FI73238C

FI73238C - Heteropolysackarid s-194 och foerfarande foer dess framstaellning.

Info

Publication number: FI73238C
Application number: FI823510A
Authority: FI
Inventors: Jerry A Peik; Suzanna M Steenbergen; Harold R Hayden
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1981-10-21
Filing date: 1982-10-14
Publication date: 1987-09-10
Also published as: FI73238B; DE3273806D1; JPH0428722B2; US4401760A; FI823510L; EP0077680B1; AU8944882A; HK38890A; EP0077680A3; AU551405B2; FI823510A0; EP0077680A2; CA1185909A; JPS5878597A

Description

73238

Heteropolysakkaridi S-194 ja sen valmistusmenetelmä.

On tunnettua, että tietyt mikro-organismit pystyvät tuottamaan heteropolysakkarideja. Jotkut näistä heteropoly-5 sakkarideista toimivat hydrofiilisinä kolloideina, ja niitä on viskositeettinsa ja virtausominaisuuksiensa takia käytetty vesipitoisten systeemien sakeutusaineina.

Muiden tekniikan alojen mukana on jatkettu tutkimuksia uusien heteropolysakkaridien löytämiseksi, joilla on 10 käyttökelpoisia ominaisuuksia sakeutus-,ja suspendointi- ja/ tai stabilointiaineina. Tämä keksintö koskee uutta hetero-polysakkaridia, jota tuottaa uusi Alcaligenes-kanta. Lisäksi keksintö koskee menetelmää tämän uuden yhdisteen valmistamiseksi. Keksinnön mukainen heteropolysakkaridi on suurimole-15 kyylinen polysakkaridi, joka sisältää pääasiallisesti hiilihydraattia. Siitä käytetään joskus nimitystä "kumi", mutta uskotaan, että heteropolysakkaridi-nimitys on tarkempi ja oikeampi. Seuraavassa keksinnön kuvauksessa yhdisteestä käytetään nimitystä heteropolysakkaridi S-194 tai lyhyesti 20 S-194.

Uusi heteropolysakkaridi S-194 koostuu pääasiallisesti hiilihydraatista ja sisältää noin 10% O-asetyyliryhmiä, noin 9% glukuronihappoa, noin 10% proteiinia sekä neutraaleja sokereita glukoosia ja ramnoosia moolisuhteessa noin 4:1.

25 Yhdistettä valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, että viljellään Alcaligenes-sukuun kuuluvaa kantaa ATCC 31961 vesipitoisessa ravintoväliaineessa submersseissa aerobisissa olosuhteissa assimiloituvan hiililähteen läsnäollessa ja eristetään mainittu heteropolysakkaridi S-194.

30 Tätä uutta yhdistettä voidaan siis valmistaa eristet tävissä olevia määriä fermentoimalla soveltuvaa ravintoväli-ainetta mikro-organismin, Alcaligenes-kannan, avulla. Tämä organismi, jota käytetään valmistettaessa heteropolysakka-ridia, on tallennettu rajoittamattomasti ja pysyvästi talle-35 tuslaitokseen American Type Culture Collection 17.9.1981, talletusnumerolla ATCC 31961.

73238

Organismi eristettiin lammikosta Kalliovuorilla sijaitsevalla Clacier Basinin alueella lähellä Denveriä Coloradossa. Organismi eritettiin kumimaisena pesäkkeenä neljän päivän inkuboinnin jälkeen (30°C) YM (Difco)-agarmaljalta.

5 Eristettyä organismia kasvatettiin sitten puhdasviljelmänä ravintoaineagarilla.

Kannan ATCC 31961 taksonomiset tutkimukset osoittivat, että se ei vastaa mitään käsikirjassa "Bergey's Manual" olevaa Alcaligenes-lajia.

10 YM-pullo-siemenviljelmä käynnistettiin tuoreella ra- vintoagar-maljalla, ja laitettiin pyöröravistimeen 30°C:seen. Noin 24 h:n kuluttua tällä alkuviljelmällä inokuloitiin E-l-pullo, joka sisälsi 3% hydrolysoitua tärkkelystä hiililäh-teenä. Tämä pullo laitettiin myös ravistimeen lämpötilaan 15 30°C. Noin 72 h:n kuluttua pullossa havaittiin jäykkäliik- keinen neste, ja kun lisättiin kaksinkertainen tilavuus 99%: ista IPA:a, havaittiin kuitumainen sakka.

Toinen YM-pullo-siemenviljelmä valmistettiin yllä mainitulla tavalla, ja sillä inokuloitiin 24 h:n kuluttua 20 viisi pulloa, jotka sisälsivät erilaisia väliaineita ja 3% glukoosia. Näitä pulloja inkuboitiin ravistimessa 30°C:ssa noin 72 h, minkä jälkeen mitattiin pH, viskositeetti, kumi-saanto ja tuotteen viskositeetti. Tulokset ovat taulukossa 1.

25 E-l-väliaine sisältää 5 g dikaliumfosfaattia, 6,1 g magnesiumsulfaattia, 0,9 g ammoniumnitraattia, 0,5 g Promosoy 100:a (entsymaattisesti hajoitettu soijapapujauho, myyjä Central Soya Chemurgy Division), 30 g dekstroosia ja 1 litra vesijohtovettä. E-l-väliaineen pH on noin 7,6-7,8.

30 3 73238

Taulukko 1 Väliaineen vaikutus kumin tuotantoon 5

Liemi Kumi l-%:inen tuote

Visk. Saanto Visk.

Väliaine pH (cP) (%) (cP) 10

E-l 6,3 1300 0,882 ND

E-l - NH4NO3+0,19% NaN03 7,0 600 0,520 ND

E-l + 0,20% Promosoy 5,9 3800 1,482 1550 E-l + HoLe2-suolat 6,2 1800 0,790 1200 15 1. ND: ei määritetty 2. HoLe-suolat: vesiliuos, joka sisältää:

Pitoisuus lopullisessa 20 väliaineessa (ppm)_ H3BC>3 0,05 B3 +

MnCl2.4H20 0,5 Mn2+

FeS04 0,5 Fe2+

25 Na~C.H.O,..2HO

2 4 4 6 (Na-tartraatti)

CuCl2 0,01 Cu2+

ZnCl2 0,02 Zn2+

CoC12.6H20 0,01 Co2+ 30 Na2Mo04.2H20 0,01 Mo6+

Ravistelupulloissa valmistetulla S-194:lla on seuraavat ominaisuudet. Tulokset on mitattu huoneen lämpötilassa.

35 ____ -· u..

4 73238 1. Viskositeetti ja leikkausvoima deionis. vesijoh- vesij.vesi A. Brookfield LVF-viskositeetti vesi_tovesi_+0,1 % KC1

1. 1,0 %, 60 rpm, akseli 3 1660 cP 1820 cP

5 6 rpm, akseli 3 11800 cP

2. 0,1 %, akseli 1 ja

UL-adapteri, 6 rpm 32 cP 34,5 cP

3. 0,5 %, Wells-Brookfield-

laitteisto, 9,6 s ^ 530 cP 614 cP

10 4. 1,0 %, 60 rpm, akseli 3 1650 cP

2. Soveltuvuus suolan ja väriaineen kanssa A. Suola

1. CaCl2 (kyllästetty) soveltuuX

15 2. Ammoniumpolyfosfaatti soveltuuX

3. 60 % NH4N03 soveltuuX

4. 1 % AI2(S04)3.181^0 soveltuuX

5. 1 % CaCl2.2H20 soveltuuX

6. 1 % KC1 soveltuuX

20 x

Syntyneistä liuoksista tutkittiin saostuminen ja hyytyminen, kumpaakaan ei esiintynyt.

B. Värit 1. Milling-vihreä soveltuu 25 2. Metyleenisminen saostuu (osoittaa, että S-194:lla on negatiivinen netto-varaus) C. Viskositeetti ammoniumpolyfosfaatissa: alku 24 h;n kuluttua muutos, % 910 cP 720 cP -20 3. Laatu/virtausominaisuudet 35 sileää, jatkuvasti virtaavaa: ei hyytymistä, kumimaisen tuntuista.

, 73238

D

4. Myötöraja (Working yield value = WYV) 6,3 x 10 5 kp/cm2 (62 dyn/cm2), 1 % liuos S.T.WX:ssa x S.T.W. = Standard tap water, standardi-vesijohtovesi, 0,01 % CaCl2 ja 0,1 % NaCl deionisoidussa vedessä.

5 Fermentointiolosuhteet

Heteropolysakkaridia S-194 syntyy aerobisessa fer-mentoinnissa soveltuvassa ravintoalustassa säädellyissä olosuhteissa inokuloitaessa organismilla ATCC 31961. Alusta sisältää hiililähteen, typpeä ja epäorgaanisia suoloja.

10 Yleensä voidaan käyttää hiilihydraatteja (esimer kiksi glukoosia, fruktoosia, maltoosia, sakkaroosia, ksy-loosia, mannitolia ja sen kaltaisia) joko yksinään tai yhdistelminä assimiloituvan hiilen lähteinä ravintoalustassa. Hiililähteen tai -lähteiden tarkka määrä väliainees-15 sa riippuu osittain väliaineen muista aineosista, mutta yleensä hiilihydraatin määrä on noin 2-5 % väliaineen painosta. Nämä hiililähteet voidaan yhdistää väliaineeseen. Yleisesti ottaen, fermentoinnin typpilähteinä voidaan käyttää monia proteiinipitoisia materiaaleja. Soveltu-20 via typpilähteitä ovat esimerkiksi hiivahydrolysaatit, pri-maarihiiva, soijajauho, puuvillasiemenjauho, kaseiinihydro-lysaatit, maissiliemi, tislausliuokset tai tomaattisose ja vastaavat. Typpilähteitä, joko yksinään tai yhdistettyinä, käytetään edullisesti noin 0,05 - 0,2 p-% vesipi-25 toisesta väliaineesta. Promosoy 100:a voidaan käyttää 0,005 - 0,4 %.

Epäorgaanisiin ravinnesuoloihin, joita voidaan lisätä viljelyväliaineeseen, kuuluvat tavanomaiset suolat, joista saadaan natriumia, kaliumia, ammoniumia, kalsiumia, 30 fosfaatteja, sulfaattia, kloridia, karbonaattia ja vastaavia ioneja. Näihin kuuluvat myös hivenainemetallit, kuten koboltti, mangaani, rauta ja magnesium.

On huomattava, että esimerkeissä kuvattavat väliaineet ovat vain esimerkkejä monenlaisista käyttökelpoisista 35 väliaineista, eivätkä ne rajoita keksintöä.

---------- — L- 6 73238 S-I94:a voidaan vaihtoehtoisesti kasvattaa väliaineessa, jossa Ca++-pitoisuus on pieni, s.o. deionisoidussa vedessä tai jossain muussa vesipitoisessa väliaineessa, joka on olennaisesti vapaa Ca++-ioneista (s.o. vähemmän kuin noin 5 4 ppm Ca++/1% kumia lopullisessa fermehtorinesteessä).

Fermentointi suoritetaan lämpötila-alueella noin 25-35°C, parhaiden mahdollisten tulosten saavuttamiseksi on kuitenkin edullista suorittaa fermentointi lämpötilassa noin 28-32°C. Ravintoväliaineen, jota käytetään ATCC-31961:n 10 kasvatukseen ja heteropolysakkaridi S-194:n tuottamiseen, pH voi vaihdella välillä 6-8.

Vaikka heteropolysakkaridia S-194 tuottavat sekä pinta- että submerssiviljelmät, on edullista suorittaa fermentointi submerssiviljelmänä.

15 Pienten määrien fermentointi on helppo suorittaa ino- kuloimalla viljelmä soveltuvaan ravintoväliaineeseen, siirtämällä tämä tuotantoväliaineeseen, ja antamalla fermentaa-tion edetä vakiolämpötilassa noin 30°C ravistimessa useita päiviä.

20 Fermentointi käynnistetään steriloidussa pullossa, joka sisältää väliainetta, yhden tai useamman siemenviljel-mävaiheen kautta. Alkuviljelyvaiheen ravintoväliaine voi olla mikä tahansa soveltuva hiili- ja typpilähteiden yhdistelmä. Alkuviljelmäpulloa ravistetaan vakiolämpötilassa 25 30°C 1-2 vrk, tai niin kauan kunnes kasvu on tyydyttävää, ja osaa viljelmästä käytetään inokuloimaan toinen alkuvil-jelmävaihe tai tuotantoväliaine. Välivaihe-alkuviljelmät, kun niitä käytetään, kasvatetaan suurinpiirtein samalla tavalla, s.o. osa alkuviljelmävaiheen viimeisen pullon kas-30 vustosta siirretään tuotantoväliaineeseen. Inkuloituja pulloja ravistetaan vakiolämpötilassa useita päiviä, ja inkubointiajan lopussa pullojen sisällöt kerätään saosta-malla 2-3-kertaisena tilavuudella soveltuvaa alkoholia, kuten isopropanolia, tai atseotrooppisella alkoholiseoksella 35 (CBM = vakiolämpötilassa kiehuva alkoholi:vesi -seos 85:15).

7 73238

Työskenneltäessä laajamittaisesti on edullista suorittaa fermentointi sopivissa säiliöissä, jotka on varustettu se-koittimella ja fermentointiväliaineen ilmastuslaitteella. Tämän menetelmän mukaisesti ravintoväliaine valmistetaan 5 säiliössä ja steriloidaan kuumentamalla korkeintaan noin 121°C:n lämpötilaan. Steriloidun väliaineen jäähtyessä se inokuloidaan tuoreella tuotantokykyisellä alkuviljelmällä, ja fermentaation annetaan edetä esimerkiksi 2-4 vrk sekoittaen ja/tai ilmastaen ravintoliuosta ja pitäen lämpötila 10 noin 30°C:na. Tämä S-194:n tuotantomenetelmä soveltuu erityisen hyvin suurten määrien tuottamiseen. Vaikka ATCC 31961:a voidaan viljellä laajasti vaihtelevissa väliaine-olosuhteissa, suositellaan seuraavia edullisia olosuhteita.

1. Viljelmän ylläpito 15 Tämä viljelmä täytyy kasvattaa YM-agarilla, Ravinto-agaria ei tulisi käyttää. On havaittu variantti, joka ei tuota polysakkaridia. Tämä variantti ei ole erotettavissa villistä tyypistä ravintoagarilla. Se on kuitenkin helposti 2q erotettavissa YM-agarilla.

YM-agarilla pesäkkeet saavuttavat koon 1,5-2 mm kolmen päivän inkuboinnin jälkeen. Tyypilliset villin tyypin pesäkkeet ovat keltaisia, pyöreitä, ehjiä, kuperia, himmeitä ja kimaltelevia. Pesäkkeet ovat kovia ja kumimaisia. Vari-2^ anttipesäkkeet ovat kohollaan olevia (mutteivät kuperia) ja pehmeitä tai sienimäisiä pikemminkin kuin kovia.

Viljelmä tulisi siirtää joka kolmas tai neljäs päivä. Siirrostuksessa tulisi poimia mieluummin yksittäisiä pesäkkeitä kuin tiheitä kasvualueita.

30 2. Alkuviljelmän valmistus Käytetään tuoreita (48-72 h) YM-agarmaljoja käynnistettäessä viljely YM- tai YM + 0,25% ^HPC^-pulloissa.

Näitä pulloja inkuboidaan ravistaen 30°C:ssa ja siirros-tetaan (1-5% inokulaattia) tuoreisiin YM- tai YM + 0,25% 35 K2HPO<j-pulloihin 24 h:n kuluttua. Kun on ravistettu 30°C: 8 73238 ssa 24-30 h, kahta näistä pulloista käytetään 3,8 l:n (1 gallonan) fermentorin inokulointiin, joka sisältää 3 1 seuraavaa alkuviljelyväliainetta.

3.0 % glukoosia 5 0,5 % K2HP04 0,2 % Promosoy 100:a 0,01 % MgS04.7H20 0,09 % NH4N03 0,1 - 0,05 % vaahdonestäjää.

10 Inokulaattimäärää 5-10% käytetään 24-30 h:n kulut tua inokuloimaan . lopullinen fermentori. Tämän fermentoin-tiin soveltuvat seuraavat vaahdonestäjät: 0,01 % K-60/Balab 0,05 % SAG 471 15 0,05 % FCA 200

0,05 % DOW C

0,10 % Proflo Oil 3. Fermentointiväliaine, 70 1

Lopullinen fermentointiväliaine on sama kuin alku-20 viljelyväliaine, mutta fosfaattipitoisuus on pienempi" 3.0 % glukoosia 0,05 % K2HP03 0,20 % Promosoy 100:a 0,01 % MgS04.7H20 25 0,09 % NH4N03 0,01 - 0,05 % vaahdonestäjää.

pH säädetään arvoon 6,5 - 7,0 35-%:isella K0H:lla. Fermentointi suoritetaan 30°C:ssa. Fermentointiaika on 60-72 h, liemen viskositeetin ollessa 3400-4900 cP mitat-30 tuna Brookfield LVF-viskositeettimittarilla, akseli no. 4, 60 rpm, huoneen lämpötilassa. Konversio on 44-59%, kun glukoosia on 3%.

Kokeet ovat osoittaneet, ettei Na2HP04:a voida käyt- 9 73238 tää. Organismi on joko hyvin herkkä natriumille tai sillä on määrätty kaliumtarve. Viimeaikaiset pullokokeet ovat myös viitanneet siihen, että suuremmat Promosoy 100-pitoi-suudet, s.o. 0,4 %, saattavat johtaa parempiin kumisaan-5 töihin.

4. Eristäminen

Fermentoinnin päätyttyä heteropolysakkaridi S-194 voidaan eristää käsittelemällä fermentointiliemi siihen sekoittuvalla liuottimena, joka liuottaa huonosti hetero-10 polysakkaridia, eikä reagoi sen kanssa. Tällä tavalla heteropolysakkaridi saostuu liuoksesta. Käytettävän liuottimen määrä on yleensä noin 2- noin 3 tilavuusosaa fermen-tointilientä. Moniin käyttökelpoisiin liuottimiin kuuluvat asetoni ja pienimolekyyliset alkanolit, kuten metanoli, 15 etanoli isopropanoli, n-butanoli, sek.-butanoli, tert.-butanoli, isobutanoli ja n-amyylialkoholi. Isopropanoli on edullinen. Lopullisen liemen pH tulisi säätää 6,5 - 6,8:ks-i ennen eristystä. Fermentointilientä pidetään tyypillisesti lämpötilassa noin 75°C vähän aikaa 20 (esimerkiksi noin 10 - 15 min), ja jäähdytetään sitten noin 30°C:seen tai sen alle ennen liuottimen lisäämistä. Alkoholipitoisuus 55 - 56 % tarvitaan saostamaan heteropolysakkaridi fermentointiliemestä. Kiinteä aine kerätään erottamalla se nesteestä, esimerkiksi suodat-25 tamalla tai siivilöimällä, ja kuivaamalla sitten korotetussa lämpötilassa.

5. Kuivaus

Tuote kuivataan korkeintaan 1 h 55°C:ssa kiertoil-ma-hyllykuivurissa.

30 Heteropolysakkaridi S-194 ATCC 31961:n tuottama heteropolysakkaridi koostuu pääasiallisesti hiilihydraatista, O-asetyyliryhmistä (noin 10 %) ja proteiinista (noin 10 %) eikä sisällä juuri lainkaan pyruvaattia.

35 Polysakkaridi S-194:n hiilihydraattiosa sisältää 10 73238 noin 9 % glukuronihappoa (kumin painosta) ja neutraaleja sokereita glukoosia ja ramnoosia suunnilleen moolisuhtees-sa 4:1.

Sekä kolloidititraus (DIMDAC/sulfonihappo-menetelmä) 5 että potentiometrinen titraus viittaavat siihen, että kumi on hapan (0,5 - 0,7 mekv. anionisia ryhmiä / 1 g kumia).

Asetyyliryhmäpitoisuudeksi määritettiin 9-11 % käsittelemällä S-194-kumin 0,2-%:nen vesiliuos alkalisella hydroksyyliamiinireagenssilla, minkä jälkeen seurasi kä-10 sittely happamalla ferrikloridireagenssilla /S. Hestrin, J. Biol, Chem. 180 (1949) 249-261/.

20 mg S-194:a hydrolysoitiin 2 N rikkihapossa (1 ml) 100°C:ssa 4 h. Jäähdytyksen jälkeen lisättiin 0,5 ml ksyloosiliuosta (3 mg/ml) sisäiseksi standardiksi. Näyt-15 teet neutraloitiin lisäämällä 3 ml kyllästettyä Ba(OH)2~ liuosta, sitten 2 pisaraa kongopunaista ja Ba(OH)2:a, kunnes väri muuttui punaiseksi. Lisättiin kiinteää CC>2:a ylimääräisten hydroksyyli-ionien neutraloimiseksi. Kun oli sentrifugoitu 30 min (2000 rpm) kaikkien näytteiden 20 supernatantit haihdutettiin. Kuivista näytteistä valmistettiin johdannaiset hydroksyyliamiinihydrokloridiliuok-sessa (0,1 ml, 40 mg/1 ml kuivaa pyridiiniä), jä lämmitettiin 45 min 90°C:ssa. Jäähdytettyihin näytteisiin lisättiin 0,1 ml uudelleen tislattua etikkahappoanhydridiä, 25 ja näytteitä pidettiin 90°C:ssa 45 min. Sokerit erotettiin aldoninitriiliasetaattijohdannaisinaan kaasu-neste-kromatografilla (lasikolonni 15 x 2 mm (sisähalkaisija), 3 % SP-2330, 100/120 meshin Supelcoport). Sokerit tunnistettiin ja niiden määrät määritettiin vertaamalla autent-30 tisiin standardeihin /J.K. Baird, M.J. Holroyde ja D.C. Ellwood, Carbohydr. Res. 27 (1973) 464-467/. Neutraalien sokereiden määritystulokset ovat taulukossa 2.

Il 1λ 73238

Taulukko 2

Neutraalien sokereiden kokonaismäärä S-194:ssa Sokeri p-% ramnoosi 20-21 5 glukoosi 73 - 77 inannoos i riboosi ja arabinoosi pieniä määriä, kaikkiaan alle 5 %.

10 Polysakkaridien erilaiset neutraalit sokerit tut kittiin myös käyttämällä laskevaa paperikromatografiaa (Whatman no. 1 kromatografiapaperi) käyttäen liuottimena pyridiini : etyyliasetaatti : vesi -seoksen (2:5:5) ylintä kerrosta. Kromatogrammit värjättiin kastamalla 15 hopeanitraattireagenssiin ja ruiskuttamalla happamalla aniliiniftalaattireagenssilla. Sokerikomponentit tunnis tettiin samanaikaisella sokeristandardien kromatografiällä ja spesifisen aniliiniftalaattireagenssi-värireaktion avulla.

20 Polysakkaridin glukuronihappopitoisuus määritettiin dekarboksyloimalla 17-%:sella kloorivetyhapolla, minkä jälkeen vapautunut hiilidioksidi sidottiin natriumhydroksidi-standardiliuokseen ja suoritettiin takaisintitraus/B.L. Browning, Methods of Wood Chemistry II (1967) 632-633/.

25 Dekarboksylointimenetelmällä saatiin pitoisuudet 8,8 8,9 ja 9,2% kolmelle eri S-194-näytteelle.

Yllä kuvatun neutraloidun happohydrolysaatin sisältämien uronihappojen erotukseen ja kokeelliseen tunnistukseen käytettiin paperielektroforeesia. Yhtä suuret 30 määrät näytettä ja tunnettua uronihappoa laitettiin Camag-elektroforeesipaperille no. 68-011, ja elektroforeesi suoritettiin 2,0 h puskurissa pH 2,7 käyttäen Camag Model HVE-elektroforeesilaitetta. Kromatogrammit kuivattiin ilmassa ja värjättiin kastamalla hopeanitraattireagenssiin erot-35 tuneiden uronihappojen sijainnin määrittämiseksi. Tällä 73238 12 menetelmällä havaittiin kaksi uronihappotäplää, joiden liikkuvuudet vastasivat glukuronihappo- ja mannuroni-happostandardeja, joista jälkimmäinen edustaa haponkes-tävää uronihappopitoista disakkaridia.

5 Alkuperäisen S-194:n IR-spektri ajettiin kuivasta aineesta KBr-tabletilla. Heteropolysakkaridilla oli piikkejä aaltoluvuilla 3400 cm ^, 2920 cm 1 ja 1725 cm"''', jotka viittaavat hydroksyyli-, metyyli- ja esteriryhmiin, vastaavasti.

10 S-194-näyte dialysoitiin ja pakastekuivattiin fer- mentoinnin jälkeen. Näytteet metyloitiin Sandfordin ja Conradin menetelmällä /Biochemistry 5 (1966) 1508-1517_7.

Sokereiden metyylieetterijohdannaiset erotettiin aditoliasetaatteinaan kaasukromatografisesti. Glukoosin 15 ja ramnoosin O-metyylijohdannaisten suhteelliset määrät on annettu taulukossa 3.

Taulukko 3 O-metyylisokereiden suhteelliset määrät metyloidun 20 S-194;n hydrolysaatissa

Metyylisokerit Sidos Moolisuhde (appr.) 2,3 Me2~ramnoosi 1,4 1 2,3,4,6 Me^-glukoosi terminaalinen 1 2.3.4 Me^-glukoosi 1,6 1 25 2,3,6 Me^-glukoosi 1,4 1 2.4 Me2~glukoosi 1,3,6 1

Siten S-194 muodostuu todennäköisimmin kuusiosaisesta toistuvasta yksiköstä, joka sisältää yhtä suuret 30 moolimäärät viittä taulukon 3 mukaista sokeria ja gluku-ronihappoa, joka todennäköisimmin ei ole termisesti sidottu .

Heteropolysakkaridi S-194:11a on, neljällä eri näytteellä tehtyjen määritysten mukaan, seuraavat ominai-35 suudet:

II

13 73238

Taulukko 4 S-194-liuoksen ominaisuudet __Näyte no._ 5 Koe BD 867 BD 1103 BD 1104 BD 1105 1 % visk./ STW (cP) 730 900 1120 1190 WYV (kp/cm^.10 ^ 3,7 3,8 4,9 5,1 10 stabiilisuus-pH-alue 2-12 2-12 2-12 2-12 lämpöstabiilisuus viskositeetin kasvu, %

Fann 50 (STW) 436 % 318 % 219 % 283 %

Leikkausvoimien kesto l 15 Waring Blender, 15 min., viskositeetin muutos, % +67 % +20 % +59 % +77 %

Liemen viskositeetti (cP)

Fann 35, 3 rpm: 20 a. merivesi 319,3 j - - - b. kyll. CaCl2.2H20 30,9 Ιο. perminen suolal. 618,0 1 - - d. standardisuolal. 350,2 - · - 25 Polysakkaridi S-194 lisää vesipitoisen väliaineen viskositeettia liuotettuna veteen pieninä pitoisuuksina.

Se on käyttökelpoinen sakeutus-, suspendointi-, emulgointi-, stabilointi-, voitelu-, kalvonmuodostus- tai sideaine erityisesti vesipitoisille systeemeille. S-194:11a on suuri 30 viskositeetti ja myötöraja (WYV), erinomainen lämmön-, leikkausvoimien- ja entsyymienkestävyys. Sillä on hyvä viskositeetti suolaliuoksessa, ja sen viskositeetti on vakio pH-alueella 2,0 - 12,0. Sillä on myös kohtalaisen hyvä sakeutusteho kuumissa ammoniumnitraattikoostumuksis-35 sa. Guarkumiin, hydroksipropyyliguarkumiin tai hydroksi- 14 73238 etyylisel^uLossaan yhdistetyn S-194:n vesiliuosten viskositeetti kasvaa synergistisesti verrattuna kunkin kumin vesiliuoksiin. Sillä on erityisesti käyttöä seuraavissa sovellutuksissa tai tuotteissa: Liimat, seinien liitos- 5 sementit, täyteaineet, tölkkien vuoraus, kuumavesisäili-öissä käytettävät yhdisteet, lateksien sakeuttaminen, hitsauspuikkojuoksutteet, juottotahnat, keraamiset lasitteet ja pursotteet, puhdistus- ja kiillotusaineet, emulsiot (lateksi, asfaltti, silikoni), hopean eristäminen, 10 siementen päällystys, pestisidien ja herbisidien ruiskutuksen säätelyaineet, nestemäiset pestisidit ja herbisidit, tupakan sideaineet, vesipohjaiset musteet, pysyvät vaahdot, nahan viimeistelyaineet, kankaan painanta ja viimeistely, paperin valmistuksessa holanterin lisäaineet ja 15 retentio- ja rakenneapuaineet, tarttumista estävät aineet, muotin irroitusaineet, nestemäiset hartsit, lietemäiset ja pakatut räjähdysaineet, öljylähteiden ja kaivojen po-rauslietteet, maaöljyn parannus- ja täydennysaineet, maa-öljyn heräteaineet, kosmeettiset valmisteet, lääkesuspen-20 siot ja -emulsiot.

Tällä kumilla on käyttöä myös ravintovalmisteissä, kuten hyytelöissä ja muissa tuotteissa, joiden sokeripitoisuus on korkea, virvoitusjuomissa mukaanluettuna sitruuna-happopohjaiset juomat, meijerituotteissa mukaanluettuna 25 jäätelö ja jugurtti, salaattikastikkeissa, kuivissa seoksissa, kuorrutteissa, kiillotteissa, siirapeissa, vanukkaissa, tärkkelyspitoisissa ruoissa, tölkitetyissä ja kuumennetuissa ruoissa ja leipomotuotteiden täytteissä.

S-194:n pääasiallinen käyttökohde ovat suspensio-30 lannoitteet. Suspensioiden valmistuksessa käytettävät raaka-aineet ovat yhteisiä kaiken tyyppisille lannoitteille, ja ne sisältävät erilaisia typpi-, fosfaatti- ja kaliumlähteitä. Typpipitoisiin aineisiin kuuluvat ammoniakki, ammoniumsuolat, urea ja ureaammoniumnitraattiliuos-35 seokset, joita kutsutaan yleisesti UAN-liuoksiksi. Fosfaat- 15 73238 tilähteisiin kuuluvat fosforihappo ja ammoniumfosfaatit, jotka toimivat myös typpilähteinä. Tavallisimmin käytettäviä suoloja ovat nestemäiset ammoniumpolyfosfaattiliuok-set, kuten 10-34-0 ja 11-37-0, muitakin laatuja on tosin 5 saatavissa. Viime vuosina ammoniumortofosfaatteja, kuten monoammoniumfosfaattia (MAP) ja diammoniumfosfaattia (DAP) on alettu arvostaa yhä enemmän niiden helpon saatavuuden ansiosta. Myös erityisyhdistelmiä, kuten urea-ammonium-polyfosfaatti 28-28-0:a käytetään. Kaliumlähteet ovat 10 pääasiassa kaliumkloridin epäpuhtaita laatuja, vaikka myös sulfaatteja ja nitraatteja käytetään.

Ainoa tähän mennessä kaupallisesti käytetty suspension stabiloija on ollut savi (attapulgiitti tai bento-niitti). Savilla on monia heikkouksia, UAN-liuokset huo-15 nontavat usein viskositeettia, tarvitaan sekoitusta suurilla leikkausvoimilla savihiukkasten hydratoimiseksi täydellisesti ja niiden paisuttamiseksi, ja suurista käyttömääristä aiheutuu usein vakavia pölyongelmia. Savet voivat myös inaktivoida joitakin pestisidejä, jotka adsorboi-20 tuvat saven pinnalle. Tavalliset kumit ja sakeutusaineet, kuten guarkumi, selluloosajohdannaiset ja ksantaanikumi, eivät tavallisesti sovellu yhteen suurten ammoniumpolyfosf aatti- tai ortofosfaattipitoisuuksien kanssa.

Polysakkaridi S-194 sopii yhteen monien erilaisten 25 ammoniumfosfaattisuolojen kanssa, sillä on oikeat virtaus-ominaisuudet hyvien suspensioiden valmistamiseksi, se ei inaktivoi pestisidejä adsorption vuoksi, ja pienet käyttömäärät helpottavat saveen liittyviä pölyämisongelmia.

Käytettäessä S-194:a suspensiolannoitteissa valmis-30 tetaan ensin S-194-liuos saatavilla olevaan veteen tai vesi/UAN-yhdistelmiin, sitten lisätään ammoniumfosfaatit ja viimeksi kaliumkloridi. S-194 liukenee myös suoraan urea-ammoniumnitraattiliuoksiin, kuten 28-0-0:aan tai 32-0-0:aan. Valmistettaessa joitakin seostuotteita, 35 urealiuokset sekoitetaan usein perussuspensioihin, jotka 73238 - -· L..

16 jo sisältävät saven, ja joka laimennetaan sitten typpi-liuoksella. Tämä johtaa liian pieneen savimäärään suolojen suspensoimiseksi. UAN-liuosten, jotka on tehty viskooseiksi S-194:lla, käyttö auttaa estämään viskositeetin 5 menetyksen myös savipitoisissa systeemeissä.

S-194:n käyttömäärä suspensiolannoitteissa on 0,25 kg / 100 kg - 2,5 kg / 1000 kg, edullisesti 0,5 kg / 1000 kg - 1,5 kg / 1000 kg (0,05 - 0,15 %) . Valmistettaessa viskooseja urea-ammoniumnitraattiliuoksia, edullinen 10 määrä on 0,15 - 0,5 p-%, joskin määriä 0,05 - 1,0 p-% voidaan käyttää.

S-194 on erityisen tehokasta juoksevien pestisidien suspensioissa, koska sillä on korkea viskositeetti pienissä pitoisuuksissa ja pienillä leikkausnopeuksilla sekä 15 erinomainen leikkausvoimien kesto. Valmistettaessa juoksevia pestisidejä menetellään yleisesti siten, että jauhetaan pestisidi pieniksi hiukkasiksi, jotta saataisiin aikaan tehokkaampi tuote ja stabiilimpi suspensio, kuula-, kolleri- ja kiekkomyllyjä käytetään hiukkasten jauhamiseen 20 ja korkeiden leikkausvoimien aikaan saamiseen prosessin aikana. Jotta vältettäisiin sakeutusaineen hajoaminen leikkausvoimien vaikutuksesta, sakeutusaine lisätään tavallisesti jauhatusprosessin loppupuolella. S-194 kestää leikkausvoimia niin hyvin, että se voidaan lisätä alussa, 25 ja säästää siten arvokasta valmistusaikaa.

Keksintöä määrittelevät lisäksi seuraavat esimerkit, jotka ovat kuvaavia eivätkä rajoittavia.

Esimerkki 1 S-194:n valmistus 30 Ensimmäinen alkuviljelypullo, joka sisälsi 100 ml YM-lientä, inokuloitiin silmukallisella tuoreelta ravinto-agarmaljalta otettua viljelmää (Alcaligenes-laji, ATCC 31961). Kun oli inkuboitu 24 h 30°C:ssa ravistaen, siirros tettiin 1 % tuoreisiin YM-pulloihin. Samanlaisen 35 inkuboinnin jälkeen inokuloitiin viiden litran fermentori, 17 73238 joka sisälsi 3 1 seuraavaa väliainetta, kahdella näistä pulloista.

3,0 % glukoosia 0,50 % K2HP04 5 0,20 % Promosoy 100 0,01 % MgS04.7H20 0,09 % NH4N03 0,07 % SAG 471-vaahdonestäjää Lämpötila pidettiin 30°C:na ja ilmastusnopeus oli 10 1 1/min. Sekoitus aloitettiin nopeudella 400 rpm, ja nopeutta nostettiin sen jälkeen hyvän sekoittumisen takaamiseksi. 24 h:n kuluttua tällä alkuviljelmällä (noin 2,5 1) inokuloitiin fermentori (30 1), joka sisälsi 20 1 seuraavaa väliainetta: 15 3,0 % glukoosia 0,05 % K2HP04 0,20 % Promosoy 100 0,01 % MgS04.7H20 0,09 % NH4N03 20 0,05 % SAG 471-vaahdonestäjää.

Lämpötila pidettiin 30°C:na ja ilmastusnopeus 10 1 / min:na koko fermentoinnin ajan. pH säädettiin automaattisesti yli 6,7:ksi lisäämällä 25-% KOH:a. Sekoitusnopeus säädettiin aluksi arvoon 300 rpm, ja sitä korotettiin tar-25 peen mukaan maksimiarvoon 700 rpm asti hyvän sekoituksen aikaansaamiseksi. Fermentoinnin tulokset ovat seuraavassa: aika pH Liuoksen viskos* kumisaanto jäännös-hiililähde 66 h 6,75 1200 cP 0,84 % 1,0 % 30 89 h 7,44 2300 cP 1,28 % 0,1 % X Brookfield VLF, akseli no. 4, 60 rpm.

Fermentointiliuos pidettiin sitten noin 75°C:n läm-35 pötilassa 10-15 min, ja jäähdytettiin sitten ympäristön 18 73238 lämpötilaan. Fermentointiliuos kaadettiin sitten kolminkertaiseen tilavuusmäärään 99-% isopropanolia. Polysakkaridi saostui kuitumaisena aineena, joka kerättiin seulan avulla. Kun kuituja oli kuivattu kiertoilma-hyllykuivuris-5 sa 55°C:ssa noin 45 min, ne jauhettiin jauheeksi, jolle käytetään nimitystä BD 947, heteropolysakkaridi S-194.

Esimerkki 2 S-194:n luokittelu A. Morfologiset havainnot 10 1. Pesäkkeiden morfologia

Ravintoagarilla ilmaantui hyvin pieniä pesäkkeitä 1 vrk:n inkuboinnin jälkeen, ja pesäkkeiden läpimitta oli noin 1 mm kolmen vrk:n inkuboinnin jälkeen. Pesäkkeet olivat keltaisia (ei hajaantuvia), pyöreitä, täysin kupe-15 ria, läpinäkymättömiä ja kimaltelevia. Kumimaista tuntua ei havaittu.

YM-agarilla ilmaantui pieniä pesäkkeitä yhdessä vrk:ssa, ja niiden läpimitta oli 1,5-2 mm kolmen vrk:n inkuboinnin jälkeen. Pesäkkeet olivat keltaisia (ei ha-20 jaantuvia), pyöreitä, täysin kuperia, läpinäkymättömiä ja kimaltelevia. Pesäkkeet olivat hyvin kumimaisen tuntuisia, ja inokulointineulalla kosketettaessa irtosi usein kokonaisia pesäkkeitä. Pitkän inkuboinnin jälkeen esiintyi samankeskisiä renkaita.

25 2. Solujen morfologia

Kanta oli gram-negatiivinen, sauvamainen bakteeri, joka liikkui sekaflagellaation avulla, s.o. soluissa oli sekä yksinapaisia että peritrikkisiä flagelloja. Kapseleita, itiöitä ja poly-/?-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) 30 akkumuloitumista ei havaittu. Happokiinnitysvärjäys oli negatiivinen.

Ravintoagarilla solukoko oli 0,5 - 0,6 x 1,5 - 2,0 yum, solut olivat suoria ja suippopäisiä.

YM-agarilla kasvaneet solut olivat suurempia kuin 35 ravintoagarilla kasvaneet. Solukko oli

II

19 7 32 38 0,5 - 0,6 x 2,0 - 2,4 pm, suurin osa soluista oli suoria ja pyöreäpäisempiä. Jotkut olivat taipuneita. Solujen havaittiin usein olevan palisadin muotoon järjestäytyneinä tiiviissä hyytelömäisessä matriisissa, joka 5 oli voimakkaasti taittavaa faasikontrastimikroskoopilla tarkasteltuna. Usein näkyi volutiinin kaltaisia aineita.

3. Kasvu liemiviljelmässä Kannan kasvu rajoittui pinnalle. Sekä ravinto-että YM-liemikoeputkiviljelmiin muodostui kuori. Eri-10 tyisen paksu kuori havaittiin YM-liemessä.

B. Fysiologiset ja biokemialliset kokeet Seuraavassa on yhteenveto tehtyjen fysiologisten ja biokemiallisten kokeiden tuloksista, jotka on koottu taulukkoon 2-1. Sekä sytokromioksidaasi- että katalaasi-15 kokeen tulokset olivat positiiviset. Organismit käyttävät glukoosia hapettamalla, mutta ei fermentoimalla. Anaerobista kasvua ei havaittu. Organismit pystyivät kasvamaan lämpö-tilaalueella 4-37°C, mutta eivät lämpötilassa 40°C. Eläviä soluja ei havaittu 30 min:n inkuboinnin jälkeen 60°C:ssa.

20 Suurin siedettävä NaCl-pitoisuus oli 1,5 %. Organismit kasvoivat sekä pH 6:ssa että 8:ssa, mutta eivät pH 4:ssa eivätkä pH 10:ssa.

TSI-agarilla havaittiin kasvua vinopinnalla, mutta happo- tai alkalireaktiota ei havaittu, eikä kasvua esiin-25 tynyt agarin sisäosissa. Miltei kaikki bakteriologiset standardikokeet antoivat negatiivisen tuloksen. Nitraatti ja nitriitti eivät kumpikaan pelkistyneet. Lakmusliuoksessa ei havaittu minkäänlaista muutosta. Organismi hydrolysoi tärkkelystä, gelatiinia (heikosti), eskuliinia, 30 Tween 80:a, mutta ei kaseiinia eikä pektiiniä. Organismi tuotti happoa oksidatiivisesti L-arabinoosista, Fruktoosista, galaktoosista, D-glukoosista, laktoosista, maltoo-sista, mannoosista, melibioosista ja sakkaroosista.

Organismit kestivät trifenyylitetratsoliumkloridi-35 pitoisuuksia 0,02 ja 0,10%.

20 73238 C. Ravinnon käyttökokeet

Tutkittiin kaikkiaan 129 substraattia, ioista organismit käyttivät seuraavaa 23:a hiili- ja energialähteenä. D-ksyloosi salisiini 5 L-arabinoosi sukkinaatti D-glukoosi fumaraatti D-mannoosi L-malaatti D-galaktoosi DL-laktaatti D-fruktoosi pyruvaatti 10 sakkaroosi p-hydroksibentsoaatti trehaloosi L-ot-alaniini maltoosi DL-isoleusiini sellobioosi L-glutamaatti laktoosi L-tyrosiini 15 inuliini

Organismit eivät pystyneet käyttämään hyväkseen rasvahappoja, alkoholeja eivätkä polyalkoholeja.

D. Antibioottiherkkyyskokeet

Organismit olivat herkkiä karbenisilliinille, 100 20 yug, klooritetrasykliinille, 5^ug, erytromysiinille, 15^ug, gentamisiinille, 10 pg, kanamysiinille, 30 pig. Organismi oli herkkä seuraaville antibiooteille, mutta resistenttejä pesäkkeitä esiintyi: kolistiini, 10 pg, novobiosiini, 30 pg, polymyksiini B, 300 ky, tetrasykliini, 30 pg.

25 Organismit olivat resistenttejä penisilliinille, 10 ky, ja streptomysiinille, 10 pg.

E. Tunnistus

Kanta S-194 oli gram-negatiivinen, sauvamainen bakteeri, liikkui sekaflagellaation avulla, vaikka pääosa 30 soluista oli polaarisesti monotrikkisesti flagelloitu- neita. Organismi oli ehdottoman aerobinen, ja sen sytokro-mioksidaasikokeen tulos oli positiivinen. Kirjallisuuden mukaan /Bergey's Manual of Determinative Bakteriology, Buchanan and Gibbons (toim.), Williams & Wilkins Company, 35 Baltimore, 8.p. (1974)_/ tällainen organismi kuuluu sukuun

II

21 7 3238

Alcaligenes, mitä yleensä pidetään epävarmana luokitteluna. Tästä näkökulmasta katsoen on aiheellista päätellä, että organismi on Alcaligenes-suvun jäsen.

22 732 38

-P

- <u -p to

0) Ai + + I I I I

to o λ; ή o 3 I—I Eh 3 4-> g a)

•H

CD

Ai

O I

,¾ -H —

U CO

G 3 3 CD 2 3 -P > co to 3

•H CO I—I

rH ^ CO ·· -H

ι-H -H fO 4-) I 3 ^ CO CO \

CN -H I -H CO O

E W 3 -H G

O (D ι-H CO *H

λ; m ·η a: m λ; ο ε m 3 ϋ 3 -h w φ 3 *-

Ή Λ CO

3 ζ 3-Hc#>di°tfPc*°c>PcK> to (0 fö >0 E-t ·π Di a) co4-)ininooLno P O 3 -H - »>*-»* G O 2 t^OjOrHrocor^o Φ I—i 4-) co

•H

tji 4-) fO

O <D >

Ή CO tO

0-¾ 44 •Ή O + + 44 CO .-H CD | >1 3 Dj

Cm 1 E-" tO

tn

•H

CO D

3 >

3 CO

Ό to •h λ;

CO 4J

Ai 3 CD -P G

O -n CD CD CD

•rH -rH Ai <D G

E CO I O Ai -H

O 3 to a: O -Q

U to 3 CO Ai O

Ai rH 44 -H I D

O 3 CD E — CD

(L) 44 44 PH >1 fc, to

O >i 3 3 :tO O G

« Cfl 2 K Ai — <

II

23 732 38 m -Ρ en •P o 0) -p

UI P

* g o ε

rP + + I I I I I I I I

G -H

Eh 0) g tn tn

•H

0 CU

> O

P X 0)

(0 I O

1 — M

a p-ι ·Η CO CO

O-I > -P >i >1

— -P -P -P

G G CO tn

CO P G -H -P

CO QJ <D Ρ λ; Λί

-P O C3 -P i—I i—I

CO X G -H CU Q) iH -h es ^ co O. Oj en I rd e en o cn (—l (JcaOCGGOl

•P o Dj O ·Η -H -H -H

o p -p (¾ tn -p -p .-h *—- 0) ·ρ r—( cd g -h en

Λ!· O CM ι-P >i CO O G -P G

G X G v£> oo Ή Ή O >h Φ g Ρ Ρ E

—I -t-> > Ό) -P t7> Ε -Ρ -Ρ -V

G G tuen X S B K G Φ Ο -Η -P -p G

G -r-> ord a a ft a H S > c/3 S IS PI

Eh ^ « X I

P

(U *3· to Λί S3 O Oj rP I + II+ + +II++I+ +

P

Eh

G

P

CO

Ή en •ρ G ··

rp G

H -P

p en a> -ρ <u

O -P -H

-P G CO

-P G O -Ρ -Ρ -P

O Ρ -ρ O -ρ -P en tn -Ρ -ρ tn

G Ό h G i—i tnoOrP-p-p-PH-PO

-p>iO-PO-POOOOCentnoeoo -G-PXl-PrP O-ΡΛί-Ρ-Ρ O O-PO-P G -Ρ -P G -H O -Ρ X G -Ρ -Ρ O O -H O Λ

OHGPtnGftKjGrPtOfH-P-PGC-P

OJOj-POGMGGiHtTiOG^r-lGGrP

O G -Ρ Ό I G -Ρ P G I G G G G G G <D

«ffijX<CPlQWIpUQHHPlSSSS

24 7 3 2 3 8 -μ

<D

10 -¾ +l o \ H I I I I I +| I I I + +1+ +

C

tn

(D

0

O) X

0 I

QJ ^ —

<D O I Q

ο λ; — < X I u (¾ I — Q “

— U O

!H Q -- -H

Q +1 -H m

<C ^ in c -H

^ -h c c c w

-H ui ro -μ G >, -H -H

CO C ι-H U) -H >, -H 10 W

C C >4 -H g r-ι -H (fl >, >, C Ή tn C C O M >1 >1 >i

Ή>ιΛίΟΦ μ >4 >i -H rH

o ω o -μ xs <υ τι >ι ή o o μ λ; λ di ·η ο >ιΉομμ

Τ! Ο μ <1> C χ χ ο U TS TS

>1 X! C Qj -H QJ 01 μ Ό >4 >i £. u x -h o -h c ό >, x: x: -h ·+ c o c c x to o; >, x: i O+iO-r-icocD-HC ωχ: cc <N -H <D -H x rH X) O to +> Λ! -H C -H ··

COCx;C+i+:C.H >, C -H C O

O -H -H -H C -H O -H C <D .H -H C -H 00

X —' -H C -H -H rH 3 tn -μ X Q) ·Η ·Η -H

Λί· C-H4->C>i+>CCG Xi+J-HrHC

3 ϋ ·Η Ή ·Η o >1 I « Ή Λ X β 0) 3 Ο Ή-μ (PCntncgCcnotnC μ η ω α: ο

Cits OM>iceatfNMoc :ca a> ra to > (0-Γ-1 EhU«WEh

Eh ^ c μ -h Φ to to x as X O 3 ο -μ > ήιιιιι + ιι Ccnii

C C C

e E J*

*H *H

ω as •H ·· TS (Ö H I—i

CO (—I

Ο -H

x μ

C CO

Ή tji 4-1 tn C -μ

Ή ·Η -Η ·Η ·Η O

I-Hcn -Η Ή 10 Id 10 HC CO

>iO-HCr-IOOO ΙΛ 4-> X> 4-J +J

>iO(0-HOOOO Eh C C V

4-ΐΰο-μ-μμΗ<Η -hcoco

(U -H o to -H ItJ (0 >1 CDjOCC

gtwc-Hxi^xitn > o :c ω +> (υΐ'με-Ημ,νΦΛ; tnctnci ο^--«θ(θίθο·ομι c-h-hc cn

ii! '3) Λ Ä W M ffl E Q « > W 3C

25 73238 -μ Φ 03 A!

O

rH

dl II + +

EH

e d

•H

r—I

o O 03 O -H -P ·· P -P (0 td •H -P Pj P 03 03 OP -P 03 >i d O Φ Ή >, +3 03 -P U3 Ή Λ Ή A! O C <Ö M d P -H >1 d Ό 03 C >1 03

>1 O Φ C -H

Ή x: O 03 Q) O

| +J -H Μ-l -P

CM C AI m -H -H <#> <#> H ro C P a

O d (—l d -P -H CM O

a; ~ -h οα τιογη a: -h -po d -h d a; -p Φ tn >poo .Η-p oja; a: d 030

d ro Ο Φ 10 to .H

ro-η t>d cp m;*; wai E-I — -P d

φ -H

03 g a: o o

rH + + + I I I I CO

d E-1 ro ω 03 U O σ >.o d Φ d

·· -H

Π5 g 03 >1 03 03

-P

•HO Pj

P i—I

Φ -H :r0 -P d d:OUOOUUUU :r0 >aooooooo > Φ 03 g^or-ocomo :r0 O ro :iC n n h1 Ί1 h1 in .h

« « h W

26 73238

Esimerkki 3 UAN 32 suspensiolannoiteformulat

Valmistettiin viskoosi UAN 32-liuos, joka sisälsi 0,25 % S-194:a, ja jonka koostumus oli seuraava: 5 S-194 0,25 % vesi 22,75 % urea 36,0 % ammoniumnitraatti 41,0 %

Viskoosista UAN 32-liuoksesta valmistettiin sitten 10 lannoitteita yksinkertaisesti lisäämällä diammoniumfosfaat-ti ja kaliumkloridijauheita.

N-P-K-analyysi

Aineosa 15-10-10 14-0-28 18-6-12

Viskoosi UAN 32 34,65 % 43,75 % 48,9 % 15 vesi 27,5 11,1 18,7 diammoniumfosfaatti 21,75 — 13,05 kaliumkloridi 16,1 45,15 19,35

Valmistettiin viskoosi UAN 32-liuos, joka sisälsi 0,15 % S-194:a, ja jonka koostumus oli seuraava: 20 S-194 0,15 % vesi 22,85 % urea 36,0 % ammoniumnitraatti 41,0 %

Viskooseista UAN 32-liuoksista valmistettiin sitten 25 lannoitteita yksinkertaisesti lisäämällä 10-34-0-polyfos-faattia ja kaliumkloridia.

N-P-K-analyysi

Aineosa 10-5-30 10-10-20 12-8-24 15-10-15 18-9-9 viskoosi 30 UAN 32 30,5 % 25,12 % 34,5 % 43,1 % 54,9 % vesi 6,4 13,1 3,1 3,3 4,1 PAP 14,7 29,4 23,6 29,4 26,5 KC1 48,4 32,3 38,7 24,2 14,5

Suspension laatu oli kohtalainen - hyvä kaikilla 35 koostumuksilla, ja sitä voitaisiin parantaa ilmaruiskutuksella kaupallisissa sovellutuksissa.

tl 27 73238

Esimerkki 4

Ammoniumpolyfosfaatti 10-34-0-formulat Suspensiot valmistettiin liuottamalla ensin S-194 saatavilla olevaan veteen, minkä jälkeen lisättiin UAN-5 liuos, sitten 10-34-0. KC1 lisättiin viimeiseksi.

N-P-K-analyysi

Aineosa 10-5-30 10-10-20 12-6-24 S-194 0,1 % 0,1 % 0,1 % vesi 6,3 13,0 6,9 10 UAN 28 30,5 25,2 36,6 10-34-0 14,7 29,5 17,7 KC1 48,4 32,3 38,7 12-12-12 15-15-10 20-4-8 15 0,1 % 0,15 % 0,15 % 14,9 11,15 7,85 30.3 43,1 63,3 35.3 29,4 11,8 19.4 16,2 12,9 20 Kaikilla näillä koostumuksilla saatiin aikaan hy viä suspensioita.

Esimerkki 5 28-28-0-formulat

Suspensiot valmistettiin liuottamalla ensin S-194 25 saatavilla olevaan veteen, minkä jälkeen lisättiin UAN-liuos, sitten 28-28-0. KC1 lisättiin viimeiseksi.

28 7 32 3 8 N-P-K-analyysi

Aineosa 15-13-13 10-10-10 15-10-151 S-194 0,1 % 0,1 % 0,1 % vesi 23,8 42,1 22,1 28-28-0 46,4 58,6 35,7 5 NH4OH (28 % NH3) 8,7 4,3 KC1 21,0 0 24,2 10-10-101 15-15-151 0,1 % 0,1 % 10 32,0 22,0 35,7 53,6 32,2 24,3 1 pH säädetty 6,5:ksi väkevöidyllä NH4OH:lla.

15 Kaikilla yllä mainituilla formuloilla saatiin hy viä suspensioita.

Esimerkki 6 Juoksevat pestisidit S-194:n leikkausvoimien keston kuvaamiseksi 0,25-20 %:sia liuoksia jauhettiin myllyllä Dymo-Mill Type KDL-

Pilot (Chicago Boiler Co.), jossa jauhatusväliaineena käytetään lasihelmiä, ja jossa korkeat leikkausvoimat ovat erityisen hajoittavia. 4:n S-194-näytteen ja ksantaani-kumin, juoksevissa pestisideissä tavallisimmin käytetyn 25 sakeutusaineen, viskositeetteja verrataan toisiinsa.

Taulukko 6-1

Kumin leikkausvoimien kesto

Dyno-Mill-jauhatus Näyte Alkuviskositeetti 5 min. 10 min.

30 (1) ksantaanikumi 1300 800 550 (2) S-194 (1) 950 1160 1050 (3) S-194 (2) 1450 3720 3920 (4) S-194 (3) 750 2850 3150 (5) S-194 (4) 1200 1750 1750 X Brookfield LVT-viskositeettimittari, akseli no. 2, 3 rpm.

35

Il 29 7 3238

Valmistettiin myös juokseva rikkiformula, jonka koostumus oli seuraava, ja jauhettiin sitä Dyno-myllyssä 5 min suspension leikkausvoimien keston osoittamiseksi. Stabiilisuutta alhaisilla leikkausnopeuksilla verrattiin 5 yhtä suuren ksantaanikumisakeutinpitoisuuden stabiilisuu-teen.

Virtaava rikkivalmiste

Rikkiä, teknillistä 52,0 %

Morwet B (natrium-n-butyylinaftaleeni- 10 sulfonaatti, Petrochemicals Co., Inc.) 1,5

R

Morwet d-425 (natriumnaftaleeni-form-aldehydikondensaatti) 2,0 etyleeniglykoli 5,0

Igepal CO-630 (nonyylifenoksipoly-15 (etyleenioksi)etanoli, GAF Corp.) 1,0

Dow Corning Antifoam A 0,2

Sakeutusaine 0,16 vesi 38,14

Pinta-aktiiviset aineet, dispergoivat aineet, gly-20 köli ja vaahdonestäjä dispergoitiin veteen, ja sitten lisättiin rikkijauhe ja sakeutusaine. Suspensioita jauhettiin sitten Dyno-myllyssä 5 min. Viskositeetit määritettiin ennen jauhatusta ja sen jälkeen Brookfield LVT-vis-kositeettimittarilla, akseli no. 3, 3 rpm.

25 Taulukko 6-2

Pestisidivalmisteen stabiilisuus Sakeutusaine Ennen jauhatusta Jauhatuksen jälkeen

Ksantaanikumi 4100 cP 2400 cP

S-194 2800 cP 3400 cP

30 Siten valmistetut suspensiot olivat kaadettavissa ja pysyviä kolme kuukautta ympäristön lämpötilassa ja 50°C:ssa.

30 73238

Esimerkki 7

Viskositeetin synergistisyys

Valmistettiin 0,5-% liuokset guarkumista, HP-guar-kumista, HECrsta ja S-194:sta. Valmistettiin myös 1:1-5 seokset näistä liuoksista. Viskositeetit mitattiin ja tulokset merkittiin käyrälle, josta määritettiin odotettavissa oleva viskositeetti. Verrattaessa odotettuja ja saatuja viskositeetteja toisiinsa havaittiin, että S-194 on synergistinen kaikkien kolmen kumin karissa.

10 Havaittu Odotettu visk. (cP) visk. (cP) 0,5 % S-194 337 0,5 % guarkumi 112 S-194/guarkumi (50/50) 395 190 15 0,5 % HP-guarkumi (Jaquar HP-80) 295 S-194/HP-guarkumi (50/50) 520 310 0,5 % HEC (Cellosize QP-15M) 110 S-194/HEC (50/50) 407 190

Claims

31 73238

1. Menetelmä heteropolysakkaridi S-194:n valmistamiseksi, joka koostuu pääasiallisesti hiilihydraatista ja si- 5 sälttää noin 10% O-asetyyliryhmiä, noin 9% glukuronihappoa, noin 10% proteiinia sekä neutraaleja sokereita glukoosia ja ramnoosia moolisuhteessa noin 4:1, tunnettu siitä, että viljellään Alcaligenes-sukuun kuuluvaa kantaa ATCC 31961 vesipitoisessa ravintoväliaineessa submersseissa aerobisissa 10 olosuhteissa assimiloituvan hiililähteen läsnäollessa ja eristetään mainittu heteropolysakkaridi S-194.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että assimiloituva hiililähde on hiilihydraatti.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että hiilihydraattina on 2-5% glukoosia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ravintoväliaine sisältää 3,0% glukoosia, 0,05% I^HPO^, 0,2% entsymaattisesti hajoitettua soija- 20 papujauhoa, 0,09% NH^NO^, 0,01% MgSO^.sen pH on 6,5-7,0 ja lämpötila 30°C.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ettei ravintoväliaine sisällä juuri lain- , ++ kaan Ca -ioneja.

6. Heteropolysakkaridi S-194, tunnettu siitä, että se koostuu pääasiallisesti hiilihydraatista ja sisältää noin 10% O-asetyyliryhmiä, noin 9% glukuronihappoa, noin 10% proteiinia sekä neutraaleja sokereita glukoosia ja ramnoosia moolisuhteessa noin 4:1, ja että se on valmistettu viljele-30 mällä Alcaligenes-sukuun kuuluvaa kantaa ATCC 31961 vesipitoisessa ravintoväliaineessa submersseissa aerobisissa olosuhteissa assimiloituvan hiililähteen läsnäollessa ja eristämällä mainittu heteropolysakkaridi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen heteropolysakkaridi, 35 tunnettu siitä, että se on valmistettu fermentointi-väliaineessa, joka ei sisällä juuri lainkaan Ca++-ioneja. 32 73238