JPH0130840B2 - - Google Patents

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JPH0130840B2
JPH0130840B2 JP54156463A JP15646379A JPH0130840B2 JP H0130840 B2 JPH0130840 B2 JP H0130840B2 JP 54156463 A JP54156463 A JP 54156463A JP 15646379 A JP15646379 A JP 15646379A JP H0130840 B2 JPH0130840 B2 JP H0130840B2
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polysaccharide
culture
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deacetylated
agar
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Esu Kangu Kenesu
Tee Koruguroo Jooji
Tee Ueedaa Jooji
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Merck and Co Inc
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】
複合多糖類はある微生物によつて生成されるこ
とが知られている。親水性コロイドとしてまたそ
の粘性と流動学的性質によりこの複合多糖類の作
用のいくつかが水性の系における濃化剤として使
われてきた。 科学技術の他の分野に関し、濃化、懸濁および
または安定剤として有用な性質を有する新しい複
合多糖類を発見する目的の研究が継続された。こ
れらの目的の性質を有する新しい複合多糖を与え
ることが本発明の目的である。この新規化合物の
製造法を与えることも目的である。またさらに本
発明の目的は本発明の続く記述から明確になるで
あろう。 本発明は選ばれた炭素源上で細菌の作用により
生産される新規複合多糖に関する。また本発明は
制御された条件下で選ばれた炭素源と培養培地成
分で細菌を培養することにより複合多糖を製造す
る新規な方法に関する。本発明の複合多糖は主に
炭水化物残基と少量の蛋白質を含む高分子量の多
糖である。時々これは「ガム（gum）」と呼ばれ
るが複合多糖という術語がより正確で的確である
と考えられる。本発明の以下の記述において、該
化合物は時により複合多糖60またはＳ−60と呼ぶ
ことにする。 この新規化合物は広範囲にわたる分類学的研究
に基き、今までに未記載の微生物でシユードモナ
ス種（Pseudomonas S.P.）により適当な栄養培
地で醗酵することにより製造することができる。
該複合多糖を製造する時に使用するこの微生物の
拘束を受けない（unrestricted）永久寄託が1978
年11月21日にアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン（American Type Culture
Collection）により受け入れ番号ATCC31461（ブ
ダペスト条約に基づく寄託）で行なわれた。 シユードモナス（Pseudomonas）属の種々の
分類の手がかり及びシユードモナス
（Pseudomonas）属の培養の記述はBergey's
Mannal〔ブリード（Breed）ら、（1957）〕の７版
及びBergey's Manual〔ドウドロフら
（Doudoroff）ら、（1974）〕の８版、また他の学
派による種々の出版物；ヒユー（Hugh）とギラ
ルゲイ（Gilardi）、1974 シユードモナス
（Pseudomonas）、臨床微生物便覧（Manual of
Clinical Microbiologg）、２版、レンネツト
（Lennette）ら編、250−269ページ、アメリカ微
生物学会、ワシントンD.C.；ウエーバー
（Weaver）ら、1972、診らしい病原性グラム陰
性細菌の同定（Identification of Unusual
Pathogenic Gram−Negative Bacteria） イ
ー・オー・キング（E.O.King）、疾病制御のため
のセンター（Center for Disease Control）、ア
トランタ；イイズカ（Iizuka）ら、1963、シユー
ドモナス属の分類の試み（Attempt of
Grouping the Genus Pseudomonas）、 J.Gen.
Appl.Microbiologg ９：73−82；ヘンドリツク
（Hendric）ら、1966、微生物学者のための同定
方法（Identification Methods for
Microbiologists）、Ａの部（Part Ａ）、ギブス
（Gibbs）ら編、１−７ページ、アカデミツク・
プレス（Academic Press）、ニユーヨークに見
られる。 これらの手がかりと記述からATCC31461のそ
れと同様の形態学的及び培養上の特徴を有するシ
ユードモナス（Pseudomonas）種を捜した。以
下の考察は新しいシユードモナス
（Pseudomonas）種の帰属に必要かつ正当化する
ものである。 菌株に関する記述 １ 細胞形態の特徴 単細胞、直線またはしばしば曲がつた棒状、
一般的に0.6−0.8×2.0−3.0μm、しばしば先細
になつた端、培養期間を長くするとより大きく
より長く（0.8−1.0×＞3μm）なり、奇形細胞
及び多形性が、特に炭水化物の制限量の培地上
で現われる。反対に、炭水化物を含んだ培地上
で生育する時には細胞はむしろ一定の桿菌状を
保つが、培養が長くなると再び大部分の細胞は
大きくなり多形性が現われる。グラム陰性、莱
膜を有せず、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸とポリ
ホスフエートの顆粒が特に窒素欠損培地上での
培養で見られる。極多毛性の鞭毛着性状態によ
る運動性が、つまり１〜４本の鞭毛がある一方
の端に着毛及び時には端に近い（Subpolav）
所から着性していることにより、見られる。 ２ コロニー形態の特徴 肉汁寒天（nutrient agar）平板上では、小
（直径0.8−1.1mm）及び大（直径3.2−3.5mm）の
コロニーが現われる。コロニーは黄色カロチノ
イド色素を有し、平滑、円形、凸円状からクツ
シヨン状である。大きなコロニーはしばしば同
心円状のしわを有する。コロニーの表面は硬く
非粘着性の組織で白金耳で押すとコロニー全体
が除かれる。YM寒天平板上では、比較的大き
い（直径〜６−７mm）、黄色、円形、平滑、粘
着性、凸円状のただ一種類のコロニーが現われ
る。粘質性で弾力のある膜がコロニーの表面上
に形成され、コロニーの表面の膜全体を除くこ
とができる。二次生育が最初のコロニーの周縁
にできる。これらのコロニーの色は周縁よりも
中心の方がより暗黄色であり、同心円状の色素
形成が見られる。細胞内黄色カロチノイド色素
に加えて、拡散性渇色色素が培養期間を長くす
ると自動酸化の結果として現われる。この現象
は肉汁寒天（Nutrient agar）上でより容易に
認められる。螢光性色素は生産されなかつた。 ３ 生理学的及び生化学的特徴 Ｓ−60菌株の生育範囲は約20℃から41℃まで
である。４℃では生育は起きない。3.0％NaCl
は生育を阻止するのに充分であり、菌株はPHが
５と11の間で生育が可能である。 ほとんどすべての炭水化物から酸が生成しガ
スは発生しないが、ポリアルコールからは生成
しない。ウレアーゼは生産される。MR、VP、
及びインドールテストはすべて陰性である。ア
ルギニン、ジヒドロラーゼ、リジンとオルニチ
ンデカルボキシラーゼは生産されない。リトマ
ス・ミルクでは酸の生成及び還元が起こる。脂
肪分解卵黄反応（lipolytic egg yolk
reaction）は陰性である。ゼラチンを弱く加水
分解するが、カゼイン、殿粉、アルギン酸、ペ
クチン、セルロース、キチン、DNAを加水分
解しない。 ４ 抗生物質に対する感受性 菌株はカナマイシン、ネオマイシン、クロー
ルテトラサイクリン、エリスロマイシンに非常
に感受性があり、ストレプトマイシンとペニシ
リンにはない。 ５ 栄養上の特徴 有機物性の生長因子は必要ではないし、アン
モニウム塩は単一の窒素源として要求を満た
す。少なくとも35の有機化合物、すなわちロー
リボース、殿粉、２−ケトルグルコネート、ム
ケート（mucate）以外の大部分の炭水化物が
利用された。さらにアセテート、カプロエー
ト、カプリレート、ペラルゴネート、スクシネ
ート、アゼレート、Ｌ−マレエート、DL−β
−ヒドロキシブチレート、ピルヴエート、エタ
ノール、ｎ−プロパノール、ｐ−ヒドロキシベ
ンゾエート、フエニルアセテート、Ｌ−α−ア
ラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、DL
−イソロイシン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グ
ルタメート、Ｌ−チロシンが利用された。 ６ DNAのGC含量 DNAの評価はモル％で〜68（Tmより）とい
う結果になつた。
【表】
【表】 し
【表】 培養条件： 複合多糖Ｓ−60はシユードモナス種の微生物の
接種による制御された条件下で適当な水性栄養培
地の好気培養中に生産される。培地は炭素、窒
素、無機塩源を含む通常の培地である。 一般的に、炭水化物（例えば、グルコース、フ
ルクトース、マルトース、砂糖、キシロース、マ
ンニトールなど）は栄養培地における同化性炭素
源として単独あるいは組み合せて使うことができ
る。培地中に使われる炭素源または炭素源類の正
確な量は一部分培地の他の成分によるが、一般的
に炭水化物の量は普通培地重量あたり約２％と４
％の間で変化する。これらの炭素源は個々に、ま
たはいくつかの炭素源類を組み合せて培地に使用
できる。一般に、蛋白質性の多くの物質が培養工
程中における窒素源として使うことができる。適
当な窒素源は、例えば、酵母加水分解物、生酵
母、大豆粉、綿実粉、カゼイン加水分解物、コー
ンスチープリカー、蒸留酒残渣の可溶性粉、トマ
トペーストなどを含む。窒素源は、単独でまたは
組み合せて、水性培地の重量あたり約0.05％から
0.2％までの範囲の量で使われる。 培養培地に加えることができる栄養無機塩類は
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウ
ム、リン酸、硫酸、塩素、炭酸などのイオンにな
り得る通常の塩類である。コバルト、マンガン、
鉄、マグネシウムのような痕跡金属もまた含まれ
る。 実施例に述べる培地は使用可能な広範囲の培地
の一例にすぎず、これに限定されるものではない
ことに留意されたい。 培養は約25℃から35℃までの間の温度範囲で行
うが、最適の結果を得るには、約28℃から32℃ま
での温度で培養を行うことが好適である。シユー
ドモナス（Pseudomonas）菌の生育及び多糖Ｓ
−60の生産のための栄養培地のPHは約６から８ま
で変えることができる。 新多糖Ｓ−60は表面及び液中培養で生産される
が、液中培養を行う方が好適である。 小規模の培養は菌を適当な栄養培地に接種、生
産培地に移した後、約30℃の一定温度、シエーカ
ー上で数日間培養を行うことにより便利に行なわ
れる。 培養は種菌の生育が培地の入つた滅菌フラスコ
で始められ、１ないしそれ以上の段階を経る。種
菌生育用の栄養培地は炭素及び窒素源の適当な組
み合せたものである。種菌のフラスコは約30℃の
一定温度で、１〜２日間または満足な生育が得ら
れるまで振盪し、得られた増殖の一部を第二段の
種または生産用培地に接種することに使われる。
必要とするなら中間段階の種用フラスコを要する
に同様な方法により増殖させる。すなわち、直前
の段階の種用フラスコの内容物の一部が生産培地
に接種することに使われる。接種したフラスコは
一定温度で数日間振盪し、培養期の最後にフラス
コの内容物をイソプロピルアルコールのような適
当なアルコールで沈殿させることにより回収す
る。 大きな規模の時には、撹拌器及び培養培地を通
気する手段を備えた適当なタンクで培養を行うこ
とが好適である。この方法によると、栄養培地は
タンク内で作り約121℃までの温度に加熱滅菌す
る。冷却後、滅菌した培地に生産培地に前に生育
させた種を接種し、培養を栄養培地を撹拌及びま
たは通気しながら及び約30℃の温度に保ちなが
ら、例えば２日から４日間の培養期間で行う。こ
のＳ−60を生産する方法は特に大量の製造に適し
ている。 生産物はイソプロパノールのような適当なアル
コールで沈殿させることにより培養培地から回収
する。 多糖Ｓ−60の物理学的及び化学的諸性質本発明
におけるシユードモナス菌により生産される複合
多糖はおよそ主に炭水化物、Ｏ−グリコシド結合
したエステルのアセチル基が３−4.5％、蛋白質
10−15％からなる。 多糖Ｓ−60の炭水化物部分はウロン酸（〜12％
ガム重量に対し）と中性糖のグルコースとラムノ
ースを含む。ラムノースとグルコースのおよその
モル比は1.5対１である。 4.5％のアセチル含量はＳ−60樹脂の0.2％水性
溶液をアルカリ性ヒドロキシルアミン試薬と処理
し、続いて酸性塩化第２鉄試薬で処理することに
より決定した〔エス・ヘストリン（S.Hestrin）
（1949）J.Biol.chem.180249261〕。 多糖Ｓ−60の中性糖は以下のように決定した。
生成物10mgを2NH2SO410mlに溶解し、混合物を
100℃４時間加熱する。得られる溶液を冷却し水
酸化バリウムで中和後固体二酸化炭素でPHを５−
６とする。得られる硫酸バリウムの沈殿を遠心分
離により除き上清を減圧下でシロツプ状になるま
で濃縮する。加水分解物の糖は３重量％のOV−
225を保持したガスクロームQ80／100メツシユを
210℃で使いヒユレツト−パツカード5750型クロ
マトグラフ（Hewlett−Packard Model 5750
chromatrgraph）でそれらのアルドノニトリル酢
酸エステル誘導体をガスクロマトグラフを行うこ
とにより試験的に固定する。糖は真の標準品と比
較することにより同定・定量する〔ジエー・ケ
ー・ベアード（J.K.Baird）、エム・ジエー・ホル
ロイド（M.J.Holroyde）、デイー・シー・エルウ
ツド（D.C.Ellwood）（1973）Carbohydr.Res.27、
464−467〕。 多糖の種々の中性糖はまたピリジン：酢酸エチ
ル：水（２：５：５）の上層を溶媒とするホワツ
トマン１番（Whatman No.１）クロマトグラフ
紙による下降法ペーパークロマトグラフを用い
ることにより特徴づけられた。クロマトグラフは
硝酸銀に浸漬及びフタル酸−アニリン噴霧試薬に
より染色した。構成糖は糖の標準品と同時クロマ
トグラフイーを行うことにより及びフタル酸−ア
ニリン試薬との特異的呈色反応により固定した。 多糖のウロン酸含量は２つの異なつた方法によ
り決定した。ある方法では試料を19％塩酸で脱炭
酸し遊離した二酸化炭素を標準水酸化ナトリウム
で捕捉し逆滴定により〔ビー・エル・ブラウニン
グ（B.L.Browning）（1967）Methods of Wood
Chemistry 、632−633〕及びカルバゾール比
色法により〔テイー・ビター（T.Bitter）、エツ
チ・エム・ムアー（H.M.Muir）（1962）Anal.
Biochem.4、330−334〕決定した。 紙電気泳動は上述の中和した酸加水分解物に
あるウロン酸の分離及び試験的同定に用いた。こ
の分解物の一定量及び既知のウロン酸標準品をカ
マグ（Camag）電気泳動用紙60−011番にの
せ、電気泳動をカマグ（Camag）モデルHVE電
気泳動装置を用いてPH2.7緩衝液中2.0時間行なつ
た。クロマトグラムを風乾し硝酸銀浸漬試薬で染
色し分離したウロン酸の位置を求めた。２つの大
きな及び１つの小さなスポツトが見られた。大き
なスポツトの１つはグルクロン酸（RGlcA＝1.0）
と同様の移動度で動きもう一方の大きなスポツト
（RGlcA＝0.85）及び小さなスポツト（RGlcA＝0.73）
はより小さな移動度であつた。これらと同一条件
下での既知ウロン酸の相対移動度は以下の通りで
ある： Rm グルクロン酸 1.0 マンニユロン酸 0.96 ガラクツロン酸 0.65 グルロン酸 0.63 自然のＳ−60の赤外吸収スペクトルはKBr錠
剤法で乾燥物質について行なつた。複合多糖は水
酸基、メチレン基、カルボニル基、カルボン酸塩
を示す3400cm-1、2950cm-1、1740cm-1、1620cm-1
にピークを示した。塩化メチレン染料を受けつけ
ず、実質的にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに不
溶、DMSOまたはホルムアミドに可溶である。 Ｓ−60の試料は以下の元素分析値を示す：Ｎ−
2.00％、Ｃ−42.62％、Ｈ−5.80％。 多糖Ｓ−60は水に低濃度で溶解した時に水性溶
液に粘度を与える。この事、剪断に対する感受性
及び全体の流動学的性質のため、これは水性の系
における濃化、懸濁及び安定剤として、例えば織
物工業の捺染用糊、または低流動水性除草剤組成
物、サラダドレツシング、濃厚プデイング、粘着
剤組成物処方用の添加剤として有用である。加熱
及び冷却後、これは弱い弾力のあるゲルを形成す
る。
【表】
【表】 脱アセチル、非清澄Ｓ−60 乾燥高分子または培養液を高PH（例えば、炭酸
ナトリウムまたは水酸化ナトリウムを用いてPH10
にする）で90−100℃の高温に10分から45分間加
熱すると脱アセチル化が容易に起こる。得られる
脱アセチル多糖Ｓ−60は堅い弾力のないまたはも
ろいゲルを形成し、工業的及び食品関係における
多くの応用に有用である。脱アセチルＳ−60の組
成は主に炭水化物、蛋白質〜17％、アセチル〜０
％である。炭水化物部分は〜13％のウロン酸、お
よそのモル比が1.5：１の中性糖ラムノースとグ
ルコースから成る。 脱アセチル化樹脂のある使用法は堅くもろいゲ
ルなので型をつくる及び堅い構造物として使うこ
とができることから、香料のような適当な溶液と
処理した後、室内防臭剤、または空気清浄剤など
に応用を見い出す。脱アセチル樹脂はまたゲル電
気泳動において、電子顕微鏡使用時のミクロトー
ム用のゲル化剤にも使われる。自然の及び脱アセ
チル樹脂はまた放射線学におけるバリウム、菓子
類の懸濁剤として、及び工具作り、歯科学、犯罪
学における型どり物質としても使われる。 KBr錠剤法で乾燥物質で測定した脱アセチル
Ｓ−60の赤外吸収スペクトルは3400cm-1、2950cm
-1、1740cm-1、1650cm-1、1610cm-1にピークを示
した。 脱アセチルＳ−60の試料は以下の元素分析値を
示す：Ｎ−2.67％、Ｃ−41.89％、Ｈ−6.07％。 脱アセチル、清澄Ｓ−60 清澄、脱アセチルＳ−60の組成は以下に示すと
おりである：〜２％蛋白質、０％アセチル、及び
炭水化物、後者は〜22％のウロン酸とおよそのモ
ル比が1.5：１の中性糖ラムノースとグルコース
から成る。 KBr錠剤法で乾燥物質で測定した清澄、脱ア
セチルＳ−60の赤外吸収スペクトルは3400cm-1、
2950cm-1、1600cm-1にピークを示した。脱アセチ
ル、清澄Ｓ−60の試料は以下の元素分析値を示
す：Ｎ−0.42％、Ｃ−36.85％、Ｈ−5.62％。試料
は次の比旋光度を示す。 〔α〕25 589＝−45゜ 脱アセチル清澄樹脂は広範囲の培養基を使用す
る種々の臨床または非臨床微生物のための、微生
物学での培養基における寒天代用品として特に有
用である。寒天に置き換えるために必要な脱アセ
チル清澄樹脂の濃度は使用する培地によるが、約
0.5から約1.25％（容量あたりの重量比）の範囲
内である。 微生物の生育の特徴は標準の寒天を基にした培
地のそれと全く同様である。 以下の詳細な実施例は本発明の代表的な面を説
明したものである。 実施例 １ 複合多糖Ｓ−60生産用の培養工程 Ａ 継代培養 シユードモナス菌、ATCC31461はNAまた
はYM寒天上で非常によく生育するから、日
常、これらを継代培養用に使用する。培養温度
は30℃である。微生物は黄橙色のカロチノイド
色素と褐色の可溶性色素を２−５日間の培養で
生産する。 Ｂ 種菌の製造 フラスコの種菌は30℃で培養したYM培地で
作られる。新しい平板培養の菌を接種した時、
YM培地の培養は24時間までに良い生育と樹脂
の形成を与える。 種培養容器として１ガロン発酵槽を用いる発
酵用種培地は最終の発酵槽の培地と同じもので
ある。 Ｃ 最終の発酵槽用培地 樹脂のナトリウム−とカリウム−塩型は異な
つた培地で作られる：それらは共に以下に述べ
る。微生物は一定のK+を要求しこれをナトリ
ウム型培養培地に加えねばならない。（３％デ
キストロースも使うことができる。 ナトリウム塩 カリウム塩 3.0％グルコース 3.0％グルコース 0.01％MgSO4・7H2O 0.01％MgSO4・7H2O 0.09％NH4NO3 0.09％NH4NO3 0.05％プロモソイ（Promosoy）
0.05％プロモソイ（Promosoy） （大豆蛋白濃縮物） １ml／HoLe塩類 １ml／HoLe塩類 1ppm Fe++ 1ppm Fe++ 0.05％Na2HPO4 0.05％K2HPO4 10ppm K+ PH制御＝NaOH PH制御＝KOH HoLe塩類は酒石酸、モリブデン酸マグネシ
ウム、CoCl3、ZnCl2、CuCl2、ホウ酸、塩化マ
ンガン、硫酸第１鉄を含む痕跡元素の溶液であ
る。 低カルシウム生成物を目的とする時、上記の
培地のいずれかも脱イオン水で使用する。培養
は50時間で完了し；培養液の粘度は通常5000−
8000cpsである。 Ｄ 回 収 生成物のゲル化する性質のために良好な繊維
形成は普通自然放置の沈殿では起きない。しか
し、90−95℃で10−15分間の低温殺菌により
（この間に濃培養液は加熱−しく薄くなる）、優
秀な繊維が培養液の容量の２倍量の99％イソプ
ロパノールを用いて冷却することなく培養液か
らの沈殿により得られることがわかつた。樹脂
1.5％の平均収率が20と70の発酵槽でグル
コース３％により得られる。 Ｅ 乾 燥 生成物を回収し50−55℃で１時間までに強制
通気式トレイドライヤーで乾燥する。 Ｆ 生成物の品質 K+塩の１％粘度は通常3000cpsの範囲内にあ
り、低カルシウムナトリウム塩のものでは約
7000cpsである。 実施例 ２ 複合多糖Ｓ−60の脱アセチル化と清澄化 すべての使用法において必ずしも必要ではない
が樹脂の清澄化は樹脂を寒天の代用品として使用
するときには価値がある。清澄化は脱アセチルの
前（自然のままの状態）または後でも行うことが
できる。脱アセチル化は熱アルカリを用い清澄化
は熱い状態で行われるから、２つの方法は容易に
便利に結合される。脱アセチル化と清澄化は共に
培養液または乾燥高分子のいずれでも行うことが
できる。脱アセチル化では、培養液を使用するな
らば、PHをKOHで10に合わせ溶液を90℃で15分
間加熱、希H2SO4でPHを７とし、Cacl2を0.2％濃
度になるように加え冷却する。堅くもろいゲルが
得られる。 脱アセチル化と清澄化の両方法における一般的
方法は以下に示す： Ａ 培養液または樹脂の２％溶液を90℃に加熱す
る。 Ｂ PHをKOHで10にする。 Ｃ 培養液または溶液の温度を15分間90−95℃に
保つ。 Ｄ PHを希HClまたはH2SO4で６−８とする。 Ｅ 10g/のスーパーエイド（Super Aid）を
過する物質に加える。 Ｆ この物質を136cm2の面積をもつフイルター部
分を用いて約６mmのスーパーエイド（Super
Aid）の層と約20−30psiの圧力で圧力フイル
ター部分（予備加熱）を通して過する。 Ｇ 液はゲル化を防ぐためにただちにイソプロ
パノールで沈殿させ繊維を１時間またはそれよ
り少ない時間で50℃で乾燥する。脱アセチル化
が不必要の時は、上述の方法はPHを上げること
以外はそのまま従う：90℃に保ち、溶液をただ
ちに過し、回収する。 清澄化はいつもカリウム塩型で行われる；
KClは必要なら前に作つた生成物の溶液に加え
ることができる。 実施例 ３ 複合多糖Ｓ−60のゲルの特徴 自然のままの樹脂及び脱アセチル樹脂のK+型
とCa++型の両方の型で、カラゲニン及び寒天と
比較したデータを編集したものを下に示す：
【表】 すべてのいろいろの型のゲルの固化及び融ける
ための広い範囲の温度があることを上述のように
留意されたい。寒天では、変化は主に海草の型に
よりカツパ・カラゲニンではカリウムイオン濃度
がゲルの特徴を決定する。脱アセチルＳ−60のゲ
ルは主に脱アセチル化の程度により特徴づけられ
る。ほんの少し脱アセチル化するとゲルはより高
い温度で固まり、より弾性がある；実際、弾力の
あるものから堅いものまで広い範囲のゲルの型が
脱アセチル化の程度により可能である。ゲルは、
主に固化点と融点の間の大きなヒステリシスがあ
ることから、カツパ・カラゲニンよりも寒天に類
似している。それらは溶かすことがむずかしく、
ゲル−ゾルの変化を観察することがむずかしいこ
とを強制しておく。一方、ゲル化の始まりから固
いゲルに鋭く数度でゲルが固化することからゲル
化点は容易に定義できる。 参考例 ４ 脱アセチル非清澄Ｓ−60 Ｓ−60培養液を90℃に加熱しPHを25％KOHの
添加で10とする。温度を15分間維持し、さらに濃
HClで中和する。この培養液を発酵槽から流出さ
せ、熱いうちに２倍量の99％IPAで回収する。脱
アセチルＳ−60の繊維をあつめ、55℃で１時間強
制通気式トレイドライヤーで乾燥し、粉にひく。 参考例 ５ 脱アセチルＳ−60の清澄化 参考例４で製造した脱アセチル複合多糖Ｓ−60
をライトニン（Lightnin）混合器で１時間脱イオ
ン水中１％濃度に再構成し50℃まで加熱しArti−
Barinkoで混合する。溶液は温度を40℃以上に保
ちながらSorvall RC2−Ｂ冷凍遠心機で20分間
10000R.P.M.（GSAヘツド（head））で遠心する。
上清をデカントしてとり次に穴が5μ、3μ、1.2μ、
0.8μのゲルマン（Gelman）型ANHydrophilic
Acropor膜（293mm）を通して過する。液を
約３−４倍量の99％イソプロパノールに加え、繊
維をあつめ、簡単に強制通気式トレイドライヤー
で55℃で乾燥し、粉にひく。生成物は本発明の脱
アセチル清澄Ｓ−60樹脂である。 参考例 ６ 脱アセチル清澄Ｓ−60を用いて寒天との置換 いくつかの異なつた培地が以下に示す通りに作
られる： 肉汁寒天 (A) 0.8％ 肉汁ブロース（Nutrient Broth）
（Difco） 1.5％ 寒天（Difco） (B) 0.8％ 肉汁ブロース（Nutrient Brote）
（Difco） 0.2％ KCl 0.9％ Ｓ−60 トリプチコース ソイ（Trypticose Soy）寒
天 (A) 2.75％ トリプチコース ソイ ブロース
（Trypticose Soy Broth）（BBL） 1.5％ 寒天（Difco） (B) 2.75％ トリプチコース ソイ ブロース
（Trypticose Soy Broth）（BBL） 0.2％ KCl 0.9％ Ｓ−60 ポテト デキストロース寒天 (A) 2.4％ ポテト デキストロースブロース
（Difco） 1.5％ 寒天 (B) 2.4％ ポテト デキストロース ブロー
ス（Difco） 0.2％ KCl 0.9％ Ｓ−60 Ｍ寒天 (A) 2.1％ YMブロース（Difco） 1.5％ 寒天（Difco） (B) 2.1％ YMブロース（Difco） 0.2％ KCl 0.9％ Ｓ−60 ブレイン・ハート・インフユージヨン（Brain
Heart Infusion）寒天 (A) 3.7％ BHIブロース（Difco） 1.5％ 寒天 (B) 3.7％ BHIブロース（Difco） 0.2％ KCl 0.9％ Ｓ−60
【表】 脱イオンをすべての培地に使つた。成分を一緒
にして（バーク（Burk's）を除く）121℃、15psi
で15−20分オートクレーブを行い55℃に冷却、滅
菌したペトリ皿に注いだ。バーク（Burk's）の
成分はグルコースを除いて一緒にし、別々にオー
トクレーブを行い、オートクレーブ後培地に加え
る。これらの培養養プレートが固化したら滅菌を
検査するために室温で24時間培養した後、それら
に以下の14菌株ですじを引いて接種した： アグロマイセス ラモサス（Agromyces
ramosus）ATCC25173 アースロバクター グロビホルミス
（Arthrobacter globifomis）ATCC8010 オーレオバシデイウム プルランス
（Aureobasidium pullulans）NRRL YB−3861 アゾトバクター インデイカス（Azotobacter
indicus）var ミクソゲネス（myxogenes）Ｓ−
７菌株ATCC21423 アゾトバクター ビネランデイ（Azotobacter
vinelandii）ATCC9047 ベイジエリンキア ラクテイコゲネス
（Beijerinckia lacticogenes）ATCC19361 エルヴイニア カルトボラ（Erwinia
cartovora）ATCC8061 エシエリヒア コリ（Escherichia coli）EG−
47菌株 クレブジーラ ニユーモニエ（Klebsiella
pneumoniea）Ｓ−53菌株 ノカルデイア サルモニカラー（Nocardia
salmonicolor）ATCC21243 Ｓ−60 ストレプトコツカス フアエカリス
（Streptococcus faecalis） トリコデルマ ロングブラキアタム
（Trichoderma longbrachiatum）ATCC13631 ズーグロエア ラミゲラ（Zoogloea ramigera）
ATCC25935 プレートを30℃で３−５日間培養し生育を調べ
た。Ｓ−60で作つた培地上にすべて菌株について
良い生育が得られ寒天の代わりＳ−60で作つた培
地と寒天のものはコロニーの形態ではほとんど差
はなかつた。これらの結果はＳ−60が微生物学の
培地における寒天の優秀な代用になることを示し
ている。BHI培地とTSAを除く、Ｓ−60を含む
すべての培地のゲル化点は42℃であつた。BHI
寒天とTSAのゲル化点は52℃であつた。寒天は
典型的に42−44℃でゲル化する。 参考例 ７ 脱アセチルＳ−60を用いた成型香料ゲルの製造 (A) 1.50％ 多糖Ｓ−60 0.75％ 炭酸ナトリウム 0.025％ ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル 3.00％ バラのかおり 4.00％ イソプロパノール 2.00％ エチレングリコール 88.50％ 水 自然のままの多糖Ｓ−60を炭酸ナトリウムと
防腐剤と混合し70℃で水に溶解する。溶液はさ
らに90℃に加熱しその温度で10分間保ち多糖を
脱アセチルする。60℃に冷却後、溶媒に分散さ
せた香料を加え混合物を通常の空気清浄剤のプ
ラスチツクの成型に入れる。混合物が38℃に冷
えたらゲル化が起こり芳香を発散する性質を持
つ独立したゲルを得る。 (B) 乾燥脱アセチル多糖Ｓ−60を培養液から希水
酸化ナトリウムでPHを10.0とし90℃に15分間加
熱することにより作る。溶液を希塩酸でPH7.0
に中和し２倍量のイソプロパノールで沈殿さ
せ、乾燥、粉にひく。固体の空気清浄剤ゲルは
以下の方法で脱アセチル生成物から作られる：
脱アセチル多糖Ｓ−60 3.0gを塩化カリウム
1.5g及びｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル防腐剤
0.15gと混合し水177mlを加える。溶液を90℃に
加熱して溶解し60℃に冷却後、はつか油の香料
6.0g、イソプロパノール8.0g、エチレングリコ
ール4.0gの混合物を加える。溶液をプラスチツ
クの型に入れ室温まで冷却する。香りの強いは
つかの香りをもつた強力な堅いゲルは簡単に変
形できたわむことなくその形を保持する。 本発明の態様を要約すると以下の様である。 １ 10−15％蛋白質、３−4.5％アセチル及び主
として炭水化物を含み、炭水化物部分が〜12％
のウロン酸、モル比がおよそ1.5：１であるラ
ムノースとグルコースからなる複合多糖Ｓ−60
であつて、該多糖が塩化メチレン染料と不相溶
性であり、実質的にＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミドに不溶でかつDMSOまたはホルムアミド
に可溶であり、3400cm-1、2950cm-1、1740cm
-1、1620cm-1のピークによつて特徴づけられる
赤外吸収スペクトルを有することを特徴とする
前記複合多糖Ｓ−60。 ２ 無命名のシユードモナス（Pseudomonas）
属微生物、ATCC31461を炭素源、カリウムイ
オン源、窒素源、痕跡無機元素、水を含む醗酵
培地で28−32℃、PH６−８において40−60時間
培養し、適当な低級アルコールによる沈殿法に
よりガムを回収することから成る第１項記載の
複合多糖Ｓ−60の製法。 ３ 窒素源をコーン・スチーブ・リカー、アルコ
ールをイソプロパノールとする第２項記載のの
製法。 ４ 無命名のシユードモナス（Pseudomonas）
菌、ATCC31461の凍結乾燥培養物。 ５ 17％蛋白質、アセチル含量が０％で、炭水化
物部分が13％のウロン酸とおよそのモル比が
1.5：１である中性糖ラムノースとグルコース
から成る炭水化物を含む脱アセチル化非清澄複
合多糖Ｓ−60。 ６ ２％蛋白質、アセチル含量が０％で、炭水化
物部分がウロン酸22％、およそのモル比が
1.5：１である中性糖ラムノースとグルコース
から成る炭水化物を含む脱アセチル化清澄複合
多糖Ｓ−60。 ７ 複合多糖Ｓ−60の１−５％水性溶液をPH約
10、90−100℃の温度で10分から45分加熱し、
それにより生成する生成物を回収することから
成る第５項記載の化合物の製法。 ８ 約0.5−５％の脱アセチル化複合多糖Ｓ−60
と栄養物から成る微生物学的培養基。 ９ 脱アセチル化Ｓ−60が清澄したものである第
８項記載の培養基。 10 約0.1−５％の脱アセチル化複合多糖Ｓ−60、
水及び低級アルカノールから成る香料ゲル組成
物。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 10−15％蛋白質、３−4.5％アセチル及び主
    として炭水化物を含み、炭水化物部分が〜12％の
    ウロン酸、モル比がおよそ1.5：１であるラムノ
    ースとグルコースからなる複合多糖Ｓ−60であつ
    て、該多糖が塩化メチレン染料と不相溶性であ
    り、実質的にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに不
    溶でかつDMSOまたはホルムアミドに可溶であ
    り、3400cm-1、2950cm-1、1740cm-1、1620cm-1の
    ピークによつて特徴づけられる赤外吸収スペクト
    ルを有することを特徴とする前記複合多糖Ｓ−
    60。 ２ シユードモナス種（Pseudomonas S.P.）
    ATCC31461を炭素源、カリウムイオン源、窒素
    源、痕跡無機元素、水を含む醗酵培地で28−32
    ℃、PH６−８において40−60時間培養し、適当な
    低級アルコールによる沈殿法によりガムを回収す
    ることから成る、 10−15％蛋白質、３−4.5％アセチル及び主と
    して炭水化物を含み、炭水化物部分が〜12％のウ
    ロン酸、モル比がおよそ1.5：１であるラムノー
    スとグルコースからなる複合多糖Ｓ−60であつ
    て、該多糖が塩化メチレン染料と不相溶性であ
    り、実質的にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに不
    溶でかつDMSOまたはホルムアミドに可溶であ
    り、3400cm-1、2950cm-1、1740cm-1、1620cm-1の
    ピークによつて特徴づけられる赤外吸収スペクト
    ルを有することを特徴とする前記複合多糖Ｓ−60
    の製法。 ３ 窒素源をコーン・スチープ・リカー、アルコ
    ールをイソプロパノールとする特許請求の範囲第
    ２項記載の製法。
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