JP2022517237A - プレバイオティック組成物およびその使用 - Google Patents

プレバイオティック組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

スフィンガンを含む摂取可能な組成物およびプレバイオティクスとしてのその使用をここに開示する。

Description

関連出願
この出願はPCT国際特許出願として2020年1月15日付けで出願されており、および2019年1月18日付けで出願された米国仮出願第62/794,452号および2019年7月1日付けで出願された米国仮出願第62/869,248号に対して優先権を主張し、それらの開示は参照によってそれらの全体をここに組み込む。
本発明の分野
ここに開示するのはスフィンガンを含む取込み可能な組成物およびプレバイオティクスとしてのその使用である。
ヒトの胃腸管は高度に複雑な微生物生態系であり、それは著しく安定していることが示された。（Zoetendal（ズーテンダール）（1998））。宿主の健康に有益である仕方において消化管フローラ（gut flora、腸内細菌叢などとも言う）を調節するために多くの異なるアプローチが使用された。（例は、Bielecka（ビエレッカ）（2002）およびSteer（スティア）（2000）を参照）。これらの異なるアプローチには、食物への生きた微小有機体の追加（プロバイオティクス）、宿主内の選択的に有益な細菌を刺激するための食物成分または食物繊維の追加（プレバイオティクス）、およびプロバイオティクスとプレバイオティクスの双方の組合せ（シンバイオティクス）が含まれる。
プレバイオティクスは健康上の利益をもたらす宿主の微小な有機体によって選択的に使用される非消化性基質である。（Gibson（ギブソン）（2017））。消化管におけるプレバイオティック効果は健康促進細菌、例えば、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の細菌などのようなものの増殖、腸内病原菌における減少、および健康関連細菌代謝産物の生産における増加または減少に基づいて評価することができる。選定されたプレバイオティクス（例えば、イヌリン、フラクトオリゴ糖類、ガラクトオリゴ糖類、ラクツロース、およびアラビノオリゴ糖類などのようなもの）のプレバイオティックな/ビフィドジェニックな性質は以前の研究において示唆および/または確認された。（例は、Guimaraes（ギマランイス）（2018）、Karltohn-Senaye（カールトン-セナエ）（2013）、Patel（パテル）（2013）、Saavedra（サアベドラ）（2002）、Tuohy（トゥーイ）（2001）、Tuohy（2002）、US8313789B2（米国特許第8313789 B2号）、US20100092440A1（米国特許出願公開第20100092440 A1号）、およびWO2004002240A2（国際公開第2004002240 A2号）を参照）。
概して、スフィンガンは大抵、[(→3)Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha(α1→)]nとして描かれる以下の置換または非置換四量体糖類から構成される多糖類である。既知のスフィンガンには、例えば、ゲラン（S-60）、ウェラン（S-130）、ラムサン（S-194）、およびジウタン（S-657）が含まれる。
ゲラン（ゲランガムまたはS-60）は種Sphingomonas elodea（スフィンゴモナス・エロディア）（以前はPseudomonas elodea（シュードモナス・エロディア））の株、例えば、株ATCC 31461によって生産される。（例は、Morrison（モリソン）（2016）、Sworn（スウォーン）（2009）、およびUS4326053A（米国特許第4326053A号）を参照）。ゲランガムの普通の形態には、高アシル（aka（別名）native（ネイティブ、自然な））、未清澄化（例は、KELCOGEL(R)（(R)は米国等での登録商標表示）（ケルコゲル）LT100ゲラン）、および低アシル、未清澄化（例は、KELCOGEL(R)LTゲラン）、および低アシル、清澄化（例は、KELCOGEL(R)およびKELCOGEL(R)Fゲランガム）が含まれる。（Sworn（2009））。複数の特殊グレードも利用でき、例えば、高アシル、PHBフリー、清澄化（例は、KELGOGEL(R)HTゲラン）および低アシル、清澄化（二重沈殿化）（例は、GELRITETM（TMは米国等でのトレードマーク表示）（ゲルライト）MKゲラン）である。ゲランの自然なまたは高アシルの形態には、（1→3）Glcユニット上に二つのアシル置換基（O6でのアセタートおよびO2でのグリセラート）が含まれ、および平均して、四量体あたり一つのグリセラートおよび二つの四量体あたり一つのアセタートがある。（Kuo（クオ）（1986））。低アシルゲランでは、グリセラートおよびアセタートは存在しない。ゲランガムはまた中間グリセラートおよびアセタート内容物と共に生産することもできる。減少したグリセラートおよびアセタート内容を有する商業上の生産物はKELCOGEL(R)DGAゲランである。
ゲランガムは大抵、一定の取込み可能な生産物においてゲル化剤または懸濁剤として機能し、および0.02から0.5％w/vまでに及ぶレベルにて存在する。（例は、Fallourd（ファロウ）（2009）、Morrison（2016）、Sworn（2009）、US6602996B1（米国特許第6602996 B1号）、US6663911B2、US5342626A、US8513408B2、およびUS20080008814A1を参照）。食品添加物としてのその承認に先立ち、調査はラットおよびヒトに投与したときのゲランガムの安全性を評価した。（例は、Anderson（アンダーソン）（1988）およびEdwards（エドワーズ）（1995）を参照；またAnderson（1990）も参照）。例として、Edwards（1995）はWistar（ウィスター）ラットに50g/kg/dのゲランガムを含む食餌を28日間給餌することを説明する。（基準点として、ラットにおける50g/kgは約8g/kgのヒトの等価量に対応する。（例は、FDA Guidance（FDAガイダンス）（2005）を参照）。興味深いことに、Edwards（1995）はゲランガムが盲腸の（cecal）または糞便の短鎖脂肪酸（SCFAs、例えば、アセタート、プロピオナート、およびブチラートなどのようなもの）に一貫した影響を及ぼさないと結論付けた。さらに、Anderson（1988）はヒトのボランティアが固定投薬スケジュールに従って175mg/kg/dの7日間、続いて追加の200mg/kg/dの16日間のゲランガムの量をさらに摂取した調査について説明する。（60-kgないし75-kgのヒトの体重範囲について、175mg/kgは10.5ないし13-gの範囲に対応し、その一方で200mg/kgは12-gないし15-gの範囲に対応する）。そこにおいて提示された結果に基づき、Anderson（1988）はゲランガムの取込みは食餌または生理学的な悪影響をいずれも引き起こさないと結論付けた。さらに、Anderson（1988）はゲランガムが糞便の増量効果を示したと結論付けた。Anderson（1988）によって観察された糞便の増量効果と一致して、その後の研究はゲランガムがネコにおいて下痢を軽減することを示した。（US9028861B2）。Tetsuguchi（テツグチ）（1997）を参照して、Li（リー）（2019）はTetsuguchi（1997）がゲランオリゴ糖類の腸のプレバイオティック効果を明白に評価しなかったのではあるが、ゲランオリゴ糖類が伝えられるところによれば腸のプレバイオティック効果を有することを説明または証拠なしに述べている。現在まで、ゲランガムまたはゲランガムに由来するオリゴ糖類がプレバイオティック薬剤として機能するかどうかを明確に論証した研究はない。
ウェラン（ウェランガムまたはS-130）はスフィンゴモナス属種（Sphingomonas sp.）によって生産される。（例は、ATCC 31555）。（US4342866AおよびUS5175277A）。ウェラン(l→4)Glcユニットのおおよそ3分の2はO3にてα-L-ラムノピラノシル基（即ち、Rha(αl→)）によって置換され、その一方で残りのウェラン(l→4)Glcユニットはα-L-マンノピラノシル基（即ち、Man(αl→)）によって置換される。（Stankowski（スタンコウスキー）（1992））。追加的に、ウェランの(1→3)GlcユニットはO2にてアセチルによって置換され得る。（Stankowski（1992））。
ラムサン（ラムサンガムまたはS-194）はスフィンゴモナス属種によって生産される。（例は、ATCC 31961）。（US4401760A）。ラムサンは(1→3)Glc-ユニットのO6位置にてD-Glc(β1→6)-D-Glc(β1→6)によって置換される。（Jansson（ヤンソン）（1986））。ラムサンは繰り返し単位ごとに一つのO-アセチル基を含み、二次的位置（secondary positions）にわたって分布する。（Jansson（1986））。
ジウタン（ジウタンガムまたはS-657）は、スフィンゴモナス属種によって生産される。（例は、ATCC 53159）。（US5175278AおよびUS20130189748A1）。ジウタンの（l→4）Glc-ユニットはO3にてRha(αl→4)-Rha(αl→）によって、O6にてアセチルによって、および(l→3)Glc-ユニットのO2にておよび/またはO6位置にてアセチルによって可変な程度に置換される。（Diltz（ディルツ）（2001））。
概略
ここに開示するのはスフィンガンを含む取込み可能な組成物およびプレバイオティクスとしてのその使用である。
略語
以下のテキストには、多数の省略語が含まれる。ここに開示する選定した用語の略語を以下に明らかにする。
A：ドナーA（雌性、28歳）
Ac：アセタート
B：ドナーB（雌性、41歳）
b-SCFA：分枝短鎖脂肪酸（例は、イソブチラート、イソバレラート、およびイソカプロラート）
C：ドナーC（雌性、34歳）
Cl：コントロール期間1
C2：コントロール期間2
CON（ave）：コントロール期間1および2についての平均値濃度
CD：クローン病
DC：遠位結腸反応器
DP：重合度
Glc：D-グルコピラノシル
GlcA：D-グルコピラノシルウロン酸
Glyc：L-グリセラート
GPRs：Gタンパク質共役型受容体
HA：高アシル
HA/LA：高アシルまたは低アシル
IBDs：炎症性腸疾患
IBS：過敏性腸症候群
IFN：インターフェロン
IL：インターロイキン
LA：低アシル
LCSs：長鎖スフィンガン
LPS：リポ多糖類
MAMPs：微生物関連の分子パターン
Man：L-マンノピラノシル
mM：ミリモル（即ち、1リットルあたりのミリモル）
MN：数平均分子量
MW：重量平均分子量
NaB：酪酸ナトリウム
OTU：運用分類単位
PHB：ポリヒドロキシブチラート
PC：近位結腸
PRRs：パターン認識受容体
Rha：L-ラムノピラノシル
ROS：活性酸素種（Reactive Oxygen Species）
SCFA：短鎖脂肪酸（例は、アセタート、プロピオナート、およびブチラート）
SHIME：ヒトの腸内微生物生態系のシミュレーター
SOS：スフィンガンオリゴ糖類
SPS：スフィンガン多糖類
TEER：経上皮電気抵抗
四量体：[Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha]、Glc,GlcA,Glc,RhaまたはGlc2,GlcA,Rha
八量体：[Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha]2 Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,RhaまたはGlc4,GlcA2,Rha2
SEC：サイズ排除クロマトグラム
TGF：トランスフォーミング増殖因子
TLR：トール様受容体
TNF：腫瘍壊死因子
TR1：処置期間1
TR2：処置期間2
TR3：処置期間3
TRT（ave）：処置期間1、2、および3の平均濃度値
UC：潰瘍性大腸炎
図１ａは、高アシルゲランから導き出される酸（SN9、実線）および酵素処理（SN18、破線）スフィンガンのポリ-およびオリゴ糖類についてのサイズ排除クロマトグラムであり、Pullulan（プルラン）分子量の標準溶出時間（すなわち、>50kDa（6.5分、塗りつぶされた正方形（黒四角））、12kDa（8.8分、塗りつぶされた円（●））、5kDa（9.3分、塗りつぶされた三角形（黒三角））、1kDa（10分、空の正方形（□））、342Da（10.65分、空の円（○））、および180Da（11.15分、空の三角形（△）））が示される。図１ｂは、低アシルゲランから導き出される酸（SN10、実線）および酵素処理（SN17、破線）スフィンガンのポリ-およびオリゴ糖類についてのサイズ排除クロマトグラムであり、プルラン分子量の標準溶出時間（すなわち、>50kDa（6.5分、塗りつぶされた正方形（黒四角））、12kDa（8.8分、塗りつぶされた円（●））、5kDa（9.3分、塗りつぶされた三角形（黒三角））、1kDa（10分、空の正方形（□））、342Da（10.65分、空の円（○））、および180Da（11.15分、空の三角形（△）））が示される。 図２ａは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についての近位結腸（PC）反応器のためのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる平均アセタート産生（mM）であり、そこで*は先行する期間と比較して統計的に有意な差を指し示し、その一方で異なる文字は異なる処置間の統計的な差を指し示す；p<0.05。図２ｂは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についての遠位結腸（DC）反応器のためのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる平均アセタート産生（mM）であり、そこで*は先行する期間と比較して統計的に有意な差を示し、その一方で異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。 図３ａは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる近位結腸（PC）反応器における平均プロピオナート産生（mM）であり、そこで*は先行する期間と比較して統計的に有意な差を示し、その一方で異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。図３ｂは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる遠位結腸（DC）反応器における平均プロピオナート産生（mM）であり、そこで*は先行する期間と比較して統計的に有意な差を示し、その一方で異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。 図４ａは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる近位結腸（PC）反応器における平均ブチラート産生（mM）であり、そこで*は先行する期間と比較して統計的に有意な差を示し、その一方で異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。図４ｂは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる遠位結腸（DC）反応器における平均ブチラート産生（mM）であり、そこで*は先行する期間と比較して統計的に有意な差を示し、その一方で異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。 図５ａは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる近位結腸（PC）反応器における平均ラクタート産生（mM）であり、そこで異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。図５ｂは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる遠位結腸（DC）反応器における平均ラクタート産生（mM）であり、そこで異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。 図６ａは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる近位結腸（PC）反応器における平均アンモニウム産生（mM）であり、そこで異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。図６ｂは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる遠位結腸（DC）反応器における平均アンモニウム産生（mM）であり、そこで異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。 図７ａは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる近位結腸（PC）反応器における平均分枝SCFA産生（mM）であり、そこで異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。図７ｂは、三体の異なるドナー（A、B、およびC）についてのコントロール（CON(ave)、n=6）および処置（TRT(ave)、n=9）期間にわたる遠位結腸（DC）反応器における平均分枝SCFA産生（mM）であり、そこで異なる文字は異なる処置間の統計的な差を示す；p<0.05。 三名の異なるヒトドナー（n=1）についてのゲランガムによるコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1、TR2およびTR3）期間の間の異なる時点でのSHIMEの近位（PC）または遠位結腸（DC）の内腔および粘液における相互シンプソン多様性指数である。陰影の強度は各々の三体の異なるドナーに対して（即ち、各行内で）正規化された絶対多様度指数を指し示す。 三名の異なるヒトドナー（n=1）についてのゲランガムによるコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1、TR2およびTR3）期間の間の異なる時点でのSHIMEの近位（PC）または遠位結腸（DC）反応器のいずれかの内腔または粘液における優位な門の存在量（Abundance）（%）である。N.B.（注意）一つのサンプルは明らかな孤立値（outlier）であり、および従ってコントロールサンプル、即ち、第二のコントロール週（C2）の間のドナーAのPCにおける粘膜サンプルのこの分析から削除した。 三名の異なるヒトドナー（n=1）についてのゲランガムによるコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1、TR2およびTR3）期間の間の異なる時点でのSHIMEの近位結腸（PC）反応器の内腔における特定の門に属する異なる科の存在量（%）である。陰影の強度は各々の異なる科に対して（即ち、各行内で）正規化された絶対存在量を指し示す。陰影の強度は各々の異なる科に対して（即ち、各行内で）正規化された絶対存在量を指し示す。 三名の異なるヒトドナー（n=1）についてのゲランガムによるコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1、TR2およびTR3）期間の間の異なる時点でのSHIMEの遠位結腸（DC）反応器の内腔における特定の門に属する異なる科の存在量（%）である。陰影の強度は各々の異なる科に対して（即ち、各行内で）正規化された絶対存在量を指し示す。 三名の異なるヒトドナー（n=1）についてのゲランガムによるコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1、TR2およびTR3）期間の間の異なる時点でのSHIMEの近位結腸（PC）反応器の粘液における特定の門に属する異なる科の存在量（%）である。陰影の強度は各々の異なる科に対して（即ち、各行内で）正規化された絶対存在量を指し示す。備考として、一つのサンプルは明らかな孤立値であり、および従ってコントロールサンプル、即ち、第二のコントロール週（C2）の間にドナーAのPCにおいて粘膜サンプルのこの分析から削除した。 三名の異なるヒトドナー（n=1）についてのゲランガムによるコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1、TR2およびTR3）期間の間の異なる時点でのSHIMEの遠位結腸（DC）反応器の粘液における特定の門に属する異なる科の存在量（%）である。陰影の強度は各々の異なる科に対して（即ち、各行内で）正規化された絶対存在量を指し示す。 Caco-2およびTHP1細胞の共培養の概略図である。Caco-2細胞は半透膜上に播種し、それはTHP1細胞と共に播種されるウェルの上に配置する。これにより頂端（apical）（AP）および側底（basolateral）（BL）区画が作り出される。Caco-2細胞の単層は高分子に対するバリアを作り出し、および細胞間空間間の小分子の受動輸送および細胞膜を横切る微小および高分子の能動輸送による通過を可能にする。双方の細胞タイプの共培養によりCaco-2細胞と接触している内腔内容物および免疫細胞（THP1）と接触している腸周囲内容物間の間接的なクロストークが可能になる。加えて、上皮細胞によって使用/形質転換される代謝物は免疫細胞応答を調節し得、および逆もまた同様である。 腸上皮バリアの損傷の際にシグナル伝達カスケードが活性化され、腸管細胞壁を破る内腔内容物がもたらされる。IFN-γ：インターフェロンガンマ；IL：インターロイキン；MCP-1：単球走化性タンパク質1；ROS：活性酸素種；TGF-β：トランスフォーミング増殖因子ベータ；TH：ヘルパーT細胞;TNF-α：腫瘍壊死因子アルファ；Treg：調節性T細胞。 炎症につながるLPSおよびTNF-αシグナル伝達経路である。AP-1：アクチベータータンパク質1（転写因子）；IL：インターロイキン、LPS：リポ多糖類；NF-κB：核因子カッパB（転写因子）；TLR4：トール様受容体4（LPS受容体）；TNF-α：腫瘍壊死因子アルファ；TNFR：TNF-α受容体。 コントロールテストCMおよびNaBでの経上皮電気抵抗（TEER）である。TEERはCaco-2/THPl-BlueTM（Caco-2/THPl-ブルー）共培養の処置の24時間後に測定し、および各24時間の値は対応する0h（0時間）値に正規化し、および初期値のパーセンテージとして示す。点線は100％（初期値）を表す。データは平均±SEMとしてプロットする。（*）はCMおよびNaB間の統計的有意差を表す。（****）=p<0.0001。CM：完全な媒体；NaB：酪酸ナトリウム。 コントロールテストLPS-、LPS+、LPS+HCおよびLPS+NaBにおけるTHP1-BlueTM細胞の側底NF-κB活性である。NF-κB活性は側底側にてCaco-2/THPl-BlueTM共培養物のLPS処置の6時間後、頂端側でのNaBまたは完全媒体による24時間の前処置後に測定した。データを平均±SEMとしてプロットする。（*）はLPS+と比較した統計的有意差を表す。（*）=p<0.05；（****）=p＜0.0001。LPS-：完全媒体で処置した細胞（LPSなし）。LPS+：LPS-処置細胞；HC：ヒドロコルチゾン；NaB：酪酸ナトリウム。 コントロールテストLPS-、LPS+、LPS+HCおよびLPS+NaBにおけるIL-6（A）およびIL-10（B）の側底分泌である。サイトカインは側底側でのCaco-2/THPl-BlueTM共培養物のLPS処置の6時間後、頂端側でのNaBまたは完全媒体による24時間の前処置後に測定した。データは平均±SEMとしてプロットする。（*）はLPS+と比較した統計的有意差を表す。（***）=p＜0.001；（****）=p＜0.0001。LPS-：完全媒体で処置した細胞（LPSなし）。LPS+：LPS処置細胞；HC：ヒドロコルチゾン；NaB：酪酸ナトリウム。 コントロールテストLPS-、LPS+、LPS+HCおよびLPS+NaBにおけるIL-1β（A）、IL-8（B）、CXCL10（C）、TNF-α（D）およびMCP-1（E）の側底分泌である。サイトカインはCaco-2/THPl-BlueTM共培養物のLPS処置の6時間後、NaBまたは頂端側の完全培地で24時間前処置した後、側底側にて測定した。データは平均±SEMとしてプロットする。（*）はLPS+と比較した統計的有意差を表す。（*）=p＜0.05；（**）=p＜0.01；（***）=p＜0.001；（****）=p＜0.0001。LPS-：完全媒体で処置した細胞（LPSなし）。LPS+：LPS処置細胞；HC：ヒドロコルチゾン；NaB：酪酸ナトリウム。 Caco-2/THPl-BlueTM共培養の経上皮電気抵抗（TEER）に対するSHIMEサンプルの影響である。結果は三体の異なるドナーについて別々に（A）、および三体のドナーの平均として（B）示す。TEERは共培養の処置の24時間後に測定し、および各24時間の値はその対応する0h値に正規化し、および初期値のパーセンテージとして示す。グレーの点線は100％（初期値）を表す。点線は実験コントロールCM（完全媒体）に対応する。データは平均±SEMとしてプロットする。三体の異なるドナーのコントロールおよび処置の間に有意差は見られなかった。PC：近位結腸サンプル；DC：遠位結腸サンプル。 THP-1-BlueTM細胞のNF-κB活性に対するSHIMEサンプルの影響である。結果は三体の異なるドナーについて別々に（A）、および三体のドナーの平均として（B）示す。NF-κB活性レベルはSHIMEサンプルにより24時間頂端側の前処置後のCaco-2/THP-1-BlueTM共培養の側底側でのLPS処置の6時間後に測定した。点線は実験コントロールLPS+に対応する。データは平均±SEMとしてプロットする。三体の異なるドナーのコントロールおよび処置間に有意差は見られなかった。PC：近位結腸サンプル；DC：遠位結腸サンプル。 IL-6（AおよびB）およびIL-10（CおよびD）の分泌に対するSHIMEサンプルの影響である。結果は三体の異なるドナーについて別々に（AおよびC）および三体のドナーの平均として（BおよびD）示す。サイトカインレベルはSHIMEサンプルにより24時間頂端側の前処置後、Caco-2/THP-1-BlueTM共培養の側底側にてLPS処置6時間後に測定した。点線は実験コントロールLPS+に対応する。データは平均±SEMとしてプロットする。（*）はコントロールと比較した統計的に有意な差を表す。（*）=p＜0.05。PC：近位結腸サンプル；DC：遠位結腸サンプル。 IL-1β（A+B）およびTNF-α（C+D）の分泌に対するSHIMEサンプルの影響である。結果は三体の異なるドナーについて別々に（A-C）、および三体のドナーの平均として（B-D）示す。サイトカインレベルはSHIMEサンプルで24時間頂端側を前処置した後、Caco-2/THP-1-BlueTM共培養の側底側でのLPS処置の6時間後に測定した。点線は実験コントロールLPS+に対応する。データは平均±SEMとしてプロットする。（*）はコントロールと比較した統計的に有意な差を表す。（****）=p＜0.0001 PC：近位結腸サンプル；DC：遠位結腸サンプル。 IL-8（A+B）、CXCL10（C+D）およびMCP-1（E+F）の分泌に対するSHIMEサンプルの影響である。結果は三体の異なるドナーについて別々に（A-C-E）、および三体のドナーの平均として（B-D-F）示す。サイトカインレベルはSHIMEサンプルにより24時間頂端側を前処置した後、Caco-2/THP-1-BlueTM共培養の側底側でLPS処置の6時間後に測定した。点線は実験コントロールLPS+に対応する。データは平均±SEMとしてプロットする。三体の異なるドナーのコントロールおよび処置間に有意差は見られなかった。PC：近位結腸サンプル；DC：遠位結腸サンプル。 定義
ここで使用する“スフィンガン”という用語は高アシルスフィンガン、中間アシルスフィンガン、低アシルスフィンガン、高アシルスフィンガン多糖類、中間アシルスフィンガン多糖類、低アシルスフィンガン多糖類、高アシルスフィンガンオリゴ糖類、中間体アシルスフィンガンオリゴ糖類、低アシルスフィンガンオリゴ糖類、またはそれらの組合せに言及する。
ここで使用する“高アシル”（または“HA”）という用語はアシル基（例は、アセチルおよびグリセリル）を含むスフィンガンに言及する。高アシルスフィンガンには、例えば、HAゲラン（ジェランとも言う）、HAウェラン、HAラムサン、HAジウタン（diutan）、などが含まれる。
ここで使用する“中間アシル”（または“IA”）という用語はアシル含量が高アシルスフィンガンよりも少ないが、低アシルスフィンガンのアシル含量よりも多いスフィンガンに言及する。中間アシルスフィンガンには、例えば、IAゲラン、IAウェラン、IAラムサン、IAジウタン、などが含まれる。
ここで使用する“低アシル”（または“LA”）という用語は、アシル基（複数）が本質的に（単数）/（複数）除去されたスフィンガンに言及する。低アシルスフィンガンには、例えば、LAゲラン、LAウェラン、LAラムサン、LAジウタン、などが含まれる。
自然なスフィンガンには、例えば、ゲラン（S-60）、ウェラン（S-130）、ラムサン（S-194）、ジウタン（S-657）、S-88、S-198、およびS-7が含まれ得、大抵は[(→3)Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha(α1→)]nとして描かれる置換または非置換四量体の糖類（“四量体”）から構成され、そこでGlcおよびGlcAはD-糖であり、その一方でRhaはL糖であり、およびそこで適用できるManはL糖である。選定したスフィンガンの化学構造を以下に描き、個々の単糖類の略語が示される（例は、(1→3)Glc、(1→4)GlcA、(1→4)Glc、および(1→4)Rha））。
Figure 2022517237000001
ここで使用する“M”という用語は例えば、プロトン（H+）、ナトリウム（Na+）、カリウム（K+）、カルシウム（Ca2+）、マグネシウム（Mg2+）、またはそれらの組合せを含む生理学的に許容可能なカチオンに言及する。
“n”の値は整数または分数に言及し、および置換または非置換であり得る四量体単位の数に言及する。一定の自然なスフィンガンは自然なスフィンガンの分子量と相関し得るnの値を有することが理解される（例は、MW≒2.5×106およびMN≒2.2×106を有する自然なゲランガム）。（US6242035B1）
ここで使用する“重合度”またはDPという表現は多糖類またはオリゴ糖類の鎖において単糖類単位の数に言及する。例として、上記の化学構造を参照すると、そこでnは四であり、DPは十六である。
ここで使用する“スフィンガン多糖類”（または“SPS”）という表現は30より大きいDPおよび自然なスフィンガンに見られるよりも小さいDPを有する高/低アシルスフィンガンに言及する。高/中間/低アシルスフィンガンから得られるSPSは異なるDPsを有する複数の多糖類を含み得ることが理解される。
ここで使用する“スフィンガンオリゴ糖類”（または“SOS”）という表現は二よりも大きいかまたは等しくおよび三十より小さいかまたは等しい（即ち、2≧DP≦30）のDPを有する高/低アシルスフィンガンに言及する。高/中間/低アシルスフィンガン（またはHA/IA/LAスフィンガン）から得られるSOSは複数のオリゴ糖類を含み得ることが理解される。
詳細な記載
ここに開示する実施態様は概して、取込み可能な（ingestible）組成物、摂取可能な組成物およびその使用、取込み可能な組成物を使用する方法、スフィンガンオリゴ糖類を調製するためのプロセス、およびスフィンガンオリゴ糖類を調製するための前記プロセスによって調製されるスフィンガンオリゴ糖類に関する。
第一の実施態様はプレバイオティック有効量のスフィンガンを含む取込み可能な組成物に向けられる。
プレバイオティック（prebiotic）有効量のスフィンガンは約1gから約10gまでおよび間のすべての値、例えば、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4、約8.5、約8.6、約8.7、約8.8、約8.9、約9.0、約9.1、約9.2、約9.3、約9.4、約9.5、約9.6、約9.7、約9.8、または約9.9などのようなものが含まれ得る。
第一の実施形態の一態様では、スフィンガンの量は約1gないし約10g、約1gないし約9g、約1gないし約8g、約1gないし約7g、約1gないし約6g、約1gないし約5g、約1gないし約4g、約1gないし約3g、または約2gから選ばれる。
第一の実施形態の組成物はHA/IA/LAスフィンガン、例えば、HAゲラン、IAゲラン、LAゲラン、HAウェラン、IAウェラン、LAウェラン、HAラムサン、IAラムサン、LAラムサン、HAジウタン、IAジウタン、LAジウタン、S-88、S-198、S-7、またはそれらの組合せなどのようなものを含み得る。
第一の実施形態の組成物はHA/IA/LAスフィンガン多糖類を含み得る。
ここでより一層詳細に説明するように、HA/IA/LAスフィンガン多糖類は、例えば、第十の実施形態に記載するような高圧均質化を含むプロセスを使用してHA/LAスフィンガンから得てもよい。模範的なHA/IA/LAスフィンガン多糖類類には、制限されないが：高アシルゲランから得られる高アシルゲラン多糖類（例は、KELCOGEL(R)LT100ゲランおよびKELGOGEL(R)HTゲラン）、中間アシルゲランから得られる中間アシルゲラン多糖類（例は、KELCOGEL(R)DGA）、低アシルゲランから得られる低アシルゲラン多糖類（例は、KELCOGEL(R)LTゲラン、KELCOGEL(R)ゲラン、KELCOGEL(R)Fゲラン、およびGELRITETMMKゲラン）、高/中間/低アシルウェランから得られる高/中間/低アシルウェラン多糖類、高/中間/低アシルジウタンから得られる高/中間/低アシルジウタン多糖類、および高/中間/低アシルラムサンから得られる高/中間/低アシルラムサン多糖類が含まれる。
第一の実施形態の組成物は自然なHA/IA/LAスフィンガンまたはHA/IA/LAスフィンガン多糖類のいずれかから導き出されるHA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類を含み得る。一態様では、第一の実施形態の組成物は自然なHA/IA/LAスフィンガンまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって決定されるように約0.3kDaないし12kDaの分子量を有するHA/IA/LAスフィンガン多糖のいずれかに由来するHA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類を含み得る。別の態様では、第一の実施形態の組成物は自然なHA/IA/LAスフィンガンまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって決定されるように約1kDaの分子量を有するHA/IA/LAスフィンガン多糖類のいずれかに由来するHA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類を含み得る。
ここでより一層詳細に説明するように、HA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類は自然なHA/IA/LAスフィンガンまたはHA/IA/LAスフィンガン多糖類、例えば、自然なHA/IA/LAスフィンガンまたはHA/IA/LAスフィンガン多糖類のグリコシド結合を加水分解すること、および加水分解された組成物を限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、沈殿、遠心分離、またはそれらの組合せに、例えば、第十の実施形態に記載されるようにさらすことを含むプロセスから得てもよい。模範的なHA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類には、制限されないが、以下が含まれる：
（i）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（ii）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、アセタートおよび/またはグリセラートを有する四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、アセタートおよび/またはグリセラートを有する八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc,GlcA、Glc,Rha、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（iii）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、五量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc)、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Glc,GlcA、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（iv）Glc(Glc-Glc),GlcA、Glc(Glc-Glc)、GlcA,Glc、Glc,Glc、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（v）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、GlcA,Glc,(Rha-Rha)、Glc,(Rha-Rha),Rha、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc、GlcA,Glcを含む（またはからなる）組成物；
（vi）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（vii）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Rha、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（viii）Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,Rha、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（ix）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rhaa、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（x）サンプル番号1-18のいずれか一を含む（またはからなる）組成物；または
（xi）サンプル番号9、10、17、および18のいずれか一を含む（またはからなる）組成物である。
上記のように、一定のスフィンガンはアシル、単糖類、または二糖類側鎖によって置換され得る（例は、ジウタンの(1→4)GlcはO3でRha(α1→4)-Rha(α1→)側-鎖によって置換される）。糖類側-鎖を有する置換オリゴ糖類は括弧によって識別され、例は、GlcA,Glc,(Rha-Rha)およびGlc,(Rha-Rha),Rhaである。
また、HA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類への言及は模範的なHA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類またはそれらの組合せのいずれか一つを意味すると理解される。
組成物は液状物、半固形物または固形物の形態であり得る。組成物はシリアル、スナックバー、または他の取込み可能な形態の形態であってよい。組成物は果物ベース、例えば、ジュースまたはスムージーなどのようなもの、または乳製品ベース、例えば、ミルク、アイスクリーム、またはヨーグルトなどのようなものであってよい。組成物は適切には飲料の形態であることができる。“飲料”という用語はすぐに飲める液状形態ならびに溶解のための濃縮物および粉体調剤物を包含する。すぐに飲める飲料は泡立たせない（still）、または炭酸と化合させ（carbonated）得る。
組成物は糖または強力な甘味料、例えば、スクラロース、グリシルリジン酸アンモニウム、アセスルファーム-Ｋ、アスパルテーム、サッカリン、サッカリン塩（例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、など）、サイクラミン酸ナトリウム、ステビア、他の非-糖甘味料、およびそれらの混合物などのようなものにより無糖化（unsweetened）または甘味を付けてもよい。組成物はまた、他の慣習的な添加剤、例えば、香料、着色料、安定剤、などのようなものを含み得る。
組成物は使用説明書を含み得る密封された容器またはパッケージに粉末状形態として貯蔵され得る。
あるいはまた、組成物は錠剤またはカプセル生産物として調剤され得、それには、スフィンガンに加え、他の許容可能な賦形剤、例えば、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、流動促進剤、流動剤（flow agent）、固結防止剤、吸着剤、保存剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、コーティング剤、などのようなものを含み得る。錠剤は当技術においてよく知られる方法に従って被覆し得る。賦形剤の例には、制限されないが、アルカリ土類炭酸塩（例は、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、など）；架橋ポリマー（例は、架橋ポリビニルピロリドン（クロスポビドン）および架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロースナトリウム））；脂肪酸；ヒュームドシリカ；潤滑剤（例は、ステアリン酸、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム）；pH調整剤（例は、酸（例は、塩酸）および塩基（例は、水酸化ナトリウム））；植物繊維（例は、トウモロコシタンパク質ゼイン）；多糖類およびその誘導体（例は、でんぷん、セルロース、または修飾セルロース、例えば、微結晶性セルロースなどのようなもの、およびセルロースエーテル、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのようなもの）；タンパク質（例は、ゼラチン）；糖類およびその誘導体（例は、二糖類、例は、スクロース、ラクトース、など）；シェラック；二酸化ケイ素；でんぷんグリコール酸ナトリウム；糖アルコール（例は、イソマルト、キシリトール、ソルビトール、およびマルチトール）；合成ポリマー（例は、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコール）；タルク；およびワックスが含まれる。
組成物はまた、プロバイオティクスおよび追加のプレバイオティクスを含み得る。
プロバイオティクスの例には、制限されないが、Lactobacillus rhamnosus GG（ラクトバチルス・ラムノサスGG）、Bifidobacterium infantis（ビフィドバクテリウム・インファンチス）、Lactobacillus acidophilus（ラクトバチルス・アシドフィルス）、Bifidobacterium lactis HN019（ビフィドバクテリウム・ラクティスHN019）、Bifidobacterium longum（ビフィドバクテリウム・ロングム）（35624株を含む）、Lactobacillus salivarius（ラクトバチルス・サリバリウス）、Bifodobacterium bifidum（ビフィドバクテリウム・ビフィダム）、Lactobacillus plantarum（ラクトバチルス・プランタルム）、Lactobacillus paracasei（ラクトバチルス・パラカゼイ）、Bifidobacterium breve（ビフィドバクテリウム・ブレーベ）、Lactobacillus gasseri KS-13（ラクトバチルス・ガセリKS-13）、Bacillus coagulans（バチルス・コアグランス）（GBI-30、6086）、Bacillus subtilis DE111（バチルス・サブチリスDE111）が含まれ、各々のそれらは単独またはそれらの組合せで使用し得る。
追加のプレバイオティクスの例には、制限されないが、イヌリン、フルクトオリゴ糖類、ガラクトオリゴ糖類、グアーガム、タラガム、キサンタンガム、キサンタン多糖類、キサンタンオリゴ糖類、こんにゃくガム（konjac gum）、カラヤガム、アラビノガラクタン、ラクツロース、サイリウム、ペクチン、ペクチン多糖類、ペクチンオリゴ糖類、トラガカント、アカシア、カラギーナン、およびその他同種類のものなどが含まれる。
ここに開示する結果はスフィンガンが（A）ヒトの結腸において有益な細菌増殖を促進し；（B）ヒトの結腸におけるプロピオナートを減少させ、および/またはブチラートのレベルを増加させ；（C）ヒトの結腸における腸バリアの完全性を改善し；および/または（D）ヒトの結腸におけるTNF-αおよび/またはIL-8のレベルを低下させることを示す。したがって、ここに開示する実施形態は以下の取込み可能な組成物に関する：
（A）哺乳動物の結腸における有益な細菌増殖を促進し、前記組成物は有益な細菌増殖の有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を含み（第二の実施形態）；
（B）哺乳動物の結腸におけるプロピオナートを減少させ、および/またはブチラートのレベルを増加させ、前記組成物は有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を含み（第三の実施形態）；
（C）哺乳動物の結腸における腸バリアの完全性を改善し、前記組成物は腸バリアの完全性の有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を含み（第四の実施形態）；または
（D）哺乳動物の結腸におけるTNF-αおよび/またはIL-8のレベルを低下させ、前記組成物はTNF-αおよび/またはIL-8低下の有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を含む（第五の実施形態）。
第二、第三、第四、および第五の実施形態のいずれか一に関連して、スフィンガンの企図された量（即ち、（i）有益な細菌増殖有効量のスフィンガン（第二の実施形態）、（ii）有効量のスフィンガン（第三の実施形態）、（iii）腸バリア完全性有効量のスフィンガン（第四の実施形態）、および（iv）TNF-αおよび/またはIL-8減少有効量のスフィンガン（第五の実施形態））は約1gないし約10gのスフィンガン、およびその間のすべての値、例えば、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4、約8.5、約8.6、約8.7、約8.8、約8.9、約9.0、約9.1、約9.2、約9.3、約9.4、約9.5、約9.6、約9.7、約9.8、および約9.9gなどのようなものを含み得る。
第二、第三、第四、および第五の実施形態のいずれか一の態様において、哺乳動物は、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウシ、バイソン、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、シカ、ラマ、アルパカ、およびその他同種類のものなどである。
第二、第三、第四、および第五の実施形態のいずれか一の態様において、スフィンガンの量は約1gないし約10g、約1gないし約9g、約1gないし約8g、約1gないし約7g、約1gないし約6g、約1gないし約5ｇ、約1gないし約4g、約1gないし約3g、または約2gから選ばれる。
また、第二、第三、第四、および第五の実施形態のいずれか一の態様において、スフィンガンの量は、結腸において有効なスフィンガン濃度を達成するのに十分であり、そこで前記スフィンガン結腸濃度は約1mg/mLから約10mg/mLまで、およびその間のすべての値に及び、例えば、約1.5mg/mL、約2mg/mL、約2.5mg/mL、約3mg/mL、約3.5mg/mL、約4mg/mL、約4.5mg/mL、約5mg/mL、約5.5mg/mL、約6mg/mL、約6.5mg/mL、約7mg/mL、約7.5mg/mL、約8mg/mL、約8.5mg/mL、約9mg/mL、または9.5mg/mLに及ぶ。
第二、第三、第四、および第五の実施形態のいずれか一の組成物は自然なHA/IA/LAスフィンガン、HA/IA/LAスフィンガン多糖類、HA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類、またはそれらの組合せのいずれか一を含み得、および随意に第一の実施形態に記載するように、プロバイオティクスまたは追加のプレバイオティクスをさらに含む。
追加的に、ここに開示する実施形態は次の薬または栄養補助食品の製造のための方法または使用のいずれにも関連する：
（A）哺乳動物の結腸における有益な細菌増殖を促進し、前記方法は有効なスケジュールで有益な細菌増殖有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を取り込むことを含み（第六の実施形態）；
（B）哺乳動物の結腸におけるプロピオナートを減少させ、および/またはブチラートのレベルを増加させ、前記方法は次の：有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を含む組成物を有効なスケジュールにて取り込むことを含み（第七の実施形態）；
（C）哺乳動物の結腸における腸バリア完全性を改善し、前記方法は次の：腸バリア完全性有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を含む組成物を有効なスケジュールにて取り込むことを含み（第八の実施形態）；
（D）哺乳動物の結腸におけるTNF-αおよび/またはIL-8のレベルを低下させる、前記方法はTNF-αおよび/またはIL-8低下有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を含む組成物を有効なスケジュールにて取り込むことを含み（第九の実施形態）；
（E）第一、第二、第三、第四、および第五の実施形態のいずれか一の組成物を単独で、またはここに記載のようなプロバイオティクスまたは追加のプレバイオティクスと組み合わせて、（i）哺乳動物の結腸における有益な細菌増殖促進（第十の実施形態）、（ii）哺乳動物の結腸におけるプロピオナートの減少および/またはブチラートレベルの増加（第十一の実施形態）、（iii）哺乳動物の結腸における腸バリアの完全性の改善（第十二の実施形態）、または（iv）哺乳動物の結腸におけるTNF-αおよび/またはIL-8のレベル低下（第十三の実施形態）用の組成物を製造するための組成物の使用；または
（F）第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、および第十三の実施形態のいずれか一の態様において、哺乳動物は例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウシ、バイソン、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、シカ、ラマ、アルパカ、およびその他同種類のものなどである。
ここに記載および請求するこれらのおよび他の実施形態について、取込みのための効果的なスケジュールには、例えば、（i）毎日取込み、例えば、一日に一回、二回、三回、などのようなもの；（ii）毎週取込み、例えば、七日間毎日、七日間隔日、などのようなもの；（iii）毎月取込み、例えば、望ましい期間の毎日の摂取およびそれに続く休息期間、時間の望ましい期間についての毎日の摂取によって継続されるなどのようなものが含まれ得る。
第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、および第十三の実施形態のいずれか一に関連して、企図される量のスフィンガン（即ち、（i）有益な細菌増殖有効量のスフィンガン（第六の実施形態）、（ii）有効量のスフィンガン（第七の実施形態）、（iii）腸バリア完全性有効量のスフィンガン（第八の実施形態）、および（iv）TNF-αおよび/またはIL-8減少有効量スフィンガン（第九の実施形態））は約1gないし約10gのスフィンガン、およびその間のすべての値、例えば、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4、約8.5、約8.6、約8.7、約8.8、約8.9、約9.0、約9.1、約9.2、約9.3、約9.4、約9.5、約9.6、約9.7、約9.8、および約9.9gを含み得る。
第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、および第十三の実施形態のいずれか一の態様において、スフィンガンの量は約1gないし約10g、約1gないし約9g、約1gないし約8g、約1gないし約7g、約1gないし約6g、約1gないし約5g、約1gないし約4g、約1gないし約3g、または約2gから選ばれる。
また、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、および第十三の実施形態のいずれか一の態様において、スフィンガンの量はここに記載するように結腸において有効なスフィンガン濃度を達成するのに十分である。
あるいはまた、および第六、第七、第八、および第九の実施形態のいずれか一に関連して、哺乳動物はヒトであり、および企図される量のスフィンガン（即ち、（i）有益な細菌増殖有効量のスフィンガン（第六の実施形態）、（ii）有効量のスフィンガン（第七の実施形態）、（iii）腸バリア完全性有効量のスフィンガン（第八の実施形態）、および（iv）TNF-αおよび/またはIL-8減少有効量のスフィンガン（第九の実施形態））は組成物を取り込むヒトのヒト体重の約10mg/kgから約150mg/kgまでを含み得る。さらに、スフィンガンの量はその間のすべての値、例えば、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg、約100mg/kg、約105mg/kg、約110mg/kg、約115mg/kg、約120mg/kg、約125mg/kg、約130mg/kg、約135mg/kg、約140mg/kg、または約145mg/kgなどのようなものを含むことが企図される。
第六、第七、第八、および第九の実施形態のいずれか一の態様において、哺乳動物はヒトであり、およびスフィンガンの量は組成物を摂取するヒトの約10mg/kgないし約150mg/kg、約10mg/kgないし約140mg/kg、約10mg/kgないし約130mg/kg、約10mg/kgないし約120mg/kg、約10mg/kgないし約110mg/kg、約10mg/kgないし約100mg/kg、約10mg/kgないし約90mg/kg、約10mg/kgないし約80mg/kg、約10mg/kgないし約70mg/kg、約10mg/kgないし約60mg/kg、10mg/kgないし約50mg/kg、約10mg/kgないし約40mg/kg、または約20mg/kgないし約30mg/kgから選ばれる。
第六、第七、第八、および第九の実施形態のいずれか一の組成物は自然なHA/LAスフィンガン、HA/LAスフィンガン多糖類、HA/LAスフィンガンオリゴ糖類、またはそれらの組合せのいずれか一を含み得、および随意に第一の実施形態に記載されるようなプロバイオティクスまたは追加のプレバイオティクスが含まれる。
ここに開示する結果はスフィンガン（例は、ゲランガム）がヒトの結腸モデルの近位および遠位部分においてBifidobacteriaceae（ビフィドバクテリア科）のレベルを増加させたことを示す。運用分類単位（Operational Taxonomic Unit）（“OUT”）レベルでは、主な変化はBifidobacteriaceae OTU 2（Bifidobacterium adolescentis（ビフィドバクテリウム・アドレセンティス）に関連）の増加に起因することが見出された。したがって、第二、第六の実施形態、または第十の実施形態の一態様において、細菌はBifidobacteriaceaeである。さらに、第二、第六の実施形態、または第十の実施形態の別の態様において、細菌はBifidobacteriaceae OTU2である。近位結腸の内腔における増加したBifidobacteriaceaeレベルは未処置のコントロールと比較して処置の間に約20％から約180％までに及び、その一方で遠位結腸の内腔における増加したBifidobacteriaceaeレベルは未処置のコントロールと比較して処置の間に約330％から約590％までに及ぶ。第二、第六の実施形態、または第十の実施形態のさらに別の態様において、近位結腸の内腔におけるBifidobacteriaceaeレベルは未処置のコントロールと比較して処置の間に約20％から約180％までの範囲で増加する。また、第二、第六の実施形態、または第十の実施形態のさらなる態様において、Bifidobacteriaceaeレベルは未処置のコントロールと比較して処置の間に約330％から約590％までの範囲で遠位結腸の内腔において増加する。
追加的に、ここに開示する結果は約4mg/mLの濃度にてスフィンガンオリゴ糖類が健康な成体の糞便サンプルに基づいてインビトロで細菌（例は、Blautia（ブラウティア属）、Parabacteroides（パラバクテリオイデス属）、Faecalibacterium（フィーカリバクテリウム属）、Clostridium XVIII（クロストリジウム属XVIII）レベルを増加させたことを示す。インビトロでのBlautiaレベルは未処置のコントロールと比較して少なくとも約5倍まで増加した。インビトロでのParabacteroidesレベルは未処置のコントロールと比較して約2倍から約40倍までに増加した。インビトロでのFaecalibacteriumレベルは未処置のコントロールと比較して約10倍から約190倍までに増加した。インビトロでのClostridium XVIIIレベルは未処置のコントロールと比較して約12倍から約60倍までに増加した。
さらに、ここに開示する結果は約4mg/mLの濃度のスフィンガンオリゴ糖類が炎症性腸疾患を有するペイシェント（人間で言う患者のこと）の糞便サンプルに基づいてインビトロで細菌（例は、Parabacteroides属、Faecalibacterium、Clostridium XVIII）レベルを増加させたことを示す。インビトロでのBlautiaレベルは未処置のコントロールと比較して少なくとも約8倍まで増加した。インビトロでのFaecalibacteriumレベルは未処置のコントロールと比較して少なくとも約8倍まで増加した。インビトロでのClostridium XVIIIレベルは未処置のコントロールと比較して約20倍から約100倍までに増加した。
ここに開示する結果は取り込まれたスフィンガン（例は、ゲランガム）がヒトの結腸モデルの近位および遠位部分の双方においてプロピオナートレベルを減少させ、および取り込まれたゲランガムが結腸モデルの近位および遠位部分の双方においてブチラートレベルを増加させたことを示す。したがって、第三の実施形態、第七の実施形態、または第十一の実施形態の一態様において、そこで哺乳動物はヒトであり、近位結腸における減少したプロピオナートレベルはコントロールと比較して処置の間に約8％から約21％までに及ぶ。哺乳動物がヒトである第三の実施形態、第七の実施形態、または第十一の実施形態の一態様において、コントロールと比較して処置の間に遠位結腸における減少したプロピオナートレベルは約8％から約11％までに及ぶ。哺乳動物がヒトである第三の実施形態、第七の実施形態、または第十一の実施形態の一態様において、遠位結腸における増加したブチラートレベルは約15％から約24％までに及ぶ。哺乳動物がヒトである第三の実施形態、第七の実施形態、または第十一の実施形態の一態様において、遠位結腸における増加したブチラートレベルは約4％から約13％までに及ぶ。
第十四の実施形態はスフィンガン多糖類（“SPS”）および/またはスフィンガンオリゴ糖類（“SOS”）を調製するためのプロセスに向けられる。
SPSを調製するためのプロセスは水において自然なHA/IA/LAスフィンガンを水和すること、および均質化、超音波処理、放射線、酸化、および/または加水分解によって自然なHA/IA/LAスフィンガンの分子量を低下させることを含む。
自然なHA/IA/LAスフィンガンの分子量の低減（即ち、鎖長の短縮）は以下を含むプロセスによる高圧均質化を使用して達成され得る：（i）水和したHA/IA/LAスフィンガン（約1％w/v）溶液を得るために脱イオン水におけるHA/LAスフィンガン生産物粉体を水和すること；（ii）均質化したHA/IA/LA SPS溶液を得るために水和したHA/IA/LAスフィンガン溶液をホモジナイザーに1から10までの回数約8,500psi（1psi=6.894757kPa）から約12,000psiまで（およびその間のすべての値）の圧力にて操作して通過させること；（iii）HA/IA/LA SPS沈殿物を得るために均質化した溶液に十分な量の適切な有機溶媒を加えること；（iv）遠心分離によってHA/IA/LA SPS沈殿物を収集すること；および（v）収集したHA/IA/LA SPS粉体を乾燥することおよび磨砕すること。
HA/IA/LA SPSを調製するためのプロセスの一態様において、HA/IA/LAスフィンガンは例えば、高アシルゲラン、中間アシルゲラン、低アシルゲラン、高アシルジウタン、中間アシルジウタン、低アシルジウタン、高アシルラムサン、中間アシルラムサン、および低アシルラムサンであり得る。HA/IA/LA SPSを調製するためのプロセスの別の態様において、前記通過は約8,500psiの圧力にて1-10回（例は、1、2、3、4、など）発生する。SPSを調製するためのプロセスのさらに別の態様において、前記通過は約12,000psiの圧力にて1-10回（例えば、1、2、3、4、など）発生する。SPSを調製するためのプロセスのさらなる態様において、前記通過は約12,000psiの圧力にて10回起こる。また、SPSを調製するためのプロセスのさらに別の態様において、適切な有機溶媒はそのように形成されたHA/IA/LAスフィンガン多糖類の沈殿を促進するものであり、例えば、イソプロパノールが含まれる。
HA/IA/LA SOSを調製するためのプロセスは以下を含む：自然なHA/IA/LAスフィンガンまたはHA/IA/LASPSおよび液状媒体を含む第一の組成物を用意すること；第二の組成物を得るためにHA/IA/LAスフィンガンまたはHA/IA/LA SPSのグリコシド結合を加水分解すること；HA/IA/LA SOSを含む第三の組成物を得るために第二の組成物を限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、沈殿、遠心分離、またはそれらの組合せにさらすこと；および随意に適切な技術、例えば、凍結乾燥などのようなものによって第三の組成物を分離または回収すること。
HA/IA/LA SOSを調製するためのプロセスの一態様において、前記加水分解は酸、酵素、超音波処理、高圧均質化、放射線、またはそれらの組合せによって媒介され得る。
HA/IA/LA SOSを調製するためのプロセスの一態様において、前記加水分解は約1ないし約3のpHを有する水性媒体によって媒介され得る。別の態様において、前記加水分解は約1ないし約3のpH（または約2のpH）を有する水性媒体によって媒介され得、そこで前記水性媒体は適切な無機または有機酸を含み得る。適切な酸の例には、制限されないが、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、クエン酸、シュウ酸、ぎ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、またはそれらの組合せが含まれる。
HA/IA/LA SOSを調製するためのプロセスの一態様において、前記加水分解は約2のpHおよび約95℃の温度にてHA/IA/LAスフィンガンまたはHA/IA/LA SPSのグリコシド結合を加水分解するのに十分な時間ぎ酸により加水分解することによって媒介される。
HA/IA/LA SOSを調製するためのプロセスの一態様において、前記加水分解は酵素によって媒介され、そこでは酵素は一またはそれよりも多く（一以上とも言う）のスフィンガングリコシド結合を開裂する能力があり、制限されないが、ゲラナーゼ（gellanase）、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ（rhamnogalacturonan endolyase）（EC 4.2.2.23）、ラムノガラクツロナンエキソリアーゼ（rhamnogalacturonan exolyase）（EC 4.2.2.24）、Hashimoto（ハシモト）によって記述されたゲランリアーゼ（gellan lyase）（EC 4.2.2.25）、Kennedy（ケネディ）（1994）によって記述されたゲランリアーゼ、またはそれらの組合せが含まれる。“ゲラナーゼ”という表現はスフィンガンの一以上のグリコシド結合を開裂する能力がある酵素に言及されることが理解される。
HA/IA/LA SOSを調製するためのプロセスの一態様において、前記さらすことには、第三の組成物を含むろ液を得るために約5kDaまたは約10kDaのいずれかの分子量カットオフを有する膜を通して第二の組成物をろ過することが含まれる。
第十五の実施形態は第十四の実施形態によって調製するようなスフィンガンオリゴ糖類を含む組成物に向けられる。
別なふうに規定しない限り、ここで使用するすべての技術的および科学的用語は本技術における通常の技量の者（当業者とも言う）によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。以下の例はここで請求および開示する実施形態をさらに例証することのみを意図しており、請求される主題の範囲を制限することを意図していない。
I．例I．HA/LASPSおよびSOSsの準備。
スフィンガン多糖類の調製。
自然なスフィンガンの鎖長は高圧均質化を使用して以下を含むプロセスによって短縮し得る：（i）水和スフィンガン溶液を得るためにスフィンガン（例は、ゲラン、ジウタン、およびラムサン）生産物粉体を1-Lの脱イオン水において1％w/vにて水和すること；（ii）均質化された溶液を得るためにAPVモデル1000ホモジナイザーにおいて水和スフィンガン溶液を約12,000psi（×10）で機械的に消化すること；（iii）スフィンガン多糖類沈殿物を得るために均質化した溶液に十分な量のイソプロピルアルコールを加えること；（iv）遠心分離によってスフィンガン多糖類沈殿物を収集すること；および（v）収集したスフィンガン多糖類粉体を乾燥することおよび粉砕すること。選定したスフィンガン（例は、高アシルゲラン、低アシルゲラン、高アシルジウタン、および高アシルラムサン）にてこの手順を使用して、表1に示すように、次のスフィンガン多糖類のサンプルを調製し、それはその後の研究のために0.8％w/vの濃度にて水において水和した。
Figure 2022517237000002
ここで製造されるゲラン多糖類は高圧均質化によって鎖長が短縮されるという点で商品化されたゲラン生産物とは異なる。実際、以前の調査は高圧均質化により自然なゲランの鎖長（および従って分子量）が減少することを示した。（US6242035B1を参照、その全体において参照により組み込まれ、そこでは自然なゲランガム（MW≒2.5×106；MN≒2.2×106）の高圧均質化はサイズ排除クロマトグラフィー/多角度レーザー光散乱（Size Exclusion Chromatography/Multiple Angle Laser Light Scattering）で測定するように、約1.7×106未満または等しいMWを有するゲランガムをもたらす）。
スフィンガンオリゴ糖類（SOSs）の調製
SOSの準備には大抵、次のものが含まれる：（i）2％w/vの自然なHA/IA/LAスフィンガン（またはHA/IA/LA SPS）溶液を調製すること；（ii）加水分解物を得るために95℃で夜通しぎ酸（pH2）で加水分解すること；（iii）ろ過物を得るために5kDaまたは10kDaのいずれかの分子量カットオフを有する限外ろ過膜を使用して加水分解物をろ過すること；（iv）凍結乾燥物を得るためにろ液を凍結乾燥すること；（v）洗浄粉体を得るために凍結乾燥物を無水エタノール（×3）で洗浄すること；および（vi）SOSを得るために洗浄粉体を乾燥させること。（あるいはまた、加水分解は次の：（i）適切な酵素、例えば、ゲラナーゼなどのようなもの；（ii）超音波処理；（iii）高圧均質化；（iv）放射線；または（v）他の既知のプロセスを使用して発生させ得る）。酸加水分解（例は、ぎ酸）手順または酵素加水分解（例は、Japan gellanase（ジャパンゲラナーゼ（EC 4.2.2.25）または438株ゲラナーゼ）を使用して、表2aに示すように、HA/LAスフィンガンオリゴ糖類の以下のサンプルを調製し、そこで単糖類含量は単糖類（グルコースおよびラムノース）含量をサンプルの濃度で割ったものに関連し、単糖類組成、オリゴ糖類含量、および分子量は以下に記載するようなものである。
Figure 2022517237000003
Figure 2022517237000004
単糖類含量は選定したSOSサンプルについてSOSサンプルを脱イオン水において溶解すること、およびThermo Fisher's Ion Chromatography（サーモフィッシャーのイオンクロマトグラフィー）システムを使用してグルコースおよびラムノースの含量を分析することによって定めた。合計単糖類含量はグルコースおよびラムノースの合計濃度をサンプルの濃度で割ったものとして算出する。
単糖類組成（サンプル番号9-10および17-18について）は次のように定めた。SOSサンプルを4％硫酸において3.5g/Lの濃度に溶解しおよび121℃で一時間オートクレーブ処理した。Zeuner（ジューナー）（2016）に従ってDionex（ダイオネクス）ICS-5000システムを使用して単糖類を定量した。グリセラートは外部標準を使用して定量化した。未知の化合物1（“UNK1”）、未知の化合物2（“UNK2”）、および未知のウロン酸1（“UNK URON1”）はグルクロン酸単位として定量化した。表2bは各々のサンプル番号9-10および17-18についての単糖類組成をまとめた。
Figure 2022517237000005
オリゴ糖類含量（サンプル番号9-10および17-19について）は次のように定めた。オリゴ糖類の識別および相対的定量はUltiMate（アリティメート）3000 UHPLC（Dionex、Sunnyvale（サニーヴェール）、CA USA（米国カリフォルニア州））にカップリングされたAmazon（アマゾン）SLイオントラップ（Bruker Daltonics（ブルカーダルトニクス）、Bremen Germany（ドイツ国ブレーメン））での液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析（LC-ESI-MS）によって実行した。50％CANにおける5μLサンプル（最終5g/L）をTSKgel Amide（TSKゲルアミド）80 HILICカラム（150mm×2mm；2μm、TOSOH（トーソー）、Greisheim（グリースハイム）、Germany）に注入した。クロマトグラフィーは溶離液A（水）、溶離液B（アセトニトリル）、およびC（100mMぎ酸アンモニウムpH5）で構成される三つの溶離液システムにて45℃での0.2mL/分にて実行した。溶離液Cは常時5％に保った。溶出プロファイルは次のようであった（時間は分で示す）：0-5、均一濃度（アイソクラティック）75％B；5-25、25％Bへの線形勾配；25-30、均一濃度5％B；30-40、均一濃度75％B。エレクトロスプレーはネガティブモードにおいてUltraScan（ウルトラスキャン）モードおよび100-2000m/zからのスキャン範囲、1000m/zのスマートパラメーター設定により操作した。自動MS2イベントは最高の有力な二つのプリカーサーイオンに対して行った。4.5kVでのキャピラリ電圧、エンドプレートオフセット0.5kV、3.0bar（バール、1bar=100kPa）でのネブライザ圧力、12.0L/分での乾燥ガスフロー、および乾燥ガス温度280℃。化合物はMSおよびMSnによって識別し、およびData analysis（データ分析）4.2 SR2において相対的強度によって定量した。
Figure 2022517237000006
Figure 2022517237000007
Glc2,GlcA,Rha,Glycとして識別するSOSは単一のグリセラートを有するゲラン四量体ユニットを表し、Glc2,GlcA,Rha,Acとして識別するSOSは単一のアセチルを有するゲラン四量体ユニットを表す。一定のSOSsには、複数の糖（シュガー）部分（viz.（すなわち）、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac）が含まれ-オリゴ糖類は特定された糖類数から推定し得る。例として、Glc5,GlcA2,Rha2,Acは追加のグルコピラノシル（Glc）およびアセチル（Ac）を伴う二つの四量体ユニット（すなわち、Glc-GlcA-Glc-Rha）を含む。さらに、Glc6,GlcA3,Rha3は三つの四量体単位（すなわち、Glc-GlcA-Glc-Rhaの三回）を含むオリゴ糖類を表す。水分の喪失によって識別されるSOSs（“-H2O”、例は、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2Oを参照）はリアーゼ/β-脱離の不飽和生産物を表す。より一層長いゲラン様オリゴマー（例は、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2）についてのいくらかの場合、一つのグルクロン酸または二つのグリセラート置換の存在間を区別するには質量スペクトルの断片化が不十分であるため、二つの構造が提案される。観察されたSOSsのすべてが構造的に識別できたわけではない。断片化に基づいて、いくらかの化合物を部分的に識別できたが、それは断片化パターンでの類似性のためであり、それゆえ最も類似する識別した特定の化合物の後に“未知のm/z誘導体”と表示した。他の化合物は断片化が不十分であるか、または予想されるゲラン由来のSOSsとは異なるタイプの化合物であるため、識別するのが不可能であった。これらの未知のSOSsは一または二の電荷が観測されたかどうかに応じて“未知（観測されたm/z）z1またはz2”と表される。下記の、サイズ排除クロマトグラフィーデータによって明らかなように、分析したサンプルには、スフィンガン多糖類（DP>30、ただし自然なスフィンガン未満）およびスフィンガンオリゴ糖類（2≧DP≦30）が含まれ得る。
SOSサンプルの報告された分子量は次のように定めた。高性能サイズ排除クロマトグラフィーはRI-101屈折率検出器（Shodex（ショウデックス））に接続されたWPS-3000サンプラー（Dionex）を有するUltimate iso（アルティメートiso）-3100 SDポンプを使用して実行した。TSKgel PWHガードカラム（7.5×7.5mm）（Tosoh Bioscience（トーソー・バイオサイエンス））を備えたTSKgel G3000PWカラム（300×7.5mm）に100μLのサンプルをロードした。溶出は40℃で1.0mL/分の流速にて100mM硝酸ナトリウムにより実行した。プルラン標準を参照として使用した。
図1aは高アシルゲランから導き出された酸（SN9、実線）および酵素処理（SN18、破線）スフィンガン多糖類およびオリゴ糖類についてのサイズ排除クロマトグラム（“SEC”）を描き、その一方で図1bは低アシルゲランから導き出された酸（SN10、実線）および酵素処理（SN17、破線）スフィンガン多糖類およびオリゴ糖類についてのSECを描く。図1aおよび図1bはどちらもプルラン分子量の標準溶出時間（すなわち、>50kDa（6.5分、塗りつぶされた正方形（黒四角））、12kDa（8.8分、塗りつぶされた円（●））、5kDa（9.3分、塗りつぶされた三角形（黒三角））、1kDa（10分、空の正方形（□））、342Da（10.65分、空の円（○））、および180Da（11.15分、空の三角形（△）））を示す。図1aについてのSECデータは高アシルスフィンガンに由来するスフィンガン多糖類（SPSs）およびスフィンガンオリゴ糖類（SOSs）の同等の分布を示す。これは酸処理サンプル（SN10）についてのSPSsおよびSOSsの分布が酵素処理サンプル（SN17）のSPSsおよびSOSsの分布と異なる図1bについてのSECデータと比較されるべきである。SECデータはまた、サンプル番号9、10、および18についての分子量範囲が約0.5kDaないし約4kDa（および可能なら最大約12kDa）であることも示す。興味深いことに、酵素処理を施した低アシルスフィンガンに由来するサンプル（SN17）は約0.5kDaないし約1kDaの分子量範囲を有するSOSsの一次溶出を示す（約1kDaのピークの狭いサイズ分布を有する）。
SOSsのオリゴマー含量は質量スペクトル分析によって定めた。大抵、SOSサンプルは1mM NaClを含有する水/アセトニトリル（1：1）を使用して0.4％の濃度にてSOSを溶解することによって調製した。Thermo Fisher's MSQ plus Single Quad Mass Spec（サーモフィッシャーのMSQプラスシングルクワッド質量分析）中に導入する前にサンプルは0.22ミクロンフィルターを通してろ過した。質量分析計は150-1000m/zからスキャンする負のエレクトロスプレーイオン化モードにおいて操作した。オリゴマーの無傷の質量から、SOSサンプルにおいて様々なオリゴ糖類が見出された。表3は選定したSOSサンプルについて観察したオリゴマーをまとめる。
Figure 2022517237000008
 II．例II．選定した腸内細菌叢の活動に対するスフィンガン（例は、自然なスフィンガン、SPSs、およびSOSs）の影響。
4mg/mL（0.4％w/v）のSPSまたはSOSを含有するサンプルを提供するために8mg/mL（0.8％w/v）のSPSまたはSOSを含有するサンプルを二倍に希釈した。二十五を超える腸内細菌叢のパネルに対する4mg/mLの濃度のサンプル番号1-12の効果はFehlbaum（フェルバウム）（2018）によって説明されるようにインビトロ発酵スクリーニングプラットフォーム（“i-screen（i-スクリーン）”）を使用して24時間の発酵後に評価した。具体的には、5-6体の健康な成体（除外基準に基づく健康）に由来する標準的な糞便微生物叢プールを使用し、それは凍結ストックから夜通し前培養した。これは続いてマイクロタイタープレートにおいて希釈し、そこではサンプルを添加し、およびその後嫌気的に37℃にて24時間インキュベーションした。インキュベーション後、培養サンプルを収穫し、および更なる分析のために処理した。96ウェルプレートにおいて、いくらかのウェルを技術的コントロール、微生物叢なしのコントロール（n=3）、および微生物叢のみを有するネガティブコントロール（n=3）について使用し、80ウェルを実験のために使用できるようにする。複数のスフィンガンサンプルおよび比較サンプル-植物抽出物（例は、ペクチン、ペクチンオリゴ糖類、およびカラギーナン）およびバイオガム（例は、キサンタンおよびキサンタンオリゴ糖類）を約4mg/mLの濃度にて分析し、それは約4g/日の用量に対応する。（Van den Abbeele（ヴァン・デン・アビーレ）（2011））。
微生物叢組成におけるシフトは次世代シーケンシングによって定めたが、それは属レベルにて、および多くの場合（すべてではない）において種レベルにて細菌を認識する。シーケンシングプールにおいてサンプルの均一な分布を得るために、合計細菌負荷はユニバーサルプライマー-プローブセットを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応（“PCR”）によって確立した。V4領域の16s rDNAアンプリコンはPCRによって調製し、それによって鋳型DNAのレベルが標準化され、および特有のエラー訂正バーコーデッドプライマーが使用され、および過剰増幅が回避される。次に、アンプリコンをゲル精製し、定量し、およびプールした。次いで、ペアードエンドシーケンシング（2×250bp）によってIllumina MiSeq(R)（イルミナMiSeq）機器にてシーケンス分析を実行した。下流シーケンス分析はthe Netherlands Organization for Applied Scientific Research（オランダ応用科学研究機構）によって開発された標準化シーケンシングパイプラインを使用して実行した。パイプラインはペアードエンドリードのアセンブリ、品質フィルタリング、キメラ除去および分類学的分類+加工したリードのクラスタリングを予測する。
標準的なコントロールは三重に行った。特に、微生物パネルには、Bacteroides（バクテロイデス属）、Coprococcus（コプロコッカス属）、Lachnospiraceae（ラクノスピラ科）未分類、Megasphaera（メガスファエラ属）、Escherichia（エシェリキア属）/Shigella（シゲラ属）、Clostridium（クロストリジウム属）XlVa、Allisonella（アリソネラ属）、Bifidobacterium（ビフィドバクテリウム属）、Dorea（ドレア属）、Collinsella（コリンセラ属）、Mogibacterium（モギバクテリウム属）、Sutterella（サテレラ属）、Bilophila（ビロフィラ属）、Blautia、Clostridium sensu stricto（クロストリジウム・センス・ストリクト）、Phascolarctobacterium（ファスコラークトバクテリウム属）、Faecalibacterium、Clostridium（クロストリジウム属）XlVb、Clostridium（クロストリジウム属）XI、Acidaminococcus（アシダミノコッカス属）、Gemmiger（ゲミガー属）、Lachnospira（ラクノスピラ属）、Parabacteroides、Paraprevotella（パラプレボテラ属）、およびButyricicoccus（ブチリシコッカス属）が含まれた。効果は未処理のコントロールと比較して定めた。表4aはBifidobacteriumおよびFaecalibacteriumの増殖に対するサンプル番号1-12の最初のi-screen分析で観察された効果をまとめ、そこで報告された結果は未処理のコントロール（増殖は1.0と表示）と比較する。
Figure 2022517237000009
太字の値は未処処置のコントロールと比較した細菌増殖の著しい変化を表す。例III（下記）で報告する結果と一致して、スフィンガン多糖類（すなわち、サンプル番号1-3）はビフィドバクテリウム属の増殖を促進した。驚くべきことに、スフィンガンオリゴ糖類（すなわち、サンプル番号8-12）は未処置のコントロールと比較してかなりの程度まで、各々のフィーカリバクテリウム属、ブラウティア属、およびパラバクテリオイデス属の増殖を促進した。BifidobacteriumおよびFaecalibacterium（例は、Faecalibacterium prausnitzii（フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ）がブチラート生産細菌であることはよく知られる。したがって、スフィンガンオリゴ糖類がFaecalibacteriumの増殖を促進することを示すi-screenの結果は、これらの組成物がプレバイオティクス活性を示すことを示唆する。また、Faecalibacterium prausnitziiは抗炎症作用があることが知られているため、i-screenの結果は、SOSがFaecalibacterium prausnitziiの増殖を促進することにより抗炎症剤として機能することを示唆する。
追加のi-screen分析はサンプル番号9、10、17、および18にて三つの異なる糞便プール、すなわち、健康な成体に由来する二つのプール（H1およびH2）および過敏性腸疾患を有する患者から得られる一つのプール（“IBD”）を用い三つまたは四つの細菌（すなわち、Blautia、Parabacteroides、Faecalibacterium、Clostridium XVIII）について実行した。具体的には、使用した糞便プールは次のものが含まれる：（i）H1プールは6名の健康な成人ボランティア（白人、年齢25-60、ヨーロッパのライフスタイルおよび栄養、健康状態の自己評価、過去3か月間抗生物質の使用なし）から導き出し、（ii）H2プールは（5）健康な成人ボランティア（年齢20-65、過去3か月間抗生物質の使用なし、健康状態の自己評価）から導き出し、および（iii）IBDプールはIBD、すなわち、潰瘍性大腸炎を有する四名の患者から導き出した。表4bは追加のi-screen分析（すなわち、第一のi-screen（番号1-2）、第二のi-screen（番号3-4）、および第三のi-screen（番号5-16））のサンプル番号9-10および17-18の三つまたは四つの細菌（すなわち、Blautia（“Blaut.”）、Parabacteroides（“Para.”）、Faecalibacterium（“Faecal.”）、Clostridium XVIII（“ClXVIII”））増殖にてのもので観察された効果をまとめ、そこでは報告した結果は未処置のコントロールと比較する（増殖は1.0として示す）。
Figure 2022517237000010
表4bの見出し項目1-4に関して、SOSは未処置のコントロールと比較して健康な成人の糞便プールにおけるBlautia、Parabacteroides、およびFaecalibacteriumの倍率変化における増加を促進したことが見られる。低アシルゲランオリゴマーに由来するSOSsはFaecalibacterium（188.91）、およびParabacteroides（21.11）およびBlautia（4.78）の最も高い倍率変化を見せた。
表4bの見出し項目5-8に関して次のことが観察された。SOSs（酸および酵素処理）は未処置のコントロールと比較して健康な成人の糞便プールでBlautia、Parabacteroides、およびFaecalibacteriumの増殖を促進した。これらの結果は酸処理された高および低アシルゲランオリゴマーサンプルの第一および第二のi-screen結果からの知見を検証する。低アシル酸で処理されたゲランオリゴマーでは、三つの属でより一層高い倍率変化値が得られた。さらに、酵素処理で生産された高および低アシルゲランオリゴマーも同じ糞便プールにおいて三つの属の増殖を増加させるのに効果的であった。
H2糞便プール（表4b見出し項目9-12）を使用すると、SOSs（酸および酵素処理）がBlautia、Parabacteroides、FaecalibacteriumおよびClostridium cluster（クロストリジウム・クラスター）XVIIIからの細菌の倍率変化を増加させたことが見られる。SOS（酸処理）はFaecalibacterium（21.93）およびParabacteroides（7.25）の最も高い倍率変化を促進した。Clostridium XVIIIクラスターの倍率変化値は12.66から55.91までに及んだ。参考までに、消化管において見出されたClostridium XVIIIおよびClostridium XlVaクラスターのほとんどはアセタートを生産し（Clostridium XlVaクラスターの2、3の株はアセタートと共にブチラートも生産し）、またゲノム分析（代謝ネットワーク）に基づき両方のクラスターは毒素を生産しない。Narushima（ナルシマ）（2014）。
IBD糞便プール（表4b見出し項目13-16）を使用すると、結果はSOSs（低アシルゲランから）がParabaeteroidesの最高の倍率変化値を促進したことを示す。酸処理された低アシルゲランオリゴマーはFaecalibacteriumの最も高い倍率変化を見せた。Clostridium cluster XVIIIの倍率変化も30.84から98.28までの範囲で増加した。注目すべきはSOSsにおいてParabacteroidesの大幅な増殖があることで興味深い。Parabacteroidesは健康によい高繊維食を消化し、それらは炎症から保護する。これらの細菌は炎症性腸疾患に苦しむ患者からは失われている。Martinez（マルティネス）（2010）、Noor（ヌール）（2010）、Segata（セガタ）（2012）、およびZitomersky（ジトメルスキー）（2013）。
表5は八つの細菌（Lachnospiraceae未分類（“Laehn. U.”）、Clostridium XlVa（“Cl XIVa”）、Bifidobaeterium（“Bifid.”）、Coprococcus（“Copro.”）Blautia（“Blaut.”）、Phascolarctobacterium、（“Phasc.”）、Faecalibacterium（“Faecal.”）、Butyricicoccus（“Butyr.”）、およびParabacteroides（“Para.”）のパネルに対するサンプル番号9-16（および比較サンプル1-16、ならびにLivauxTMサプリメント、イヌリン、およびアモキシシリン）の第二のi-screen分析について観察された効果をまとめ、そこで報告した結果は未処置のコントロールと比較する（増殖は1.0として示す）。
Figure 2022517237000011
表6は第二のスクリーニングにおいて使用した比較サンプル1-16の組成構成を要約する。
Figure 2022517237000012
表5の結果に基づいて、すべてのスフィンガンオリゴ糖がすべての比較サンプルと比較してFaecalibacteriumの最も高い増殖を示したことが見られ得る。特に、Faecalibacteriumの最高の増殖はGELRITETMMKゲラン（5kDaカットオフ（SN10））から得られるゲランオリゴ糖類（約52倍）、自然なラムサン（SN12）から得られるラムサンオリゴ糖類（約49倍）、およびGELRITETMMK（10kDaカットオフ（SN14））から得られるゲランオリゴ糖類（43倍）によって示された。興味深いことに、LivauxTM生産物－Faecalibacterium増殖活性を有すると掲げられた（例は、livaux.com/livaux-gi-problem/を参照）は－未処理のコントロールと比較してFaecalibacterium増殖活性におけるわずか1.14倍の増加を示した。LivauxTM生産物の活性についての比較的低いFaecalibacteriumの増殖活性は発表されたデータと一致する。（US20170326190A1）。
表4および表5からの結果の比較は、一定の例では、選定したサンプルについての変動性を示す（SN10（188.31 v. 51.54）およびSN12（70.44 v. 48.73）を比較）。選定したデータの追加分析は選定したスフィンガンについての変動係数（すなわち、平均に対する標準偏差の比率）が約7％から約32％まで、および場合によっては最大約80％まで変動し得ることを示す。
表5の結果に基づいて、すべてのスフィンガンオリゴ糖類がBlautiaについての増殖活性における増加を示したことが見られ得る（すなわち、未処置のコントロールと比較して2-5倍の増加）。
示されていないデータはすべてのスフィンガンオリゴ糖類がEscherichia/Shigellaについての増殖活性における低下を見せたことを明らかにする（未処置のコントロールと比較しておよそ9-36％の減少）。これはLivauxTM生産物とは対照をなすであろうが、それはEscherichia/Shigellaについての増殖活性における増加を見せた（未処置のコントロールと比較しておよそ45％増加）。
III．例III．ヒト胃腸管における内腔および粘膜腸内細菌叢の活性および組成に対するゲランガムの影響。
A．材料および方法、SHIME実験の設計、および典型的なSHIME反応器のセットアップ
ヒト腸内微生物生態系のシミュレーターの側面（またはSHIME）が知られる。（例は、Molly（モーリー）（1993）、Possemiers（ポッシミエルス）（2004）、Possemiers（2017）、Van de Wiele（ヴァン・ド・ヴィール）（2013）、Van den Abbeele（2012）、およびVan den Abbeele（2013）を参照）。
SHIMEの典型的な反応器セットアップは成体のヒトの胃腸管を表し、Molly（1993）によって説明された。それはヒト胃腸管のさまざまな部分をシミュレートする一連の五つの反応器で構成される（例は、胃（V1）、小腸（V2）、上行結腸（V3）、横行結腸（V4）、および下行結腸（V5））。最初の二つの反応器は食物の摂取および消化におけるさまざまなステップをシミュレートするためのフィルアンドドロー（fill-and-draw）原理であり、定義された量のSHIMEフィード（140mL 3×/日）ならびに膵臓および胆汁液（60mL 3×/日）を、それぞれ胃（VI）および小腸（V2）の区画に加える蠕動ポンプを有し、および指定された間隔の後にそれぞれの反応器が空にされる。最後の三つの区画は大腸をシミュレートする。これらの反応器は継続的に撹拌され；それらは一定の容量およびpH制御を有する。結腸のさまざまな部分におけるインビボ条件に似せるためにさまざまな脈管の保持時間およびpHが選定される。糞便微生物叢を接種すると、これらの反応器は上行（V3）、横行（V4）、および下行（V5）の結腸をシミュレートする。接種材料の準備、保持時間、pH、温度設定および反応器フィードの組成はPossemiers（2004）によって以前に説明された。結腸の異なる領域における微生物群集が安定すると、代表的な微生物群集が三つの結腸区画において確立され、それは異なる結腸領域において組成および機能において双方が異なる。
ヒト腸管は大きくおよび複雑な微生物の群衆を伴い、それは病原体によるコロニー形成を防ぐことによって、および栄養素を生産することによってヒトの健康を維持することに関与する。微小有機体は腸全体にランダムに分布しておらず、および腸壁に付着しているものは病原体に対する‘バリア’として重要な役割を果たし、粘膜免疫応答が指示され、および潜在的に有害なコロナイザー（colonizers、生着菌などとも言う）を犠牲にしてニッチが占められる。ただし、目下のインビトロ戦略は消化管粘膜に付着する微小有機体の画分を培養可能にすることはできず、および内腔の微生物群集のモデリングに制限される。これは消化管生態系の重要な部分が考慮されておらず、および潜在的に重大な情報が失われることを意味する。
この問題を克服するために、粘液層のコロニー形成を説明するためにSHIMEシステムが修飾された。（例は、Van den Abbeele（2012）およびVan den Abbeele（2013）を参照）。修飾したSHIMEシステムはM-SHIMEとして知られ、それは数週間にわたって内腔および粘液に関連する微生物群集の双方を培養可能にすることができる。
粘膜区画を含めると、SHIMEの値およびモデリング能力が向上し、および特定の処置が粘膜関連微生物群集を調節することができるかどうかが評価可能になる。
1．調査のための適応されたSHIMEセットアップ
SHIMEセットアップはTWINSHIME（ツインSHIME）構成からTripleSHIME（トリプルSHIME）構成に適合し、それには、各々のドナーについての胃、小腸、近位結腸、および遠位結腸用の脈管（または反応器）が含まれた。TripleSHIME構成は三つの異なる条件を並行して比較できた。三名の異なるヒトドナーの微生物叢によるゲランガムの潜在的な発酵を評価した（ドナーA：女性、28歳；ドナーB：女性、41歳；ドナーC：女性、34歳）。TWINSHIMEにおける三つの領域と比較して結腸領域は二つの領域に制限した。十分な胃腸管シミュレーションについて代表する結果を得るために、保持時間およびpH範囲を最適化した。実際に、TripleSHIME実験では、それぞれがAC-TC-DC構成（上行、横行および下行結腸）で構成される2つのユニットを働かせる代わりに、一つは3つのPC-DCユニットを使用した。ヒト成人の糞便微生物叢による接種により、これらの反応器は近位結腸（PC；pH5.6-5.9；保持時間=20h；500mLの容量）および遠位結腸（DC；pH6.6-6.9；保持時間=32h；800mLの容量）をシミュレートする。
この研究についてのSHIME実験は七週間を超えて及ぶ三つの段階（安定化、制御、および処置）で構成された。
安定化期間：適切な糞便サンプルによる結腸反応器の接種の後、二週間の安定化期間は微生物群集をローカル環境条件に応じて異なる反応器で分化させることを可能にした。この期間の間、糞便接種物における元々存在した消化管細菌叢の最大の多様性をサポートするために、基本的な栄養マトリクスをSHIMEに提供した。
コントロール期間：この二週間の参照期間の間に、標準のSHIME栄養素マトリクスを14日間モデルにさらに投与した。この期間におけるサンプルの分析により、さまざまな反応器でのベースラインの微生物群集の組成および活性を決定可能にし、それは処置効果を評価するための参照として使用した。
処理期間：この三週間の期間中、SHIME反応器は通常の条件下で操作したが、テスト生産物が追加された食事を伴う。この期間において結腸反応器から採取されたサンプルは常在微生物群集の組成および活性に対する特定の影響の調査を可能にする。
B．微生物群集の組成および活性の分析
SHIMEの特長は安定化した微生物叢群集と連携し、およびさらなる分析のためにさまざまな腸領域から定期的にサンプルを収集する実現性である。結腸領域における大容量は微生物群集を乱したり、または実験の残りの部分を危険にさらしたりすることなく、毎日十分な容量の液体を収集することを可能にする。
標準的なSHIME実験の一環として実験全体を通して複数の微生物パラメーターが監視される。これらの測定はモデルのパフォーマンスを評価し、およびプレバイオティクス処理による微生物群集の組成および活性の基本的な変化を監視できるようにするために必要である。
1．微生物群集の組成および活性の分析
酸/塩基の消費：結腸反応器での微生物代謝産物の生産はpHを変動させる。継続的なpH制御（酸または塩基の添加を通して）を伴わないと、pHは固定した間隔を超えるであろう。酸/塩基の消費はSHIME実験の間に継続的に監視する。
合計ガス生産：合計ガス生産の評価は最終用途の場合における潜在的な許容範囲の問題に関連する重要な側面である。ただし、消化管の連続モデルにおいて、オンラインの合計ガス生産の測定は困難であり、質量の連続的な流入および流出（in-and-outflow）のためである。したがって、合計ガス生産分析は典型的にバッチ設定において評価される。
2．微生物群集活性（3×/週）
短鎖脂肪酸（SCFA）：酢酸、プロピオン酸および酪酸の濃度を分析した。
ラクタート：SCFAの前駆体および潜在的な抗菌剤。
アンモニウムおよび分枝SCFA（イソ酪酸、イソ吉草酸およびイソカプロン酸）はタンパク質分解発酵のマーカーであり、宿主の健康にかなり悪影響を及ぼす。
微生物群集組成（1×/週）；サンプルは16S標的Illumina（イルミナ）シーケンシング用に採取した。
C．研究に使用したGellan Gum
試験生産物には、食物グレードのゲランガム、KELCOGEL(R)LT100-Pゲランガム（“Gellan Gum”）が含まれた。KELCOGEL(R)LT100-Pゲランガムは自然（高アシル）ゲランガムである。生産物は1g/dのインビトロ用量にてテストし、それは2g/dのインビボ用量に対応する。
D．SHIMEセットアップの安定性
コントロール期間の間、SCFAレベルは三つのSHIMEユニット内で非常に安定し（平均して、レベルはコントロール期間での連続する時点間で94.4％類似した）、活性および組成の観点から微生物群集の安定性が明確に指し示される。安定した反応器条件は処置の間に観察される任意の効果が施された試験生産物に実際に起因したという確信を高める。
E．全体的な発酵活性
1．酸/塩基の消費
酸および塩基の消費はSHIME実験全体の微生物活性全体を反映する。最適な環境条件が維持されることを確実にするために、SHIMEシステムにおけるpHは近位結腸における5.6-5.9および遠位結腸における6.6-6.9間でpHコントローラーによって制御する。異なる反応器における微生物群集が安定すると（接種後2週間から開始して）、塩基-酸の消費は大抵低い。ただし、処置の間に細菌は増えた量のSCFAを生産し得る。結果として、反応器における環境は酸性化し、それらを事前に設定されたpH範囲に保つためにそれぞれの反応器に塩基を投与する必要がある。その結果、酸/塩基の消費量が増加する。実験を通して酸/塩基の消費量を測定することにより、微生物群集の活性に対する試験生産物の潜在的な影響を推定することが可能であろう。ただし、酸/塩基消費は微生物発酵の大まかな指標にすぎないことに注目しなければならず、発酵によって生産されたすべての酸が同様のpH低下を引き起こすわけではなく（より一層低いpKaの酸、例えば、アセタートなどのようなものはpHを効果的に低下させ）、その一方で酸の相互への変換はまたpHに影響を与えることができる（例は、アセタート/ラクタートからプロピオナート/ブチラートへの変換はpHを上昇させる）。微生物代謝物（例えば、SCFAおよびラクタートなどのようなもの）の実際の測定はより一層正確な読みを提供する。
表7のデータは試験生産物の全体的な発酵が近位および遠位の結腸区画双方における試験した三名のドナーにわたって同様の傾向を示したことを示す。
近位結腸（PC）反応器における三名の異なるドナー（A、B、C）についてGellan Gumによる処置の二つのコントロール（ClおよびC2）および三つの処置（TR1-TR3）の間の週平均塩基-酸消費量（mL/日）およびコントロール（n=6）および処置（n=9）期間全体にわたる平均酸/塩基消費。
Figure 2022517237000013
近位結腸において、酸性化は非常に限られ、しかしながら、試験したすべてのドナーについての処置の最終週の間に、塩基消費量が増加する傾向が観察された。遠位結腸において、近位結腸と比較してコントロール期間の間に酸性化がより一層顕著であった。これはより一層酸性の近位結腸懸濁物（pH=5.6-5.9）の遠位結腸への物理的移動がpHを正しい間隔（pH = 6.6- 6.9）に保つために、この遠位結腸におけるより一層高い塩基消費を自動的に起こさせる。試験生産物の補給は試験されたすべてのドナーの処置開始直後にわずかに上昇した塩基消費をもたらした。
2．ガス生産
ガスは腸内微生物による発酵活性の主要なエンドポイントであるため、ガス生産における変化は全体的な発酵プロファイルの指標を提供する。連続SHIMEモデルではガス生産が監視されないため、窒素ガスによるヘッドスペースの定期的なフラッシイングを考慮すれば（嫌気生活を確実にするために）、ガス生産は個別の短期バッチインキュベーションにおいて評価する。そのようなインキュベーション中に、調査中の生産物の同じ用量がコントロール期間中にSHIMEの近位結腸に由来する微生物叢に供給され、それゆえに連続SHIMEモデルにおいて処置を開始するときに発生するプロセスが模倣される。
ガス生産に関してドナー依存の影響が観察された（データは示さない）。試験生産物により処置する際ドナーBについてわずかに増加したガス生産が観察されたのに対し、処置は他のドナーについてわずかに減少したガス生産をもたらした。全体として、ガス生産はすべての条件について6-24時間の時間間隔で最も強かった。4-6時間の時間間隔でだけ、試験生産物での処置の際にすべてのドナーにわたり一貫した（ただし軽度の）ガス生産における増加が観察されたが、他の時間間隔はドナー固有の違いによって特徴付けられた。
全体として、Gellan Gumによる処置は試験した三名のドナーについて腸内細菌叢によるガス生産にほとんど影響を与えなかった。
F．微生物群集活性の分析
1．短鎖脂肪酸（SCFA）の生産
以下の情報はTriple-SHIME実験でのSCFA生産に対する試験生産物の影響を説明する。SCFAの生産は結腸における炭水化物代謝に起因し、および種々の健康への影響に関連する。最も豊富なSCFAsはアセタート、プロピオナートおよびブチラートである。SCFAsは消化管の健康における重大な役割を果たすことでよく知られる。アセタートは宿主についてエネルギー源として、および体内の脂質合成のための潜在的な基質として使用することができる。さらに、それはブチラートの合成における重要な副産物であり、および病原体に対して抗微生物効果を発揮することができる。しかし、健康増進効果はプロピオナートおよびブチラートに主に起因し、それらは消化管上皮について主要なエネルギー源として作用し、および炎症および結腸ガンに対する保護効果を示す。Cummings（カミングス）（1987）。プロピオナートは肝臓に輸送されることが知られており、そこでそれは血しょうにおけるコレステロール低下効果を有し、および血糖コントロールにプラスの影響を及ぼす。（Wright（ライト）（1990）、Demigne（デミーニュ）（1995）、およびWong（ウォン）（2006）を参照）。
要約すると、SCFA生産に対する調査された基質の有益な効果には、その結果、アセタート、プロピオナートおよび/またはブチラートの生産の増加が含まれる。以下の情報は三名のドナーの結果の直接比較を考慮する。
異なるドナーを最適に比較するために、それらの三名すべてについて平均SCFAレベルを各々の異なるSCFA（週ごとおよび期間ごとに）について表示する。
2．アセタートの生産
アセタートは他にも多数あるがBacteroides spp.（バクテロイデス属種）（phylum Bacteroidetes（バクテロイデス門））およびBifidobacteria（ビフィドバクテリウム属）を含む広範囲の消化管微生物によって生産することができる。その結果、Gellan GumはドナーAおよびCの近位結腸でのアセタートレベルを著しく増加させたが、アセタートレベルはドナーBについて影響を与えなかった（図2a、表8）。最大の平均増加はドナーAについて観察された（即ち、1.7mMまたは+21％の増加）。対照的に、遠位結腸において、Gellan Gum処置時のアセタートレベルの増加はドナーBについてだけ観察され（図2b、表8）、コントロール期間と比較して平均2.1mM（+6％）の増加であった。
三名の異なるドナー（A、BおよびC）についての近位（PC）および遠位結腸（DC）反応器でのアセタート生産（mMにおける）、およびコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1-TR3）週間中の週平均アセタート生産に対するGellan Gum処置の影響（図1a-1bも参照）。
Figure 2022517237000014
 3．プロピオナート生産
プロピナートは広範囲の消化管微生物によって生産され、最も豊富なプロピオナート生産株はBacteroides spp.（バクテロイデス属種）（phylum Bacteroidetes（バクテロイデス門））、Veillonella（ベイロネラ属）（phylum Firmicutes、ファーミキューテス門）およびAkkermansia muciniphila（アッカーマンシア・ムシニフィラ）（phylum Verrucomicrobia（ベルコミクロビウム門）である。試験した三名のドナーすべてについて、Gellan Gumの施与は双方の結腸領域の処置に応答してプロピオナートレベルの著しい減少をもたらした（図3a-3b、表9）。近位結腸では、ドナーAおよびBについて強い即時の減少が観察されたが、ドナーCについて効果はそれほど顕著ではなかった（即ち、ドナーCについて1.7mM（-8％）の減少に対してドナーAおよびBについてそれぞれ-4.3mM（-18％）および-4.8 mM（-20％））。他方での遠位結腸では、すべてのドナーについてプロピオナートレベルでのより一層緩やかな減少が観察された。これらの知見はEdwards（1995）およびAnderson（1988）の研究を考慮して驚くべきものである。例として、Edwards（1995）はウィスターラット（Wistar rats）についてゲランガムはSCFA含量に対し一貫した影響を及ぼさなかったと述べ、その一方でAnderson（1988）はゲランガムの大量の摂取は雌性ボランティアについてのプロピオナート糞便含量における23％減少および雄性ボランティアのプロピオナート糞便含量において33％増加をもたらしたと報告する。
三名の異なるドナー（A、BおよびC）についての近位（PC）および遠位結腸（DC）反応器でのプロピオナート生産（mMにおいて）、およびコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1-TR3）週間中の週平均プロピオナート生産に対するGellan Gum処置の影響（図2a-2bも参照）。
Figure 2022517237000015
 4．ブチラート生産
ブチラートはClostridiumクラスターIVおよびXlVa（Firmicutes門）のメンバーによって生産される。クロスフィーディング（cross-feeding）と呼ばれるプロセスにおいて、これらの微生物はアセタートおよび/またはラクタートを（他の基質とともに）健康関連のブチラートに変換する。試験したすべてのドナーについて近位にGellan Gumの補充によりブチラートレベルは徐々に増加し、および遠位結腸においては比較的程度が低いまでであった（図4a-4b、表10）。効果は近位結腸で最も顕著であり、ドナーA、ドナーBおよびドナーCについてそれぞれ2.3mM（+24％）、1.9mM（+21％）および1.4mM（+15％）の著しい増加を伴った。遠位結腸では、ドナーAだけがGellan Gum補給の際にブチラートレベルを有意に増加させた（即ち、1.4mM（+13％）の増加）。
三名の異なるドナー（A、BおよびC）についての近位（PC）および遠位結腸（DC）反応器でのブチラート生産（mMにおける）、ならびにコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1-TR3）週間中の週平均ブチラート生産に対するGellan Gum処置の影響（また図4a-4bも参照）。
Figure 2022517237000016
 5．ラクタート生産
ヒト腸には、ラクタートを産生する細菌およびラクタートを利用する細菌の両方が生息する。ラクタートは乳酸菌によって生産され、および環境のpHを低下させる。特に低いpH値では、ラクタートは病原体に対して強力な抗微生物効果を発揮することができる。ラクタートの別の有益な効果はそのブチラートおよび/またはプロピオナートへの変換から生じる。それゆえに、異なる微生物種がラクタートを生産および変換するので、ラクタート濃度の増加は増加した生産ならびに減少した変換の双方から生じることができる。したがって、ラクタートの結果のデータ解釈には注意する必要がある。
近位結腸では、試験したすべてのドナーについて処置の最終週の間にラクタート濃度が増加し、ドナーAについてだけ有意性に達する（表11）。しかし、他のドナーについて、処置の最終週の間に、ラクタート濃度がこの週の経過の間に徐々に増加したため、高い標準偏差を観察することができ、即ち、ドナーBについての最終処置週の初めでの0.19mMからその週の終わりでの0.73mMまでおよびドナーCについての0.13mMから0.46mMまでであった。遠位結腸において、ドナーCについての処置の最終週の間に著しく増加したラクタート濃度が観察された。ドナーAについて、Gellan Gumの補充の際にラクタート濃度が高くなる傾向が観察されたが、ドナーBについてラクタート濃度は処置により影響されなかった。
三名の異なるドナー（A、BおよびC）についての近位（PC）および遠位結腸（DC）反応器でのラクタート生産（mMにおいて）、およびコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1-TR3）週間中の週平均ラクタート生産に対するGellan Gum処置の影響（また図5a-5bも参照）。
Figure 2022517237000017
 6．アンモニウムおよび分枝SCFAの生産
アンモニウム（NH4 +）および分枝SCFA（b-SCFA=イソブチラート、イソバレラートおよびイソカプロラートの和）の双方の生産はタンパク質分解に起因し、および消化管細菌叢のタンパク質分解活性を反映する。後者は直接的および間接的な健康への悪影響（例として、結腸ガン発生）に関連しているため、アンモニウム/b-SCFA生産での減少は有益であると考えられる。図6a-6b（表12）は二つの結腸領域における異なる処置に関連する平均アンモニウム（mg/mLにおいて）生産を示すが、図7a-7b（表13）は二つの結腸領域における異なる処置に関連する平均分枝SCFA生産（mMにおいて）を提示する。
アンモニウムレベルはドナーCについての処置の最終週の間に近位結腸でのわずかな増加を除いて、試験したすべてのドナーについての近位結腸および遠位結腸の双方においてゲランガムによる処置によって影響を受けなかった。これらの結果は分枝SCFAレベルによって確認され、そこで試験したすべてのドナーについて近位結腸および遠位結腸の双方において処置の終わりに向かってわずかな増加しか観察されなかった。
三名の異なるドナー（A、BおよびC）についての近位（PC）および遠位結腸（DC）反応器でのアンモニウム生産（mg/L）、ならびにコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1-TR3）週間の間の週平均アンモニウム生産（mg/L）に対するGellan Gum処置の影響（また図6a-6bも参照）。
Figure 2022517237000018

三名の異なるドナー（A、BおよびC）についての近位（PC）および遠位結腸（DC）反応器での分枝SCFA生産（mM）、ならびにコントロール（ClおよびC2）および処置（TR1-TR3）週間の間の週平均分枝SCFA生産（mM）に対するGellan Gum処置の影響（また図7a-7bも参照）。
Figure 2022517237000019
 G．微生物群集組成の分析
16S標的化Illuminaシーケンシングは16S rRNA遺伝子の増幅に基づく分子技術である。Illuminaシーケンシング方法はPCRベースであり、微生物の配列は飽和レベルに達するまで増幅される。したがって、広範囲の（事前定義されていない）OTUsに関する情報が取得される一方で（＞100異なる最も優勢なOTUs）、結果は各サンプル内の配列の合計量に対する比例値として表示され、それゆえに、半定量的結果が提供される。ここで適用される方法論には、16S rDNAの二つの超可変領域（V3-V4）にまたがるプライマーが含まれる。ペアードシーケンシングアプローチ（paired sequencing approach）を使用すると、2×250bpのシーケンシングにより424bpのアンプリコンが得られる。そのような断片は分類学的に情報量が少ないより一層小さな断片と比較して分類学的により一層有用である。門および科レベルにてデータを処理することに加えて、変化した特定のOTUsを識別することができ、その一方でまた、シンプソン多様性指数（Simpson diversity index）は多様性および均等性（evenness）の両方の尺度として算出することができる。インデックスの可能な最小値は1であり、一つのOUTだけで構成されるコミュニティ（群集）が表される。可能な最高値はOTUsの合計数である。OTU分布がより均一であるとき、インデックスは最大値にさらに近づくが、その一方で少数のOTUsによって支配されているコミュニティは1に近い値をもたらす。インデックスが高いほど、多様性が大きくなり、および均一性が大きくなる。
1．多様性指数
相互シンプソン多様性指数（The reciprocal Simpson Diversity index）は種の豊富さおよび均等性の両方の観点から多様性の尺度として算出した。多様性指数に基づいて、コントロール期間中に各々の三つのSHIMEユニットがPCおよびDCの両方において再現性のある内腔および粘膜の微生物群集によってコロニー形成されたことが続いた。多様性はDCにおいてより一層高かったが、その一方またそれはPCおよびDCの両方において内腔微生物叢について粘膜微生物叢に対して著しく高かった（表14）。
コントロール期間（n=6）中のSHIMEの三つのユニットの近位（PC）および遠位結腸（DC）の内腔（L）および粘液（M）の平均相互シンプソン多様性指数。さらにまた、LおよびMの間またはPCおよびDCの間の相互シンプソン多様性指数についてスチューデントのt検定を使用して算出されるそれらのp値によって証明されるような有意差（p＜0.05）。
Figure 2022517237000020
さらに、処置効果に関して、ゲランガムは試験された三名のドナーすべてについて、コントロールと比較して腸内細菌叢の多様性を増加させた（図8）。PCにおける内腔微生物叢の多様性だけがGellan Gum処置によりわずかに減少した。
2．門レベル
また、門レベルでの微生物叢の組成は三つの異なるSHIMEユニットが近位結腸および遠位結腸の両方において再現性のある内腔および粘膜の微生物群集によってコロニー形成されたことを指摘した。その結果、各々の四つの環境について平均値を算出し、一方でいずれかの四つの環境について特定の門の選好（preference of）を理解するために統計的検定を実行した（表15）。
コントロール期間中のSHIMEの三つのユニットの近位（PC）および遠位結腸（DC）の内腔（L）および粘液（M）の微生物門レベルでの平均存在量（％）（n=6）。さらにまた、LおよびMの間、またはPCおよびDCの間の一定の門についての有意差（p<0.05）はスチューデントのt検定を使用して計算されたp値を使って太字および下線を引く。
Figure 2022517237000021
これにより内腔対粘液の層の次のものによる門特異的なコロニー形成が明らかになった：（i）内腔におけるBacteroidetes（バクテロイデス門）のより一層高いレベル（DCにおいてだけ有意）；（ii）内腔におけるProteobacteria（プロテオバクテリア門）のより一層高いレベル（PCにおいてだけ有意）；および（iii）粘液におけるSynergistetes（シネルギステス門）のより一層高いレベル（DCにおいてだけ存在）。さらに、以下の縦方向の違いが結腸に沿って観察された：（i）PCにおける増加したActinobacteria（アクチノバクテリア門）レベル；（ii）DCにおける増加したBacteroidetesのレベル（内腔においてだけ有意）；（iii）DCにおけるSynergistetesの存在；および（iv）粘液層におけるPCでのより一層低いProteobacteriaレベルであり、その一方で内腔において反対の傾向が観察された。
処置に関して、発酵の主要部位、即ち、近位結腸の内腔（図9）にて、Gellan Gumは試験した三名のドナーすべてについてBacteroidetesおよびFirmicutesを犠牲にしてActinobacteriaレベルを強く増加させた。遠位結腸の内腔サンプルについても同様の観察が注目された（図9）。追加的に、遠位結腸において、SynergistetesおよびLentisphaerae（レンティスファエラ門）の内腔レベルはGellan Gumでの処置の際に増加した。粘膜区画（図9）において、変動性は時間の経過とともにサンプルにおいてより一層高くなる傾向があった。これは粘液層の頂部に形成されるバイオフィルムのより一層不均一な組成に対する均一な内腔懸濁物に起因する可能性がある。内腔におけるのと同様に、粘膜ActinobacteriaはGellan Gumによる処置により近位および遠位結腸の両方において豊富化され（Synergistetesの非常に強い刺激を示したPCにおけるドナーCを除く）、しかしながら、これはBacteroidetesおよびFirmicutesにおける内腔でのような減少が伴われなかった。実際、粘膜区画において、Gellan Gum処置の際にFirmicutesレベルに個体差が観察され、即ち、ドナーAはFirmicutesレベルの低下を示したが、その一方でドナーBおよびCについて増加が観察された。最後に、Gellan Gumによる処置は近位結腸の粘膜サンプルにおいてProteobacteriaの存在量を増加させる傾向があった。
3．科およびOTUレベル
科レベルでは、Gellan Gumの処置効果は主に発酵の主な部位、即ち、近位結腸の内腔について議論される（図10）。他の結腸環境（内腔遠位結腸（図11）、粘膜近位結腸（図12）および粘膜遠位結腸（図13））については、多くの同様の観察が行われ、および従って発酵の主な部位からの特定のおよび別個の変化だけが議論される。
Gellan Gumは試験した三名のドナーすべてのBifidobacteriaceaeレベルを大幅に増加させた。図10-11に示す情報は二つのコントロール期間についての近位結腸反応器の内腔でのBifidobacteriaceaeレベルが平均24.7±5.5％であるのに対し、三つの処置期間についての近位結腸反応器の内腔のBifidobacteriaceaeレベルは平均39.0±8.8％であることを示す。さらに、図10-11において提示する情報は二つのコントロール期間についての遠位結腸反応器の内腔でのBifidobacteriaceaeレベルが平均1.85±1.0％であったのに対し、三つの処置期間についての遠位結腸反応器の内腔でのBifidobacteriaceaeレベルは平均8.3±2.3％であったことを示す。OTUレベルでは、主な変化はBifidobacteriaceae OTU 2（Bifidobacterium adolescentisに関連）の増加に起因することが見出された。この強力なビフィドジェニック効果はGellan Gum処置の際に三名のドナーすべてについて観察されたアセタートレベルの大幅な増加とうまく対応する。
Gellan Gumによる処置は試験した三名のドナーすべてのBacteroidaceaeレベルを強く低下させた。Bacteroidaceaeファミリーには、多くの既知のプロピオナート生産株が含まれ、それはGellan Gumの補給の際に観察されたプロピオナートレベルでの強力な低下を説明する。追加的に、Gellan Gumにより処理すると、Veillonellaceae（ベイヨネラ科）の存在量の減少が観察され、それはVeillonellaceae OTU 1（Megamonas sp.（メガモナス属種）に関連）の減少に主に起因した。このOTUは強力なプロピオナート生産株であるため（ラクタートを消費しながら）、その減少は処置期間中に観察された減少したプロピオナート濃度に寄与する可能性がある。
Gellan Gumはまた、試験した三名のドナーの三週間の処置期間を通じてLachnospiraceaeレベルをわずかに増加させ、それは同じ期間中に観察された増加したブチラート濃度に連関することができる。対照的に、内腔遠位結腸ではLachnospiraceaeレベルが低下したのに対し、他のブチラート産生ファミリーはGellan Gum処置の際に増加し、即ち、Acidaminococcaceae（アシダミノコッカス科）、Eubacteriaceae（ユーバクテリウム科）およびRuminococcaceae（ルミノコッカス科）である。しかし、処置の最終週の間に、Ruminococcaceaeのレベルは遠位結腸において再び減少したが、同じ週の間にVeillonellaceaeの刺激が観察された。後者は処置の最終週の間に遠位結腸において観察されたプロピオナート産生の増加を説明し、およびVeillonellaceae OTU 1（Megamonas sp.に関連）の刺激に主に起因する。
Gellan Gumにより処置すると粘膜環境において単独で濃縮された別のブチラート産生ファミリーはClostridiaceae（クロストリジウム科）ファミリーであり、近位結腸におけるClostridiaceae OTU 23（Clostridium butyricum（クロストリジウム・ブチリクム）に関連）対遠位結腸におけるClostridiaceae OTU 17（Clostridium tertium（クロストリジウム・テルチウム）に関連）が明確に増加した。
Gellan Gum処置に関する別の一貫した知見はProteobacteria門内のいくつかのファミリーでの増加、例えば、Enterobacteriaceae（エンテロバクター科、腸内細菌科）およびXanthomonadaceae（キサントモナス科）の増加などのようなものであった。これらのファミリーはそれらがいくつかの日和見病原性種を含むとして主に知られるが、しかしながらまた、これらのファミリー内には多くの共生生物が存在し、それらはさまざまな結腸領域においてタンパク質を発酵させることが知られるが、主に遠位結腸においてである。確かに、遠位結腸領域について同様の観察がなされ、そこでProteobacteria門のいくつかのファミリーがGellan Gumでの処置の際にわずかに増加した。これらの知見は処置期間の終わりに向かって観察された分枝SCFAレベルにおけるわずかな増加と相関することができる。
最後に、内腔近位結腸でのGellan Gum処置の際に、いくつかのドナー特異的変化が観察された：（i）ドナーBおよびCについてのMicrobacteriaceae（マイクロバクテリウム科）レベルの増加；（ii）ドナーAおよびCについてのMicrococcaceae（ミクロコッカス科）レベルの増加；（iii）特にドナーCで観察されたEnterococcaceae（エンテロコッカス科）レベルの増加（同様の観察が遠位結腸で行われ、それはこのドナーについて観察された処置の最終週の間に増加したラクタート濃度を説明することができた）；および（iv）ドナーCについてのSynergistaceae（シネルギステス科）レベルの増加である。Synergistaceaeは主に遠位結腸領域のコロナイザーであるため、内腔遠位結腸サンプルにおいてより一層強い効果が観察され、そこでは試験した三名のドナーすべてについてSyngeristaceaeの強い濃縮が観察された。
H．例IIIの結果の概要
酸/塩基の消費、ガス、SCFA、ラクタートおよびアンモニウムの生産はすべて、コントロール期間の間三つの異なるSHIMEユニット内で非常に安定していた。これはSHIMEモデルが最適な条件下で操作され、安定した結腸微生物叢がもたらされたことを指し示した。この安定性は処置中に観察された任意の効果が2g/dのインビボ用量に対応する濃度にて施された試験生産物から真にもたらされたことに必須である。
Gellan Gumによる処置を開始すると、試験したすべてのドナーの処置の最終週に、近位結腸での塩基消費量が増加した（SCF A/ラクタート産生を介した微生物発酵を指し示す）。また、遠位結腸では、塩基消費量における軽度の即時増加を観察した。ガス生産に関し、ドナー依存の効果を観察し、ドナーBについてのガス生産はわずかに増加したが、他のドナーのガス生産は生産物の追加の際に減少した。
塩基消費およびガス生産は微生物発酵の大まかな指標を提供するだけであるが、SCFA測定は糖分解発酵プロセスにおいてより一層詳細な洞察を提供する。これはGellan Gumが近位結腸において主に発酵し、そこでそれはアセタートおよびブチラートのレベルを徐々に増加させながらプロピオナートのレベルを即座に減少させたことを論証した。ドナーAの微生物叢はGellan Gumで処置するとアセタートおよびブチラートの両方のレベルが最も顕著に増加した。また、遠位結腸では、アセタートおよびブチラートのレベルは処置の過程の間に徐々に増加し、その一方でプロピオナートのレベルは徐々に減少し、次いで処置の最終週の間に増加した。アセタート生産での最大の増加はドナーBで観察されたが、ドナーAはブチラートレベルでの最大の増加をもたらした。さらに、ラクタート濃度は全体的に非常に安定したままであった。近位結腸では、ラクタートだけはドナーAについての処置の最終週の間に有意に増加した。遠位結腸では、ドナーCについての処置の最終週の間に有意に増加したラクタート濃度を観察した。
タンパク質分解発酵についてのマーカーに関し、ドナーCの処置の最終週の間に近位結腸においてわずかに増加したことを除いて、近位結腸と遠位結腸の両方で試験したすべてのドナーでアンモニウムレベルは影響を受けなかった。これらの結果は分枝したSCFAレベルによって確認され、そこで試験したすべてのドナーについて近位および遠位結腸の両方で処置の終わりに向かってわずかな増加だけが観察された。
16S標的化シーケンシング分析により、SHIMEモデルは試験した三名のドナーについての近位および遠位結腸区画の両方で多様な内腔および粘膜の微生物叢を維持したことが明らかになった。興味深いことに、粘膜微生物叢はヒト成体についての知見と一致して、よく知られているブチラート産生種を含むファミリーにより強く豊富化された。粘液層のこの種特異的なコロニー形成に加えて、微生物コロニー形成における縦方向の違い（近位対遠位結腸）もまた確立された。
微生物群集組成に対する処置効果に関し、Gellan Gumはコントロール期間と比較して、試験した三名のドナーの消化管細菌叢の多様性を増加させることが知見された。さらに、発酵の主要部位（近位結腸の内腔）で、Gellan GumはBacteroidetesおよびFirmicutesを犠牲にしてActinobacteriaレベルを強く増加させた。Actinobacteriaでの増加はBifidobacteriaceaeでのブルーム（異常発生とも言う）に主に関連し、それは試験した三名のドナーすべてのアセタートレベルの増加とうまく対応した。興味深いことに、Gellan Gumの補給に対するビフィドジェニック効果はBifidobacterium adolescentisに関連するOUTでの増加に起因するだけであった。BacteroidetesおよびFirmicutesのレベルでの低下は試験した三名のドナーすべての低下したBacteroidaceaeおよびVeillonellaceaeのレベルに主に起因した。両方のファミリーはいくつかの強力なプロピオナート産生株を含み、処置期間中に観察されたプロピオナート濃度の低下と相関する。最後に、Gellan Gumによる3週間の処置期間中のブチラート産生の増加はいくつかのFirmicutesファミリー、例えば、内腔近位結腸でのLachnospiraceae、内腔の遠位結腸でのAcidaminococcaceae、EubacteriaceaeおよびRuminococcaceaeおよび粘膜環境におけるClostridiaceaeなどのようなものに属するブチラート産生種での増加に起因する可能性があった。
IV．例IV．消化管壁機能に対するゲランガムの効果。
A．はじめに
消化管における微小有機体は宿主とその栄養環境との境界にある生物学的に活性な群集を表す。結果として、それらは宿主の生理学および代謝のいくつかの側面に深く影響する。広範囲の微生物の構造成分および代謝物が宿主の腸細胞と直接相互作用して、栄養素の取込みおよび上皮の健康に影響を与える。微生物関連分子パターン（MAMPs）および細菌由来代謝物（例は、短鎖脂肪酸（SCFA））の両方が種々のシグナル伝達経路、例えば、リンパ球成熟、上皮の健康、神経内分泌シグナル伝達、パターン認識受容体（PRRs）-媒介およびG-タンパク質共役型受容体（GPRs）-媒介シグナル伝達などのようなものを活性化する。次に、これらのシグナル伝達経路は炎症性の緊張（inflammatory tone）、エネルギーバランス、消化管運動性および食欲の調節を指図する（Ha（ハー）（2014）でレビューされる）。宿主-マイクロバイオームの相互作用の調節不全は代謝症候群および肥満、炎症性腸疾患（IBD）、例えば、クローン病（CD）および潰瘍性大腸炎（UC）、過敏性腸症候群（IBS）、セリアック病、糖尿病、アレルギー、喘息および自己免疫疾患などのようなものを含め、非常に多くの疾患に寄与することが今日認識される（Groschwitz（グロッシウィッツ）（2009））。これらの障害に共通するのは腸上皮バリアの調節不全（より一層高い透過性）であり、病状が引き起こされる（Fasano（ファザーノ）（2011））。腸のバリア機能が破壊されるとき、分子の輸送はもはや制御されないため、内腔内容物が固有層に入り、および免疫系を活性化し、それによって制御されない免疫応答（‘リーキーガット（leaky gut、腸管壁侵漏などとも言う）’として知られるプロセス）につながり得る。腸上皮バリアは隣接する細胞を機械的にリンクし、および細胞間空間を密閉する複雑なタンパク質-タンパク質ネットワークである細胞間密着結合によって形成される。したがって、腸上皮バリアは免疫寛容および免疫活性化間の平衡を制御し、および従ってそれは‘リーキーガット’の病因において顕著な役割を果たす。これらの密着結合の不適切な機能または調節は、内腔要素がバリアを通過することを可能にするより一層大きな細胞間空間の原因であると考えられ、連続的な局所および全身性炎症を伴う。
B．Caco-2/THP1共培養インビトロモデル
宿主および消化管細菌叢間の界面を模倣するために、いくつかのインビトロモデルが過去数年間に開発されてきており、それは腸上皮様細胞およびヒト起源の免疫細胞の使用を含む。ここで使用するモデルは腸上皮様細胞（Caco-2細胞）およびヒト単球/マクロファージ（THP1細胞）の共培養モデルであった。（図14を参照；またPossemiers（2013）Satsu（サツ）（2006）も参照）。Caco-2は適切な支持体上に播種されるとき、成熟腸細胞様細胞に自発的に分化し、分極、絨毛の存在、ドームの形成、密着結合の存在および頂端刷子縁酵素（apical brushborder enzymes）のベクトル輸送および発現によって特徴付けられる（Sambuy（サンバイ）（2005））。THP1単球は急性白血病を有するヒト患者から分離され、ホルボール12-ミリスタート13-アセタート（PMA）処理によりマクロファージ様細胞に分化する。PMA活性化THP1細胞はマクロファージに特徴的な形態学的特徴を獲得し、支持体に付着し、遊走および食作用に必要な葉状仮足を発達させ、およびトール様受容体（TLR）応答について準備を整えることができる。（Dumrese（ドゥムレセ）（2009））。密着結合（タイトジャンクションなどのこと）タンパク質は隣接する上皮細胞を一緒に保ち、それによって高分子に対する実質不浸透性のバリアが形成される。これらの接合部の‘堅固性（tightness）’は経上皮電気抵抗（TEER）として測定でき、高いTEERはより厳しいバリアに対応する。バリア機能が失われると、流体の傍細胞輸送（細胞間）が増加し、それはTEERの減少として測定することができる。サイトカインを上清中に分泌するPMA活性化THP1細胞の頂部上にCaco-2細胞を置くとき、それらの単層が破壊される。これはおそらく密着結合のサイトカイン媒介性破壊によるものであり、およびTEERでの減少として測定することができる。
消化管内では、化学的、機械的または病原体によって引き起こされるバリア破壊は内腔から固有層への細菌の流入につながり得る（図15）。これにより免疫系が活性化され、それは生理学的な‘免疫寛容原性’炎症から有害な病理学的炎症に切り替わる。炎症性シグナル伝達カスケードは警報分子、例えば、炎症促進性サイトカイン（例は、腫瘍壊死因子（TNF）-αおよびインターロイキン（IL）-1β）などのようなものの産生とともに開始される。TNF-αは、インターフェロン（IFN）-γと一緒に、白血球およびCD4+TH（ヘルパー）1型細胞、侵入する微小有機体に対する重大な細胞防御因子によって産生される。これらの炎症促進性サイトカインはケモカイン（例は、IL-8およびケモカイン（C-X-Cモチーフ）リガンド（CXCL）-10）および接着分子）の産生を誘導し、好中球の動員および活性酸素種（ROS）の産生に必要である。ROSの生産は侵入した細菌を死滅させ、および上皮壁での破れを封じるために必要である。しかしながら、それらはまた組織の破壊および炎症を引き起こし得、IL-6およびIL-10のような抗炎症性サイトカインの産生によって炎症を解消する必要性が導かれる。
IL-6は炎症促進性および抗炎症性の両方の特性を所有する。Scheller（シェラー）（2011）。IL-6は好中球のクリアランスを促進する単球走化性タンパク質（MCP）-1の活性化を介して単球/マクロファージの動員を導く。IL-6はまた炎症促進性サイトカイン、例えば、IL-1などのようなものの産生を抑制することもできる。さらに、IL-6は腸上皮の再生および創傷治癒にプラスの効果を有する。Dann（ダン）（2008）。他方、IL-6はトランスフォーミング（形質転換とも言う）増殖因子（TGF）-βと一緒に、CD4+T細胞の重要なサブセット―TH17細胞の分化を誘導し－それは粘膜組織での細胞外微生物に対する宿主防御において重要な役割をもつ。
IL-10は抗炎症性サイトカインであり、いくつかの生得的な免疫および獲得免疫細胞型を抑えることが可能である。また、IL-10は抗炎症分子の活性化を誘導し、および調節性T細胞（Treg）機能を強化し、それは免疫恒常性を回復させる。Lyer（リアー）（2012）。これらのスイッチオフ機構が損なわれ、および免疫恒常性を回復することができないとき、消化管の病状が発生することがあり、それは慢性炎症を引き起こし得る（例えば、IBDにおいて見られるように、それはTH1-媒介応答の過剰活性化によって、言い換えればTNF-αの過剰産生によって特徴付けられる）。
炎症に関して、TNF-αは免疫系によって、それが多面発現効果を発揮し、および炎症性シグナル伝達を増幅することが可能であるため、産生される最も強力でおよび危険なサイトカインの一つである（図16）。妨げられないとき、TNF-αは慢性炎症を導き、および急性炎症の場合には死に至ることさえある。このため、抗TNF-α療法はIBDおよび関節リウマチを含め、慢性炎症状態において広く使用される。
Caco-2/THP-1共培養モデルはIBD患者でも観察されるいくらかの特長を示し、およびそのため、‘TBD様’モデルであることが示唆され、それは両方が腸上皮バリアの完全性を保護できる物質の効果をテストするために使用でき、および炎症を軽減する。Satsu（2006）。前述のように、このモデルでは、腸のバリア機能の保護はTEERでの増加として測定され、その一方で抗炎症の可能性はサイトカインプロファイルの分析を介して定められる（抗炎症性サイトカインでの増加および炎症促進性サイトカインでの減少）。
SHIMEから収集した結腸懸濁物を共培養の頂端側（Caco-2細胞）に接触させる。基底外側チャンバー（THP1細胞が存在する場所）で観察された効果は次いでCaco-2細胞によって生産された信号によって、および/または微小分子および高分子の輸送によって間接的に媒介される。このアプローチの独特な側面は、それが消化ステップの間に消化管細菌叢によって生産される生産物および発酵由来の代謝物によって誘発される効果を評価可能にするという事実にある（それで純粋な生産物によってだけではない）。Daguet（ダゲット）（2016）。
C．研究の目的
研究のこの部分の目的は三名の異なるドナーにおいて、生産物Gellan Gumおよびそれらの代謝物が消化管壁機能に及ぼす潜在的なプラスの効果を調査することであった。細菌は消化管壁と密接に相互作用し、それで微生物活性の調節は消化管壁の機能に影響を与える可能性がある。これは腸上皮の透過性および特定の免疫マーカーをインビトロで評価することによって査定する。
D．材料および方法
上記のSHIME実験から収集したサンプルを使用して、腸上皮バリア機能および免疫マーカーに対する発酵生産物の効果をインビトロで評価した。これらには、コントロール期間および処置期間の終わりに収集した三名の異なるドナーの近位および遠位結腸反応器からのサンプルが含まれる。
E．Caco-2細胞
共培養実験は以前に記載されたように実行した。Daguet（ダゲット）（2016）。簡単に説明すると、Caco-2細胞（HTB-37；American Type Culture Collection（アメリカンタイプカルチャーコレクション））を24ウェル半透性インサートに播種した。Caco-2単層は経上皮電気抵抗（TEER）を備えた機能的な細胞単層が得られるまで、1週間に三回の培地交換で14ないし21日間培養した。細胞はグルコースおよびグルタミンを含み、HEPESおよび20％（v/v）熱不活化（HI）ウシ胎仔血清（FBS）を添加したDulbecco's Modified Eagle Medium（ダルベッコ改変イーグル培地）（DMEM）で維持した。
F．THP1-BlueTM（THP1-ブルー）細胞
THP1-BlueTM（InvivoGen（インビボゲン））細胞はHEPES、ピルビン酸ナトリウムおよび10％（v/v）HI-FBSを添加した、グルコースおよびグルタミンを含むRoswell Park Memorial Institute（ロズウェルパーク記念研究所）（RPMI）1640培地で維持した。THP1-BlueTMは転写因子核因子カッパB（NF-κB）によって誘導されるプロモーターの制御下で分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を発現するレポーター構築物により安定的にトランスフェクトされたTHP1ヒト単球である。TLRが活性化されると（例は、リポ多糖（LPS）；グラム陰性菌から分離されるものによって）、NF-κBが活性化され、およびSEAPの発現および分泌を誘導する。SEAP活性は次いでQUANTI-Blue（QUANTI-ブルー）試薬（InvivoGen）を使用して上清において測定することができる。THP1-BlueTM細胞を24ウェルプレートにおいて播種し、およびPMAで処理し、それは細胞のマクロファージ様細胞への分化を誘導し、それはまた接着することができ、およびTLRシグナル伝達のためにプライミングされる。
G．Caco-2/THPl-blueTM共培養
共培養を設定する前に、Caco-2単層のTEERを測定した（=0h（0時間）の時点）。空のインサートのTEERはインサートの残留電気抵抗を考慮してすべての読み取り値から差し引いた。次いで前述のように、Caco-2-ベアリングインサートをさらなる実験のためにPMA分化THP1-BlueTM細胞の頂部上に配置した。Possemiers（2013）およびLyer（2012）。
簡単に説明すると、頂端区画（Caco-2細胞を含む）は滅菌ろ過（0.22μm）結腸SEHME懸濁物によりまたは様々な濃度の生菌により満たされた。細胞はまた、陽性コントロールとして酪酸ナトリウム（NaB）（Sigma-Aldrich（シグマ-アルドリッチ））で頂端的に処理した。基底外側区画（THP1-BlueTM細胞を含む）はCaco-2完全培地で満たした。細胞はまたコントロールとして両方のチャンバーでCaco-2完全培地にさらした。細胞を24時間処理し、その後TEERを測定した（=24hの時点）。空のインサートのTEERを差し引いた後、すべての24h値はそれ自体の0h値に正規化し（異なるインサートの初期TEERの違いを説明するため）、および初期値のパーセンテージとして表示する。次いで、基底外側上清を処分し、および細胞を基底外側にて超高純度LPS（Escherichia coli K12（エシェリキア・コリK12）、InvivoGen）を含むCaco-2完全培地で刺激した。細胞はまた、ヒドロコルチゾン（HC）（Sigma-Aldrich）と組み合わせたLPSおよびコントロールとしてのLPSを含まない培地（LPS-）により基底外側にて刺激した。LPS刺激後、サイトカイン測定のために（Luminex(R)multiplex（ルミネックス・マルチプレックス）（Affymetrix-eBioscience（アフィメトリクス-イーバイオサイエンス））によるヒトIL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、CXCL10およびMCP-1）およびNF-κB活性のためにメーカーの指示に従って基底外側上清を収集した。細胞は空気/CO2（95：5、v/v）の加湿雰囲気において37℃にてインキュベーションした。
H．統計
実験コントロールは最初に別々のプロットで提示する；これらは完全培地コントロール（CMまたはLPS-）、リポ多糖（LPS+）処理細胞ならびに酪酸ナトリウム（NaB）およびヒドロコルチゾン（HC）コントロールに関連する。TEERに関しては、条件CMおよびNaBを比較し、および対応のない両側スチューデントのt検定を使用することによって統計的有意性を算出した。免疫マーカー（サイトカイン/ケモカインおよびNF-κB活性）については、すべての条件（LPS-、LPS+HCおよびLPS+NaB）はLPS+と比較する。統計的有意性はLPS+に対するDunnett（ダネット）の多重比較検定による一元配置分散分析を使用することによって算出した。（*）、（**）、（***）、および（****）は、それぞれp<0.05、p<0.01、p<0.001、およびp<0.0001を表す。
SHIMEサンプルに関する結果は個別に表示する。両方の結腸反応器（近位（PC）および遠位（DC）結腸）について提示したコントロール（C）および処置（T）サンプルはSHIME実験において生物学的三重として採取した。三名の異なるドナーの結果が別々に、また三名のドナーの平均としても示す。各処置サンプルおよびコントロール間のTEER、NF-κB活性化およびサイトカイン産生の違いを評価するために、Tukey（テューキー）の多重比較検定を使用した通常の一元配置分散分析を実行した（有意性はアスタリスク（*）により描く）。（*）、（**）、（***）、および（****）はそれぞれp<0.05、p<0.01、p<0.001およびp<0.0001を表す。すべての統計はWindows（ウィンドウズ）用のGraphPadPrismTM（グラフパッドプリズム）ソフトウェアバージョン7.02（GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実行した。
I．コントロール結果
1．経上皮電気抵抗（TEER）
24時間の共培養インキュベーション後、完全培地（CM）コントロールはCaco-2細胞上のPMA-活性化THP1細胞によって誘導した損傷のために、TEERのほぼ40％の減少を示した（図17）。予想通り、酪酸ナトリウム（NaB；陽性コントロール）はCaco-2細胞をこの損傷から保護することおよび単層のTEERを維持することができた。Peng（パン）（2007）。LPSはTEERを24hにて測定した後にだけ追加することに注目する。ただし、予備実験では、使用したLPSの用量がCaco-2細胞のバリアの完全性に大きな影響を与えないことが示された。
2．免疫マーカー
異なる免疫マーカーについて取得した結果は図18、図19および図20に見ることができる。予想通り、LPSはNF-κBの活性化（図18）ならびに試験したすべてのサイトカイン（IL-6およびIL-10（図19）およびIL-1β、IL-8、CXCL10、TNF-αおよびMCP-1（図20））の分泌を増加させることができた。また、コルチコステロイドであるヒドロコルチゾン（HC）はLPS誘導性サイトカインおよびケモカインを弱めることによって（図19および図20）、およびNF-κBのLPS誘導性転写活性を抑制することによって（図18）、広範な免疫抑制物質として作用する。対照的に、酪酸ナトリウム（NaB）はマーカー依存性の効果を示した。NaBはNF-κBの転写活性を増加させ（図18）、その効果はおそらく非ヒストンタンパク質、例えば、NF-κBなどのようなものに対するヒストンデアセチラーゼ（HDAC）抑制活性の減弱によって媒介される。Glozak（グロザック）（2005）およびVinolo（ビノロ）（2011）。加えて、NaBはいくらかの免疫メディエーターに対して明確な選択的転写後抑制活性を示した。より一層具体的には、NaBはLPS誘導性IL-6およびIL-10分泌（免疫ホメオスタシスに関与する）を選択的に増加させ（図19）、その一方でそれはLPS誘導性TNF-α（炎症促進性サイトカイン）およびIL-8、CXCL10およびMCP-1（免疫細胞の動員において関与するケモカイン）を選択的に抑制した（図20）。
結論として、すべてのコントロールはこの実験において期待どおりに動作し、およびSHIMEサンプルについて得られた結果を以下に示す。この実験では、HCおよびNaBがLPS誘発性のIL-1β発現を意外にも減少させなかったことが注目される。
J．SHIMEサンプルの結果
1．経上皮電気抵抗（TEER）
コントロールおよびすべての結腸反応器からの処置の最後の週の間に収集したSHIMEサンプルは、ろ過（0.22μm）後にCaco-2完全培地において希釈し（1：5、v/v）、および24hの間共培養に対して頂端に与えた。
TEERが約40％減少した完全培地（CM）コントロール（図17）と比較して、SHIMEから収集したすべてのコントロールおよび処置サンプルはTEERをほぼ初期値に維持することができた（図21）。有意ではないが、TEERでの軽度の増加がコントロールと比較して三名のドナーすべての遠位結腸サンプルにおけるGellan Gum処置について観察された。この増加が三名のドナーすべてで一貫して観察されたという事実を考えると、Gellan Gumの発酵は使用されたインビトロモデルにおいて腸上皮バリア機能を改善する可能性があると結論付けることができる。
2．免疫マーカー
SHIMEサンプルによるCaco-2/THP-1-BlueTM共培養の頂端前処理の24時間後、基底外側上清を処分し、および細胞をLPSで刺激した。6時間の刺激後、培地に分泌されたサイトカインおよびケモカインを測定するためおよびNF-κB活性を定めるために基底外側上清を収集した。
LPS+コントロール（赤い点線）と比較したとき、すべてのSHIMEサンプルはLPS誘導NF-κB転写活性を増加させた（図22）。ただし、コントロールサンプルおよび処置サンプル間に統計的に有意な差はなかった。したがって、NF-κB活性での増加は細胞に対するSHIME懸濁物の影響をむしろ反映し、および試験化合物ではない。
NF-κB活性について取得した結果と同様に、すべてのSHIMEサンプルはLPS+コントロールと比較してLPS誘導IL-6およびIL-10レベルを増加させた（図23）。有意ではないが、コントロールと比較してIL-6およびIL-10レベルのわずかな増加が遠位結腸サンプルのすべてのドナーで一貫して観察された。これはドナーAでのIL-6レベルについてだけ統計的に有意に異なった。IL-6およびIL-10レベルのこの増加はまた三名のドナーの平均を分析したときにも見られた。興味深いことに、近位結腸および遠位結腸のすべてのサンプルにわたり対応のあるt検定を適用するとき、試験した三名のドナーにわたりIL-10レベルの有意な増加（p<0.05）が観察された。
IL-1βおよびTNF-αについて取得した結果を図24に示す。すべてのSHIMEサンプルはLPS+コントロールと比較してIL-1β分泌を明らかに増加させた（赤い点線）が、コントロールおよび処置間でIL-1βレベルに違いは、ドナーBを除いて観察されず、そこではIL-1βレベルの有意な増加が近位結腸反応器についての処置後に観察された。三名のドナーの平均を分析したとき、コントロールおよび処置間でIL-1β分泌における有意差は見られなかった。
それらのコントロールと比較して、LPS誘発TNF-αレベルはドナーAおよびドナーBについての近位および遠位結腸サンプルにおいて減少したが、ドナーCではそうしなかった。三名のドナーの平均を観察するとき、TNF-α分泌でのわずかな減少はコントロールと比較して近位結腸サンプルで見られたが、静的に有意な差は観察されなかった。
図25に見られるように、IL-8分泌は三名のドナーのうち二名についての遠位結腸サンプルについてコントロールと比較してゲGellan Gum添加時に減少する傾向があった。ただし、この違いは重要ではなかった。
LPS-誘発CXCL10レベルはGellan Gumによる処置後すべてのドナーについての遠位結腸サンプルについてわずかに増加する傾向があった。近位結腸サンプルでは、一名のドナーだけが処置時にCXCL10発現のわずかな減少を示した。MCP-1レベルは近位結腸のための処置後にわずかに減少する傾向があった。対照的に、すべてのドナーの遠位結腸反応器について明らかな増加が観察された。しかしながら、有意性は得られなかった。
結論として、Gellan Gumは腸上皮バリア機能にわずかな影響しか及ぼさなかったが、抗炎症性サイトカインIL-6およびIL-10の発現を増加させる傾向があった。いくらかの条件は炎症促進性サイトカインおよびケモカインの産生を減少させる傾向があった。ただし、処置およびコントロール間でいくらかの統計的に有意な差しか見られなかった。
コントロールと比較した処置サンプルによって誘発された変化の概要を把握するために、三名のドナーのSHIME処置サンプルの平均を近位および遠位結腸反応器についてSHIMEコントロールサンプルの平均に対して正規化し、および表16においてプロットした。
Figure 2022517237000022
概して、コントロールと比較した処置サンプルでの免疫マーカーにおける変化はかなり穏やかであることはここで言っておくべきであろう。表16に見られるように、Gellan Gumは両方の結腸反応器においてIL-10分泌を増強し、およびTNF-α分泌を減少させると考えられる。IL-8分泌はわずかに減少する一方、IL-6は遠位結腸サンプルについてだけ増加する。IL-1β分泌は近位結腸サンプルについて増加すると考えられるが、これらの結果は一名のドナーにおいてだけIL-1βの有意な増加によって影響を受ける。MCP-1分泌は近位結腸サンプルではGellan Gum処置によって減少するが、遠位結腸サンプルでは増加する。
K．例IVの結果の概要
研究のこの部分の目的はリーキーガット状態の調節の観点から消化管壁機能に対するGellan Gumおよびその代謝物の潜在的な正の効果を調査することであった。これは腸上皮の透過性および特定の免疫マーカーをインビトロで評価することによって行った。
結腸で発酵すると、Gellan GumはTEERの観点から腸バリアの完全性を改善する傾向があった。増加は有意ではなかったが、遠位結腸サンプルをインビトロモデルにさらすとき、三名のドナーすべてで一貫した増加が観察された。さらに、生産物は免疫抑制特性を有する傾向があり、好中球動員において役割を果たすことが知られる炎症促進性サイトカインTNF-αおよび走化性タンパク質IL-8を含め、いくつかの免疫メディエーターのレベルを低下させる傾向があった。好中球のクリアランスを促進するMCP-1は、Gellan Gum処置後に遠位結腸反応器について増加する傾向があった。他方で、真正な（bona fide）抗炎症性サイトカインであるIL-10は、創傷修復に関与するサイトカインであるIL-6と同様に増加する傾向があった。これらの報告したすべての変化は主に遠位結腸反応器において観察され、それゆえに結腸の遠位領域での宿主免疫細胞に対するGellan Gumの発酵産物のより顕著な効果が示唆される。
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本開示に依然として含まれるであろう代替の実施形態、例、および修飾は特に前述の教示に照らして、本技術における熟練した者によってなされ得る。さらに、本開示を説明するために使用する用語は制限ではなく説明の言葉の性質を意図していることを理解すべきである。
米国仮出願第62/794,452号および第62/869,248号の主題は参照によってその全体がここに組み込まれる。さらに、ここに記載の参考文献は必要な範囲でそれらの全体が参照によって組み込まれる。組み込まれた用語およびここに開示する用語間に意味の違いがある場合、ここに開示する用語の意味が支配する。
本技術における熟練した者はまた、本開示の範囲および精神から離れることなく、上記の好適なおよび代替の実施形態の様々な適応および修飾を構成することができることを認めるであろう。したがって、添付の請求の範囲内で、ここに具体的に記載されている以外で本開示を実践し得ることが理解される。
ここでより一層詳細に説明するように、HA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類は自然なHA/IA/LAスフィンガンまたはHA/IA/LAスフィンガン多糖類、例えば、自然なHA/IA/LAスフィンガンまたはHA/IA/LAスフィンガン多糖類のグリコシド結合を加水分解すること、および加水分解された組成物を限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、沈殿、遠心分離、またはそれらの組合せに、例えば、第十の実施形態に記載されるようにさらすことを含むプロセスから得てもよい。模範的なHA/IA/LAスフィンガンオリゴ糖類には、制限されないが、以下が含まれる：
（i）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（ii）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、アセタートおよび/またはグリセラートを有する四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、アセタートおよび/またはグリセラートを有する八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc,GlcA、Glc,Rha、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（iii）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、五量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc)、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Glc,GlcA、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（iv）Glc(Glc-Glc),GlcA、Glc(Glc-Glc)、GlcA,Glc、Glc,Glc、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（v）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、GlcA,Glc,(Rha-Rha)、Glc,(Rha-Rha),Rha、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc、GlcA,Glcを含む（またはからなる）組成物；
（vi）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（vii）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Rha、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（viii）Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,Rha、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（ix）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む（またはからなる）組成物；
（x）サンプル番号1-18のいずれか一を含む（またはからなる）組成物；または
（xi）サンプル番号9、10、17、および18のいずれか一を含む（またはからなる）組成物である。

Claims (24)

  1. プレバイオティックな有効量のスフィンガンを含む取込み可能な組成物。
  2. スフィンガンの量は約1gないし約10g、約1gないし約9g、約1gないし約8g、約1gないし約7g、約1gないし約6g、約1gないし約5g、約1gないし約4g、約1gないし約3g、または約2gから選ばれる、請求項1の取込み可能な組成物。
  3. スフィンガンは高アシルゲラン、中間アシルゲラン、低アシルゲラン、高アシルウェラン、中間アシルウェラン、低アシルウェラン、高アシルラムサン、中間アシルラムサン、低アシルラムサン、高アシルジウタン、中間アシルジウタン、低アシルジウタン、S-88、S-198、S-7、またはそれらの組合せから選ばれる高、中間、または低アシルスフィンガンを含む、請求項1-2のいずれか一項の取込み可能な組成物。
  4. スフィンガンは高アシルスフィンガン多糖類、中間アシルスフィンガン多糖類、低アシルスフィンガン多糖類、またはそれらの組合せを含む、請求項1-2のいずれか一項の取込み可能な組成物。
  5. スフィンガンは高アシルスフィンガンオリゴ糖類、中間アシルスフィンガンオリゴ糖類、低アシルスフィンガンオリゴ糖類、またはそれらの組合せを含む、請求項1-2のいずれか一項の取込み可能な組成物。
  6. スフィンガンは以下の：
    高/中間/低アシルスフィンガンまたは高/中間/低アシルスフィンガン多糖類および液状媒体を含む第一の組成物を用意すること；
    第二の組成物を得るために高/中間/低アシルスフィンガンまたは高/中間/低アシルスフィンガン多糖類のグリコシド結合を加水分解すること；
    高/中間/低アシルスフィンガンオリゴ糖類（SOS）を含む第三の組成物を得るために第二の組成物を限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、沈殿、遠心分離、またはそれらの組合せにさらすこと；および
    随意に第三の組成物を分離することまたは回収すること
    を含むプロセスによって得られる高、中間、または低アシルSOSを含む、請求項1-2のいずれか一項の取込み可能な組成物。
  7. スフィンガンは以下の：
    （i）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む組成物；
    （ii）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、アセタートおよび/またはグリセラートを有する四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、アセタートおよび/またはグリセラートを有する八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc,GlcA、Glc,Rhaを含む組成物；
    （iii）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、五量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc)、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Glc,GlcAを含む組成物；
    （iv）Glc(Glc-Glc),GlcA、Glc(Glc-Glc)、GlcA,Glc、Glc,Glcを含む組成物；
    （v）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、GlcA,Glc,(Rha-Rha)、Glc,(Rha-Rha),Rha、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc、GlcA,Glcを含む組成物；
    （vi）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む組成物；
    （vii）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Rha、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む組成物；
    （viii）Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,Rhaを含む組成物；
    （ix）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rhaa、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む組成物；
    またはそれらの組合せ
    から選ばれる高/中間/低スフィンガンオリゴ糖類を含む、請求項1-2および5-6のいずれか一項の取込み可能な組成物。
  8. 以下のための方法であって
    （A）哺乳動物の結腸における有益な細菌増殖を促進することであり、前記方法は有益な細菌増殖有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体を有効なスケジュールで取り込むことを含み；
    （B）哺乳動物の結腸におけるプロピオナートを減少させることおよび/またはブチラートレベルを増加させることであり、前記方法は以下の：有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体が含まれる組成物を有効なスケジュールで取り込むことを含み；
    （C）哺乳動物の結腸における腸バリアの完全性を改善することであり、前記方法は以下の：腸バリアの完全性有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体が含まれる組成物を有効なスケジュールで取り込むことを含み；または
    （D）哺乳動物の結腸におけるTNF-αおよび/またはIL-8のレベルを低下させることであり、前記方法はTNF-αおよび/またはIL-8を低下させる有効量のスフィンガンおよび取込み可能な媒体が含まれる組成物を有効なスケジュールで取り込むことを含む。
  9. 哺乳動物はヒトであり、およびスフィンガンの量は組成物を取り込むヒトの約10mg/kgないし約150mg/kg、約10mg/kgないし約140mg/kg、約10mg/kgないし約130mg/kg、約10mg/kgないし約120mg/kg、約10mg/kgないし約110mg/kg、約10mg/kgないし約100mg/kg、約10mg/kgないし約90mg/kg、約10mg/kgないし約80mg/kg、約10mg/kgないし約70mg/kg、約10mg/kgないし約60mg/kg、10mg/kgないし約50mg/kg、約10mg/kgないし約40mg/kg、または約20mg/kgないし約30mg/kgから選ばれる、請求項8の方法。
  10. スフィンガンは高アシルゲラン、中間アシルゲラン、低アシルゲラン、高アシルウェラン、中間アシルウェラン、低アシルウェラン、高アシルラムサン、中間アシルラムサン、低アシルラムサン、高アシルジウタン、中間アシルジウタン、低アシルジウタン、S-88、S-198、S-7、またはそれらの組合せから選ばれる高、中間、または低アシルスフィンガンを含む、請求項8-9のいずれか一項の取込み可能な組成物。
  11. スフィンガンは高アシルスフィンガン多糖類、中間アシルスフィンガン多糖類、低アシルスフィンガン多糖類、またはそれらの組合せを含む、請求項8-9のいずれか一項の方法。
  12. スフィンガンは高アシルスフィンガンオリゴ糖類、中間アシルオリゴ糖類、低アシルスフィンガンオリゴ糖類、またはそれらの組合せを含む、請求項8-9のいずれか一項の方法。
  13. スフィンガンは以下の：
    高/中間/低アシルスフィンガンまたは高/中間/低アシルスフィンガン多糖類および液状媒体を含む第一の組成物を用意すること；
    第二の組成物を得るために高/中間/低アシルスフィンガンまたは高/中間/低アシルスフィンガン多糖類のグリコシド結合を加水分解すること；
    高/中間/低アシルスフィンガンオリゴ糖類（SOS）を含む第三の組成物を得るために第二の組成物を限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、沈殿、遠心分離、またはそれらの組合せにさらすこと；および
    随意に第三の組成物を分離することまたは回収すること
    を含むプロセスによって得られる高、中間、または低アシルSOSを含む、請求項8-9のいずれか一項の方法。
  14. スフィンガンは以下の：
    （i）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む組成物；
    （ii）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、アセタートおよび/またはグリセラートを有する四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、アセタートおよび/またはグリセラートを有する八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc,GlcA、Glc,Rhaを含む組成物；
    （iii）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、八量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha)、五量体(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc)、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Glc,GlcAを含む組成物；
    （iv）Glc(Glc-Glc),GlcA、Glc(Glc-Glc)、GlcA,Glc、Glc,Glcを含む組成物；
    （v）四量体(Glc,GlcA,Glc,Rha)、GlcA,Glc,(Rha-Rha)、Glc,(Rha-Rha),Rha、GlcA,Glc,Rha、Glc,GlcA,Glc、Rha,Glc、GlcA,Glcを含む組成物；
    （vi）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rha、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む組成物；
    （vii）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Rha、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA2,Rha、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA2,Rha、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA4,Rha2、Glc6,GlcA3,Rha3、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む組成物；
    （viii）Glc,GlcA,Rha,-H2O、Glc,Rha、Glc2,GlcA,Rha,-H2O、Glc2,Rhaを含む組成物；
    （ix）Glc,GlcA、Glc,GlcA,Glyc、Glc,GlcA,Rhaa、Glc,GlcA,Rha,Glyc、Glc,Rha、Glc,Rha+28、Glc2,GlcA、Glc2,GlcA,Rha、Glc2,GlcA,Rha,+28、Glc2,GlcA,Rha,Ac、Glc2,GlcA,Rha,Glyc、Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28、Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O、Glc2,GlcA,Rha2,Glyc、Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O、Glc3,GlcA,Rha、Glc3,GlcA,Rha2、Glc3,GlcA,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha,Glyc、Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc3,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA,Rha2,+43、Glc4,GlcA,Rha2,Ac、Glyc、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O、Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2、Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc、Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc、Glc4,GlcA3,Rha2、Glc4,GlcA2,Rha3,Ac、Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2、Glc5,GlcA2,Rha2、Glc5,GlcA2,Rha2,Ac、Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax（式中xは4ないし約25であり）、またはそれらの組合せを含む組成物；
    またはそれらの組合せ
    から選ばれる高/中間/低アシルスフィンガンオリゴ糖類を含む、請求項8-9および12-13のいずれか一項の方法。
  15. スフィンガンは自然なスフィンガンを含み、および細菌はビフィドバクテリウム科（Bifidobacteriaceae）である、請求項8の方法。
  16. スフィンガンはゲランガムを含む、請求項15の方法。
  17. 哺乳動物はヒトであり、およびビフィドバクテリウム科のレベルは近位結腸の内腔において（a）コントロールと比較して処置の間に約20％ないし約180％からまたは（b）未処置のコントロールと比較して処置の間に約330％から約590％までの範囲で増加する、請求項8の方法。
  18. 哺乳動物はヒトであり、およびスフィンガンは高/中間/低アシルスフィンガンオリゴ糖類を含み、および細菌はブラウティア属（Blautia）、パラバクテリオイデス属（Parabacteroides）、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）XVIII、またはそれらの組合せである、請求項8の方法。
  19. 以下の：
    （a）ブラウティア属レベルは未処置のコントロールと比較して少なくとも約5倍まで増加し、
    （b）パラバクテリオイデス属レベルは未処置のコントロールと比較して約2倍から約40倍まで増加し、
    （c）フィーカリバクテリウム属レベルは未処置のコントロールと比較して処置の間に約10倍から約190倍まで増加し、および
    （d）クロストリジウム属XVIIIレベルは未処置のコントロールと比較して約12倍から約60倍まで増加する
    の一以上が生じる、請求項18の方法。
  20. 先行する請求項のいずれか一項におけるように高/中間/低アシルスフィンガンオリゴ糖類（“SOS”）を用意するにあたり、以下の：
    高/中間/低アシルスフィンガンまたは高/中間/低アシルスフィンガン多糖類および液状媒体を含む第一の組成物を用意すること；
    第二の組成物を得るために高/中間/低アシルスフィンガンまたは高/中間/低アシルスフィンガン多糖類のグリコシド結合を加水分解すること；
    高/中間/低アシルSOSを含む第三の組成物を得るために第二の組成物に限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、沈殿、遠心分離、またはそれらの組合せにさらすこと；および
    随意に第三の組成物を分離することまたは回収すること
    を含む、プロセス。
  21. 前記加水分解することは酸、酵素、超音波処理、高圧均質化、放射線、またはそれらの組合せによって媒介される、請求項20のプロセス。
  22. 酵素はゲラナーゼ、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ（EC 4.2.2.23）、ラムノガラクツロナンエキソリアーゼ（EC 4.2.2.24）、ゲランリアーゼ（EC 4.2.2.25）、またはそれらの組合せである、請求項21のプロセス。
  23. 前記さらすことは第三の組成物を含むろ過物を得るために第二の組成物を約5kDaまたは約10kDaのいずれかの分子量カットオフを有する膜を通してろ過することを含む、請求項21のプロセス。
  24. 請求項20-23のいずれか一項によって用意されるSOSを含む組成物。
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