化する。 （ｂ）基質特異性 スーパーオキサイドイオンに作用する。 （ｃ）作用至適ｐＨ 各ＳＯＤの作用至適ｐＨは表１に示すとおりである。 （ｄ）ｐＨ安定性 各ＳＯＤのｐＨ安定性の範囲は表１に示すとおりであ
る。 （ｅ）熱安定性 １％ウシ血清アルブミンを含む各ＳＯＤ試料溶液（０．
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を各温度にて
１時間作用させた後、ＳＯＤの活性測定を行った結果に
より作成した熱安定性曲線から９０％以上活性が残存す
る温度を算出した。その結果は表１に示すとおりであ
る。 （ｆ）吸収スペクトル 紫外吸収スペルトルの一例を図１に示す。各ＳＯＤは表
１に示す極大吸収及び極小吸収を示す。 （ｇ）分子吸光係数 各ＳＯＤの２８０ｎｍにおける分子吸光係数は表１に示
す通りである。 （ｈ）分子量 本ＳＯＤの分子量は、カラムとしてプロテインパック３
００（内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、２カラム、ウォ
ーターズ社製）を用い、溶出溶媒として０．１Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）を用いて、ゲルろ過高速液体クロマトグラフィ
ーを使用して測定した。また、ラウリル硫酸ナトリウム
（以下、ＳＤＳと略す）で処理した後、ＳＤＳ存在下の
ポリアクリルアミド電気泳動を使用して測定した。その
結果を表１に示す。表記したＳＯＤのうち、サッカロマ
イセス・エグジグーズ ＩＦＯ １１７０以外に由来す
るＳＯＤは２個のサブユニットからなる二量体であり、
また、サッカロマイセス・エグジグーズ ＩＦＯ １１
７０由来のＳＯＤは高塩濃度では四量体でも存在してい
た。 （ｉ）等電点 等電点電気泳動により測定した。結果を表１に示す。 （ｊ）Ｎ末端アミノ酸の種類 キャンディダ・ミレリ ＮＲＲＬ Ｙ−７２４５のＳＯ
Ｄのみアラニンであり、その他のＳＯＤはバリンであっ
た。 （ｋ）アミノ酸組成 各ＳＯＤを６Ｎ−ＨＣｌ、１００°Ｃで一定時間（２４
〜７２時間）加水分解した後、アミノ酸分析装置により
構成アミノ酸を定量する。表２の値は、算出された分子
量から換算したＳＯＤサブユニットあたりの各アミノ酸
残基数で示す。アスパラギンは加水分解によりアスパラ
ギン酸として検出され、グルタミンはグルタミン酸とし
て検出される。なお、トリプトファンの残基数はＭＣＤ
スペクトルにより求めたものである。 （ｌ）原子吸光分析 サブユニット当たりＣｕ、Ｚｎが各１原子存在している
ことがわかった（表示せず）。 （ｍ）結晶構造及び元素分析 結晶は得られていない。元素分析はまだ測定していない
ため不明である。
【００１８】本発明の製造方法によって得られる５種類
のＳＯＤは、分子構造、特にアミノ酸組成の点で公知の
いずれのＳＯＤとも異なり、新規なＳＯＤである。すな
わち、サッカロマイセス・セレビシエのＳＯＤが５０°
Ｃにおいてほぼ完全に失活したのに対し、クルイフェロ
マイセス・マルキシアヌス・バライティ・ラクチスのＳ
ＯＤは６０°Ｃにおいても８０％以上の活性を有してお
り、高い熱安定性を有している。また、サッカロマイセ
ス・セレビシエの比活性が４９８０ユニット／ｍｇタン
パク質であったのに対し、キャンディダ・ミレリのＳＯ
Ｄの比活性は６９９０ユニット／ｍｇタンパク質であ
り、強力なＳＯＤ活性を有している。なお、表２に示す
ようにサッカロマイセス・エグジグーズは菌体当たりの
ＳＯＤ含量が高く、効率よく菌体からＳＯＤが製造する
ことが可能である。
のＳＯＤは、分子構造、特にアミノ酸組成の点で公知の
いずれのＳＯＤとも異なり、新規なＳＯＤである。すな
わち、サッカロマイセス・セレビシエのＳＯＤが５０°
Ｃにおいてほぼ完全に失活したのに対し、クルイフェロ
マイセス・マルキシアヌス・バライティ・ラクチスのＳ
ＯＤは６０°Ｃにおいても８０％以上の活性を有してお
り、高い熱安定性を有している。また、サッカロマイセ
ス・セレビシエの比活性が４９８０ユニット／ｍｇタン
パク質であったのに対し、キャンディダ・ミレリのＳＯ
Ｄの比活性は６９９０ユニット／ｍｇタンパク質であ
り、強力なＳＯＤ活性を有している。なお、表２に示す
ようにサッカロマイセス・エグジグーズは菌体当たりの
ＳＯＤ含量が高く、効率よく菌体からＳＯＤが製造する
ことが可能である。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】本製造方法におけるＳＯＤの供給源として
用いるこれらの酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ
と同様永年にわたって食品などに利用されてきた酵母で
ある。したがって、これらのＳＯＤは安全性の点から、
食品などへの使用が期待できるとともに、一方ではサッ
カロマイセス・セレビシエと分子構造及び酵素化学的特
徴が異なっているため、用途的にもその特徴を生かすこ
とができる。また、クルイフェロマイセス属、トルラス
ポラ属、キャンディダ属に属する酵母によるＳＯＤの製
造方法は従来にない新規なものである。
用いるこれらの酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ
と同様永年にわたって食品などに利用されてきた酵母で
ある。したがって、これらのＳＯＤは安全性の点から、
食品などへの使用が期待できるとともに、一方ではサッ
カロマイセス・セレビシエと分子構造及び酵素化学的特
徴が異なっているため、用途的にもその特徴を生かすこ
とができる。また、クルイフェロマイセス属、トルラス
ポラ属、キャンディダ属に属する酵母によるＳＯＤの製
造方法は従来にない新規なものである。
【００２２】
【実施例】以下に実施例をもって、本発明の内容を具体
的に説明するが、これは本発明を例示するものに過ぎ
ず、本発明の範囲を限定するものではない。なお、培地
組成における％は特に限定しない限り［％（ｗ／ｖ）］
を示す。 〔実施例１〕酵母として、表３に例示した酵母菌株を使
用した。ＹＰＧ培地（ペプトン２％、酵母エキス１％、
ブドウ糖２％）３００ｍｌを２Ｌ容の三角フラスコに入
れ、１２０°Ｃ，２０分蒸気殺菌した後、ｐＨを６．０
に調整し、これに、ＹＰＧ寒天培地（ペプトン２％、ブ
ドウ糖２％、ｐＨ；６．０、寒天２％）で、３０°Ｃ、
２４時間培養菌体を植菌し、３０°Ｃ、回転数２００ｒ
ｐｍで、２４時間攪拌培養を行った。その培養液から遠
心分離により集菌、水洗し、酵母菌体を得た。
的に説明するが、これは本発明を例示するものに過ぎ
ず、本発明の範囲を限定するものではない。なお、培地
組成における％は特に限定しない限り［％（ｗ／ｖ）］
を示す。 〔実施例１〕酵母として、表３に例示した酵母菌株を使
用した。ＹＰＧ培地（ペプトン２％、酵母エキス１％、
ブドウ糖２％）３００ｍｌを２Ｌ容の三角フラスコに入
れ、１２０°Ｃ，２０分蒸気殺菌した後、ｐＨを６．０
に調整し、これに、ＹＰＧ寒天培地（ペプトン２％、ブ
ドウ糖２％、ｐＨ；６．０、寒天２％）で、３０°Ｃ、
２４時間培養菌体を植菌し、３０°Ｃ、回転数２００ｒ
ｐｍで、２４時間攪拌培養を行った。その培養液から遠
心分離により集菌、水洗し、酵母菌体を得た。
【００２３】得られた菌体３ｇを５０ｍＭリン酸カルシ
ウム緩衝液（ｐＨ７．８）５０ｍｌに懸濁し、クライオ
・クリーン・ブラスター（太陽酸素社製）を使用して菌
体を破壊しＳＯＤ粗抽出液を得た。なお、クライオ・ク
リーン・ブラスターは菌体の懸濁物に低温の高圧窒素ガ
スを噴射して瞬時に凍結して、スプレー状とし、この凍
結体をそのまま高圧窒素ガスに乗せて金属製の壁に衝突
させて、菌体を破砕する装置である。
ウム緩衝液（ｐＨ７．８）５０ｍｌに懸濁し、クライオ
・クリーン・ブラスター（太陽酸素社製）を使用して菌
体を破壊しＳＯＤ粗抽出液を得た。なお、クライオ・ク
リーン・ブラスターは菌体の懸濁物に低温の高圧窒素ガ
スを噴射して瞬時に凍結して、スプレー状とし、この凍
結体をそのまま高圧窒素ガスに乗せて金属製の壁に衝突
させて、菌体を破砕する装置である。
【００２４】得られた粗抽出液についてＳＯＤの活性を
測定し、算出した前記菌体（湿重量）あたりのＳＯＤ活
性を表３に示す。また、粗抽出液をアナリティカル バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ 第４４巻、２７６〜２８７頁、１９７
１年）に記載の方法によりゲル電気泳動及び活性染色を
行い、得られた銅・亜鉛−ＳＯＤの相対移動度を表３に
示す。また、同様にしてマンガン−ＳＯＤについても活
性染色によって相対移動度を測定したところ、従来知ら
れているサッカロマイセス・セレビシエのマンガン−Ｓ
ＯＤの相対移動度とは異なっており、新規なマンガン−
ＳＯＤであることがわかった。なお、本実施例において
示されたチゴサッカロマイセス属に属する酵母からＳＯ
Ｄを採取する方法は従来知られていない。
測定し、算出した前記菌体（湿重量）あたりのＳＯＤ活
性を表３に示す。また、粗抽出液をアナリティカル バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ 第４４巻、２７６〜２８７頁、１９７
１年）に記載の方法によりゲル電気泳動及び活性染色を
行い、得られた銅・亜鉛−ＳＯＤの相対移動度を表３に
示す。また、同様にしてマンガン−ＳＯＤについても活
性染色によって相対移動度を測定したところ、従来知ら
れているサッカロマイセス・セレビシエのマンガン−Ｓ
ＯＤの相対移動度とは異なっており、新規なマンガン−
ＳＯＤであることがわかった。なお、本実施例において
示されたチゴサッカロマイセス属に属する酵母からＳＯ
Ｄを採取する方法は従来知られていない。
【００２５】
【表３】
【００２６】〔実施例２〕菌株としてキャンディダ・ミ
レリ ＮＲＲＬ Ｙ−７２４５を用い、前記ＹＰＧ寒天
培地で２５°、２４時間培養した菌体を、予め滅菌され
た、２Ｌ容の三角フラスコに入った３００ｍｌの前記Ｙ
ＰＧ培地に植菌し、２５°Ｃで、回転数２００ｒｐｍ
で、２４時間の攪拌培養を行い、種培養とした。これ
を、予め滅菌された上記組成の培地３Ｌの入った５Ｌ容
のジャーファーメンターに植菌し、通気量２ｖｖｍ〔単
位容積あたりの毎分の通気容量〕、回転数５００ｒｐ
ｍ、温度２５°Ｃで３０時間通気攪拌培養した。
レリ ＮＲＲＬ Ｙ−７２４５を用い、前記ＹＰＧ寒天
培地で２５°、２４時間培養した菌体を、予め滅菌され
た、２Ｌ容の三角フラスコに入った３００ｍｌの前記Ｙ
ＰＧ培地に植菌し、２５°Ｃで、回転数２００ｒｐｍ
で、２４時間の攪拌培養を行い、種培養とした。これ
を、予め滅菌された上記組成の培地３Ｌの入った５Ｌ容
のジャーファーメンターに植菌し、通気量２ｖｖｍ〔単
位容積あたりの毎分の通気容量〕、回転数５００ｒｐ
ｍ、温度２５°Ｃで３０時間通気攪拌培養した。
【００２７】この培養液中には、培養１６時間目にブド
ウ糖及びペプトンをそれぞれ培養液に対して４％及び１
％となるように添加した。また、培養期間を通じて、培
養液のｐＨを５以上に保持するように、２Ｎ水酸化ナト
リウム溶液で調整した。なお、使用された培地はすべて
１２０°Ｃ、２０分の蒸気殺菌が行われているものであ
る。培養終了後、遠心分離により集菌、水洗、脱水を行
い、１８０ｇの酵母菌体（湿重量）を得た。
ウ糖及びペプトンをそれぞれ培養液に対して４％及び１
％となるように添加した。また、培養期間を通じて、培
養液のｐＨを５以上に保持するように、２Ｎ水酸化ナト
リウム溶液で調整した。なお、使用された培地はすべて
１２０°Ｃ、２０分の蒸気殺菌が行われているものであ
る。培養終了後、遠心分離により集菌、水洗、脱水を行
い、１８０ｇの酵母菌体（湿重量）を得た。
【００２８】酵母菌体からのＳＯＤの抽出は、有機溶媒
を用いるＧｏｓｃｉｎとＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法、す
なわち、ビオヒミカ エト ビオフィジカ アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ ２８９巻、２７６〜２８３頁、１９７２年）に
記載の方法を参考にして行った。すなわち、前記酵母菌
体１８０ｇを０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３４０ｍｌ
で懸濁した後、エタノール・クロロホルム混合液（５：
３）２４０ｍｌを加え室温で４時間攪拌することにより
菌体を破壊した。
を用いるＧｏｓｃｉｎとＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法、す
なわち、ビオヒミカ エト ビオフィジカ アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ ２８９巻、２７６〜２８３頁、１９７２年）に
記載の方法を参考にして行った。すなわち、前記酵母菌
体１８０ｇを０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３４０ｍｌ
で懸濁した後、エタノール・クロロホルム混合液（５：
３）２４０ｍｌを加え室温で４時間攪拌することにより
菌体を破壊した。
【００２９】つぎに遠心分離（５０００ｒｐｍ、２０
分）を行い、菌体残査を取り除いた黄色上清液（タンパ
ク質重量１５ｇ、比活性４３ユニット／ｍｇタンパク
質）５６０ｍｌに固形リン酸水素二カリウムを１８０ｇ
添加し、２層分離させた。分液ロートで上層を回収後、
回収液と同容量のアセトンを加え、生じた沈澱を遠心分
離により回収した。沈澱は１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）３００ｍｌに溶解し、該緩衝液を外液と
し、外液を攪拌・放置して透析後、硫酸アンモニウム
（飽和度６０〜９０％）による塩析を行い、沈澱物を得
た。
分）を行い、菌体残査を取り除いた黄色上清液（タンパ
ク質重量１５ｇ、比活性４３ユニット／ｍｇタンパク
質）５６０ｍｌに固形リン酸水素二カリウムを１８０ｇ
添加し、２層分離させた。分液ロートで上層を回収後、
回収液と同容量のアセトンを加え、生じた沈澱を遠心分
離により回収した。沈澱は１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）３００ｍｌに溶解し、該緩衝液を外液と
し、外液を攪拌・放置して透析後、硫酸アンモニウム
（飽和度６０〜９０％）による塩析を行い、沈澱物を得
た。
【００３０】沈澱物は、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、
２０分）により回収し、最少量の前記１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液、本例においては５０ｍｌに溶解し、該緩衝
液で透析後、予め該緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァセル（ファルマシアＬＫＢ社）が充填されたカラム
（内径３ｃｍ×長さ１５ｃｍ）に負荷し、該緩衝液で溶
出した。ＳＯＤは、このＤＥＡＥカラムには完全吸着さ
れず、特にＳＯＤを溶出させるように調製された溶出液
を使用しないでそのままカラムから徐々に溶出された。
この溶出液からＳＯＤ活性画分（タンパク質１７ｍｇ、
比活性４１２０ユニット／ｍｇタンパク質）８０ｍｌを
回収し、限外ろ過（アミコン社）により５ｍｌまでに濃
縮した。
２０分）により回収し、最少量の前記１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液、本例においては５０ｍｌに溶解し、該緩衝
液で透析後、予め該緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァセル（ファルマシアＬＫＢ社）が充填されたカラム
（内径３ｃｍ×長さ１５ｃｍ）に負荷し、該緩衝液で溶
出した。ＳＯＤは、このＤＥＡＥカラムには完全吸着さ
れず、特にＳＯＤを溶出させるように調製された溶出液
を使用しないでそのままカラムから徐々に溶出された。
この溶出液からＳＯＤ活性画分（タンパク質１７ｍｇ、
比活性４１２０ユニット／ｍｇタンパク質）８０ｍｌを
回収し、限外ろ過（アミコン社）により５ｍｌまでに濃
縮した。
【００３１】濃縮後、予め５０ｍＭ塩化ナトリウムを含
む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡
化されたセファクリルＳ−２００ＨＲが充填されたカラ
ム（内径２．５ｃｍ×長さ１５０ｃｍ）にこの濃縮液を
負荷し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。この溶
出液からＳＯＤ活性画分（タンパク質８．３ｍｇ、比活
性６９９０ユニット／ｍｇタンパク質）２０ｍｌを回収
した。この液につきＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動を行ったところ、単一なタンパク質のバンドとして検
出され、かつ活性染色により銅・亜鉛−ＳＯＤであるこ
とがわかった。この精製されたＳＯＤの酵素化学的特性
は前述の表１及び表２中に示した通りである。
む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡
化されたセファクリルＳ−２００ＨＲが充填されたカラ
ム（内径２．５ｃｍ×長さ１５０ｃｍ）にこの濃縮液を
負荷し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。この溶
出液からＳＯＤ活性画分（タンパク質８．３ｍｇ、比活
性６９９０ユニット／ｍｇタンパク質）２０ｍｌを回収
した。この液につきＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動を行ったところ、単一なタンパク質のバンドとして検
出され、かつ活性染色により銅・亜鉛−ＳＯＤであるこ
とがわかった。この精製されたＳＯＤの酵素化学的特性
は前述の表１及び表２中に示した通りである。
【００３２】〔実施例３〕サッカロマイセス・エグジグ
ーズ ＩＦＯ １１７０、クルイフェロマイセス・マル
キシアヌス・バライティ・ラクチス ＡＴＣＣ ８５８
５、クルイフェロマイセス・サーモトレランス ＡＴＣ
Ｃ ２０３０９及びトルラスポラ・デルブルエキ ＡＴ
ＣＣ １０６６４並びに対照菌としてサッカロマイセス
・セレビシエ ＩＦＯ ２０４４のＳＯＤを実施例２と
同様の培養方法、分離精製法によって調製した。得られ
た上記５菌株の銅・亜鉛−ＳＯＤの酵素化学的性質は表
１及び表２に示す通りである。
ーズ ＩＦＯ １１７０、クルイフェロマイセス・マル
キシアヌス・バライティ・ラクチス ＡＴＣＣ ８５８
５、クルイフェロマイセス・サーモトレランス ＡＴＣ
Ｃ ２０３０９及びトルラスポラ・デルブルエキ ＡＴ
ＣＣ １０６６４並びに対照菌としてサッカロマイセス
・セレビシエ ＩＦＯ ２０４４のＳＯＤを実施例２と
同様の培養方法、分離精製法によって調製した。得られ
た上記５菌株の銅・亜鉛−ＳＯＤの酵素化学的性質は表
１及び表２に示す通りである。
【００３３】
【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、食品
に使用される酵母からＳＯＤを製造することができるた
め、食品等に添加して使用する場合に安全性が高いＳＯ
Ｄを提供することができる。また、食品酵母を利用して
ＳＯＤの工業的規模の生産を図る際には、菌の取扱い、
処理及び汚染等に関して生産工程での安全性が高いとと
もに、菌体収量の多い酵母を使用することにより効率的
なＳＯＤの生産が可能になる。
に使用される酵母からＳＯＤを製造することができるた
め、食品等に添加して使用する場合に安全性が高いＳＯ
Ｄを提供することができる。また、食品酵母を利用して
ＳＯＤの工業的規模の生産を図る際には、菌の取扱い、
処理及び汚染等に関して生産工程での安全性が高いとと
もに、菌体収量の多い酵母を使用することにより効率的
なＳＯＤの生産が可能になる。
【図１】表１に示した６種類に酵母から採取された各Ｓ
ＯＤの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中
〔タンパク質含量１ｍｇ／ｍｌ〕における紫外吸収スペ
クトル図である。
ＯＤの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中
〔タンパク質含量１ｍｇ／ｍｌ〕における紫外吸収スペ
クトル図である。
【図２】表１に示した６種類の酵母から採取された各Ｓ
ＯＤの熱安定性を示すグラフ図である。
ＯＤの熱安定性を示すグラフ図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 高山 健一郎 愛知県名古屋市東区白壁５丁目３番地 敷 島製パン株式会社内 (72)発明者 正田 誠 神奈川県横浜市緑区長津田4259 東京工業 大学資源化学研究所内 (72)発明者 古川 秀之 愛知県名古屋市天白区大字八事字裏山15 名城大学薬学部内
Claims (6)
- 【請求項１】 食品に利用されている酵母であるサッカ
ロマイセス・エグジグーズ、クルイフェロマイセス・マ
ルキシアヌス・バライティ・ラクチス、クルイフェロマ
イセス・サーモトレランス、トルラスポラ・デルブルエ
キ又はキャンディダ・ミレリの中から選択される一種を
好気的に培養し、得られた菌体からスーパーオキサイド
ディスムターゼを採取することを特徴とするスーパーオ
キサイドディスムターゼの製造方法。 - 【請求項２】 食品に利用されている酵母がサッカロマ
イセス属であり、加水分解により得られるサブユニット
あたりのアミノ酸組成モル比が、アスパラギン酸又はア
スパラギン２０、トレオニン１５、セリン８、グルタミ
ン酸又はグルタミン１２、プロリン７、グリシン２３、
アラニン１０、システイン２、バリン１５、メチオニン
１、イソロイシン６、ロイシン６、チロシン２、フェニ
ルアラニン６、ヒスチジン７、リジン７及びアルギニン
５であるスーパーオキサイドディスムターゼを採取する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のスーパー
オキサイドディスムターゼの製造方法。 - 【請求項３】 酵母がクルイフェロマイセス属であり、
加水分解により得られるサブユニットあたりのアミノ酸
組成モル比が、アスパラギン酸又はアスパラギン１８、
トレオニン１１、セリン１２、グルタミン酸又はグルタ
ミン１１、プロリン６、グリシン２６、アラニン１０、
システイン２、バリン１７、イソロイシン５、ロイシン
８、チロシン１、フェニルアラニン５、ヒスチジン８、
リジン９及びアルギニン４であるスーパーオキサイドデ
ィスムターゼを採取することを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載のスーパーオキサイドディスムターゼの製
造方法。 - 【請求項４】 酵母がクルイフェロマイセス属であり、
加水分解により得られるサブユニットあたりのアミノ酸
組成モル比が、アスパラギン酸又はアスパラギン２１、
トレオニン８、セリン１０、グルタミン酸又はグルタミ
ン１３、プロリン４、グリシン２１、アラニン１２、シ
ステイン２、バリン１２、イソロイシン７、ロイシン
８、チロシン１、フェニルアラニン５、ヒスチジン７、
リジン８、アルギニン４及びトリプトファン１であるス
ーパーオキサイドディスムターゼを採取することを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のスーパーオキサイド
ディスムターゼの製造方法。 - 【請求項５】 酵母がトルラスポラ属であり、加水分解
により得られるサブユニットあたりのアミノ酸組成モル
比が、アスパラギン酸又はアスパラギン１５、トレオニ
ン１３、セリン１０、グルタミン酸又はグルタミン１
４、プロリン３、グリシン２５、アラニン１２、システ
イン２、バリン１３、イソロイシン６、ロイシン８、チ
ロシン１、フェニルアラニン４、ヒスチジン６、リジン
１１、アルギニン５及びトリプトファン１であるスーパ
ーオキサイドディスムターゼを採取することを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載のスーパーオキサイドディ
スムターゼの製造方法。 - 【請求項６】 酵母がキャンディダ属であり、加水分解
により得られるサブユニットあたりのアミノ酸組成モル
比が、アスパラギン酸又はアスパラギン１８、トレオニ
ン１３、セリン５、グルタミン酸又はグルタミン１１、
プロリン７、グリシン２３、アラニン１４、システイン
２、バリン１３、メチオニン１、イソロイシン６、ロイ
シン５、チロシン２、フェニルアラニン７、ヒスチジン
７、リジン５及びアルギニン４であるスーパーオキサイ
ドディスムターゼを採取することを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載のスーパーオキサイドディスムターゼ
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17162492A JPH05336962A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | スーパーオキサイドディスムターゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17162492A JPH05336962A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | スーパーオキサイドディスムターゼの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336962A true JPH05336962A (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=15926631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17162492A Pending JPH05336962A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | スーパーオキサイドディスムターゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05336962A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1693447A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-08-23 | Gnosis S.p.A. | Procedure for the preparation of superoxide dismutase |
| CN102533686A (zh) * | 2010-12-30 | 2012-07-04 | 花王株式会社 | 抗氧化剂的制造方法 |
-
1992
- 1992-06-04 JP JP17162492A patent/JPH05336962A/ja active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BIOKHIMIYA 52-3=1983 * |
| EUR.J.BIOCHEM.147-1=1985 * |
| INT.J.SYST.BACTERIOL 33-4=1983 * |
| J.AGRIC.FOOD CHEM.37-1=1989 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1693447A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-08-23 | Gnosis S.p.A. | Procedure for the preparation of superoxide dismutase |
| CN102533686A (zh) * | 2010-12-30 | 2012-07-04 | 花王株式会社 | 抗氧化剂的制造方法 |
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