CN113784630A - 益生元组合物及其用途 - Google Patents

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于海隆
J.P.阿布杜
N.M.曼朱纳塔
T.A.塔拉谢克
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Abstract

本文中公开包含鞘胺醇胶的可摄取组合物及其作为益生元的用途。

Description

益生元组合物及其用途
相关申请
本申请是2020年1月15日以PCT国际专利申请提交的并且主张2019年1月18日申请的美国临时申请案第62/794,452号及2019年7月1日申请的美国临时申请案第62/869,248号的优先权，其公开内容在此通过引用完整并入本文。
技术领域
本文中公开包含鞘胺醇胶的可摄取组合物及其作为益生元(prebiotic)的用途。
背景技术
人类胃肠道是已显示为非常稳定的高度复杂微生物生态系统。
(Zoetendal(1998)。)已使用许多不同方法来以有益于宿主健康的方式调节肠道微生物群。(参见例如Bielecka(2002)及Steer(2000)。)这些不同方法包括向食品中添加活的微生物(益生菌(probiotic))、添加食品成分或膳食纤维以在宿主内选择性刺激有益细菌(益生元)、及益生菌与益生元两者的组合(共生质(synbiotic))。
益生元为非可消化基质，其由赋予健康益处的宿主微生物选择性使用。(Gibson(2017)。)肠道中的益生元效应可基于以下评估：促进健康的细菌(诸如乳杆菌及双歧杆菌)的生长、肠病原体的减少、及健康相关细菌代谢物产生的增加或减少。先前研究中已提出及/或证实所选益生元(诸如菊糖、果寡糖、半乳寡糖、乳酮糖、及阿拉伯寡糖)的益生元/双歧杆菌促进(bifidogenic)性质。(参见例如Guimaraes(2018)、Karltohn-Senaye(2013)、Patel(2013)、Saavedra(2002)、Tuohy(2001)、Tuohy(2002)、US8313789B2、US20100092440A1及WO2004002240A2。)
一般而言，鞘胺醇胶(sphingan)为多糖，其包含以下大体上如[(→3)Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha(α1→)]n所描绘的经取代或未经取代的四聚糖。已知的鞘胺醇胶包括例如结冷胶(gellan)(S-60)、威兰胶(welan)(S-130)、鼠李糖胶(rhamsan)(S-194)、及迪特胶(diutan)(S-657)。
结冷胶(亦称gellan gum或S-60)由物种伊乐鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaselodea)(以前伊乐假单胞菌(Pseudomonas elodea))的菌株，例如菌株ATCC31461产生。(参见例如Morrison(2016)、Sworn(2009)及US4326053A。)结冷胶的常见形式包括高酰基(亦称为天然)未澄清(例如，
Figure BDA0003249826240000021
LT100结冷胶)、低酰基未澄清(例如，
Figure BDA0003249826240000022
LT结冷胶)及低酰基澄清(例如，
Figure BDA0003249826240000023
及
Figure BDA0003249826240000024
F结冷胶)。(Sworn(2009)。)数种专用级别亦可用，例如高酰基、无PHB、澄清(例如，
Figure BDA0003249826240000025
HT结冷胶)及低酰基澄清(二次沉淀)(例如，GELRITETM MK结冷胶)。天然或高酰基形式的结冷胶在(1→3)Glc单元上包括两个酰基取代基(O6处的乙酸盐/酯及O2处的甘油酸盐/酯)，且平均起来，每四聚体存在一个甘油酸盐/酯且每两个四聚体存在一个乙酸盐/酯。(Kuo(1986)。)在低酰基结冷胶中，不存在甘油酸盐/酯及乙酸盐/酯。结冷胶亦可经产生而具有中等甘油酸盐/酯及乙酸盐/酯含量。具有降低的甘油酸盐/酯及乙酸盐/酯含量的商业产品为
Figure BDA0003249826240000026
DGA结冷胶。
结冷胶一般充当某些可摄取产品中的胶凝或悬浮剂，且在0.02至0.5％w/v范围内的水平下存在。(参见例如Fallourd(2009)、Morrison(2016)、Sworn(2009)、US6602996B1、US6663911B2、US5342626A、US8513408B2及US20080008814A1。)在其批准为食品添加剂之前，研究评估在向大鼠及人类施用时结冷胶的安全性。(参见例如Anderson(1988)及Edwards(1995)；亦参见Anderson(1990)。)举例而言，Edwards(1995)描述饲喂韦斯大鼠(Wistar rat)包括50g/kg/d结冷胶的饮食28天。(作为参考，大鼠中50g/kg对应于约8g/kg的人类当量。(参见例如FDAGuidance(2005)。)引起关注地，Edwards(1995)推断结冷胶对盲肠或粪便短链脂肪酸(SCFA，诸如乙酸、丙酸及丁酸)不具有一致影响。此外，Anderson(1988)描述一项研究，其中人类志愿者根据175mg/kg/d持续7天，后接200mg/kg/d持续另外16天的固定给药时程摄取一定量的结冷胶。(对于60kg至75kg的人类重量范围，175mg/kg对应于10.5至13g的范围，而200mg/kg对应于12g至15g的范围。)基于其中所呈现的结果，Anderson(1988)推断摄取结冷胶不引起不利膳食效应，亦不引起不利生理效应。此外，Anderson(1988)推断结冷胶展现粪便膨化效应。与由Anderson(1988)观测到的粪便膨化效应一致，后续研究显示结冷胶减少猫的腹泻。(US9028861B2。)参考Tetsuguchi(1997)，Li(2019)在无解释或证明的情况下提及结冷胶寡糖据报导具有肠益生元效应，不过Tetsuguchi(1997)清楚地未评估结冷胶寡糖的肠益生元效应。迄今为止，无研究确定地证明结冷胶或衍生自结冷胶的寡糖是否充当益生元剂。
威兰胶(亦称welan gum或S-130)由鞘氨醇单胞菌属种(例如，ATCC31555)产生。(US4342866A及US5175277A。)威兰胶(1→4)Glc单元的大致三分之二在O3处经α-L-鼠李吡喃糖苷基(亦即，Rha(α1→))取代，而威兰胶(1→4)Glc单元的其余部分经α-L-甘露吡喃糖苷基(亦即，Man(α1→))取代。(Stankowski(1992)。)另外，威兰胶的(1→3)Glc单元可在O2处经乙酰基取代。(Stankowski(1992)。)
鼠李糖胶(亦称rhamsan gum或S-194)由鞘氨醇单胞菌属种(例如，ATCC31961)产生。(US4401760A。)鼠李糖胶在(1→3)Glc单元的O6位置处经D-Glc(β1→6)-D-Glc(α1→)取代。(Jansson(1986)。)鼠李糖胶每重复单元含有一个O-乙酰基，遍及二级位置而分布。(Jansson(1986)。)
迪特胶(亦称diutan gum或S-657)由鞘氨醇单胞菌属种(例如，ATCC53159)产生。(US5175278A及US20130189748A1。)迪特胶的(1→4)Glc单元在O3处经Rha(α1→4)-Rha(α1→)取代，在O6处经乙酰基取代，且在可变程度上在(1→3)Glc单元的O2及/或O6位置处经乙酰基取代。(Diltz(2001)。)
发明内容
本文中公开包含鞘胺醇胶的可摄取组合物及其作为益生元的用途。
缩写
下本包括大量缩写术语。本文中所公开的所选术语的缩写在以下鉴定。
A：供体A(女性，28岁)
Ac：乙酸盐/酯(Acetate)
B：供体B(女性，41岁)
b-SCFA：分支链短链脂肪酸(例如，异丁酸、异戊酸、及异己酸)
C：供体C(女性，34岁)
C1：对照期1
C2：对照期2
CON(ave)：对照期1及2的平均值浓度
CD：克罗恩氏病
DC：远端结肠反应器
DP：聚合度
Glc：D-葡萄吡喃糖苷基
GlcA：D-葡萄吡喃糖苷基糖醛酸
Glyc：L-甘油酸盐/酯(L-Glycerate)
GPR：G蛋白偶联受体
HA：高酰基
HA/LA：高酰基或低酰基
IBD：炎性肠道疾病
IBS：肠易激综合征
IFN：干扰素
IL：白介素
LA：低酰基
LCS：长链鞘胺醇胶
LPS：脂多糖
MAMP：微生物相关分子样式(microbial associated molecular pattern)
Man：L-甘露吡喃糖苷基
mM：毫摩尔(milli-molar)(亦即，每升毫摩尔数)
MN：数量平均分子量
MW：重量平均分子量
NaB：丁酸钠
OTU：操作分类单元(Operational Taxonomic Unit)
PHB：聚羟基丁酸酯
PC：近端结肠
PRR：样式辨识受体
Rha：L-鼠李吡喃糖苷基
ROS：活性含氧物(Reactive Oxygen Species)
SCFA：短链脂肪酸(例如，乙酸、丙酸、及丁酸)
SHIME：人类肠微生物生态系统的模拟器(Simulator of the Human IntestinalMicrobial Ecosystem)
SOS：鞘胺醇胶寡糖
SPS：鞘胺醇胶多糖
TEER：跨上皮电阻
四聚体：[Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha]、Glc,GlcA,Glc,Rha或Glc2,GlcA,Rha
八聚体：[Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha]2Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha或Glc4,GlcA2,Rha2
SEC：大小排阻层析图
TGF：转化生长因子
TLR：toll样受体
TNF：肿瘤坏死因子
TR1：处理期1
TR2：处理期2
TR3：处理期3
TRT(ave)：处理期1、2及3的平均浓度值
UC：溃疡性结肠炎
附图说明
图1a.经酸(SN9，实线)及酶处理(SN18，虚线)的衍生自高酰基结冷胶的鞘胺醇胶多糖及寡糖的大小排阻层析图，其显示普鲁兰(Pullulan)分子量标准洗脱时间(即，>50kDa(6.5分钟，实心正方形(■))、12kDa(8.8分钟，实心圆形(●))、5kDa(9.3分钟，实心三角形(▲))、1kDa(10min，空心正方形(□))、342Da(10.65分钟，空心圆形(○))及180Da(11.15分钟，空心三角形(△)))。
图1b.经酸(SN10，实线)及酶处理(SN17，虚线)的衍生自低酰基结冷胶的鞘胺醇胶多糖及寡糖的大小排阻层析图，其显示普鲁兰分子量标准洗脱时间(即，>50kDa(6.5分钟，实心正方形(■))、12kDa(8.8分钟，实心圆形(●))、5kDa(9.3分钟，实心三角形(▲))、1kDa(10min，空心正方形(□))、342Da(10.65分钟，空心圆形(○))及180Da(11.15分钟，空心三角形(△)))。
图2a.对于三个不同供体(A、B及C)，近端结肠(PC)反应器在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内的平均乙酸产生(mM)，其中*指示相对于之前时期的统计显著差异，而不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图2b.对于三个不同供体(A、B及C)，远端结肠(DC)反应器在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内的平均乙酸产生(mM)，其中*指示相对于之前时期的统计显著差异，而不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图3a.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内近端结肠(PC)反应器中的平均丙酸产生(mM)，其中*指示相对于之前时期的统计显著差异，而不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图3b.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内远端结肠(DC)反应器中的平均丙酸产生(mM)，其中*指示相对于之前时期的统计显著差异，而不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图4a.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内近端结肠(PC)反应器中的平均丁酸产生(mM)，其中*指示相对于之前时期的统计显著差异，而不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图4b.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内远端结肠(DC)反应器中的平均丁酸产生(mM)，其中*指示相对于之前时期的统计显著差异，而不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图5a.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内近端结肠(PC)反应器中的平均乳酸产生(mM)，其中不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图5b.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(n＝9)期内远端结肠(DC)反应器中的平均乳酸产生(mM)，其中不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图6a.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内近端结肠(PC)反应器中的平均铵产生(mg/L)，其中不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图6b.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内远端结肠(DC)反应器中的平均铵产生(mg/L)，其中不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图7a.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内近端结肠(PC)反应器中的平均分支链SCFA产生(mM)，其中不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图7b.对于三个不同供体(A、B及C)，在对照(CON(ave)，n＝6)及处理(TRT(ave)，n＝9)期内远端结肠(DC)反应器中的平均分支链SCFA产生(mM)，其中*指示相对于之前时期的统计显著差异，而不同字母指示不同处理之间的统计差异；p<0.05。
图8.对于三个不同人类供体(n＝1)，使用结冷胶在对照(C1及C2)及处理(TR1、TR2及TR3)期期间不同时间点时，SHIME的近端结肠(PC)或远端结肠(DC)的腔及粘液的倒数辛普森多样性指数(Reciprocal Simpson Diversity Index)。阴影强度指示绝对多样性指数，其对于三个不同供体中的各者(亦即，每一列内)标准化。
图9.对于三个不同人类供体(n＝1)，使用结冷胶在对照(C1及C2)及处理(TR1、TR2及TR3)期期间不同时间点时，SHIME的近端结肠(PC)或远端结肠(DC)反应器的腔及粘液中优势门的丰度(％)。注意，一个样本为明显离群值，且因此自此对照样本的分析移除，亦即，在第二对照周(C2)期间供体A的PC中的粘膜样本。
图10.对于三个不同人类供体(n＝1)，使用结冷胶在对照(C1及C2)及处理(TR1、TR2及TR3)期期间不同时间点时，SHIME的近端结肠(PC)反应器的腔中属于特定门的不同科的丰度(％)。阴影强度指示绝对丰度，其对于不同科中的各者(亦即，每一列内)标准化。阴影强度指示绝对丰度，其对于不同科中的各者(亦即，每一列内)标准化。
图11.对于三个不同人类供体(n＝1)，使用结冷胶在对照(C1及C2)及处理(TR1、TR2及TR3)期期间不同时间点时，SHIME的远端结肠(DC)反应器的腔中属于特定门的不同科的丰度(％)。阴影强度指示绝对丰度，其对于不同科中的各者(亦即，每一列内)标准化。
图12.对于三个不同人类供体(n＝1)，使用结冷胶在对照(C1及C2)及处理(TR1、TR2及TR3)期期间不同时间点时，SHIME的近端结肠(PC)反应器的粘液中属于特定门的不同科的丰度(％)。阴影强度指示绝对丰度，其对于不同科中的各者(亦即，每一列内)标准化。作为备注，一个样本为明显离群值，且因此自此对照样本的分析移除，亦即，在第二对照周(C2)期间供体A的PC中的粘膜样本。
图13.对于三个不同人类供体(n＝1)，使用结冷胶在对照(C1及C2)及处理(TR1、TR2及TR3)期期间不同时间点时，SHIME的远端结肠(DC)反应器的粘液中属于特定门的不同科的丰度(％)。阴影强度指示绝对丰度，其对于不同科中的各者(亦即，每一列内)标准化。
图14.Caco-2及THP1细胞共培养的示意图。Caco-2细胞接种于半透膜上，该半透膜置放于接种有THP1细胞的孔的顶部上。这产生顶端(apical；AP)及底外侧(basolateral；BL)隔室。Caco-2细胞单层产生对大分子的屏障，且允许藉由以下通过：小分子在细胞间间隙之间的被动运输，及微分子及大分子穿过细胞膜的主动输送。两种细胞类型的共培养允许接触Caco-2细胞的腔内容物与接触免疫细胞(THP1)的肠周围(peri-intestinal)内容物之间的间接串扰(cross-talk)。另外，由上皮细胞使用/转化的代谢物可调节免疫细胞反应，且反之亦然。
图15.在肠上皮屏障损伤后活化的信号传导级联，导致腔内容物突破肠细胞壁。IFN-γ：干扰素γ；IL：白介素；MCP-1：单核细胞趋化蛋白1；ROS：活性含氧物；TGF-β：转化生长因子β；TH：辅助T细胞；TNF-α：肿瘤坏死因子α；Treg：调节T细胞。
图16.导致发炎的LPS及TNF-α信号传导路径。AP-1：活化蛋白1(转录因子)；IL：白介素，LPS：脂多糖；NF-κB：核因子κB(转录因子)；TLR4：toll样受体4(LPS受体)；TNF-α：肿瘤坏死因子α；TNFR：TNF-α受体。
图17.在对照测试CM及NaB上的跨上皮电阻(TEER)。TEER在Caco-2/THP1-BlueTM共培养物处理后24小时量测，且各24小时值相对于其对应0小时值标准化且显示为初始值的百分比。点线代表100％(初始值)。数据以均值±SEM形式绘制。(*)代表CM与NaB之间的统计显著差异。(****)＝p<0.0001。CM：完全培养基；NaB：丁酸钠。
图18.对照测试LPS-、LPS+、LPS+HC及LPS+NaB中THP1-BlueTM细胞的底外侧NF-κB活性。在顶侧用NaB或完全培养基预处理24小时之后，在底外侧进行Caco-2/THP1-BlueTM共培养物的6小时LPS处理之后量测NF-κB活性。数据以均值±SEM形式绘制。(*)代表与LPS+相比的统计显著差异。(*)＝p<0.05；(****)＝p<0.0001。LPS-：经完全培养基(无LPS)处理的细胞；LPS+：经LPS处理的细胞；HC：氢化可的松；NaB：丁酸钠。
图19.对照测试LPS-、LPS+、LPS+HC及LPS+NaB中IL-6(A)及IL-10(B)非底外侧分泌。在顶侧用NaB或完全培养基预处理24小时之后，在底外侧进行Caco-2/THP1-BlueTM共培养物的6小时LPS处理之后量测细胞因子。数据以均值±SEM形式绘制。(*)代表与LPS+相比的统计显著差异。(***)＝p<0.001；(****)＝p<0.0001。LPS-：经完全培养基(无LPS)处理的细胞；LPS+：经LPS处理的细胞；HC：氢化可的松；NaB：丁酸钠。
图20.对照测试LPS-、LPS+、LPS+HC及LPS+NaB中IL-1β(A)、IL-8(B)、CXCL10(C)、TNF-α(D)及MCP-1(E)的底外侧分泌。在顶侧用NaB或完全培养基预处理24小时之后，在底外侧进行Caco-2/THP1-BlueTM共培养物的6小时LPS处理之后量测细胞因子。数据以均值±SEM形式绘制。(*)代表与LPS+相比的统计显著差异。(*)＝p<0.05；(**)＝p<0.01；(***)＝p<0.001；(****)＝p<0.0001。LPS-：经完全培养基(无LPS)处理的细胞；LPS+：经LPS处理的细胞；HC：氢化可的松；NaB：丁酸钠。
图21.SHIME样本对Caco-2/THP1-BlueTM共培养物的跨上皮电阻(TEER)的影响。结果对三个不同供体分别地显示(A)且以三个供体的均值形式显示(B)。TEER在共培养物处理后24小时量测，且各24小时值相对于其对应0小时值标准化且显示为初始值的百分比。灰色点线代表100％(初始值)。点线对应于实验对照CM(完全培养基)。数据以均值±SEM形式绘制。在三个不同供体的对照与处理之间未发现显著差异。PC：近端结肠样本；DC：远端结肠样本。
图22.SHIME样本对THP-1-BlueTM细胞的NF-κB活性的影响。结果对三个不同供体分别地显示(A)且以三个供体之均值形式显示(B)。在顶侧用SHIME样本预处理24小时之后，在对Caco-2/THP1-BlueTM共培养物的底外侧进行LPS处理之后6小时量测NF-κB活性水平。点线对应于实验对照LPS+。数据以均值±SEM形式绘制。在三个不同供体的对照与处理之间未发现显著差异。PC：近端结肠样本；DC：远端结肠样本。
图23.SHIME样本对IL-6分泌(A及B)及IL-10分泌(C及D)的影响。结果对三个不同供体分别地显示(A及C)且以三个供体的均值形式显示(B及D)。在顶侧用SHIME样本预处理24小时之后，在对Caco-2/THP1-BlueTM共培养物的底外侧进行LPS处理之后6小时量测细胞因子水平。点线对应于实验对照LPS+。数据以均值±SEM形式绘制。(*)代表与对照相比的统计显著差异。(*)＝p<0.05。PC：近端结肠样本；DC：远端结肠样本。
图24.SHIME样本对IL-1β分泌(A+B)及TNF-α分泌(C+D)的影响。结果对三个不同供体分别地显示(A-C)且以三个供体的均值形式显示(B-D)。在顶侧用SHIME样本预处理24小时之后，在对Caco-2/THP1-BlueTM共培养物的底外侧进行LPS处理之后6小时量测细胞因子水平。点线对应于实验对照LPS+。数据以均值±SEM形式绘制。(*)代表与对照相比的统计显著差异。(****)＝p<0.0001，PC：近端结肠样本；DC：远端结肠样本。
图25.SHIME样本对IL-8分泌(A+B)、CXCL10分泌(C+D)及MCP-1分泌(E+F)的影响。结果对三个不同供体分别地显示(A-C-E)且以三个供体的均值形式显示(B-D-F)。在顶侧用SHIME样本预处理24小时之后，在对Caco-2/THP1-BlueTM共培养物的底外侧进行LPS处理之后6小时量测细胞因子水平。点线对应于实验对照LPS+。数据以均值±SEM形式绘制。在三个不同供体之对照与处理之间未发现显著差异。PC：近端结肠样本；DC：远端结肠样本。
定义
如本文所用，术语“鞘胺醇胶”指高酰基鞘胺醇胶、中酰基鞘胺醇胶、低酰基鞘胺醇胶、高酰基鞘胺醇胶多糖、中酰基鞘胺醇胶多糖、低酰基鞘胺醇胶多糖、高酰基鞘胺醇胶寡糖、中酰基鞘胺醇胶寡糖、低酰基鞘胺醇胶寡糖、或其组合。
如本文所用，术语“高酰基”(或“HA”)指包含酰基(例如，乙酰基及甘油基)的鞘胺醇胶。高酰基鞘胺醇胶包括例如HA结冷胶、HA威兰胶、HA鼠李糖胶、HA迪特胶等。
如本文所用，术语“中酰基”(或“IA”)指一种鞘胺醇胶，其中酰基含量小于高酰基鞘胺醇胶，但大于低酰基鞘胺醇胶的酰基含量。中酰基鞘胺醇胶包括例如IA结冷胶、IA威兰胶、IA鼠李糖胶、IA迪特胶等。
如本文所用，术语“低酰基”(或“LA”)指一种鞘胺醇胶，其中(多个)酰基已基本上移除。低酰基鞘胺醇胶包括例如LA结冷胶、LA威兰胶、LA鼠李糖胶、LA迪特胶等。
天然鞘胺醇胶可包括例如结冷胶(S-60)、威兰胶(S-130)、鼠李糖胶(S-194)、迪特胶(S-657)、S-88、S-198及S-7，包含大体上如[(→3)Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha(α1→)]n所描绘之经取代或未经取代之四聚糖(“四聚体”)，其中Glc及GlcA为D-糖，而Rha为L-糖，且适用时Man为L-糖。以下描绘所选鞘胺醇胶之化学结构，显示个别单糖之缩写术语(例如，(1→3)Glc、(1→4)GlcA、(1→4)Glc及(1→4)Rha))。
Figure BDA0003249826240000111
a鼠李糖胶每四聚体含有大致一个O-乙酰基，遍及二级位置而分布。
如本文所用，术语“M”指生理学上可接受的阳离子，包括例如质子(H+)、钠离子(Na+)、钾离子(K+)、钙离子(Ca2+)、镁离子(Mg2+)、或其组合。
“n”值指整数或小数且指可经取代或未经取代的四聚单元的数目。应理解，某些天然鞘胺醇胶具有可与天然鞘胺醇胶(例如，MW≈2.5×106且MN≈2.2×106的天然结冷胶)的分子量相关的n值。(US6242035B1)
如本文所用，表述“聚合度”或DP指多糖或寡糖链中单糖单元的数目。举例而言，参考以上描绘的化学结构，在n为四时，DP为十六。
如本文所用，表述“鞘胺醇胶多糖”(或“SPS”)指DP大于30且DP小于天然鞘胺醇胶中所发现的DP的高/低酰基鞘胺醇胶。应理解，获自高/中/低酰基鞘胺醇胶的SPS可包含具有不同DP的复数种多糖。
如本文所用，表述“鞘胺醇胶寡糖”(或“SOS”)指DP大于或等于2且小于或等于30(亦即，2≥DP≤30)的高/低酰基鞘胺醇胶。应理解，获自高/中/低酰基鞘胺醇胶(或HA/IA/LA鞘胺醇胶)的SOS可包含复数种寡糖。
具体实施方式
本文中所公开的实施方案大体上关于可摄取组合物、可摄取组合物及其用途、使用可摄取组合物的方法、用于制备鞘胺醇胶寡糖的过程及藉由用于制备鞘胺醇胶寡糖的该过程制备的鞘胺醇胶寡糖。
第一实施方案关于一种可摄取组合物，其包含益生元有效量的鞘胺醇胶。
鞘胺醇胶的益生元有效量可包含约1g至约10g及其间的所有值，例如约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8或约9.9。
在第一实施方案的一个方面，鞘胺醇胶的量选自约1g至约10g、约1g至约9g、约1g至约8g、约1g至约7g、约1g至约6g、约1g至约5g、约1g至约4g、约1g至约3g或约2g。
第一实施方案的组合物可包含HA/IA/LA鞘胺醇胶，诸如HA结冷胶、IA结冷胶、LA结冷胶、HA威兰胶、IA威兰胶、LA威兰胶、HA鼠李糖胶、IA鼠李糖胶、LA鼠李糖胶、HA迪特胶、IA迪特胶、LA迪特胶、S-88、S-198、S-7、或其组合。
第一实施方案的组合物可包含HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖。
如本文中更详细地解释，HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖可使用例如包含如例如第十实施方案中所描述的高压均质化的过程，获自HA/LA鞘胺醇胶。例示性HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖包括(但不限于)：获自高酰基结冷胶(例如，
Figure BDA0003249826240000121
LT100结冷胶及
Figure BDA0003249826240000122
HT结冷胶)的高酰基结冷胶多糖、获自中酰基结冷胶(例如，
Figure BDA0003249826240000123
DGA)的中酰基结冷胶多糖、获自低酰基结冷胶(例如，
Figure BDA0003249826240000125
LT结冷胶、
Figure BDA0003249826240000124
结冷胶、
Figure BDA0003249826240000131
F结冷胶及GELRITETM MK结冷胶)的低酰基结冷胶多糖、获自高/中/低酰基威兰胶的高/中/低酰基威兰胶多糖、获自高/中/低酰基迪特胶的高/中/低酰基迪特胶多糖及获自高/中/低酰基鼠李糖胶的高/中/低酰基鼠李糖胶多糖。
第一实施方案的组合物可包含衍生自天然HA/IA/LA鞘胺醇胶或HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖的HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖。在一个方面，第一实施方案的组合物可包含HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖，其衍生自天然HA/IA/LA鞘胺醇胶或如藉由大小排阻层析所测定，分子量为约0.3kDa至12kDa的HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖。在另一个方面，第一实施方案的组合物可包含HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖，其衍生自天然HA/IA/LA鞘胺醇胶或如藉由大小排阻层析所测定，分子量为约1kDa的HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖。
如本文中更详细地解释，HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖可获自天然HA/IA/LA鞘胺醇胶或HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖，例如一种过程，其包含水解天然HA/IA/LA鞘胺醇胶或HA/IA/LA多糖的糖苷键及使水解组合物经历超过滤、大小排阻层析、沉淀、离心、或其组合，如例如第十实施方案中所描述。例示性HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖包括(但不限于)：
(i)包含以下(或由以下组成)的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x为4至约25)、Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x为4至约25)、或其组合；
(ii)包含以下(或由以下组成)的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、含乙酸盐/酯及/或甘油酸盐/酯的四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、含乙酸盐/酯及/或甘油酸盐/酯的八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc,GlcA、Glc,Rha、或其组合；
(iii)包含以下(或由以下组成)的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、五聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc)、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Glc,GlcA、或其组合；
(iv)包含以下(或由以下组成)的组合物：Glc(Glc-Glc),GlcA、Glc(Glc-Glc)、GlcA,Glc、Glc,Glc、或其组合；
(v)包含以下(或由以下组成)的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、GlcA、Glc、(Rha-Rha)、Glc,(Rha-Rha),Rha、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc、GlcA,Glc；
(vi)包含以下(或由以下组成)的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x为4至约25)、或其组合；
(vii)包含以下(或由以下组成)的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Rha、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x为4至约25)；
(viii)包含以下(或由以下组成)的组合物：Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,Rha、或其组合；
(ix)包含以下(或由以下组成)的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rhaa、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x为4至约25)；
(x)包含第1-18号样本中的任一者(或由其组成)的组合物；或
(xi)包含第9、10、17及18号样本中的任一者(或由其组成)的组合物。
如上文所陈述，某些鞘胺醇胶可经酰基、单糖或二糖侧链取代(例如，迪特胶的(1→4)Glc在O3处经Rha(α1→4)-Rha(αl→)侧链取代)。具有糖侧链的经取代寡糖由括号标识，例如GlcA,Glc,(Rha-Rha)及Glc,(Rha-Rha),Rha。
而且，提及HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖应理解为意指例示性HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖中的任一者、或其组合。
组合物可呈液体、半固体或固体形式。组合物可呈谷类、点心棒形式或其他可摄取形式。组合物可基于水果，诸如果汁或冰沙；或基于乳制品，诸如牛乳、冰淇淋或酸乳饮料。组合物可适合地呈饮料形式。术语“饮料”涵盖立即可饮用液体形式以及浓缩液及供溶解的粉末配制物。立即可饮用饮料可为不充气或碳酸化的。
组合物可为未增甜或用糖或强甜味剂增甜的，强甜味剂诸如三氯蔗糖(sucralose)、甘草酸铵、乙酰舒泛钾(acesulfame-K)、阿斯巴甜、糖精、糖精盐(例如，钠、钾、钙等)、环己胺磺酸钠(sodium cyclamate)、甜菊(stevia)、其他非糖甜味剂及其混合物。组合物亦可含有其他习知添加剂，诸如调味剂、着色剂、稳定剂等。
组合物可以粉末状形式储存于可包含使用说明书的密封容器或包装中。
可替代地，组合物可配制为锭剂或胶囊产品，其可包含除鞘胺醇胶以外的其他可接受赋形剂，诸如结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、助滑剂、流动剂、防结块剂、吸附剂、防腐剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、包衣剂等。锭剂可根据发明所属技术领域中熟知的方法包衣。赋形剂的实例包括(但不限于)碱土金属碳酸盐(例如，碳酸镁、碳酸钙等)；交联聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮(crospovidone))及交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素钠(croscarmellose sodium)))；脂肪酸；烟雾状二氧化硅(fumed silica)；润滑剂(例如，硬脂酸、硬脂酸甘油酯、硬脂酸镁)；pH调节剂(例如，酸(例如，氢氯酸)及碱(例如，氢氧化钠))；植物纤维(例如，玉米蛋白质玉米醇溶蛋白)；多糖及其衍生物(例如，淀粉、纤维素或改质纤维素，诸如微晶纤维素，及纤维素醚，诸如羟丙基纤维素及羟丙基甲基纤维素)；蛋白质(例如，明胶)；糖及其衍生物(例如，二糖，例如蔗糖、乳糖等)；虫胶；二氧化硅；淀粉羟乙酸钠；糖醇(例如，异麦芽酮糖醇(isomalt)、木糖醇、山梨糖醇及麦芽糖醇)；合成聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮及聚乙二醇)；滑石；及蜡。
组合物亦可包含益生菌及额外益生元。
益生菌的实例包括(但不限于)鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)HN019、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(包括菌株35624)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、两歧双歧杆菌(Bifodobacterium bifidum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)KS-13、凝结杆菌(Bacillus coagulans)(GBI-30，6086)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(DE111)，其各自可单独使用、或其组合。
额外益生元的实例包括(但不限于)菊糖、果寡糖、半乳寡糖、瓜尔胶、刺云实胶(tara gum)、黄原胶、黄原胶多糖(xanthanic polysaccharide)、黄原胶寡糖、魔芋胶(konjac gum)、加拉亚胶(karaya gum)、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)、乳果糖、蚤草(psyllium)、果胶、果胶多糖(pectinic polysaccharide)、果胶寡糖、黄蓍胶、阿拉伯胶、角叉菜胶及其类似物。
本文中所公开的结果显示鞘胺醇胶(A)促进人类结肠中的有益细菌生长；(B)降低人类结肠中的丙酸水平及/或提高人类结肠中的丁酸水平；(C)改善人类结肠中的肠屏障完整性；及/或(D)降低人类结肠中的TNF-α水平及/或IL-8水平。因此，本文中所公开的实施方案关于用于以下的可摄取组合物：
(A)促进哺乳动物结肠中的有益细菌生长，该组合物包含有益细菌生长有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质(第二实施方案)；
(B)降低哺乳动物结肠中的丙酸水平及/或提高哺乳动物结肠中的丁酸水平，该组合物包含有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质(第三实施方案)；
(C)改善哺乳动物结肠中的肠屏障完整性，该组合物包含肠屏障完整性有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质(第四实施方案)；
(D)降低哺乳动物结肠中的TNF-α水平及/或IL-8水平，该组合物包含TNF-α及/或IL-8降低有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质(第五实施方案)；
如与第二、第三、第四及第五实施方案中的任一者相关，预期量的鞘胺醇胶(亦即，(i)有益细菌生长有效量的鞘胺醇胶(第二实施方案)，(ii)有效量的鞘胺醇胶(第三实施方案)，(iii)肠屏障完整性有效量的鞘胺醇胶(第四实施方案)，及(iv)TNF-α及/或IL-8降低有效量的鞘胺醇胶(第五实施方案))可包含约1g至约10g的鞘胺醇胶，及其间的所有值，例如约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8及约9.9g。
在第二、第三、第四及第五实施方案中的任一者的一个方面，哺乳动物为例如人类、犬、猫、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、乳牛、野牛、猪、绵羊、马、山羊、鹿、骆马(llama)、羊驼及其类似物。
在第二、第三、第四及第五实施方案中的任一者的一个方面，鞘胺醇胶的量选自约1g至约10g、约1g至约9g、约1g至约8g、约1g至约7g、约1g至约6g、约1g至约5g、约1g至约4g、约1g至约3g或约2g。
而且，在第二、第三、第四及第五实施方案中的任一者的一个方面，鞘胺醇胶的量足以在结肠中达成有效鞘胺醇胶浓度，其中该鞘胺醇胶结肠浓度在约1mg/mL至约10mg/mL范围内及其间的所有值，例如约1.5mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约5.5mg/mL、约6mg/mL、约6.5mg/mL、约7mg/mL、约7.5mg/mL、约8mg/mL、约8.5mg/mL、约9mg/mL或9.5mg/mL。
第二、第三、第四及第五实施方案中的任一者的组合物可包含天然HA/IA/LA鞘胺醇胶、HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖、HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖中的任一者、或其组合，且可选地进一步包含如第一实施方案中所描述的益生菌或额外益生元。
另外，本文中所公开的实施方案关于用于制备药物或膳食补充剂的方法，或用于制备药物或膳食补充剂的用途：
(A)促进哺乳动物结肠中的有益细菌生长，该方法包含按有效时程摄取有益细菌生长有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质(第六实施方案)；
(B)降低哺乳动物结肠中的丙酸水平及/或提高哺乳动物结肠中的丁酸水平，该方法包含：按有效时程摄取包含有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质的组合物(第七实施方案)；
(C)改善哺乳动物结肠中的肠屏障完整性，该方法包含：按有效时程摄取包含肠屏障完整性有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质的组合物(第八实施方案)；
(D)降低哺乳动物结肠中的TNF-α水平及/或IL-8水平，该方法包含：按有效时程摄取包含TNF-α及/或IL-8降低有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质的组合物(第九实施方案)；
(E)单独的第一、第二、第三、第四及第五实施方案中的任一者的组合物，或该组合物与如本文中所描述的益生菌或额外益生元的组合的用途，其用于制备用于以下的组合物：(A)促进哺乳动物结肠中的有益细菌生长(第十实施方案)，(B)降低哺乳动物结肠中的丙酸水平及/或提高哺乳动物结肠中的丁酸水平(第十一实施方案)，(iii)改善哺乳动物结肠中的肠屏障完整性(第十二实施方案)，或(iv)降低哺乳动物结肠中的TNF-α水平及/或IL-8水平(第十三实施方案)；或
(F)在第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二及第十三实施方案中的任一者的一个方面，哺乳动物为例如人类、犬、猫、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、乳牛、野牛、猪、绵羊、马、山羊、鹿、骆马、羊驼及其类似物。
对于本文中所描述且要求保护的这些及其他实施方案而言，摄取的有效时程可包括例如(i)每日摄取，诸如一日一次、一日两次、一日三次等；(ii)每周摄取，诸如每日持续七天，隔日持续七天等；(iii)每月摄取，诸如每日摄取持续所要时段，后接静息期(restingperiod)，继续每日摄取持续所要时段。
如与第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二及第十三实施方案中的任一者相关，预期量的鞘胺醇胶(亦即，(i)有益细菌生长有效量的鞘胺醇胶(第六实施方案)，(ii)有效量的鞘胺醇胶(第七实施方案)，(iii)肠屏障完整性有效量的鞘胺醇胶(第八实施方案)，及(iv)TNF-α及/或IL-8降低有效量的鞘胺醇胶(第九实施方案))可包含约1g至约10g的鞘胺醇胶，及其间的所有值，例如约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8及约9.9g。
在第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二及第十三实施方案中的任一者的一个方面，鞘胺醇胶的量选自约1g至约10g、约1g至约9g、约1g至约8g、约1g至约7g、约1g至约6g、约1g至约5g、约1g至约4g、约1g至约3g或约2g。
而且，在第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二及第十三实施方案中的任一者的一个方面，鞘胺醇胶的量足以在结肠中达成有效鞘胺醇胶浓度，如本文中所描述。
在替代方案中，且如与第六、第七、第八及第九实施方案中的任一者相关，哺乳动物为人类且预期量的鞘胺醇胶(亦即，(i)有益细菌生长有效量的鞘胺醇胶(第六实施方案)，(ii)有效量的鞘胺醇胶(第七实施方案)，(iii)肠屏障完整性有效量的鞘胺醇胶(第八实施方案)，及(iv)TNF-α及/或IL-8降低有效量的鞘胺醇胶(第九实施方案))可包含摄取组合物的人类每千克人体重量约10mg至约150mg。另外，预期鞘胺醇胶的量包含其间的所有值，例如约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg、约105mg/kg、约110mg/kg、约115mg/kg、约120mg/kg、约125mg/kg、约130mg/kg、约135mg/kg、约140mg/kg或约145mg/kg。
在第六、第七、第八及第九实施方案中的任一者的一个方面，哺乳动物为人类且鞘胺醇胶的量选自约10mg/kg至约150mg/kg、约10mg/kg至约140mg/kg、约10mg/kg至约130mg/kg、约10mg/kg至约120mg/kg、约10mg/kg至约110mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约10mg/kg至约90mg/kg、约10mg/kg至约80mg/kg、约10mg/kg至约70mg/kg、约10mg/kg至约60mg/kg、10mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约40mg/kg、或约20mg/kg至约30mg/kg摄取组合物的人类。
第六、第七、第八及第九实施方案中的任一者的组合物可包含天然HA/IA/LA鞘胺醇胶、HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖、HA/IA/LA鞘胺醇胶寡糖中的任一者、或其组合，且可选地进一步包含如第一实施方案中所描述的益生菌或额外益生元。
本文中所公开的结果显示鞘胺醇胶(例如，结冷胶)提高人类结肠模型的近端及远端部分中的双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)水平。在操作分类单元(“OTU”)层级上，发现主要变化归因于双歧杆菌科OTU 2(与青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)相关)的增加。因此，在第二实施方案、第六实施方案或第十实施方案的一个方面，细菌为双歧杆菌科。此外，在第二实施方案、第六实施方案或第十实施方案的另一个方面，细菌为双歧杆菌科OTU2。与未处理对照相比，在处理期间近端结肠腔中双歧杆菌科水平提高的范围为约20％至约180％，而与未处理对照相比，在处理期间远端结肠腔中双歧杆菌科水平提高的范围为约330％至约590％。在第二实施方案、第六实施方案或第十实施方案的又一个方面，与未处理对照相比，在处理期间近端结肠腔中双歧杆菌科水平提高的范围为约20％至约180％。而且，在第二实施方案、第六实施方案或第十实施方案的另一个方面，与未处理对照相比，在处理期间远端结肠腔中双歧杆菌科水平提高的范围为约330％至约590％。
另外，基于健康成人的粪便样本，本文中所公开的结果显示浓度为约4mg/mL的鞘胺醇胶寡糖提高体外细菌(例如，布劳特氏菌属(Blautia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、梭菌属(Clostridium)XVIII)水平。与未处理对照相比，体外布劳特氏菌属水平提高达至少约5倍。与未处理对照相比，体外副拟杆菌属水平提高约2倍至约40倍。与未处理对照相比，体外粪杆菌属水平提高约10倍至约190倍。与未处理对照相比，体外梭菌属XVIII水平提高约12倍至约60倍。
此外，基于患有炎性肠道疾病的患者的粪便样本，本文中所公开的结果显示浓度为约4mg/mL的鞘胺醇胶寡糖提高体外细菌(例如，副拟杆菌属、粪杆菌属、梭菌属XVIII)水平。与未处理对照相比，体外布劳特氏菌属水平提高达至少约8倍。与未处理对照相比，体外粪杆菌属水平提高达至少约8倍。与未处理对照相比，体外梭菌属XVIII水平提高约20倍至约100倍。
本文中所公开的结果显示所摄取的鞘胺醇胶(例如，结冷胶)降低人类结肠模型的近端部分及远端部分两者中的丙酸水平，及所摄取的结冷胶提高结肠模型的近端部分及远端部分两者中的丁酸水平。因此，在第三实施方案、第七实施方案或第十一实施方案的一个方面，在哺乳动物为人类时，与对照相比，在处理期间近端结肠中丙酸水平降低的范围为约8％至约21％。在第三实施方案、第七实施方案或第十一实施方案的一个方面，在哺乳动物为人类时，与对照相比，在处理期间远端结肠中丙酸水平降低的范围为约8％至约11％。在第三实施方案、第七实施方案或第十一实施方案的一个方面，在哺乳动物为人类时，远端结肠中丁酸水平提高的范围为约15％至约24％。在第三实施方案、第七实施方案或第十一实施方案的一个方面，在哺乳动物为人类时，远端结肠中丁酸水平提高的范围为约4％至约13％。
第十四实施方案关于用于制备鞘胺醇胶多糖(“SPS”)及/或鞘胺醇胶寡糖(“SOS”)的过程。
用于制备SPS的过程包含：将天然HA/IA/LA鞘胺醇胶在水中水合，及藉由均质化、超声处理、辐射、氧化及/或水解降低天然HA/IA/LA的分子量。
降低天然HA/IA/LA的分子量(亦即，缩短链长)可藉由包含以下的过程使用高压均质化实现：(i)将HA/LA鞘胺醇胶产品粉末在去离子水中水合以获得水合HA/IA/LA鞘胺醇胶(约1％w/v)溶液；(ii)使水合HA/IA/LA鞘胺醇胶溶液通过在约8,500psi至约12,000psi(及其间的所有值)的压力下操作的均质机1至10次，以获得均质化HA/IA/LA SPS溶液；(iii)将足够量的适合有机溶剂添加至均质化溶液中，以获得HA/IA/LA SPS沉淀物；(iv)藉由离心收集HA/IA/LA SPS沉淀物；及(v)干燥且研磨所收集的HA/IA/LA SPS粉末。
在用于制备HA/IA/LA SPS的过程的一个方面，HA/IA/LA鞘胺醇胶可为例如高酰基结冷胶、中酰基结冷胶、低酰基结冷胶、高酰基迪特胶、中酰基迪特胶、低酰基迪特胶、高酰基鼠李糖胶、中酰基鼠李糖胶及低酰基鼠李糖胶。在用于制备HA/IA/LA SPS的过程的另一个方面，该通过在约8,500psi的压力下发生1至10次(例如，1、2、3、4等)。在用于制备SPS的过程的又一个方面，该通过在约12,000psi的压力下发生1至10次(例如，1、2、3、4等)。在用于制备SPS的过程的另一个方面，该通过在约12,000psi的压力下发生10次。而且，在用于制备SPS的过程的又一个方面，适合有机溶剂为促进如此形成的HA/IA/LA鞘胺醇胶多糖的沉淀的有机溶剂，包括例如异丙醇。
用于制备HA/IA/LA SOS的过程包含：制备包含天然HA/IA/LA鞘胺醇胶或HA/IA/LASPS及液体介质的第一组合物；水解HA/IA/LA鞘胺醇胶或HA/IA/LA SPS的糖苷键，以获得第二组合物；使第二组合物经历超过滤、大小排阻层析、沉淀、离心、或其组合以获得包含HA/IA/LA SOS的第三组合物；及可选地，藉由适合技术，例如冻干分离或回收第三组合物。
在用于制备HA/IA/LA SOS的过程的一个方面，该水解可由酸、酶、超声处理、高压均质化、辐射、或其组合介导。
在用于制备HA/IA/LA SOS的过程的一个方面，该水解可由pH为约1至约3的水性介质介导。在另一个方面，该水解可由pH为约1至约3(或pH为约2)的水性介质介导，其中该水性介质可包含适合的无机或有机酸。适合的酸的实例包括(但不限于)硫酸、氢氯酸、硝酸、磷酸、柠檬酸、草酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、或其组合。
在用于制备HA/IA/LA SOS的过程的一个方面，该水解由以下介导：用甲酸在约2的pH及约95℃的温度下水解，持续足以水解HA/IA/LA鞘胺醇胶或HA/IA/LA SPS的糖苷键的时间。
在用于制备HA/IA/LA SOS的过程的一个方面，该水解由酶介导，其中该酶能够切割一或多种鞘胺醇胶糖苷键，包括(但不限于)结冷胶酶(gellanase)、由Hashimoto描述的鼠李半乳糖醛酸(rhamnogalacturonan)内裂合酶(endolyase)(EC 4.2.2.23)、鼠李半乳糖醛酸外裂合酶(exolyase)(EC 4.2.2.24)、结冷胶裂合酶(EC 4.2.2.25)、由Kennedy(1994)描述的结冷胶裂合酶、或其组合。应理解，表述“结冷胶酶”指能够切割鞘胺醇胶之一或多种糖苷键的酶。
在用于制备HA/IA/LA SOS的过程的一个方面，该经历包含将第二组合物通过截留分子量(molecular weight cutoff)为约5kDa或约10kDa的膜过滤，以获得包含第三组合物的滤液。
第十五实施方案关于包含如藉由第十四实施方案制备的鞘胺醇胶寡糖的组合物。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语具有本领域技术人员通常所理解的相同含义。以下实施例仅意欲进一步说明本文中所要求保护及公开的实施方案，且并不意欲限制要求保护的主题的范围。
实施例
I.实施例I.HA/LA SPS及SOS的制备
鞘胺醇胶多糖的制备。
天然鞘胺醇胶的链长可藉由包含以下的过程使用高压均质化缩短：(i)将鞘胺醇胶(例如，结冷胶、迪特胶及鼠李糖胶)产品粉末以1％w/v在1L去离子水中水合以获得水合鞘胺醇胶溶液；(ii)在APV 1000型均质机中在约12,000psi下机械消化水合鞘胺醇胶溶液(10次)，以获得均质化溶液；(iii)将足够量的异丙醇添加至均质化溶液中，以获得鞘胺醇胶多糖沉淀物；(iv)藉由离心收集鞘胺醇胶多糖沉淀物；及(v)干燥且研磨所收集的鞘胺醇胶多糖粉末。对所选鞘胺醇胶(例如，高酰基结冷胶、低酰基结冷胶、高酰基迪特胶及高酰基鼠李糖胶)使用此程序，制备以下鞘胺醇胶多糖样本，如表1中所示，其以0.8％w/v的浓度在水中水合以供后续研究。
表1.鞘胺醇胶多糖的概述(第1-7号样本)。
Figure BDA0003249826240000231
Figure BDA0003249826240000241
注释：
a第6号样本为获自结冷胶的结冷胶多糖，该结冷胶由衍生自野生型伊乐鞘氨醇单胞菌的菌株，菌株438产生。来自菌株438的结冷胶藉由以下分离：用蛋白酶、EDTA、SDS、溶菌酶及淀粉酶处理发酵液；接着藉由异丙醇诱导的经处理且加热的培养液沉淀进行结冷胶回收。
b第7号样本为获自由菌株438产生的结冷胶的结冷胶多糖。来自菌株438的结冷胶藉由以下分离：将发酵液离心以获得集结细胞及上清液，用淀粉酶及蛋白酶处理所收集的上清液，及使用异丙醇沉淀自经加热的培养液回收结冷胶。
本文中所制备的结冷胶多糖与商业化结冷胶产品的不同之处在于链长藉由高压均质化缩短。实际上，先前研究显示高压均质化缩短天然结冷胶的链长(且因此减小分子量)。(参见以全文引用的方式并入的US6242035B1，其中天然结冷胶(MW≈2.5×106；MN≈2.2×106)的高压均质化产生如藉由大小排阻层析/多角度激光光散射法所量测，MW小于或等于约1.7×106的结冷胶。)
鞘胺醇胶寡糖(SOS)的制备
SOS制备一般包含：(i)制备2％w/v天然HA/IA/LA鞘胺醇胶(或HA/IA/LA SPS)溶液；(ii)在95℃下用甲酸(pH 2)水解过夜，以获得水解产物；(iii)使用截留分子量为5kDa或10kDa的超过滤膜过滤水解产物，以获得滤液；(iv)冻干滤液以获得冻干物；(v)用无水乙醇洗涤冻干物(3次)，以获得经洗涤的粉末；及(vi)干燥经洗涤的粉末以获得SOS。(可替代地，水解可使用以下进行：(i)适合的酶，诸如结冷胶酶；(ii)超声处理；(iii)高压均质化；(iv)辐射；或(v)其他已知过程。)使用酸水解(例如，甲酸)程序或酶水解(例如，日本结冷胶酶(Japan gellanase)(EC 4.2.2.25)或菌株438结冷胶酶)，制备以下HA/LA鞘胺醇胶寡糖样本，如表2a中所示，其中单糖含量％指单糖(葡萄糖及鼠李糖)含量除以样本浓度，单糖组合物、寡糖内容物及分子量如下文所描述。
表2a.鞘胺醇胶寡糖的概述(第8-18号样本。)
Figure BDA0003249826240000242
Figure BDA0003249826240000251
藉由将SOS样本溶解于去离子水中，且使用Thermo Fisher离子层析系统分析葡萄糖及鼠李糖含量，测定所选SOS样本的单糖含量。总单糖含量按葡萄糖及鼠李糖的总浓度除以样本浓度计算。
单糖组合物(对于第9-10及17-18号样本而言)如下测定。将SOS样本溶解于4％硫酸中至3.5g/L的浓度，且在121℃下高压灭菌1小时。根据Zeuner(2016)使用Dionex ICS-5000系统对单糖进行定量。使用外部标准品对甘油酸盐/酯进行定量。未知化合物1(“UNK1”)、未知化合物2(“UNK2”)及未知糖醛酸1(“UNK URON1”)按葡糖醛酸单元定量。表2b概述第9-10及17-18号样本中的每一者的单糖组合物。
表2b.鞘胺醇胶寡糖的概述(单糖组合物，第9-10及17-18号样本。)
Figure BDA0003249826240000261
寡糖含量(对于第9-10及17-19号样本而言)如下测定。藉由与UltiMate 3000UHPLC(Dionex,Sunnyvale,CA USA)偶联的Amazon SL离子阱(Bruker Daltonics,BremenGermany)上的液相层析电喷雾离子化质谱法(LC-ESI-MS)执行寡糖的鉴别及相对定量。将于50％ACN中的5μL样本(5g/L最终)注入于TSKgel Amide 80HILIC管柱(150mm×2mm；2μm，TOSOH,Greisheim,Germany)上。在包含洗脱剂A(水)、洗脱剂B(乙腈)及C(100mM甲酸铵pH5)的三洗脱剂系统上，在45℃下在0.2毫升/分钟下执行层析。洗脱剂C在所有时间保持在5％下。洗脱轮廓如下(时间以分钟为单位指定)：0-5，75％B；5-25，线性梯度至25％B；25-30，等度5％B；30-40，等度75％B。电喷雾用UltraScan模式以负模式及100-2000m/z扫描范围，1000m/z智慧参数设定操作。对两个最高盛行前体离子执行自动MS2事件。毛细管电压在4.5kV下，端板偏置0.5kV，雾化器压力在3.0巴下，干燥气体流量在12.0升/分钟下，且干燥气体温度在280℃下。化合物藉由MS及MSn鉴别，且由Data analysis 4.2 SR2中的相对强度定量。
表2c.鞘胺醇胶寡糖的概述(寡糖含量，第9-10及17-18号样本)。
Figure BDA0003249826240000262
Figure BDA0003249826240000271
a Glc,GlcA,Rha可为Rha-Glc-GlcA或GlcA-Glc-Rha。
鉴别为Glc2,GlcA,Rha,Glyc的SOS代表含单一甘油酸盐/酯的结冷胶四聚体单元，而鉴别为Glc2,GlcA,Rha,Ac的SOS代表含单一乙酰基的结冷胶四聚体单元。某些SOS包括多个糖部分(即，Glc5,GlcA2,Rha2,Ac)-寡糖可根据指定糖数目推断。举例而言，Glc5,GlcA2,Rha2,Ac包括两个四聚单元(即，Glc-GlcA-Glc-Rha)以及额外葡萄吡喃糖苷基(Glc)及乙酰基(Ac)。此外，Glc6,GlcA3,Rha3代表包括三个四聚单元(即，Glc-GlcA-Glc-Rha乘以3)的寡糖。由损失水(“-H2O”，参见例如Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O)鉴别的SOS代表裂合酶/β-消除的不饱和产物。在较长类结冷胶寡聚物(例如，Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2)的一些情况下，提出两种结构，这是因为质谱片段化不足以区分一个葡糖醛酸或两个甘油酸盐/酯取代的存在。所观测到的SOS并非全部可经结构鉴别。基于片段化，一些化合物可归因于片段化图案中的相似度经部分鉴别，因此在最类似的经鉴别的化合物后标示为“未知m/z衍生物”。其他化合物归因于不良片段化，或归因于与预期结冷胶衍生SOS相比不同类型的化合物而不可能鉴别。视观测到一个电荷或两个电荷而定，这些未知SOS标示为“未知(所观测到的m/z)z1或z2”。如由下文大小排阻层析数据所证明，所分析的样本可包含鞘胺醇胶多糖(DP>30，但低于天然鞘胺醇胶)及鞘胺醇胶寡糖(2≥DP≤30)。
SOS样本的报告分子量如下测定。使用与RI-101折射率侦测器(Shodex)连接的具有WPS-3000取样器的Ultimate iso-3100 SD泵(Dionex)执行高效能大小排阻层析。将100μL样本负载于配备有TSKgel PWH保护管柱(7.5×7.5mm)(Tosoh Bioscience)的TSKgelG3000PW管柱(300×7.5mm)上。在40℃下用100mM硝酸钠以1.0毫升/分钟的流动速率执行洗脱。普鲁兰标准品用作参考物。
图1a描绘经酸(SN9，实线)及酶处理(SN18，虚线)的衍生自高酰基结冷胶的鞘胺醇胶多糖及寡糖的大小排阻层析图(“SEC”)，而图1b描绘经酸(SN10，实线)及酶处理(SN17，虚线)的衍生自低酰基结冷胶的鞘胺醇胶多糖及寡糖的SEC。图1a及图1b两者均显示普鲁兰分子量标准洗脱时间(即，>50kDa(6.5分钟，实心正方形(■))、12kDa(8.8分钟，实心圆形(●))、5kDa(9.3分钟，实心三角形(▲))、1kDa(10min，空心正方形(□))、342Da(10.65分钟，空心圆形(○))及180Da(11.15分钟，空心三角形(△)))。图1a的SEC数据显示衍生自高酰基鞘胺醇胶的鞘胺醇胶多糖(SPS)及鞘胺醇胶寡糖(SOS)的可比分布。这应与图1b的SEC数据相比，在该SEC数据中，经酸处理的样本(SN10)的SPS及SOS的分布不同于经酶处理的样本(SN17)的SPS及SOS的分布。SEC数据亦显示第9、10及18号样本的约0.5kDa至约4kDa(且可能至多约12kDa)的分子量范围。引起关注地，经酶处理的衍生自低酰基鞘胺醇胶的样本(SN17)显示具有约0.5kDa至约1kDa的分子量范围的主要SOS洗脱(伴随位于约1kDa处峰的窄尺寸分布)。
SOS的寡聚物含量藉由质谱分析测定。一般而言，藉由使用含1mM NaCl的水/乙腈(1:1)将SOS以0.4％的浓度溶解制备SOS样本。将样本通过0.22微米过滤器过滤，随后引入至Thermo Fisher的MSQ外加Single Quad Mass Spec中。质谱仪以负电喷雾电离模式操作，自150至1000m/z扫描。根据寡聚物的完整质量，在SOS样本中发现不同寡糖。表3概述针对所选SOS样本观测到的寡聚物。
表3.SOS中经鉴别的寡聚物。
Figure BDA0003249826240000291
()指示侧链。
II.实施例II.鞘胺醇胶(例如天然鞘胺醇胶、SPS及SOS)对所选肠道微生物群的活性的影响。
将含有8mg/mL(0.8％w/v)的SPS或SOS的样本以因数2稀释，以提供含有4mg/mL(0.4％w/v)的SPS或SOS的样本。如由Fehlbaum(2018)所描述，在使用体外发酵筛选平台(“i-筛选(i-screen)”)发酵24小时之后，评定浓度为4mg/mL的第1-12号样本对一组超过二十五种肠道微生物群的影响。具体而言，使用来源于56名健康成人(基于排除准则为健康)的标准粪便微生物群库，其自冷冻储备液预培养过夜。这之后为在微量滴定板中稀释，样本添加在微量滴定板中且随后在37℃下厌氧温育24小时。在温育之后，培养物样本经收集及加工以供进一步分析。在96孔培养板中，一些孔用于技术对照、不含微生物群的对照(n＝3)及仅含微生物群的阴性对照(n＝3)，留下可用于实验的80个孔。在对应于约4克/天的剂量的约4mg/mL浓度下分析数种鞘胺醇胶样本及比较样本-植物萃取物(例如，果胶、果胶寡糖及角叉菜胶)及生物胶(biogums)(例如，黄原胶及黄原胶寡糖)。(Van den Abbeele(2011)。)
藉由在属层级上且在许多情况下(而非所有)在种层级上辨识细菌的下一代测序测定微生物群组成的变化。为了在测序库中具有样本的均一分布，使用通用引物-探针组藉由定量聚合酶链反应(“PCR”)确定总细菌负载。藉由PCR制备V4区的16s rDNA扩增子，从而使模板DNA的水平标准化且使用独特的带纠错条码的引物(error correcting barcodedprimer)且避免过度扩增。接下来，扩增子经凝胶纯化、定量及合并。随后在lllumina MiSeq仪器上藉由端测序(2×250bp)执行序列分析。使用由荷兰应用科学研究组织(NetherlandsOrganization for Applied Scientific Research)开发的标准化测序管线执行下游序列分析。管线预见成对端读段组装、品质过滤、嵌合体移除及经加工读段的分类学分类+聚类。
一式三份进行标准对照。特定而言，微生物组包括拟杆菌属(Bacteroides)、粪球菌属(Coprococcus)、未分类的毛螺菌科(Lachnospiraceae)、巨球菌属(Megasphaera)、埃希氏菌属(Escherichia)/志贺氏菌属(Shigella)、梭菌属XlVa、阿里松氏菌属(Allisonella)、双歧杆菌属、多尔氏菌属(Dorea)、柯林斯菌属(Collinsella)、艰难杆菌属(Mogibacterium)、萨特菌属(Sutterella)、嗜胆菌属(Bilophila)、布劳特氏菌属、狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪杆菌属、梭菌属XlVb、梭菌属XI、胺基酸球菌属(Acidaminococcus)、芽殖菌属(Gemmiger)、毛螺菌属(Lachnospira)、副拟杆菌属、副普雷沃氏菌属(Paraprevotella)及丁酸球菌属(Butyricicoccus)。相对于未处理对照测定影响。表4a概述第1-12号样本的第一i-筛选分析的对双歧杆菌属及粪杆菌属生长观测到的影响，其中报告结果相对于未处理对照(生长表示为1.0)。
表4a.第1-12号样本所观测到的所选肠道微生物群活性数据。
Figure BDA0003249826240000301
Figure BDA0003249826240000311
加粗值代表与未处理对照相比，细菌生长的显著变化。与实施例III(下文)中所报告的结果一致，鞘胺醇胶多糖(即第1-3号样本)促进双歧杆菌属生长。出人意料地，鞘胺醇胶寡糖(即，第8-12号样本)以相对于未处理对照显著的程度促进粪杆菌属、布劳特氏菌属及副拟杆菌属中的每一者的生长。众所周知双歧杆菌属及粪杆菌属(例如，普拉粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii))为产生丁酸的细菌。因此，显示鞘胺醇胶寡糖促进粪杆菌属生长的i-筛选结果表明这些组合物展现益生元活性。而且，由于已知普拉粪杆菌与抗发炎相关，i-筛选结果表明SOS藉由促进普拉粪杆菌生长充当抗炎剂。
使用三个不同粪便库，即，来源于健康成人的两个库(H1及H2)及获自患有肠易激病(“IBD”)的患者的一个库，针对三种或四种细菌(即，布劳特氏菌属、副拟杆菌属、粪杆菌属、梭菌属XVIII)对第9、10、17及18号样本执行额外i-筛选分析。具体而言，所使用的粪便库包括：(i)H1库来源于六名健康成年志愿者(高加索人，25-60岁，欧洲生活方式及营养，自我评价健康状况，过去3个月中无抗生素使用)，(ii)H2库来源于(5)名健康成年志愿者(20-65岁，过去3个月中无抗生素使用，自我评价健康状况)，及(iii)IBD库来源于四名患有IBD，即溃疡性结肠炎的患者。表4b概述第9-10及17-18号样本的额外i-筛选分析(即，第一i-筛选(第1-2号)、第二i-筛选(第3-4号)及第三i-筛选(第5-16号))对三种或四种细菌(即，布劳特氏菌属(“Blaut.”)、副拟杆菌属(“Para.”)、粪杆菌属(“Faecal.”)、梭菌属XVIII(“ClXVIII”))生长观测到的影响，其中报告结果相对于未处理对照(生长表示为1.0)。
表4b.第9-10及17-18号样本所观测到的所选肠道微生物群活性数据。
Figure BDA0003249826240000312
Figure BDA0003249826240000321
a Faecal.反应如表4a中所报告。
b Faecal.反应如表5中所报告。
就表4b条目1-4而言，可发现与未处理对照相比，SOS促进健康成人的粪便库中布劳特氏菌属、副拟杆菌属及粪杆菌属的变化倍数增加。衍生自低酰基结冷胶寡聚物的SOS展现粪杆菌属(188.91)以及副拟杆菌属(21.11)及布劳特氏菌属(4.78)的最高变化倍数。
就表4b条目5-8而言，得出以下观测结果。与未处理对照相比，SOS(经酸及酶处理)促进健康成人的粪便库中布劳特氏菌属、副拟杆菌属及粪杆菌属的生长。这些结果验证来自经酸处理的高酰基及低酰基结冷胶寡聚物样本的第一及第二i-筛选结果的发现。在低酰基经酸处理的结冷胶寡聚物的情况下获得三个属的较高变化倍数值。此外，用酶处理产生的高酰基及低酰基结冷胶寡聚物亦对同一粪便库中三个属的生长增加有效。
使用H2粪便库(表4b条目9-12)，可发现SOS(经酸及酶处理)增加布劳特氏菌属、副拟杆菌属、粪杆菌属及来自梭菌属XVIII簇的细菌的变化倍数。SOS(经酸处理)提升粪杆菌属(21.93)及副拟杆菌属(7.25)的最高变化倍数。梭菌属XVIII簇变化倍数值范围为12.66至55.91。作为参考，肠道中所发现的梭菌属XVIII及梭菌属XIVa簇的大部分产生乙酸(梭菌属XIVa簇中的数种菌株除亦乙酸以外产生丁酸)，此外基于基因组分析(代谢网路)，两种簇均不产生毒素。Narushima(2014)。
使用IBD粪便库(表4b条目13-16)，结果显示SOS(来自低酰基结冷胶)提升副拟杆菌属的最高变化倍数值。经酸处理的低酰基结冷胶寡聚物展现粪杆菌属的最高变化倍数。梭菌属XVIII簇的变化倍数亦增加30.84至98.28的范围。值得注意的是，SOS中存在副拟杆菌属的显著生长。副拟杆菌属分解有益健康的高纤维膳食，其保护免于发炎。罹患炎性肠道疾病的患者中缺失这些细菌。Martinez(2010)、Noor(2010)、Segata(2012)及Zitomersky(2013)。
表5概述第9-16号样本(及比较样本1-16，以及LivauxTM补充剂、菊糖及阿莫西林)的第二i-筛选分析对一组八种细菌(未分类的毛螺菌科(“Lachn.U.”)、梭菌属XIVa(“ClXIVa”)、双歧杆菌属(“Bifid.”)、粪球菌属(“Copro.”)、布劳特氏菌属(“Blaut.”)、考拉杆菌属(“Phasc.”)、粪杆菌属(“Faecal.”)、丁酸球菌属(“Butyr.”)及副拟杆菌属(“Para.”))观测到的影响，其中报告结果相对于未处理对照(生长表示为1.0)。
表5.所选SOS(SN9-SN16)及比较样本(CS)针对一组八种细菌的影响。
样本 Lachn.U. ClXIVa Bifid. Copro. Blaut. Phasc. Faecal. Butyr. Para.
SN9 2.42 1.00 0.65 1.02 2.21 1.08 30.71 0.95 6.79
SN10 1.19 0.93 0.73 0.83 3.20 1.37 51.54 0.93 15.99
SN11 1.20 1.07 0.38 1.22 2.56 1.97 30.24 1.12 26.30
SN12 0.53 1.17 1.34 0.31 2.28 2.90 48.73 0.73 37.79
SN13 2.06 0.96 0.80 0.88 2.12 1.04 17.49 0.91 9.36
SN14 1.16 0.83 0.86 0.78 3.00 1.29 43.63 0.99 17.67
SN15 1.14 0.88 0.67 1.12 4.96 1.24 29.05 0.84 6.59
SN16 1.08 0.80 1.32 0.82 2.30 2.11 11.24 0.92 31.01
CS1 3.90 0.62 1.01 0.52 1.86 1.21 3.74 0.55 0.49
CS2 3.54 0.52 0.62 0.39 1.26 1.31 3.09 0.67 0.53
CS3 3.08 0.54 0.83 0.56 1.91 1.58 3.63 0.77 0.52
CS4 2.82 0.54 0.88 0.51 1.68 1.64 3.20 0.71 0.55
CS5 1.67 0.55 0.43 0.71 1.31 1.94 3.49 0.91 0.71
CS6 2.45 0.54 0.89 0.50 1.74 1.67 2.26 0.84 0.47
CS7 1.52 0.71 0.53 0.93 1.15 1.09 1.35 1.49 0.75
CS8 1.13 0.51 0.65 0.58 0.55 1.27 1.13 1.19 0.46
CS9 1.22 1.02 0.74 1.27 0.92 0.98 1.46 1.25 0.98
CS10 2.03 0.66 0.84 0.87 1.49 1.53 3.64 0.71 0.80
CS11 1.20 1.07 0.60 0.84 1.13 1.86 1.77 0.72 1.38
CS12 2.35 0.54 2.13 0.57 2.72 1.79 2.18 0.67 0.58
CS13 0.72 0.59 1.95 0.56 5.15 2.17 1.81 0.68 0.52
CS14 1.17 1.05 0.56 1.07 1.31 1.24 1.04 0.68 2.80
CS15 1.23 0.81 1.05 0.83 1.79 1.21 1.15 1.33 7.16
CS16 1.38 0.73 1.52 0.82 2.52 1.50 1.25 1.00 8.26
CS17 1.19 0.82 1.11 1.03 1.79 1.28 0.94 1.07 7.01
CS18 0.97 0.72 1.68 1.15 1.53 1.07 1.14 0.74 0.79
CS19 0.73 0.81 3.35 0.82 3.64 0.78 0.93 0.89 0.62
CS20 0.04 0.03 0.24 0.04 0.23 0.08 0.37 0.00 12.10
表6概述第二筛选中所使用的比较样本1-16的组合物构成。
表6.比较样本(“CS”)1-16的概述。
Figure BDA0003249826240000331
Figure BDA0003249826240000341
a对于半成品果胶及果胶寡糖(POS)，果胶样本使用果胶甲基酯酶处理以便获得较低酯化程度(DE)，或使用聚半乳糖醛酸酶及果胶裂合酶处理以便获得具有较低MW/IV(分子量/固有粘度)的果胶。
基于表5结果，可发现相对于所有比较样本，所有鞘胺醇胶寡糖展现最高粪杆菌属生长。特定而言，最高粪杆菌属生长由以下显示：获自GELRITETMMK结冷胶(5kDa截留值(SN10))的结冷胶寡糖(约52倍)、获自天然鼠李糖胶(SN12)的鼠李糖胶寡糖(约49倍)及获自GELRITETM MK(10kDa截留值(SN14))的结冷胶寡糖(43倍)。引起关注地，与未处理对照相比，LivauxTM产品(以具有粪杆菌属生长活性推销(参见例如livaux.com/livaux-gi-problem/))显示粪杆菌属生长活性的仅1.14倍增加。LivauxTM产品活性的相对低粪杆菌属生长活性与公开数据一致。(US20170326190A1)。
在某些个例中，来自表4的结果与来自表5的结果的比较显示所选样本的变化性(参见SN10(188.31对51.54)及SN12(70.44对48.73))。对所选数据的额外分析显示所选鞘胺醇胶的变化系数(即，标准差与均值的比率)可在约7％至约32％之间变化，且在一些情况下，至多约80％。
基于表5结果，可发现所有鞘胺醇胶寡糖展现布劳特氏菌属的生长活性增加(即，相对于未处理对照，2-5倍增加)。
未显示的数据公开所有鞘胺醇胶寡糖展现埃希氏菌属/志贺氏菌属的生长活性减少(相对于未处理对照，约9-36％减少)。这应与LivauxTM产物形成对比，LivauxTM产物展现埃希氏菌属/志贺氏菌属的生长活性增加(相对于未处理对照，约45％增加)。
III.实施例III.结冷胶对人类胃肠道中的腔及粘膜肠道微生物菌群(microbiome)的活性及组成的影响。
A.材料及方法、SHIME实验的设计及典型SHIME反应器设置
已知人类肠微生物生态系统的模拟器(或SHIME)的各方面。(参见例如Molly(1993)、Possemiers(2004)、Possemiers(2017)、Van de Wiele(2013)、Van den Abbeele(2012)及Van den Abbeele(2013)。)
代表成人胃肠道的SHIME的典型反应器设置由Molly(1993)描述。其由模拟人类胃肠道的不同部分(例如，胃(V1)、小肠(V2)、升结肠(V3)、横结肠(V4)及降结肠(V5))的一连串五个反应器组成。前两个反应器具有进排交替原则以模拟食品摄取及消化中的不同步骤，其中蠕动泵分别向胃(V1)及小肠(V2)隔室中添加确定量的SHIME馈料(140mL 3次/天)及胰液与胆液(60mL3次/天)，且在指定间隔之后排空各别反应器。后三个隔室模拟大肠。这些反应器经连续搅拌；其具有恒定容积及pH控制。选择不同容器的滞留时间及pH以便相似于结肠的不同部分中的体内条件。在用粪便微生物群接种后，这些反应器模拟升结肠(V3)、横结肠(V4)及降结肠(V5)。接种体制备、滞留时间、pH、温度设置及反应器馈料组合物先前由Possemiers(2004)描述。在结肠的不同区中的微生物群落稳定化后，代表性微生物群落在三个结肠隔室中建立，该微生物群落在不同结肠区中在组成及功能两者中不同。
人类肠道携带大且复杂的微生物群落，其藉由预防病原体定殖及产生营养素涉及维持人体健康。微生物并非随机分布在整个肠中，且粘附于肠壁的微生物作为对抗病原体的“屏障”起重要作用，指挥粘膜免疫反应且在损害潜在有害定殖物(colonizer)的情况下占据生态栖位。然而，当前体外策略不允许培养粘附于肠粘膜的微生物部分，且限于腔微生物群落的模型建立。此意指未考虑肠道生态系统的一个重要部分，且可能损失关键信息。
为了解决此问题，修改SHIME系统以考虑粘液层的定殖。(参见例如Van denAbbeele(2012)及Van den Abbeele(2013)。)经修改SHIME系统称为M-SHIME，其允许在数周时段内培养腔及粘液相关微生物群落。
包含粘膜隔室增加SHIME的值及模型建立能力，且允许评估特定处理是否亦能够调节粘膜相关微生物群落。
1.研究的经调适的SHIME设置
将SHIME设置自TWINSHIME配置调适至TripleSHIME配置，TripleSHIME配置包括用于各供体中的胃、小肠、近端结肠及远端结肠的容器(或反应器)。TripleSHIME配置准许三种不同条件的并行比较。评估结冷胶由三个不同人类供体的微生物群的潜在发酵(供体A：女性，28岁；供体B：女性，41岁；供体C：女性，34岁)。相比于TWINSHIME中的三个区，结肠区限于两个区。使滞留时间及pH范围最佳化以便获得代表全胃肠道模拟的结果。在实践中，在TripleSHIME实验中，使用3个PC-DC单元，而非用各自由AC-TC-DC配置(升结肠、横结肠及降结肠)构成的2个单元工作。在用成年人类的粪便微生物群接种后，这些反应器模拟近端结肠(PC；pH 5.6-5.9；滞留时间＝20小时；500mL容积)及远端结肠(DC；pH 6.6-6.9；滞留时间＝32小时；800mL容积)。
此研究的SHIME实验由跨越七周时段的三个阶段(稳定化、对照及处理)组成。
稳定化期：在用适当粪便样本接种结肠反应器后，两周稳定化期允许微生物群落在不同反应器中分化，视局部环境条件而定。在此时期期间，向SHIME提供基本营养基质以支持原先存在于粪便接种体中的肠道微生物群的最大多样性。
对照期：在此两周参考期期间，向该模型进一步给予标准SHIME营养基质持续14天的时段。对此时期中的样本的分析允许测定不同反应器中的基线微生物群落组成及活性，其用作用于评估处理效果的参考。
处理期：在此三周时期期间，SHIME反应器在标称条件下操作，但具有补充有测试产品的饮食。获自此时期中的结肠反应器的样本允许研究对滞留微生物群落组成及活性的特定影响。
B.对微生物群落组成及活性的分析
SHIME的特征为用经稳定化的微生物群群落工作及有规律地自不同肠区收集样本以供进一步分析的可能性。结肠区中的大容积允许每天收集足够体积的液体，而不干扰微生物群落或危及其余实验。
作为标准SHIME实验的部分，贯穿整个实验监测数个微生物参数。这些量测为评估模型的效能所必需且允许监测微生物群落组成及活性归因于益生元处理的基本变化。
1.对微生物群落组成及活性的分析
酸/碱消耗：结肠反应器中微生物代谢物的产生改变pH。在无连续pH控制(经由添加酸或碱)的情况下，pH将超过固定区间。酸/碱消耗在SHIME实验期间连续监测。
总气体产生：总气体产生的评估为与在最终应用的情况下的潜在耐受问题相关的重要方面。然而，归因于块体的连续流入及流出，难以在连续肠道模型中进行线上总气体产生量测。总气体产生分析因此典型地在批次设置中评定。
2.微生物群落活性(3次/周)
短链脂肪酸(SCFA)：分析乙酸、丙酸及丁酸的浓度。
乳酸：SCFA的前体及潜在抗微生物剂。
铵及分支链SCFA(异丁酸、异戊酸及异己酸)为蛋白分解发酵的标记物，对宿主健康具有相当不良的影响。
微生物群落组成(1次/周)；取得样本用于16S靶向Illumina测序。
C.用于研究的结冷胶
测试产品包括食品级结冷胶
Figure BDA0003249826240000371
LT100-P结冷胶(“结冷胶”)。
Figure BDA0003249826240000372
LT100-P结冷胶为天然(高酰基)结冷胶。产品以1克/天的体外剂量测试，该剂量对应于2克/天的体内剂量。
D.SHIME设置的稳定性
在对照期期间，SCFA水平在三个SHIME单元内极稳定(平均起来，在对照期中的连续时间点之间，水平94.4％类似)，清楚地表明就活性及组成而言的微生物群落稳定性。稳定反应器条件提高在处理期间所观测到的真正由所施用的测试产品引起的任何效果的置信度。
E.整体发酵活性
1.酸/碱消耗
酸及碱的消耗反映整个SHIME实验中的整体微生物活性。为了确保最佳环境条件得到维持，SHIME系统中的pH由pH控制剂在近端结肠中控制在5.6-5.9之间，且在远端结肠中控制在6.6-6.9之间。在不同反应器中的微生物群落稳定化(始于接种之后2周)后，碱-酸消耗大体上较低。然而，在处理期间，细菌可产生增加量的SCFA。因此，反应器中的环境将酸化，需要向个别反应器中施用碱以将其保持在预设pH范围内。因此，酸/碱消耗将增加。藉由量测在整个实验中的酸/碱消耗，能够估计测试产品对微生物群落活性的潜在影响。然而，必须注意酸/碱消耗仅为微生物发酵的粗略指示物，因为经由法酵产生的酸并非全部引起类似pH降低(pKa较低的酸，诸如乙酸，有效地降低pH)，而酸向彼此的转化亦可影响pH(例如，乙酸/乳酸转化为丙酸/丁酸提高pH)。微生物代谢物(诸如SCFA及乳酸)的实际量测提供更精确读数。
表7数据显示测试产品的整体发酵在近端及远端结肠隔室两者中在所测试的三个供体内显示类似倾向。
表7.在近端结肠(PC)反应器中三个不同供体(A、B及C)的用结冷胶处理的两个对照(C1及C2)及三个处理(TR1-TR3)周期间的平均每周碱-酸消耗(毫升/天)及在整个对照(n＝6)及处理(n＝9)期内的平均酸/碱消耗。
Figure BDA0003249826240000381
在近端结肠中，酸化极有限，不过在处理的最后一周期间针对所测试的所有供体观测到朝向碱消耗增加的趋势。在远端结肠中，相比于近端结肠，在对照期期间酸化较明显。这由以下事实解释：酸性较高的近端结肠悬浮液(pH＝5.6-5.9)物理转移至远端结肠自动引起此远端结肠中的较高碱消耗，以将pH保持在恰当区间(pH＝6.6-6.9)中。对于所测试的所有供体，补充测试产品引起紧接地在处理起始之后稍微升高的碱消耗。
2.气体产生
由于气体为肠道微生物的发酵活性的主要指标，因此气体产生的变化提供对整体法酵轮廓的指示。因为鉴于用氮气规律冲洗顶部空间(以确保厌氧)，在连续SHIME模型中不监测气体产生，所以在独立短期批次温育中评估气体产生。在此类温育期间，将相同剂量的所研究产品供应至来源于对照期期间SHIME的近端结肠的微生物群，由此模拟在连续SHIME模型中起始处理时发生的过程。
就气体产生而言观测到供体依赖性效应(资料未显示)。尽管在用测试产品处理后针对供体B观测到稍微增加的气体产生，但处理引起其他供体的稍微降低的气体产生。总体而言，对于所有条件，气体产生在6-24小时时间区间期间最剧烈。仅在4-6小时时间区间期间，在用测试产品处理后在所有供体中观测到气体产生的一致(但轻微)增加，而其他时间区间的特征由供体特异性差异界定。
总体而言，对于所测试的三个供体，用结冷胶处理几乎不影响肠道微生物群的气体产生。
F.对微生物群落活性的分析
1.短链脂肪酸(SCFA)产生
以下信息描述Triple-SHIME实验中测试产品对SCFA产生的影响。SCFA产生由结肠中的碳水化合物代谢引起，且与各种健康效应相关。最丰富的SCFA为乙酸、丙酸及丁酸。众所周知SCFA在肠道健康中起至关重要的作用。乙酸可用作宿主的能量源及体内脂质合成的潜在基质。此外，其为丁酸合成中的重要副产物，且可施加对抗病原体的抗微生物效应。然而，促进健康的效应主要归因于丙酸及丁酸，其充当肠上皮的主要能量源且已显示对抗发炎及结肠癌的保护效应。Cummings(1987)。已知丙酸运输至肝脏，在肝脏中其具有在血浆中降低胆固醇的效应且正面地影响血糖控制。(参见Wright(1990)、Demigne(1995)及Wong(2006)。)
总体而言，所研究的基质对SCFA产生的有益影响因此包括乙酸、丙酸及/或丁酸产生的增加。以下信息考虑三个供体的结果的直接比较。
为了最佳比较不同供体，对其中全部三个展示不同SCFA中的各者的平均SCFA水平(每周及每时期)。
2.乙酸产生
乙酸可由广泛范围的肠道微生物，包括尤其拟杆菌属(拟杆菌门(Bacteroidetes))及双歧杆菌产生。因此，尽管结冷胶显著提高供体A及C的近端结肠中的乙酸水平，但对于供体B乙酸水平不受影响(图2a，表8)。针对供体A观测到最大平均提高(亦即，1.7mM或+21％的提高)。相比之下，在远端结肠中，仅针对供体B观测到在结冷胶处理后提高的乙酸水平(图2b，表8)，相对于对照期，平均提高为2.1mM(+6％)。
表8.对于三个不同供体(A、B及C)用结冷胶处理对近端结肠(PC)及远端结肠(DC)反应器中的乙酸产生(以mM为单位)的影响，及对照(C1及C2)及处理(TR1-TR3)周期间的平均每周乙酸产生(亦参见图1a-1b)。
Figure BDA0003249826240000401
3.丙酸产生
丙酸可由广泛范围的肠道微生物产生，最丰富丙酸产生者为拟杆菌属(拟杆菌门)、韦荣氏球菌属(Veillonella)(厚壁菌门(Firmicutes))及嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)(疣微菌门(Verrucomicrobia))。对于所测试的所有三个供体，结冷胶施用引起回应于两个结肠区的处理的丙酸水平显著降低(图3a-3b，表9)。在近端结肠中，针对供体A及B观测到强烈立即降低，而对于供体C影响较不明显(亦即，相对于供体A及B分别-4.3mM(-18％)及-4.8mM(-20％)，供体C的1.7mM(-8％)的降低)。另一方面在远端结肠中，针对所有供体观测到丙酸水平的较逐步降低。鉴于Edwards(1995)及Anderson(1988)的研究，这些发现出人意料。举例而言，Edwards(1995)陈述对于韦斯大鼠，结冷胶对SCFA含量不具有一致影响，而Anderson(1988)报告摄取大量结冷胶引起女性志愿者丙酸粪便含量降低23％，及男性志愿者丙酸粪便含量提高33％。
表9.对于三个不同供体(A、B及C)结冷胶处理对近端结肠(PC)及远端结肠(DC)反应器中的丙酸产生(以mM为单位)的影响，及对照(C1及C2)及处理(TR1-TR3)周期间的平均每周丙酸产生(亦参见图2a-2b)。
Figure BDA0003249826240000411
4.丁酸产生
丁酸由梭菌属IV及XIVa簇(厚壁菌门)的成员产生。在被称作交互饲养(cross-feeding)的过程中，这些微生物将乙酸及/或乳酸(连同其他基质)转化为健康相关丁酸。对于所测试的所有供体，丁酸水平在补充结冷胶后在近端结肠中逐渐提高，且在远端结肠中以较低程度提高(图4a-4b，表10)。影响在近端结肠中最明显，供体A、供体B及供体C分别显著提高2.3mM(+24％)、1.9mM(+21％)及1.4mM(+15％)。在远端结肠中，仅供体A在结冷胶补充后具有显著提高的丁酸水平(亦即，1.4mM(+13％)的提高)。
表10.对于三个不同供体(A、B及C)结冷胶处理对近端结肠(PC)及远端结肠(DC)反应器中的丁酸产生(以mM为单位)的影响，及对照(C1及C2)及处理(TR1-TR3)周期间的平均每周丁酸产生(亦参见图4a-4b)。
Figure BDA0003249826240000421
5.乳酸产生
人类肠携带产生乳酸的细菌及利用乳酸的细菌两者。乳酸由乳酸菌产生且降低环境pH。尤其在低pH值下，乳酸可施加对抗病原体的强抗微生物效应。乳酸的另一有益影响由其转化为丁酸及/或丙酸引起。由于不同微生物物种由此产生及转化乳酸，因此乳酸浓度提高可由增加的产生以及减少的转化两者引起。因此，在对乳酸结果进行数据解释的情况下需要谨慎。
在近端结肠中，对于所测试的所有供体乳酸浓度在处理的最后一周期间提高，仅对于供体A到达显著(表11)。然而，在处理的最后一周期间，随着乳酸浓度在此周期间逐渐提高，针对其他供体可观测到高标准差，亦即，对于供体B，在最后处理周开始时的0.19mM直至在该周结束时的0.73mM，且对于供体C，0.13mM直至0.46mM。在远端结肠中，针对供体C在处理的最后一周期间观测到显著提高的乳酸浓度。对于供体A，在结冷胶补充后观测到朝向较高乳酸浓度的趋势，而对于供体B，在处理后乳酸浓度不受影响。
表11.对于三个不同供体(A、B及C)结冷胶处理对近端结肠(PC)及远端结肠(DC)反应器中的乳酸产生(以mM为单位)的影响，及对照(C1及C2)及处理(TR1-TR3)周期间的平均每周乳酸产生(亦参见图5a-5b)。
Figure BDA0003249826240000422
6.铵及分支链SCFA产生
铵(NH4 +)及分支链SCFA(b-SCFA＝异丁酸、异戊酸及异己酸的总和)的产生均由蛋白质降解引起且反映肠道微生物群的蛋白分解活性。由于后者与直接及间接不利健康效应(例如，结肠癌发生)相关，因此铵/b-SCFA产生的减少被视为有益的。图6a-6b(表12)在两个结肠区中呈现与不同处理相关的平均铵(以mg/mL为单位)产生，而图7a-7b(表13)在两个结肠区中呈现与不同处理相关的平均分支链SCFA产生(以mM为单位)。
对于所测试的所有供体，在近端结肠及远端结肠两者中铵水平不受用结冷胶处理影响，不同之处在于对于供体C，在处理的最后一周期间近端结肠中轻微提高。这些结果由分支链SCFA水平证实，其中对于所测试的所有供体，在近端结肠及远端结肠两者中在处理即将结束之际观测到仅轻微提高。
表12.对于三个不同供体(A、B及C)结冷胶处理对近端结肠(PC)及远端结肠(DC)反应器中的铵产生(mg/L)的影响，及对照(C1及C2)及处理(TR1-TR3)周期间的平均每周铵产生(mg/L)(亦参见图6a-6b)。
Figure BDA0003249826240000431
表13.对于三个不同供体(A、B及C)结冷胶处理对近端结肠(PC)及远端结肠(DC)反应器中的分支链SCFA产生(mM)的影响，及对照(C1及C2)及处理(TR1-TR3)周期间的平均每周分支链SCFA产生(mM)(亦参见图7a-7b)。
Figure BDA0003249826240000432
G.对微生物群落组成的分析
16S靶向Illumina测序是基于16S rRNA基因扩增的分子技术。因为Illumina测序方法基于PCR，所以扩增微生物序列直至到达饱和水平。因此，尽管获得关于广谱(非预界定)OUT的信息(>100种不同的最主导OTU)，但结果呈现为相对于各样本内序列的总量的比例值，由此提供半定量结果。本文中所应用的方法涉及跨越16S rDNA的两个高变区(V3-V4)的引物。使用成对测序方法，对2x250 bp测序产生424bp扩增子。与在分类学上提供较少信息的较小片段相比，此类片段在分类学上较适用。除在门及科层级上加工数据以外，可鉴别改变的特定OTU，而此外辛普森(Simpson)多样性指数可作为多样性及均匀性两者的量度计算。该指数的最低可能值为1，代表由仅一种OTU组成的群落。最高可能值为OUT的总数目。当OTU分布更均匀时，指数将更接近最大值，而由少数OTU主导的群落将引起更接近于1的值。指数愈高，多样性愈大且均匀性愈大。
1.多样性指数
倒数辛普森多样性指数作为就物种富度及均匀性两者而言的多样性的量度计算。基于多样性指数，因此在对照期期间，三个SHIME单元中的各者在PC及DC两者中由可再现腔及粘膜微生物群落定殖。多样性在DC中较高，而在PC及DC两者中，相对于粘膜微生物群，对于腔微生物群亦显著较高(表14)。
表14.在对照期(n＝6)期间三个SHIME单元的近端结肠(PC)及远端结肠(DC)的腔(L)及粘液(M)中的平均倒数辛普森多样性指数。此外，在L与M之间或PC与DC之间倒数辛普森多样性指数亦存在显著差异(p<0.05)，如藉助于其如使用Student氏t检验计算的p值证明。
Figure BDA0003249826240000441
此外，就处理效果而言，对于所测试的所有三个供体，相对于对照结冷胶提高肠道微生物群的多样性(图8)。在结冷胶处理后，仅PC中的腔微生物群的多样性稍微降低。
2.门层级
此外，在门层级上的微生物群组成指出在近端结肠及远端结肠两者中，三个不同SHIME单元由可再现腔及粘膜微生物群落定殖。因此，计算四种环境中的各者的平均值同时执行统计检验，以理解特定门对四种环境中的各者的偏好(表15)。
表15.在对照期(n＝6)期间三个SHIME单元的近端结肠(PC)及远端结肠(DC)的腔(L)及粘液(M)中在微生物门层级上的平均丰度(％)。此外，在L与M之间或PC与DC之间对于某一门的亦显著差异(p<0.05)藉助于其如使用Student氏t检验计算的p值加粗且加底线。
Figure BDA0003249826240000451
这展现腔相对于粘液层的门特异性定殖，其中：(i)腔中拟杆菌门的较高水平(仅在DC中显著)；(ii)腔中变形菌门的较高水平(仅在PC中显著)；及(iii)粘液中互养菌门的较高水平(仅存在于DC中)。此外，观测到沿结肠的以下纵向差异：(i)PC中提高的放线菌门水平；(ii)DC中提高的拟杆菌门水平(仅在腔中显著)；(iii)DC中存在互养菌门；及(iv)粘液层中PC中降低的变形菌门水平，而在腔中观测到相反趋势。
就处理而言，因此在主要发酵位点，亦即近端结肠的腔处(图9)，对于所测试的所有三个供体，结冷胶在损害拟杆菌门及厚壁菌门的情况下强烈提高放线菌门水平。对远端结肠的腔样本注意到类似观测结果(图9)。另外，在远端结肠中，在用结冷胶处理后互养菌门及粘胶球形菌门的腔水平提高。在粘膜隔室(图9)中，随时间推移样本中变化率倾向于较高。这可归因于相对于均质腔悬浮液，形成于粘液层顶部上的生物膜的更异质组成。与腔中类似，粘膜放线菌门在用结冷胶处理后在近端结肠及远端结肠两者中富集(除PC中的供体C以外，其显示对互养菌门的极强刺激)，不过这未伴有如在腔中的拟杆菌门及厚壁菌门的减少。实际上，在结冷胶处理后在厚壁菌门水平中观测到粘膜隔室个体间差异，亦即，供体A显示厚壁菌门水平降低，而针对供体B及C观测到增加。最后，用结冷胶处理倾向于提高近端结肠的粘膜样本中的变形菌门丰度。
3.科及OTU层级
在科层级上，将主要论述对主要发酵位点，亦即近端结肠的腔的结冷胶处理效果(图10)。对于其他结肠环境(远端结肠腔(图11)、近端结肠粘膜(图12)及远端结肠粘膜(图13))，进行许多类似观测，且因此将仅论述特定及与主要发酵位点相异的变化。
对于所测试的所有三个供体，结冷胶强烈提高双歧杆菌科水平。图10-11中所呈现的信息显示对于两个对照期，近端结肠反应器的腔中的双歧杆菌科水平平均24.7±5.5％，而对于三个处理期，近端结肠反应器的腔中的双歧杆菌科水平平均39.0±8.8％。此外，图10-11中所呈现的信息显示对于两个对照期，远端结肠反应器的腔中的双歧杆菌科水平平均1.85±1.0％，而对于三个处理期，远端结肠反应器的腔中的双歧杆菌科水平平均8.3±2.3％。在OTU层级上，发现主要变化归因于双歧杆菌科OTU 2(与青春双歧杆菌相关)的增加。此强双歧杆菌促进效应与在结冷胶处理后针对所有三个供体观测到的显著提高的乙酸水平很好地对应。
对于所测试的所有三个供体，用结冷胶处理强烈降低拟杆菌科(Bacteroidaceae)水平。拟杆菌科含有许多已知丙酸产生者，其解释在结冷胶补充后观测到的丙酸水平的强烈降低。另外，在用结冷胶处理后，观测到韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)的丰度减少，其主要归因于韦荣氏球菌科OTU 1(与巨单胞菌属(Megamonas)相关)的减少。由于此OTU为强效丙酸产生者(同时消耗乳酸)，其减少可能促成在处理期期间观测到的降低的丙酸浓度。
对于所测试的三个供体，结冷胶亦稍微提高在整个三周处理期中的毛螺菌科水平，其可能与在同一时期期间观测到的提高的丁酸浓度有关。相比之下，在结冷胶处理后，远端结肠腔中毛螺菌科水平降低，而其他产生丁酸的科增加，亦即，胺基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、优杆菌科(Eubacteriaceae)及瘤胃菌科(Ruminococcaceae)。然而，在处理的最后一周期间，瘤胃菌科水平再次在远端结肠中降低，而在同一周期间观测到对韦荣氏球菌科的刺激。后者解释在处理的最后一周期间在远端结肠中观测到的增加的丙酸产生，且主要归因于对韦荣氏球菌科OTU 1(与巨单胞菌属相关)的刺激。
在用结冷胶处理后在粘膜环境中单独富集的另一产生丁酸的科为梭菌科(Clostridiaceae)，相对于远端结肠中的梭菌科OTU 17(与第三梭菌(Clostridiumtertium)相关)，近端结肠中相异地增加梭菌科OTU 23(与丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)相关)。
在结冷胶处理后的另一个一致发现为变形菌门内数个科的增加，诸如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)及黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)的增加。这些科主要因其含有数种机会性病原物种而为人所知，不过这些科内亦存在许多共生物，已知其在不同结肠区，但主要在远端结肠中发酵蛋白质。实际上，对远端结肠区进行类似观测，其中在用结冷胶处理后变形菌门的数个科稍微增加。这些发现可能与在处理期即将结束之际观测到的分支链SCFA水平的轻微提高相关。
最后，在近端结肠腔中在结冷胶处理后观测到一些供体特异性变化：(i)供体B及C的提高的微杆菌科(Microbacteriaceae)水平；(ii)供体A及C的提高的微球菌科(Micrococcaceae)水平；(iii)尤其针对供体C观测到的提高的肠球菌科(Enterococcaceae)水平(在远端结肠中进行类似观测，其可解释针对此供体观测到的在处理的最后一周期间提高的乳酸浓度)；及(iv)供体C的提高的互养菌科(Synergistaceae)水平。由于互养菌科为远端结肠区的主要定殖物，因此在远端结肠腔样本中观测到较强效果，其中针对所测试的所有三个供体观测到互养菌科的强富集。
H.实施例III结果的概述
在对照期期间，在三个不同SHIME单元内酸/碱消耗、气体、SCFA、乳酸及铵产生均极稳定。此指示SHIME模型在其最佳条件下操作，产生稳定结肠微生物群。此稳定性为在处理期间观测到的真正由以对应于2克/天的体内剂量的浓度施用的测试产品引起的任何效果的先决条件。
在起始用结冷胶处理后，对于所测试的所有供体，在处理的最后一周期间近端结肠中碱消耗增加(表明经由SCFA/乳酸产生的微生物发酵)。此外，在远端结肠中观测到碱消耗的轻微即时增加。就气体产生而言，观测到供体依赖性效应，供体B的气体产生稍微增加，而对于其他供体，在产品添加后气体产生减少。
虽然碱消耗及气体产生仅提供对微生物发酵的粗略指示，但SCFA量测提供糖化发酵过程中的更详细洞察。此展现结冷胶主要在近端结肠中发酵，在近端结肠中其立即降低丙酸水平，同时逐渐提高乙酸及丁酸水平。在用结冷胶处理后，供体A的微生物群引起乙酸及丁酸水平两者的最明显提高。此外在远端结肠中，乙酸及丁酸水平在处理过程中逐渐提高，而丙酸水平逐渐降低，接着在处理的最后一周期间提高。针对供体B观测到乙酸产生的最大增加，而供体A引起丁酸水平的最大提高。此外，乳酸浓度整体上保持极稳定。在近端结肠中，对于供体A，乳酸仅在处理的最后一周期间显著增加。在远端结肠中，针对供体C在处理的最后一周期间观测到显著提高的乳酸浓度。
就蛋白分解发酵的标记物而言，因此在近端结肠及远端结肠两者中铵水平对于所测试的所有供体不受影响，不同之处在于对于供体C，在处理的最后一周期间在近端结肠中的轻微提高。这些结果由分支链SCFA水平证实，其中对于所测试的所有供体，在近端结肠及远端结肠两者中在处理即将结束之际观测到仅轻微提高。
16S靶向测序分析展现对于所测试的三个供体，SHIME模型在近端结肠隔室及远端结肠隔室两者中维持多样腔及粘膜微生物群。引起关注地，与对成年人类的发现一致，粘膜微生物群强烈富集有含熟知产生丁酸的物种的科。除粘液层的此物种特异性定殖以外，亦建立微生物定殖的纵向差异(近端结肠对远端结肠)。
就对微生物群落组成的处理效果而言，发现相对于对照期，结冷胶提高所测试的三个供体的肠道微生物群的多样性。此外，因此在主要发酵位点(近端结肠的腔)处，结冷胶在损害拟杆菌门及厚壁菌门的情况下强烈提高放线菌门水平。放线菌门的增加主要与双歧杆菌科的繁殖相关，其与所测试的所有三个供体提高的乙酸水平很好地对应。引起关注地，在结冷胶补充后的双歧杆菌促进效应仅归因于与青春双歧杆菌相关的OTU的增加。对于所测试的所有三个供体，拟杆菌门及厚壁菌门水平的降低主要归因于拟杆菌科及韦荣氏球菌科水平的降低。两种科均含有数种强效丙酸产生者，与在处理期期间观测到的降低的丙酸浓度相关。最后，在利用结冷胶的整个3周处理期中增加的丁酸产生潜在地归因于数种厚壁菌门菌科的产生丁酸的物种的增加，所述科诸如近端结肠腔中的毛螺菌科，远端结肠腔中的胺基酸球菌科、优杆菌科及瘤胃菌科，及环境中的梭菌科。
IV.实施例IV.结冷胶对肠壁功能的影响。
A.引言
肠道中的微生物代表处于宿主与其营养环境界面处的生物活性群落。因此，其深远影响宿主生理及代谢的数个方面。广泛范围的微生物结构组分及代谢物与宿主肠细胞直接相互作用以影响营养摄取及上皮健康。微生物相关分子样式(MAMP)及细菌衍生的代谢物(例如，短链脂肪酸(SCFA))两者活化各种信号传导路径，诸如淋巴细胞成熟作用、上皮健康、神经内分泌信号传导、样式辨识受体(PRR)介导的信号传导及G蛋白偶联受体(GPR)介导的信号传导。继而，这些信号传导路径将决定炎性紧张(inflammatory tone)、能量平衡、肠道运动性及食欲调控(评述于Ha(2014)中)。如今认识到宿主-微生物菌群相互作用失调促成大量疾病(Groschwitz(2009))，包括代谢综合征及肥胖症、诸如克罗恩氏病(CD)及溃疡性结肠炎(UC)的炎性肠道疾病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、乳糜泻、糖尿病、过敏、哮喘及自体免疫疾病。肠上皮屏障失调(可渗透性提高)为这些病症所共有，其引发病变(Fasano(2011))。当肠屏障功能被破坏时，分子运输不再受控，使得腔内含物可进入固有层且活化免疫系统，从而导致不可控免疫反应(被称为“肠漏(leaky gut)”的过程)。肠上皮屏障由细胞间紧密接合，一种机械连接相邻细胞且密封细胞间间隙的复杂蛋白质-蛋白质网络。因此，肠上皮屏障控制免疫耐受与免疫活化之间的平衡，且因此其在“肠漏”发病机制中具有显著作用。这些紧密接合的不当作用或调控似乎造成较大细胞间间隔，允许腔成分通过屏障，伴随连续局部及全身发炎。
B.Caco-2/THP1共培养体外模型
为了模拟宿主与肠道微生物菌群之间的界面，过去数年中已开发出数种体外模型，其包括人源肠上皮样细胞及免疫细胞的使用。本文所用的模型为肠上皮样细胞(Caco-2细胞)及人类单核细胞/巨噬细胞(THP1细胞)的共培养物模型。(参见图14；亦参见Possemiers(2013)Satsu(2006)。)当接种于适合载体时，Caco-2自发分化成成熟肠上皮样细胞，其特征由以下界定：极化、存在绒毛、形成圆顶、存在紧密接合及向量运输及表达顶端刷状缘酶(评述于Sambuy(2005)中)。自患有急性白血病的人类患者分离的THP1单核细胞在12-豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯(PMA)处理后分化成巨噬细胞样细胞。PMA活化的THP1细胞获得巨噬细胞所特有的形态特征，能够粘附于支持物，产生迁移及吞噬作用所必需的片状伪足，且针对toll样受体(TLR)反应预致敏(primed)。(Dumrese(2009)。)紧密接合蛋白质使相邻上皮细胞在一起，从而形成大分子实际上不可渗透的屏障。这些接合的“紧密度”可按跨上皮电阻(TEER)量测，其中高TEER对应于较紧密的屏障。在屏障功能损失后，流体的旁细胞输送(在细胞之间)增加，其可按TEER的降低量测。当将Caco-2细胞置放于PMA活化的THP1细胞顶部上时，其向上清液中分泌细胞因子，所述细胞的单层被破坏。这可能归因于细胞因子介导的密封接合破坏，且可按TEER的降低量测。
在肠道内，化学、机械或病原体触发的屏障破坏会导致细菌自腔流入至固有层中(图15)。这将活化免疫系统，其将自生理“耐受原性(tolerogenic)”发炎切换至有害病理性发炎。发炎信号传导级联将以产生警报分子，诸如促炎细胞因子(例如，肿瘤坏死因子(TNF)-α及白介素(IL)-1β)起始。TNF-α连同干扰素(IFN)-γ由白细胞及CD4+TH(辅助)第1型细胞产生，所述细胞为对抗侵入微生物的关键细胞防御者。这些促炎性细胞因子将诱导趋化因子(例如，IL-8及趋化因子(C-X-C基元)配体(CXCL)-10及粘附分子)产生，所述趋化因子为嗜中性粒细胞募集及活性含氧物(ROS)产生所必需。ROS产生为杀灭侵入细菌及密封上皮壁中的突破口所必需。然而，其亦可导致组织破坏及发炎，引起藉由抗炎性细胞因子，如IL-6及IL-10的产生消退炎症的需要。
IL-6具有促炎特性及抗炎特性两者。Scheller(2011)。IL-6经由单核细胞趋化蛋白(MCP)-1的活化引起单核细胞/巨噬细胞募集，其促进嗜中性粒细胞的清除。IL-6亦能够抑制诸如IL-1的促炎细胞因子的产生。此外，IL-6对肠上皮再生及伤口愈合具有正面影响。Dann(2008)。另一方面，IL-6连同转化生长因子(TGF)-β诱导CD4+T的重要亚类，TH17细胞的分化，该细胞在粘膜组织中对抗细胞外微生物的宿主防御中具有关键作用。
IL-10为抗炎细胞因子，能够抑制数种先天性免疫细胞类型及适应性免疫细胞类型。此外，IL-10诱导抗炎分子的活化且增强调节T细胞(Treg)功能，其将恢复免疫稳态。Lyer(2012)。当这些切断机制受损且免疫稳态无法恢复时，肠道病变可发生，其可导致慢性发炎(如见于例如IBD中，IBD的特征由TH1介导的反应的过度活化，亦即TNF-α过度产生界定)。
就炎症而言，TNF-α为由免疫系统产生的最强效且危险的细胞因子之一，因为其施加多效性效应且能够扩增发炎信号传导(图16)。当未经抵消时，TNF-α会导致慢性炎症且在急性炎症的情况下甚至死亡。出于此原因，抗TNF-α疗法在慢性炎性病状，包括IBD及类风湿性关节炎中广泛使用。
Caco-2/THP-1共培养物模型显示亦在IBD患者中观测到的一些特征，且因此，被提出为“IBD样”模型，其可用于测试既可保护肠上皮屏障完整性亦减少发炎的物质的效果。Satsu(2006)。如所述，在此模型中，对肠屏障功能的保护按TEER的提高量测，而抗炎潜能经由对细胞因子轮廓(抗炎细胞因子的增加及促炎细胞因子的减少)的分析测定。
使自SHIME收集的结肠悬浮液与共培养物的顶侧(Caco-2细胞)接触。在底外侧室(其中THP1细胞滞留)上观测到的效应随后由Caco-2细胞产生的信号及/或微分子及大分子的运输间接介导。此方法的独特方面在于以下事实：其允许评估由产品及由肠道微生物群在消化步骤期间产生的发酵衍生的代谢物(因此，不仅由纯产品)诱导。Daguet(2016)。
C.研究目标
此研究部分的目标为在三个不同供体中研究产品结冷胶及其代谢物对肠壁功能的潜在正面影响。细菌与肠壁密切相互作用，因此调节微生物活性可能影响肠壁功能。此将由在体外评估肠上皮渗透性及特定免疫标记物而评定。
D.材料及方法
自上文所描述的SHIME实验收集的样本用于在体外评估发酵产物对肠上皮屏障功能及免疫标记物的影响。这些包括在对照期及处理期结束时收集的来自三个不同供体的近端结肠及远端结肠反应器的样本。
E.Caco-2细胞
如先前所描述执行共培养实验。Daguet(2016)。简言之，将Caco-2细胞(HTB-37；美国典型培养物保藏中心)接种于24孔半透插入物中。将Caco-2单层培养14至21天，伴随每周三次培养基更换，直至获得具有跨上皮电阻(TEER)的功能性细胞单层。将细胞维持在含有葡萄糖及谷氨酰胺且补充有HEPES及20％(v/v)热灭活(HI)胎牛血清(FBS)的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM)中。
F.THP1-BlueTM细胞
将THP1-BlueTM(InvivoGen)细胞维持在含有葡萄糖及谷氨酰胺，补充有HEPES、丙酮酸钠及10％(v/v)HI-FBS的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中。THP1-BlueTM为处于可由转录因子核因子κB(NF-κB)诱导的启动子的控制下表达分泌性碱性磷酸酶(SEAP)基因的报导子构建体稳定转染的THP1人类单核细胞。在TLR活化(例如，由脂多糖(LPS)进行；自革兰氏阴性细菌分离)后，NF-κB变为经活化且诱导SEAP的表达及分泌。随后可藉由使用QUANTI-蓝试剂(InvivoGen)在上清液中量测SEAP活性。将THP1-BlueTM细胞接种于24孔培养板中，且用诱导细胞分化成巨噬细胞样细胞的PMA处理，所述细胞能够粘附且针对TLR信号传导预致敏。
G.Caco-2/THP1-blueTM共培养物
在建立共培养物之前，量测Caco-2单层的TEER(＝0小时时间点)。自所有读数减除空插入物的TEER以考虑插入物的残余电阻。随后，将带有Caco-2的插入物置放于PMA分化的THP1-BlueTM细胞顶部上以供进一步实验，如先前所描述。Possemiers(2013)及Lyer(2012)。
简言之，将顶端隔室(含有Caco-2细胞)用经无菌过滤(0.22μm)的结肠SHIME悬浮液填充，或用不同浓度的活细菌填充。亦将细胞在顶端用丁酸钠(NaB)(Sigma-Aldrich)处理作为阳性对照。将底外侧隔室(含有THP1-BlueTM细胞)用Caco-2完全培养基填充。亦将细胞在两个室中暴露于Caco-2完全培养基作为对照。将细胞处理24小时，其后量测TEER(＝24小时时间点)。在减除空插入物的TEER之后，将所有24小时值相对于其自身0小时值标准化(以考虑不同插入物的初始TEER的差异)，且以初始值的百分比形式呈现。随后，弃去底外侧上清液，且在底外侧用含有超纯LPS(大肠杆菌(Escherichia coli)K12，InvivoGen)的Caco-2完全培养基刺激细胞。亦在底外侧用LPS与氢化可的松(HC)(Sigma-Aldrich)的组合及不含LPS的培养基(LPS-)刺激细胞作为对照。在LPS刺激之后，根据制备商说明书收集底外侧上清液用于细胞因子量测(人类IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、CXCL10及MCP-1，藉由
Figure BDA0003249826240000531
多重分析(Affymetrix-eBioscience)进行)及NF-κB活性。将细胞在37℃下在空气/CO2(95:5，v/v)的增湿气氛中温育。
H.统计学
首先在独立曲线图中呈现实验对照；这些涉及完全培养基对照(CM或LPS-)、经脂多糖(LPS+)处理的细胞及丁酸钠(NaB)及氢化可的松(HC)对照。关于TEER，比较条件CM及NaB，且藉由使用不成对双尾Student氏t检验计算统计显著性。对于免疫标记物(细胞因子/趋化因子及NF-κB活性)，将所有条件(LPS-、LPS+HC及LPS+NaB)与LPS+相比。藉由使用单因子ANOVA(one-way ANOVA)伴随针对LPS+的邓奈特氏多重比较检验(Dunnett's multiplecomparisons test)计算统计显著性。(*)、(**)、(***)及(****)分别代表p<0.05、p<0.01、p<0.001及p<0.0001。
分别地呈现关于SHIME样本的结果。对于两个结肠反应器(近端结肠(PC)及远端结肠(DC))呈现的对照(C)及处理(T)样本视为SHIME实验中的生物三份重复。显示亦作为三个供体的均值的分别三个不同供体的结果。为了评估各处理样本及对照之间TEER、NF-κB活化及细胞因子产生中的差异，执行普通单因子ANOVA伴随塔基氏多重比较检验(Tukey'smultiple comparisons test)(显著性以星号(*)来描绘)。(*)、(**)、(***)及(****)分别代表p<0.05、p<0.01、p<0.001及p<0.0001。使用供Windows使用的GraphPad PrismTM软体7.02版(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)执行所有统计。
I.对照结果
1.跨上皮电阻(TEER)
在24小时共培养物温育之后，完全培养基(CM)对照显示TEER的几乎40％降低，这是由于由PMA活化的THP1细胞诱导的对Caco-2细胞的损害(图17)。如所预期，丁酸钠(NaB；阳性对照)能够保护Caco-2细胞免受此损害且维持单层的TEER。Peng(2007)。注意仅在已在24小时时量测TEER之后添加LPS。然而，预实验已显示所使用的LPS的剂量不显著影响Caco-2细胞的屏障完整性。
2.免疫标记物
针对不同免疫标记物获得的结果可见于图18、图19及图20。如所预期，LPS能够增加NF-κB活化(图18)以及所测试的所有细胞因子(IL-6及IL-10(图19)及IL-1β、IL-8、CXCL10、TNF-α及MCP-1(图20))的分泌。此外，作为皮质类固醇，氢化可的松(HC)藉由抑制LPS诱导的细胞因子及趋化因子(图19及图20)且藉由抑制LPS诱导的NF-κB的转录活性(图18)充当宽免疫抑制剂。相比之下，丁酸钠(NaB)显示标记物依赖性效应。NaB提高NF-κB的转录活性(图18)，其为一种可能由减弱对诸如NF-κB的非组蛋白的组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制活性介导的效应。Glozak(2005)及Vinolo(2011)。另外，NaB显示对一些免疫介体清楚的选择性转录后抑制活性。更具体而言，NaB选择性增加LPS诱导的IL-6及IL-10分泌(涉及免疫稳态)(图19)，同时其选择性抑制LPS诱导的TNF-α(促炎细胞因子)及IL-8、CXCL10及MCP-1(涉及免疫细胞募集的趋化因子)(图20)。
总之，在此实验中所有对照如所预期表现，且针对SHIME样本获得的结果在以下呈现。注意在此实验中，HC及NaB出乎意料地不减少LPS诱导的IL-1β表达。
J.SHIME样本的结果
1.跨上皮电阻(TEER)
将在对照最后一周及处理最后一周期间自所有结肠反应器收集的SHIME样本在过滤(0.22μm)之后稀释(1:5，v/v)于Caco-2完全培养基，且在顶端向共培养物提供持续24小时。
相比于TEER降低大致40％的完全培养基(CM)对照(图17)，自SHIME收集的所有对照及处理样本能够将TEER几乎维持在初始值下(图21)。与对照相比，在所有三个供体的远端结肠样本中针对结冷胶处理观测到TEER的轻微，不过不显著的提高。鉴于针对所有三个供体一致地观测到此提高的事实，可推断在所使用的体外模型中结冷胶发酵具有改善肠上皮屏障功能的潜能。
2.免疫标记物
在用SHIME样本在顶端预处理Caco-2/THP-1-BlueTM共培养物24小时之后，弃去底外侧上清液，且用LPS刺激细胞。在6小时刺激之后，收集底外侧上清液以量测培养基中分泌的细胞因子及趋化因子，且测定NF-κB活性。
当与LPS+对照(红色点线)相比时，所有SHIME样本提高LPS诱导的NF-κB转录活性(图22)。然而，对照样本与处理样本之间不存在统计显著差异。因此，NF-κB活性的提高实际上反映SHIME悬浮液对细胞的效果，而非测试化合物的效果。
类似于针对NF-κB活性所获得的结果，与LPS+对照相比，所有SHIME样本提高LPS诱导的IL-6及IL-10水平(图23)。尽管不显著，但针对远端结肠样本中的所有供体一致地观测到与对照相比，IL-6及IL-10水平的轻微提高。此仅对于供体A中的IL-6水平具有统计显著差异。当分析三个供体的均值时，亦发现此IL-6及IL-10水平提高。引起关注地，当在近端结肠及远端的所有样本中应用成对t检验时，在所测试的三个供体中观测到显著提高的IL-10水平(p<0.05)。
针对IL-1β及TNF-α获得的结果显示于图24中。与LPS+对照(红色点线)相比，所有SHIME样本显然增加IL-1β分泌，然而，除供体B以外，在对照与处理之间未观测到IL-1β水平的差异，在供体B中对于近端结肠反应器在处理后观测到IL-1β水平的显著提高。当分析三个供体的均值时，在对照与处理之间未发现IL-1β分泌的显著差异。
与其对照相比，对于供体A及供体B但不对于供体C，近端结肠及远端结肠样本中LPS诱导的TNF-α水平降低。当观测三个供体的均值时，与对照相比，TNF-α分泌的轻微减少见于近端结肠样本中，但未观测到静态显著差异。
如图25中所见，对于三个供体中的两个的远端结肠样本，与对照相比，在结冷胶添加后IL-8分泌倾向于减少。然而，此差异不显著。
在用结冷胶处理之后，对于所有供体的远端结肠样本，LPS诱导的CXCL10水平倾向于稍微提高。在近端结肠样本中，仅一个供体在处理后显示CXCL10表达的轻微减少。对于近端结肠，在处理之后MCP-1水平倾向于稍微降低。相比之下，针对所有供体的远端结肠反应器观测到清楚的提高。然而，未获得显著性。
总之，尽管结冷胶对肠上皮屏障功能具有轻微效果，但其倾向于增加抗炎细胞因子IL-6及IL-10的表达。一些条件倾向于减少促炎细胞因子及趋化因子产生。然而，在处理与对照之间仅可发现一些统计显著差异。
为了具有与对照相比由处理样本诱导是变化的概览，对于近端结肠及远端结肠反应器将三个供体是SHIME处理样本的均值相对于SHIME对照样本的均值标准化且绘制于表16中。
表16.来自相对于SHIME对照样本的均值标准化的三个供体的SHIME处理样本的均值的细胞实验结果。
结肠 TEER NF-κB IL-6 IL-10 IL-1P TNF-α IL-8 CXCL10 MCP-1
近端 1.00 1.01 0.90 1.06 1.28 0.88 1.06 0.97 0.85
远端 1.04 0.99 1.16 1.09 0.93 0.98 0.93 1.12 1.31
一般而言，可合理地说与对照相比，处理样本中的免疫标记物变化相当温和。如表16中所见，结冷胶似乎在两个结肠反应器中增强IL-10分泌且减少TNF-α分泌。仅对于远端结肠样本，IL-8分泌稍微减少而IL-6增加。对于近端结肠样本，IL-1β分泌似乎增加，但这些结果受仅一个供体中IL-1β的显著增加影响。对于近端结肠样本，MCP-1分泌藉由结冷胶处理减少，但对于远端结肠样本增加。
K.实施例IV结果的概述
此研究部分的目标为研究结冷胶及其代谢物对就调节肠漏病状而言的肠壁功能的潜在正面影响。这藉由在体外评估肠上皮渗透性及特定免疫标记物进行。
在结肠中发酵后，结冷胶倾向于改善就TEER而言的肠屏障完整性。尽管增加不显著，但当将远端结肠样本暴露于体外模型时针对所有三个供体观测到一致增加。此外，产品倾向于具有免疫抑制特性，引起降低已知在嗜中性粒细胞募集中起作用的数种免疫介体，包括促炎细胞因子TNF-α及趋化蛋白IL-8的水平的倾向。在结冷胶处理之后，对于远端结肠反应器，促进嗜中性粒细胞清除的MCP-1倾向于增加。另一方面，真实(bona fide)抗炎细胞因子IL-10倾向于增加，且涉及伤口修复的细胞因子IL-6倾向于增加。所有这些报告变化主要在远端结肠反应器中观测到，由此表明在结肠的远端区中结冷胶的发酵产物对宿主免疫细胞的较明显影响。
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本领域技术人员可作出仍会被本文的公开内容涵盖的替代实施方案、实例及修改，尤其是在依据前述教示内容下。此外，应理解，用于描述本文的公开内容的术语意欲为说明而非限制性的。
美国临时申请案第62/794,452号及第62/869,248号的主题以全文引用的方式并入本文中。另外，本文中所描述的参考文献以全文引用的方式并入，至必需程度。在并入术语与本文中所公开的术语之间存在含义差异的情况下，应以本文中所公开的术语的含义为准。
本领域技术人员亦将了解，在不脱离本文的公开内容的范围及精神的情况下，可作出上文所描述的优选及替代实施方案的各种修编及修改。因此，应理解，在所附权利要求书的范围内，本文的公开内容可以本文中所具体描述者以外的方式实现。

Claims (24)

1.一种可摄取组合物，其包含益生元有效量的鞘胺醇胶(sphingan)。
2.权利要求1的可摄取组合物，其中该鞘胺醇胶的量选自约1g至约10g、约1g至约9g、约1g至约8g、约1g至约7g、约1g至约6g、约1g至约5g、约1g至约4g、约1g至约3g、或约2g。
3.权利要求1至2中任一项的可摄取组合物，其中该鞘胺醇胶包含选自以下的高、中或低酰基鞘胺醇胶：高酰基结冷胶(gellan)、中酰基结冷胶、低酰基结冷胶、高酰基威兰胶(welan)、中酰基威兰胶、低酰基威兰胶、高酰基鼠李糖胶(rhamsan)、中酰基鼠李糖胶、低酰基鼠李糖胶、高酰基迪特胶(diutan)、中酰基迪特胶、低酰基迪特胶、S-88、S-198、S-7、或其组合。
4.权利要求1至2中任一项的可摄取组合物，其中该鞘胺醇胶包含高酰基鞘胺醇胶多糖、中酰基鞘胺醇胶多糖、低酰基鞘胺醇胶多糖、或其组合。
5.权利要求1至2中任一项的可摄取组合物，其中该鞘胺醇胶包含高酰基鞘胺醇胶寡糖、中酰基鞘胺醇胶寡糖、低酰基鞘胺醇胶寡糖、或其组合。
6.权利要求1至2中任一项的可摄取组合物，其中该鞘胺醇胶包含藉由包含以下的方法获得的高、中或低酰基鞘胺醇胶寡糖(SOS)：
制备第一组合物，该第一组合物包含高/中/低酰基鞘胺醇胶或高/中/低酰基鞘胺醇胶多糖及液体介质；
水解该高/中/低酰基鞘胺醇胶或该高/中/低酰基鞘胺醇胶多糖的糖苷键以获得第二组合物；
使该第二组合物经历超过滤、大小排阻层析、沉淀、离心、或其组合以获得包含该高/中/低酰基SOS的第三组合物；及
可选地分离或回收该第三组合物。
7.权利要求1至2及5至6中任一项的可摄取组合物，其中该鞘胺醇胶包含选自以下的高/中/低鞘胺醇胶寡糖：
(i)包含以下的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、或其组合；
(ii)包含以下的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、含乙酸盐/酯及/或甘油酸盐/酯的四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、含乙酸盐/酯及/或甘油酸盐/酯的八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc,GlcA、Glc,Rha；
(iii)包含以下的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、五聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc)、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Glc,GlcA；
(iv)包含以下的组合物：Glc(Glc-Glc),GlcA、Glc(Glc-Glc)、GlcA,Glc、Glc,Glc；
(v)包含以下的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、GlcA,Glc,(Rha-Rha)、Glc,(Rha-Rha),Rha、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc、GlcA,Glc；
(vi)包含以下的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、或其组合；
(vii)包含以下的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Rha、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、或其组合；
(viii)包含以下的组合物：Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,Rha；
(ix)包含以下的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rhaa、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、或其组合；
或其组合。
8.一种方法，其用于
(A)促进哺乳动物结肠中的有益细菌生长，该方法包含按有效时程摄取有益细菌生长有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质；
(B)降低哺乳动物结肠中的丙酸水平及/或提高哺乳动物结肠中的丁酸水平，该方法包含：按有效时程摄取包含有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质的组合物；
(C)改善哺乳动物结肠中的肠屏障完整性，该方法包含：按有效时程摄取包含肠屏障完整性有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质的组合物；或
(D)降低哺乳动物结肠中的TNF-α水平及/或IL-8水平，该方法包含：按有效时程摄取包含TNF-α及/或IL-8降低有效量的鞘胺醇胶及可摄取介质的组合物。
9.权利要求8的方法，其中该哺乳动物是人类，且该鞘胺醇胶的量选自约10mg/kg至约150mg/kg、约10mg/kg至约140mg/kg、约10mg/kg至约130mg/kg、约10mg/kg至约120mg/kg、约10mg/kg至约110mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约10mg/kg至约90mg/kg、约10mg/kg至约80mg/kg、约10mg/kg至约70mg/kg、约10mg/kg至约60mg/kg、10mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约40mg/kg、或约20mg/kg至约30mg/kg摄取该组合物的人类。
10.权利要求8至9中任一项的方法，其中该鞘胺醇胶包含选自以下的高、中或低酰基鞘胺醇胶：高酰基结冷胶、中酰基结冷胶、低酰基结冷胶、高酰基威兰胶、中酰基威兰胶、低酰基威兰胶、高酰基鼠李糖胶、中酰基鼠李糖胶、低酰基鼠李糖胶、高酰基迪特胶、中酰基迪特胶、低酰基迪特胶、S-88、S-198、S-7、或其组合。
11.权利要求8至9中任一项的方法，其中该鞘胺醇胶包含高酰基鞘胺醇胶多糖、中酰基鞘胺醇胶多糖、低酰基鞘胺醇胶多糖、或其组合。
12.权利要求8至9中任一项的方法，其中该鞘胺醇胶包含高酰基鞘胺醇胶寡糖、中酰基寡糖、低酰基鞘胺醇胶寡糖、或其组合。
13.权利要求8至9中任一项的方法，其中该鞘胺醇胶包含藉由包含以下的方法获得的高、中或低酰基鞘胺醇胶寡糖(SOS)：
制备第一组合物，该第一组合物包含高/中/低酰基鞘胺醇胶或高/中/低酰基鞘胺醇胶多糖及液体介质；
水解该高/中/低酰基鞘胺醇胶或该高/中/低酰基鞘胺醇胶多糖的糖苷键以获得第二组合物；
使该第二组合物经历超过滤、大小排阻层析、沉淀、离心、或其组合以获得包含该高/中/低酰基SOS的第三组合物；及
可选地分离或回收该第三组合物。
14.权利要求8至9及12至13中任一项的方法，其中该鞘胺醇胶包含选自以下的高/中/低酰基鞘胺醇胶寡糖：
(i)包含以下的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、或其组合；
(ii)包含以下的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、含乙酸盐/酯及/或甘油酸盐/酯的四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、含乙酸盐/酯及/或甘油酸盐/酯的八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc,GlcA、Glc,Rha；
(iii)包含以下的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、五聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc)、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Glc,GlcA；
(iv)包含以下的组合物：Glc(Glc-Glc),GlcA、Glc(Glc-Glc)、GlcA,Glc、Glc,Glc；
(v)包含以下的组合物：四聚体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、GlcA,Glc,(Rha-Rha)、Glc,(Rha-Rha),Rha、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc、GlcA,Glc；
(vi)包含以下的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、或其组合；
(vii)包含以下的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Rha、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、或其组合；
(viii)包含以下的组合物：Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,Rha；
(ix)包含以下的组合物：Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rhaa、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax(其中x是4至约25)、或其组合；
或其组合。
15.权利要求8的方法，其中该鞘胺醇胶包含天然鞘胺醇胶且该细菌是双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)。
16.权利要求15的方法，其中该鞘胺醇胶包含结冷胶。
17.权利要求8的方法，其中该哺乳动物是人类且近端结肠的腔中的双歧杆菌科水平提高的范围是：(a)与对照相比，在处理期间约20％至约180％或(b)与未处理对照相比，在处理期间约330％至约590％。
18.权利要求8的方法，其中该哺乳动物是人类且该鞘胺醇胶包含高/低酰基鞘胺醇胶寡糖且该细菌是布劳特氏菌属(Blautia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、梭菌属(Clostridium)XVIII、或其组合。
19.权利要求18的方法，其中发生以下中的一或多者：
(a)与未处理对照相比，布劳特氏菌属水平提高达至少约5倍；
(b)与未处理对照相比，副拟杆菌属水平提高约2倍至约40倍；
(c)与未处理对照相比，在处理期间粪杆菌属水平提高约10倍至约190倍；及
(d)与未处理对照相比，梭菌属XVIII水平提高约12倍至约60倍。
20.一种用于制备如前述权利要求中任一项中的高/中/低酰基鞘胺醇胶寡糖(“SOS”)的方法，该方法包含：
制备第一组合物，该第一组合物包含高/中/低酰基鞘胺醇胶或高/中/低酰基鞘胺醇胶多糖及液体介质；
水解该高/中/低酰基鞘胺醇胶或该高/中/低酰基鞘胺醇胶多糖的糖苷键以获得第二组合物；
使该第二组合物经历超过滤、大小排阻层析、沉淀、离心、或其组合以获得包含该高/中/低酰基SOS的第三组合物；及
可选地分离或回收该第三组合物。
21.权利要求20的方法，其中所述水解由酸、酶、超声处理、高压均质化、辐射、或其组合介导。
22.权利要求21的方法，其中该酶是结冷胶酶(gellanase)、鼠李半乳糖醛酸(rhamnogalacturonan)内裂合酶(EC 4.2.2.23)、鼠李半乳糖醛酸外裂合酶(EC4.2.2.24)、结冷胶裂合酶(EC 4.2.2.25)、或其组合。
23.权利要求21的方法，其中所述经历包含将该第二组合物通过截留分子量为约5kDa或约10kDa的膜过滤以获得包含该第三组合物的滤液。
24.一种组合物，其包含如藉由权利要求20至23中任一项制备的SOS。
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