WO2022240224A1 - 젤란검을 유효성분으로 하는 장내 균총 개선용 조성물 및 이를 포함하는 대사성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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gellan gum
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prebiotic
food
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박호영
이은정
전현정
오미진
이혜빈
도문호
김윤숙
하상근
최인욱
김슬기
강선희
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한국식품연구원
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    • A61P3/06—Antihyperlipidemics

Definitions

  • the present invention relates to a composition containing gellan gum as an active ingredient, and relates to a prebiotic composition for improving intestinal flora and a composition for improving, preventing or treating metabolic diseases by containing gellan gum as an active ingredient.
  • the occurrence of metabolic diseases such as obesity, diabetes, hyperlipidemia, non-alcoholic fatty liver, and dyslipidemia caused by abnormal lipid and carbohydrate metabolism has rapidly increased due to the westernized diet.
  • the incidence of diseases related to intestinal function is gradually increasing.
  • the intestinal mucosa of the human body is an important organ that performs an immunological function as a barrier to block the inflow of microorganisms or their by-products, antigens, and toxins into the bloodstream.
  • intestinal flora In intestinal health, the intestinal flora environment present in the intestinal tract is very important. More than 400 species of bacteria inhabit the intestines in numbers of about 100 trillion per gram of colon contents. Intestinal flora is divided into beneficial bacteria and harmful bacteria. When the balance of these intestinal flora is disturbed, intestinal infection by pathogenic bacteria occurs, inflammation of the intestine occurs, and intestinal permeability increases, resulting in leaky gut syndrome. When foreign substances such as bacterial antigens, bacterial by-products, and endotoxin enter the body through mucosal cells in a leaky gut, they cause an inflammatory response, resulting in increased insulin resistance and reduced liver function, resulting in fat accumulation even without excessive intake of carbohydrates. This leads to inflammatory obesity.
  • the obesity refers to a state in which excessive body fat is accumulated.
  • the pharmacological mechanisms of currently used obesity drugs are largely 1) inhibition of fat absorption, 2) promotion of fat decomposition and heat generation, 3) regulation of appetite and satiety, 4) inhibition of protein metabolism, and 5) regulation of emotions related to food intake.
  • Representative anti-obesity drugs include XenicalTM, which suppresses fat absorption, and ReductilTM, which suppresses appetite by stimulating the sympathetic nervous system.
  • the obesity treatment has been reported to cause temporary weight loss, rapid weight loss, and drug-induced side effects on the heart, blood pressure, and nervous system.
  • Diabetes is a disease caused by an insufficient secretion of insulin or a failure to function normally, and is characterized by hyperglycemia in which the concentration of glucose in the blood increases and glucose is excreted in the urine.
  • PPAR- ⁇ activators, GLP-1 derivatives, DPP-IV inhibitors, etc. are currently used for diabetes treatment, but these conventional drugs are reported to have side effects of weight gain and toxicity to the liver, kidneys, muscles, heart, etc. have.
  • the hyperlipidemia is known as a disease that causes an excessive amount of fat components present in the blood and accumulated on the walls of blood vessels to cause inflammation, resulting in cardiovascular diseases such as myocardial infarction, stroke or cerebral infarction.
  • Currently used drugs for hyperlipidemia include 'statin' drugs that have HMG-CoA reductase inhibitory activity, but it has been reported that they have side effects that are toxic to the liver or muscles when used for a long period of time.
  • the dyslipidemia refers to a state in which total cholesterol, LDL cholesterol or triglyceride in the blood is increased, or HDL cholesterol is decreased, and is known to increase the risk of cardiovascular diseases such as heart attack and stroke.
  • drugs that can be used as a treatment for dyslipidemia include Bayer's BAY13-9952 (implitapide), which inhibits the activity of MTP (microsomal triglyceride transfer protein), but these drugs have specific mechanisms of action in cells. There is a problem that there is a possibility of causing side effects because it has not been identified.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2020-0109175
  • Patent Document 2 Republic of Korea Patent Registration No. 10-0673068
  • An object of the present invention is to provide a prebiotic or food composition for improving intestinal health using gellan gum as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases containing gellan gum as an active ingredient.
  • the present invention provides a therapeutic use (for use in therapy) of a composition containing gellan gum as an active ingredient for manufacturing a medicine for improving intestinal flora, preventing or treating metabolic diseases.
  • the present invention provides a method for treating metabolic diseases, which includes administering a pharmaceutical composition containing gellan gum as an active ingredient to patients with weakened intestinal health or metabolic diseases.
  • the present invention provides a prebiotic or intestinal health improving food composition containing gellan gum as an active ingredient.
  • the prebiotic composition has a prebiotic activity that relatively proliferates beneficial bacteria in the intestine compared to harmful bacteria in the intestine, and the beneficial bacteria in the intestine include Lactobacillus plantarum , Lactococcus lactis , and Bifidobacter Composed of Bifidobacterium breve , Bifidobacterium bifidum , Bacteroides uniformis , Bacteroides vulgatus and Bacteroides ovatus At least one selected from the group, and the intestinal harmful bacteria may be Escherichia coli.
  • the gellan gum may be low acyl gellan gum.
  • the composition may include gellan gum at a concentration of 5 mg/ml to 100 mg/ml.
  • the composition may be used to improve or prevent metabolic diseases.
  • the composition can suppress the increase in body weight and body fat, lower the increase in blood cholesterol and LDL cholesterol, and reduce the concentration of endotoxin in the blood.
  • composition reduces the enzyme activity of tall-like receptor 4 (TLR4), alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), which are indicators of liver damage, in liver tissue, ACC (acetyl CoA carboxylase), FAS (fatty acid synthase),
  • TLR4 tall-like receptor 4
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • SREBP1-C Sterol response element binding protein
  • CD36 Cluster of differentiation-36
  • ChREBP Carbohydrate response element binding protein
  • the composition suppresses the expression of IL6 (interleukin-6) and TNF- ⁇ (tumor necrosis factor ⁇ ), which are cytokines involved in inflammation, in liver tissue, and inhibits the expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP1), a macrophage-attracting protein. expression may be reduced.
  • IL6 interleukin-6
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • MCP1 monocyte chemoattractant protein-1
  • the metabolic disease may be any one or more selected from the group consisting of dyslipidemia, non-alcoholic fatty liver, insulin resistance syndrome, diabetes and obesity.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases comprising gellan gum as an active ingredient.
  • the gellan gum may be low acyl gellan gum.
  • the metabolic disease may be any one or more selected from the group consisting of dyslipidemia, non-alcoholic fatty liver, insulin resistance syndrome, diabetes and obesity.
  • One aspect of the present invention relates to a prebiotic containing gellan gum as an active ingredient or a food composition for improving intestinal health.
  • the present invention relates to a prebiotic containing gellan gum as an active ingredient.
  • tick composition It may be a composition for improving intestinal flora and a composition for improving intestinal health.
  • the present invention provides a novel use of gellan gum for preparing a prebiotic or food composition for improving intestinal health through improvement of intestinal flora.
  • composition of the present invention by containing the gellan gum as an active ingredient, has a prebiotic activity that promotes the promotion of beneficial bacteria in the intestine compared to harmful bacteria in the intestine, has an effect of improving intestinal flora, and improves intestinal health and intestinal function. have an effect
  • the gellan gum is a polysaccharide in the form of a straight chain in which glucose, gluconic acid, and rhamnose are regularly repeated, and is being marketed as a product, and its manufacturing method is well known.
  • gellan gum may be obtained by purifying, drying, and pulverizing a high-molecular polysaccharide gum material obtained by pure culture fermentation of carbohydrates using Pseudomonas elodea isolated from aquatic plants of the genus Elodea.
  • the gellan gum may be a type in which an acyl group is removed or a type in which an acyl group is combined, but the type may be used without limitation.
  • the gel properties of gellan gum vary depending on the degree of acetylation of gellan gum.
  • low acyl gellan gum represented by Chemical Formula 1 is used, and the molecular weight is 2 ⁇ 10 5 to 3 ⁇ 10 5 was used.
  • Low acyl gellan gum is a polysaccharide in which 2 glucose, 1 glucuronic acid, and 1 rhamnose tetrasaccharide are linked in the main chain.
  • R 1 and R 2 are different from or identical to each other, each independently may be any one selected from a hydrogen atom, a glyceryl group, and an acetyl group, and n is an integer of 2 or more.
  • R 1 when the R 1 is a glyceryl group, R 2 may be an acetyl group, and the total content of the acetyl group and the glyceryl group may be 50% or less, preferably 7.5% or less.
  • 'Prebiotic' or 'prebiotic' is a food component that is not digested well in the body, and does not undergo hydrolysis or absorption in the upper part of the gastrointestinal tract, and stimulates the growth or activity of certain limited symbiotic bacteria.
  • a substance that directs the intestinal microflora in a direction beneficial to the health of the host refers to a substance that promotes the growth of beneficial bacteria in the intestine compared to harmful bacteria in the intestine.
  • the prebiotics composition may also be referred to as a composition for improving intestinal microorganisms or flora. This has the effect of increasing and decreasing the efficacy of probiotics and improving intestinal health or improving intestinal function.
  • 'improvement of intestinal microflora' or 'improvement of intestinal flora' means promoting the growth of beneficial bacteria in the intestine and inhibiting the growth of harmful bacteria in the intestine, while maintaining the balance between beneficial bacteria and harmful bacteria in the intestine.
  • the improvement of 'intestinal health' or 'intestinal function' means an action that can maintain a normal intestinal environment by regulating the flora of beneficial and harmful bacteria in the intestine, which can promote the flora of beneficial bacteria in the intestine and suppress the flora of harmful bacteria.
  • the overall function of the intestine can be improved and activated by strengthening the close junction barrier function of the intestine.
  • 'intestinal beneficial bacteria' refers to beneficial bacteria present in the intestine of the host and strains that act beneficially to the intestinal environment when ingested and reach the intestine. These means bacteria that survive gastric acid and bile acid, reach the small intestine, proliferate and settle in the intestine, show useful effects in the intestinal tract, and satisfy the conditions of being non-toxic and non-pathogenic. That is, it can be understood as probiotics.
  • the intestinal beneficial bacteria may be any one or more selected from the group consisting of strains of the genus Lactobacillus, genus Lactococcus, genus Bifidobacterium and genus Bacteroides, and are not particularly limited thereto, but are preferably Lactobacillus rhamnosus ( Lactobalcillus rhamnosus ), Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Lactococcus lactis ( Lactococcus lactis ), Bifidobacterium longum ( Bifidobacterium longum ), Bifidobacterium brave ( Bifidobacterium breve ), Bifidobacterium bifi It may be any one or more selected from the group consisting of Bifidobacterium bifidum , Bacteroides uniformis , Bacteroides vulgatus and Bacteroides ovatus , preferably is Lactobacillus plantarum MG
  • Gellan gum an active ingredient of the present invention, has a prebiotic activity that relatively proliferates beneficial bacteria in the intestine compared to harmful bacteria in the intestine, wherein the beneficial bacteria in the intestine are Lactobalcillus rhamnosus , Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Lactococcus lactis ( Lactococcus lactis ), Bifidobacterium longum ( Bifidobacterium longum ), Bifidobacterium breve ( Bifidobacterium breve ), Bifidobacterium bifidum ( Bifidobacterium bifidum ), Bacteroides uniform Miss ( Bacteroides uniformis ), Bacteroides vulgatus ( Bacteroides vulgatus ) and Bacteroides ovatus ( Bacteroides ovatus ) At least one selected from the group consisting of, the intestinal harmful bacteria may be Escherichia coli
  • the active ingredient of the present invention is Lactobacillus plantarum MG989, Lactococcus lactis LL-KF14, BP than conventional fructo-oligosaccharide (FOS).
  • gellan gum an active ingredient of the present invention, is effective in the growth of probiotic strains such as Lactiplantibacillus plantarum and Bifidobacterium bifidum even in vivo. can be confirmed to increase.
  • gellan gum the active ingredient of the present invention, significantly promotes the growth of various intestinal beneficial bacteria known to have an effect of improving intestinal health or improving intestinal function, compared to harmful intestinal bacteria. It can be said that, along with prebiotic activity, intestinal health or intestinal function improvement, suppression or prevention, and intestinal microflora improvement effect are achieved.
  • the gellan gum of the present invention promotes the growth of beneficial bacteria, and is consumed by beneficial bacteria to produce short-chain fatty acids (SCFA) as metabolites, thereby inhibiting the growth of harmful bacteria and significantly improving intestinal health.
  • SCFA short-chain fatty acids
  • gellan gum promotes selective growth of beneficial bacteria. It can be seen that it has an effect, and in addition to showing a slight degree of prebiotic properties for non-probiotic bacteria, it affects only the growth of desired beneficial bacteria, so it is not only suitable for regulating the intestinal flora, but also prevents unwanted secondary effects. It has an advantageous effect in that it can be prevented.
  • gellan gum an active ingredient of the present invention, is degraded by beneficial bacteria and has an effect on inhibiting the growth of harmful bacteria by slightly acidifying the pH of the culture environment.
  • Gellan gum the active ingredient of the present invention, exhibits growth characteristics of strains of the genus prebiotic and species strains that are completely different from those of other modified starches, and gellan gum is significantly superior to other modified starches. It can be seen that the tick effect can be obtained.
  • the composition of the present invention contains gellan gum in an amount of 1 mg/ml or more, preferably 5 mg/ml or more, more preferably 5 mg/ml to 100 mg/ml, and even more preferably 40 mg/ml or more. mg/ml to 100 mg/ml. Since gellan gum is a natural product and does not have side effects on the human body even when administered in excess, the upper and lower limits of the amount of gellan gum included in the composition of the present invention can be selected and implemented by those skilled in the art within appropriate ranges.
  • the food composition of the present invention includes all forms such as functional food, nutritional supplement, health function food, food additives, and feed, including humans or livestock. animals as food objects.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the type of food is not particularly limited.
  • foods to which the gellan gum can be added include drinks, meat, sausages, bread, biscuits, rice cakes, chocolates, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, chewing gum, and dairy including ice cream.
  • products, various soups, beverages, alcoholic beverages and vitamin complexes, dairy products and milk-processed products, etc. and includes all health functional foods or health supplement foods in the usual sense.
  • the gellan gum may be added to food as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the amount of gellan gum added to the food composition of the present invention may be suitably determined depending on its purpose of use (for prevention or improvement). Based on the total weight of the food composition of the present invention, it is more preferable to include the gellan gum in an amount of 0.1 to 50% by weight, preferably 0.5 to 20% by weight, more preferably 0.5 to 5% by weight, but limited thereto. It doesn't work. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the food composition of the present invention may include not only gellan gum as an active ingredient, but also ingredients commonly added during food preparation, such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavors.
  • ingredients commonly added during food preparation such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavors.
  • the aforementioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrins and cyclodextrins and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • flavoring agents natural flavoring agents [thaumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.]) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • thaumatin, stevia extract eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • citric acid, high fructose corn syrup, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, and various plant extracts are further included. can make it
  • the present invention provides a health functional food comprising a prebiotic composition containing gellan gum as an active ingredient, a composition for improving intestinal flora, and a composition for improving, suppressing or preventing intestinal health or intestinal function.
  • Health functional food is a food made by adding gellan gum to food materials such as drinks, teas, spices, chewing gum, confectionery, etc., or made into capsules, powders, suspensions, etc. It means to bring, but unlike general drugs, it has the advantage of not having side effects that may occur when taking drugs for a long time using food as a raw material.
  • the health functional food of the present invention obtained in this way is very useful because it can be consumed on a daily basis.
  • the amount of gellan gum added to such health functional foods cannot be uniformly determined depending on the type of target health functional food, but it can be added within a range that does not impair the original taste of the food, and the target food It is usually in the range of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight, and most preferably 0.5 to 5% by weight.
  • the health functional food of the present invention may be in the form of pills, tablets, capsules or beverages.
  • the food composition containing gellan gum as an active ingredient can be used alone as "health functional food that helps prebiotic activity” or "health functional food that helps improve intestinal flora", or as “improving intestinal health” It can be used as a health functional food that helps.
  • the 'health functional food' refers to food manufactured (including processing) according to legal standards using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body (Article 3, Subparagraph 1 of the Health Functional Food Act).
  • the term 'health functional food' may differ in terminology or scope from country to country, but 'Dietary Supplement' in the US, 'Food Supplement' in Europe, 'Health Functional Food' or 'Health Functional Food' in Japan. It may correspond to 'Food for Special Health Use (FoSHU)' or 'Health Food' in China.
  • the food composition or health functional food may additionally contain food additives, and the suitability as a food additive is determined according to the standards and standards for the item in accordance with the general rules and general test methods of the 'Food Additive Code' unless otherwise specified. follow
  • the health functional food can be used together with the gellan gum as "health functional food that helps prebiotic activity” or "health functional food that helps improve intestinal flora", or “helps improve intestinal health”
  • Raw materials notified as 'functional raw materials' or individually recognized raw materials used in "health functional foods that give health functional foods” guar gum, guar gum hydrolysate, soybean dietary fiber, wheat dietary fiber, gum arabic, inulin, fructooligosaccharide, glucomannan , raffinose, aloe gel, powdered agar, whole aloe leaf, etc.
  • prebiotic activity, intestinal flora improvement, or health functional food materials related to intestinal health improvement can be used in combination.
  • the food composition may be used to improve or prevent metabolic diseases.
  • the food composition may be a food composition for improving, preventing or treating metabolic diseases containing gellan gum as an active ingredient.
  • 'metabolic disease' is a disease caused by a metabolic disorder in vivo, and is a disease in which various diseases such as obesity, diabetes, hypertension, hyperlipidemia, arteriosclerosis, coronary artery disease, non-alcoholic fatty liver, etc.
  • vascular diseases include diabetic complications such as diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, diabetic foot disease, diabetic neuropathy, cardiovascular diseases such as hyperlipidemia, stroke, angina pectoris, myocardial infarction, peripheral
  • vascular diseases but it is not particularly limited as long as it is any disease caused by metabolic diseases, but preferably, the metabolic diseases are at least one selected from the group consisting of dyslipidemia, non-alcoholic fatty liver, insulin resistance syndrome, diabetes and obesity.
  • 'dyslipidemia' may be any one or more selected from the group consisting of hyperlipidemia, hypercholesterolemia, and hypertriglyceridemia.
  • 'fatty liver' refers to a condition or disease in which fat is accumulated in hepatocytes in an excessive amount due to liver fat metabolism disorders, and may specifically be non-alcoholic fatty liver.
  • 'hyperlipidemia' refers to a condition or disease in which the concentration of fat components, particularly cholesterol or triglyceride, in the blood is higher than normal levels, and any condition in which lowering the blood lipid concentration is required It is used in a broad sense that includes.
  • 'hypercholesterolemia' refers to a condition or disease in which cholesterol in the blood is excessively high
  • hypertriglyceridemia refers to a condition or disease in which the concentration of triglyceride in the blood is excessively high
  • 'insulin resistance syndrome' is a concept that collectively refers to diseases caused by cells not effectively burning glucose due to a decrease in the function of insulin to lower blood sugar. If insulin resistance is high, it can mean a state in which the human body produces too much insulin and various diseases can occur as a cause. It refers to a disease characterized by an increase in (very low density lipoprotein, VLDL) and neutral fat, a decrease in high density lipoprotein (HDL), and hypertension, and is recognized as a risk factor for cardiovascular disease and type 2 diabetes. It is a concept that exists (Diabetes, 37:1595-607 (1988)).
  • the aforementioned treatment for insulin resistance syndrome refers to making insulin function properly in the body in a state of insulin resistance.
  • the treatment of insulin resistance syndrome can be used to improve insulin resistance, control insulin resistance, enhance insulin sensitivity, control insulin sensitivity, etc., and any meaning corresponding to an action that can get out of the insulin resistant state is within the scope of the present invention. can be included
  • 'diabetes' refers to a chronic disease characterized by a relative or absolute deficiency of insulin that causes glucose intolerance.
  • 'Diabetes' may include all types of diabetes, and includes, for example, type 1 diabetes, type 2 diabetes and hereditary diabetes.
  • Type 1 diabetes is insulin-dependent diabetes, which is mainly caused by the destruction of ⁇ -cells.
  • Type 2 diabetes is non-insulin dependent diabetes, caused either by insufficient secretion of insulin after a meal or by insulin resistance.
  • 'obesity' refers to a state in which body fat is excessively accumulated, rather than simply being overweight.
  • it may be inflammatory obesity caused by leaky gut syndrome. That is, even if carbohydrates are not excessively consumed, it may be that the body weight or body fat ratio increases due to the decrease in liver function due to leaky gut syndrome and the continuous inflammatory response.
  • Obesity is usually determined using the body mass index (BMI). 23 to 24.9 is considered overweight, 25 to 29.9 is considered mildly obese, 30 to 34.9 is moderately obese, and 35 or more is considered severely obese. are doing Obesity is caused by a combination of multiple causes rather than a single cause. Wrong eating habits, including westernized eating habits, reduced activity, emotional factors, and genetic factors, etc. increases the risk of disease.
  • the composition for improving, preventing or treating metabolic diseases may also be referred to as a composition for improving, preventing, alleviating, suppressing, or treating an increase in body weight or body fat due to the various causes. More preferably, it has the effect of improving, preventing, or treating metabolic diseases caused by a high-fat diet, and even more preferably, improving, preventing, or treating inflammatory obesity or metabolic diseases caused by leaky gut syndrome caused by a high-fat diet It can also be said to have the effect of
  • body weight and body fat increased significantly. It increases body weight, body fat and white epididymal fat weight over time, increases blood cholesterol and LDL cholesterol as well as endotoxin concentrations, and increases markers of liver damage (triglycerides, TLR4, ALT, AST, ACC, FAS, SREBP1). , ChREBP) and liver inflammatory markers (IL6, TNF- ⁇ , CD36 and MCP1) to increase insulin resistance, impair blood glucose tolerance, and induce glucose and insulin homeostasis disorders due to ectotoxin-induced, etc. and lead to obesity or metabolic diseases.
  • liver damage triglycerides, TLR4, ALT, AST, ACC, FAS, SREBP1
  • ChREBP liver inflammatory markers
  • IL6, TNF- ⁇ , CD36 and MCP1 to increase insulin resistance, impair blood glucose tolerance, and induce glucose and insulin homeostasis disorders due to ectotoxin-induced, etc. and lead to obesity or metabolic diseases.
  • the administration of gellan gum reduces the increase in body weight, body fat and white epididymal fat weight, decreases the increase in blood cholesterol and LDL cholesterol concentration, and suppresses the increase in endotoxin concentration in serum to lower it to a normal level.
  • it restores leptin and insulin resistance, reduces the level of endotoxin in the blood, restores the barrier function and inhibits liver fat accumulation at the same time.
  • liver damage indicators ALT, AST, ACC, FAS, SREBP1, ChREBP
  • liver inflammation indicators IL6, TNF- ⁇ and MCP1
  • 'contained as an active ingredient' or 'contained as an active ingredient' means containing gellan gum in an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the present invention, and specifically to improve, prevent or treat metabolic diseases.
  • the composition of the present invention may contain gellan gum in an amount of 1 mg/ml or more, preferably 5 mg/ml or more, and more preferably 5 mg/ml to 100 mg/ml. Since gellan gum is a natural product and does not have side effects on the human body even when administered in excess, the upper and lower limits of the amount of gellan gum included in the composition of the present invention can be selected and implemented by those skilled in the art within appropriate ranges.
  • the food composition of the present invention includes all forms such as functional food, nutritional supplement, health function food, food additives, and feed, including humans or livestock. animals as food objects.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the type of food is not particularly limited.
  • foods to which the gellan gum can be added include drinks, meat, sausages, bread, biscuits, rice cakes, chocolates, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, chewing gum, and dairy including ice cream.
  • products, various soups, beverages, alcoholic beverages and vitamin complexes, dairy products and milk-processed products, etc. and includes all health functional foods or health supplement foods in the usual sense.
  • the gellan gum may be added to food as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the amount of gellan gum added to the food composition of the present invention may be suitably determined depending on its purpose of use (for prevention or improvement). Based on the total weight of the food composition of the present invention, it is more preferable to include the gellan gum in an amount of 0.1 to 50% by weight, preferably 0.5 to 20% by weight, more preferably 0.5 to 5% by weight, but limited thereto. It doesn't work. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the food composition of the present invention may include not only gellan gum as an active ingredient, but also ingredients commonly added during food preparation, such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavors.
  • examples of the aforementioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrins and cyclodextrins and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • flavoring agents natural flavoring agents [thaumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.]) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • thaumatin, stevia extract eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the food composition of the present invention is prepared as a drink or beverage
  • citric acid, high fructose corn syrup, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, and various plant extracts may be further included in addition to the radish extract of the present invention.
  • the present invention provides a health functional food comprising a food composition for improving, suppressing or preventing metabolic diseases containing the gellan gum as an active ingredient.
  • Health functional food means that gellan gum is added to food materials such as beverages, teas, spices, chewing gum, confectionery, etc., or produced as capsules, powders, suspensions, etc., and when ingested, it brings specific health effects.
  • unlike general drugs it has the advantage of not having side effects that may occur when taking drugs for a long time by using food as a raw material.
  • the health functional food of the present invention obtained in this way is very useful because it can be consumed on a daily basis.
  • the amount of gellan gum added to such health functional food cannot be uniformly defined depending on the type of target health functional food, but it can be added within a range that does not impair the original taste of the food, and is usually 0.01 for target food. to 50% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight.
  • it is usually added in the range of 0.1 to 100% by weight, preferably 0.5 to 80% by weight.
  • the health functional food of the present invention may be in the form of pills, tablets, capsules or beverages.
  • the food composition containing gellan gum as an active ingredient can be used alone as "functional health food to help improve metabolic diseases" or "functional health food to help improve obesity".
  • the 'health functional food' refers to food manufactured (including processing) according to legal standards using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body (Article 3, Subparagraph 1 of the Health Functional Food Act).
  • the term 'health functional food' may differ in terminology or scope from country to country, but 'Dietary Supplement' in the US, 'Food Supplement' in Europe, 'Health Functional Food' or 'Health Functional Food' in Japan. It may correspond to 'Food for Special Health Use (FoSHU)' or 'Health Food' in China.
  • the food composition or health functional food may additionally contain food additives, and the suitability as a food additive is determined according to the standards and standards for the item in accordance with the general rules and general test methods of the 'Food Additive Code' unless otherwise specified. follow
  • the health functional food can be used together with the gellan gum as "health functional food that helps improve metabolic diseases" or "health functional food that helps improve obesity", and is notified as a 'functional raw material' used therefor.
  • As raw materials or individually recognized raw materials Garcinia cambogia extract, conjugated linoleic acid, green tea extract, chitosan, guar gum, guava leaf extract, inulin, banaba leaf extract, EPA and DHA-containing oils, indigestible maltodextrin, etc.
  • Health functional food materials can be used in combination.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases containing gellan gum as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for animals for improving or preventing metabolic diseases containing gellan gum as an active ingredient A food composition for improving or preventing metabolic diseases containing gellan gum as an active ingredient; or a feed additive for improving or preventing metabolic diseases containing gellan gum as an active ingredient; or a metabolic disease treatment method comprising applying gellan gum to humans or non-human mammals.
  • the present invention is to provide a therapeutic use (for use in therapy) of a composition containing gellan gum as an active ingredient.
  • the present invention provides a novel use of gellan gum for the manufacture of a drug for the treatment of metabolic diseases or a drug for animals.
  • the composition can suppress the increase in body weight and body fat, lower the increase in blood cholesterol and LDL cholesterol, and reduce the concentration of endotoxin in the blood.
  • the composition reduces the enzyme activity of ALT (alanine aminotransferase) and AST (aspartate aminotransferase), which are indicators of liver damage, in liver tissue, ACC (acetyl CoA carboxylase), FAS (fatty acid synthase), SREBP1-C (Sterol response element binding protein ) and expression of ChREBP (carbohydrate response element binding protein).
  • the composition suppresses the expression of IL6 (interleukin-6) and TNF- ⁇ (tumor necrosis factor ⁇ ), which are cytokines involved in inflammation, in liver tissue, and inhibits the expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP1), a macrophage-attracting protein. expression may be reduced.
  • IL6 interleukin-6
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • MCP1 monocyte chemoattractant protein-1
  • composition may be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to gellan gum as an active ingredient, and the adjuvant includes an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, an expanding agent, a lubricant, and a glidant.
  • the adjuvant includes an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, an expanding agent, a lubricant, and a glidant.
  • a flavoring agent or the like may be used.
  • the pharmaceutical composition may be preferably formulated as a pharmaceutical composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Formulations of the pharmaceutical composition may be granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, solutions, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops, or injectable solutions.
  • the active ingredient may be combined with an oral, non-toxic, pharmaceutically acceptable inactive carrier such as ethanol, glycerol, or water.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and coloring agents may also be included in the mixture.
  • Suitable binders include, but are not limited to, starch, gelatin, natural sugars such as glucose or beta-lactose, corn sweeteners, natural and synthetic gums such as acacia, tracacanth or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • acceptable pharmaceutical carriers are sterile and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added if necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to prepare formulations for injections such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, etc., preferably oral administration.
  • the suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, usually This allows the skilled physician to readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-10 g/kg, more preferably 0.001 g/kg to 1 g/kg, even more preferably 0.004 g/kg. It may be administered in a dose of kg to 0.1 g/kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in a unit dose form by formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient, or prepared by putting it into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally contain a dispersing agent or stabilizer.
  • the present invention provides the use of gellan gum for the manufacture of a medicine or food for the improvement, prevention or treatment of metabolic diseases.
  • gellan gum can be used for the improvement, prevention or treatment of metabolic diseases.
  • the present invention provides a method for improving, preventing or treating metabolic diseases comprising administering an effective amount of gellan gum to a mammal.
  • mammal refers to a mammal that is a subject of treatment, observation or experimentation, and preferably refers to a human.
  • an effective amount refers to an amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human thought by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, which means that the symptom is alleviated. contains an amount that induces
  • the effective amount and frequency of administration of the active ingredient of the present invention can be varied depending on the desired effect.
  • the optimal dosage to be administered can be easily determined by those skilled in the art, and the degree of obesity, body weight, body fat, serum triglyceride and endotoxin concentrations, active ingredients and other ingredients contained in the composition, type of formulation, and patient's It can be adjusted according to various factors including age, body weight, general health condition, sex and diet, administration time, administration route, treatment period, and concurrently used drugs.
  • gellan gum in the case of adults, it is preferable to administer gellan gum at a dose of 0.0001 g/kg to 10 g/kg, more preferably 0.001 It may be administered in a dose of g/kg to 10 g/kg, more preferably 0.004 g/kg to 0.1 g/kg.
  • the composition containing gellan gum as an active ingredient is administered in a conventional manner through oral, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, topical, intraocular or intradermal routes It can be administered, and it can be administered orally as desired.
  • the present invention contains gellan gum as an active ingredient, and in vitro (ALT) (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase), ACC (acetyl CoA carboxylase), FAS (fatty acid synthase), SREBP1- Any one selected from the group consisting of Sterol response element binding protein (C), carbohydrate response element binding protein (ChREBP), interleukin-6 (IL6), tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ ), and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP1)
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • ACC acetyl CoA carboxylase
  • FAS fatty acid synthase
  • TLR4 tall-like receptor 4
  • ALT aminotransferase
  • AST aminotransferase
  • ACC acetyl CoA carboxylase
  • FAS fatty acid synthase
  • SREBP1-C Sterol response element binding protein
  • CD36 Cluster of differentiation-36
  • ChREBP carbohydrate response element binding protein
  • IL6 interleukin-6
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • MCP1 monocyte It may be to suppress the expression of all of them including chemoattractant protein-1) at once.
  • the reagent composition is a triglyceride of liver cells in vitro, TLR4 (tall-like receptor 4), ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase), ACC (acetyl CoA carboxylase), FAS (fatty acid synthase), SREBP1-C (Sterol response element binding protein), CD36 (Cluster of differentiation-36), ChREBP (carbohydrate response element binding protein), IL6 (interleukin-6), TNF- ⁇ (tumor necrosis factor ⁇ ) and MCP1 (monocyte chemoattractant protein-1) ) can be used as a composition capable of controlling the expression of any one or more or all of them, and in particular, triglyceride, TLR4 (tall-like receptor 4), ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase) of the liver cells in vitro ), ACC (acetyl CoA carboxylase
  • Another aspect of the present invention may be provided as a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease, or a food composition for the improvement and prevention of intestinal diseases, which contains gellan gum as an active ingredient.
  • intestinal diseases such as inflammatory bowel disease
  • a food composition for the improvement and prevention of intestinal diseases which contains gellan gum as an active ingredient.
  • the inflammatory bowel disease is an idiopathic disease and refers to a disease that causes chronic and recurrent inflammation in the digestive tract and damage to intestinal mucosal tissue.
  • the above intestinal diseases include Crohn's disease (CD), ulcerative colitis (UC), and other causes whose causes have not been clearly identified, but genetic findings, immune and environmental factors, and some microorganisms (pathogens). diseases caused by
  • composition of the present invention is a pharmaceutical composition and can be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable auxiliary agent in addition to gellan gum as an active ingredient, and the auxiliary agent includes an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, A coating agent, an expanding agent, a lubricant, a lubricant, or a flavoring agent may be used.
  • the pharmaceutical composition may be preferably formulated as a pharmaceutical composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Formulations of the pharmaceutical composition may be granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, solutions, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops, or injectable solutions.
  • the active ingredient may be combined with an oral, non-toxic, pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and coloring agents may also be included in the mixture.
  • Suitable binders include, but are not limited to, starch, gelatin, natural sugars such as glucose or beta-lactose, corn sweeteners, natural and synthetic gums such as acacia, tracacanth or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • acceptable pharmaceutical carriers are sterile and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and these
  • One or more of the components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added if necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to prepare formulations for injections such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, etc., preferably oral administration.
  • the suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, usually This allows the skilled physician to readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered in a dose of 0.0001 g/kg to 10 g/kg, more preferably 0.001 g/kg to 10 g/kg. kg, more preferably at a dose of 0.004 g/kg to 0.1 g/kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in unit dose form by formulation using pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients, or prepared by being placed in a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally contain a dispersing agent or stabilizer.
  • the present invention provides a method for improving, preventing or treating intestinal health or inflammatory bowel disease, comprising administering an effective amount of gellan gum to a mammal.
  • mammal refers to a mammal that is a subject of treatment, observation or experimentation, and preferably refers to a human.
  • the term "effective amount” means an amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, which is considered by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, which is Includes an amount that induces relief of symptoms.
  • the effective amount and frequency of administration of the active ingredient of the present invention can be varied depending on the desired effect.
  • the optimal dosage to be administered can be easily determined by those skilled in the art, and the degree of intestinal health or inflammatory bowel disease, the amount of active ingredients and other ingredients contained in the composition, the type of dosage form, and the patient's age, weight, general It can be adjusted according to various factors, including health status, sex and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, and concurrently used drugs.
  • gellan gum in the case of adults, it is preferable to administer gellan gum at a dose of 0.0001 g / kg to 10 g / kg when administering gellan gum once to several times a day, More preferably, it may be administered at a dose of 0.001 g/kg to 10 g/kg, and even more preferably 0.004 g/kg to 0.1 g/kg.
  • the composition containing gellan gum as an active ingredient is administered through oral, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, topical, intraocular or intradermal routes. It can be administered in a conventional manner.
  • the intestinal microorganism improving or prebiotic composition of the present invention contains gellan gum as an active ingredient, thereby increasing the growth of beneficial bacteria in the intestine and suppressing the growth of harmful bacteria in the intestine, thereby improving the intestinal environment, thereby improving the intestinal flora. balance can be maintained.
  • gellan gum the active ingredient of the present invention, suppresses the increase in body weight and body fat in high-fat diet animal models, lowers the concentration of endotoxin, total cholesterol and LDL cholesterol in serum, inhibits the activity of ALT and AST enzymes, which are indicators of liver damage, and triglycerides It inhibits the expression of cerides, TLR4, ACC, FAS, SREBP1, and ChREBP, and inhibits the expression of IL6, TNF- ⁇ , CD36, and MCP-1, which are indicators of liver inflammation, so that metabolic diseases including obesity can be prevented and It can be used effectively for treatment.
  • Figure 1 shows the analysis of prebiotic activity scores of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group for Lactobalcillus rhamnosus MG316. it's a graph
  • Figure 2 is Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) Experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group prebiotic activity (prebiotic activity score) for MG989 was analyzed is the graph shown.
  • Figure 3 shows the prebiotic activity score of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group for Lactococcus lactis LL-KF140. It is a graph showing the analysis.
  • Figure 4 analyzes the prebiotic activity score of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group for Bifidobacterium longum KCTC3421 is the graph shown.
  • Figure 5 analyzes the prebiotic activity score of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group for Bifidobacterium breve KCTC3441 is the graph shown.
  • Figure 6 analyzes the prebiotic activity score of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group for Bifidobacterium bifidum KCTC3440 This is the graph shown by
  • Figure 7 is Bacteroides uniformis ( Bacteroides uniformis ) Experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group by analyzing the prebiotic activity (prebiotic activity score) is the graph shown.
  • Figure 8 is Bacteroides vulgatus ( Bacteroides vulgatus ) Experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), a positive control group (FOS), and the prebiotic activity (prebiotic activity score) of the normal group analyzed and shown it's a graph
  • Figure 9 is Bacteroides ovatus ( Bacteroides ovatus ) Experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), a positive control group (FOS), and the prebiotic activity (prebiotic activity score) of the normal group analyzed and shown it's a graph
  • Figure 10 shows the prebiotic activity scores of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal groups for Lactiplantibacillus plantarum MG989. It is a graph showing the analysis.
  • Figure 11 analyzes the prebiotic activity score of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group for Lacticaseibacillus rhamnosus MG316 This is the graph shown by
  • Figure 12 shows the prebiotic activity scores of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group for Lactococcus lactis LL-KF140. It is a graph showing the analysis.
  • Figure 13 analyzes the prebiotic activity scores of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal groups for Bifidobacterium bifidum MG731 This is the graph shown by
  • Figure 14 is Bifidobacterium breve ( Bifidobacterium breve ) Experimental group 1 (0.1%), Experimental group 2 (0.5%), positive control (FOS) and normal group prebiotic activity (prebiotic activity score) analysis for MG729 is the graph shown.
  • Figure 15 analyzes the prebiotic activity score of Experimental Group 1 (0.1%), Experimental Group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal groups for Bifidobacterium longum MG723 is the graph shown.
  • 16 is a metabolite analysis result of the culture medium of Lacticaseibacillus rhamnosus MG316 according to gellan gum treatment.
  • 17 is a metabolite analysis result of the culture medium of Lactococcus lactis LL-KF140 according to gellan gum treatment.
  • 19 is a metabolite analysis result of the culture medium of Bifidobacterium bifidum MG731 according to gellan gum treatment.
  • Figure 20 is the result of analyzing the beneficial bacteria growth effect in the intestine from the feces of the normal group (NC), the high-fat diet group (HF or HFD), the positive control group (FOS), and the experimental groups (GG10, GG40).
  • 21 is a body shape photograph (a) and a graph (b) of animal models classified into groups 1 to 5 measured using a body composition analyzer.
  • FIG. 22 is a graph showing changes in body fat mass (%) of animal models classified into groups 1 to 5 measured using a body composition analyzer.
  • the body composition analyzer was measured according to the protocol using dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) (InAlyzer; Medikors Inc., Seongnam, Korea). Whole body scanning was performed, from which body fat mass was analyzed using InAlyzer software.
  • DXA dual-energy X-ray absorptiometry
  • 23 is a graph showing the results of measuring the weight of white epididymal adipose tissue extracted from animal models classified into groups 1 to 4.
  • 24 is a graph showing liver weights of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 25 is a graph showing the triglyceride concentration in the liver of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 26 is a graph showing blood cholesterol concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 27 is a graph showing blood HDL cholesterol concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 29 is a graph showing endotoxin concentrations in blood of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 30 is a graph showing blood ALT concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 31 is a graph showing blood AST concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 32 is a graph showing serum insulin concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 33 is a graph showing HOMA-IR of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 34 is a graph showing serum leptin concentrations of animal models classified into groups to groups 5.
  • 35 is a graph showing fasting blood glucose measurements of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 37 is a graph of oral glucose tolerance test results of animal models classified into groups 1 to 5.
  • FIG. 37 is a graph showing AUC (Area Under the Curve) measured for a blood glucose level curve (FIG. 36).
  • 39 is a graph showing SREBP1 protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5;
  • 40 is a graph showing ChREBP protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 41 is a graph showing FAS protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 43 is a graph showing CD36 protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 47 is a graph showing positive staining areas measured when liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5 were stained with Oil Red O.
  • 48 is a Western blot showing changes in the expression of inflammatory-related cytokines and macrophage-inducing proteins in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 49 is a graph showing IL6 expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 51 is a graph showing MCP1 protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 53 is a graph showing IL-1 ⁇ protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 55 is a plot showing the relative abundance of intestinal microflora in animal models classified into groups 1 to 5.
  • FIG. 56A is a graph of plasma FITC-dextran concentration over time in animal models classified into groups 1 to 5, and FIG. 56B is a graph of plasma FITC-dextran concentration (Area Under the Curve) (AUC) for the graph (FIG. 56A). This is a graph showing measurements.
  • Figure 57A is a graph showing the measurement of ⁇ -glucuronidase activity in animal models classified into groups 1 to 5
  • Fig. 57B is a graph showing the measurement of myeloperoxidase activity in animal models classified into groups 1 to 5.
  • FIG. 58A is a graph showing TNF- ⁇ mRNA expression levels in animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 58B is a graph showing IL-1 ⁇ mRNA expression levels in animal models classified into groups 1 to 5.
  • 59 is a heatmap showing the correlation between gut microbiota and metabolic parameters.
  • GG Food additive grade gellan gum
  • KELCOGEL® Low acyl gellan gum
  • a prebiotic acticity score analysis was performed as a method for evaluating the growth effect of gellan gum (GG) on beneficial bacteria in the intestine.
  • Lactobacillus plantarum MG989, Lactobalcillus rhamnosus MG316, Bifidobacterium longum KCTC3421, Bifidobacterium bifidum isolated from human intestine as intestinal beneficial bacteria KCTC3440, Bifidobacterium breve KCTC3441 and Lactococcus lactis LL-KF140 strain which is a commercially available prebiotics material isolated from kimchi, were used, which were purchased from the Center for Biological Resources.
  • Bacteroides uniformis Bacteroides vulgatus , and Bacteroides ovatus isolated from Korean intestines were used as intestinal beneficial bacteria.
  • Escherichia coli KCTC2441 was used as intestinal harmful bacteria.
  • Lactobacillus strain and Lactococcus strain were cultured using MRS medium.
  • the culture conditions were static culture at pH 6.5 ⁇ 0.2 and 37° C. for 48 hours, and the oxygen requirement was facultative anaerobic, and the strain was preserved through freeze-drying preservation or cell suspension freezing.
  • Bifidobacteria genus ( Bifidobacteria ) strains and Escherichia coli ( Escherichia coli ) strains are TSA (tryptic soy agar) medium containing 5% sheep blood (sheep blood) and 0.05% L-cysteine (L-cysteine) was used, and cultured at 37 ° C. for 48-72 hours, and cultured under anaerobic conditions as obligate anaerobic bacteria.
  • Bacteroides strains, which are obligate anaerobic bacteria, were cultured in BHI (Brain Heart Infusion broth) medium and anaerobically cultured at 37 °C for 48-72 hours.
  • the culture medium for the prebiotic activity score analysis was M9 MB, in which 2 g/L of glucose, 0.015 g/L of CaCl 2 , and 0.5 g/L of MgSO 4 were added to MB (minimal broth).
  • each of the beneficial bacteria and harmful bacteria are spread on each M9 MB solid medium (agar), cultured for 24-48 hours in a 37 ° C. incubator, and then inoculated into 10 ml of M9 MB broth Secondary culture was carried out for 24-48 hours in a 37 °C incubator.
  • the control group is a group in which 1 mg/ml glucose is added as a sample
  • the positive control group is a group in which 5 mg/ml fructooligosaccharides (FOS) is added as a sample
  • experimental group 1 is a group with 1 mg/ml gellan gum (GG) added as a sample
  • experimental group 2 is a group with 5 mg/ml gellan gum (GG) added as a sample. to be.
  • the probiotic log O.D on the prebiotic at 24 h is the absorbance of the positive control group or experimental groups 1 and 2 for each beneficial bacteria after 24 hours.
  • probiotic log O.D. on the prebiotic at 0 h is the absorbance of the positive control group or experimental groups 1 and 2 for each beneficial bacteria at 0 hour (the moment the sample is inoculated).
  • probiotic log O.D. on glucose at 24h is the absorbance of the control group (1 mg/ml glucose) for each beneficial bacteria after 24 hours.
  • probiotic log O.D. on glucose at 0h is the absorbance of a control group (1 mg/ml glucose) for each beneficial bacteria at 0 hour (the moment the sample is inoculated).
  • Enteric log OD on the prebiotic at 24 h is the absorbance of the positive control group or experimental groups 1 and 2 for harmful bacteria ( E. coil ) after 24 hours.
  • Enteric log OD on the prebiotic at 0 h is the absorbance of the positive control group or experimental groups 1 and 2 for harmful bacteria ( E. coil ) after 0 hours (the moment the sample is inoculated).
  • Enteric log OD on glucose at 24h is the absorbance of a control (1 mg/ml glucose) against harmful bacteria ( E. coil ) after 24 hours.
  • Enteric log OD on glucose at 0h is the absorbance of the control group (1 mg/ml glucose) against harmful bacteria ( E. coil ) after 0 hours (the moment the sample is inoculated).
  • 1 to 9 are graphs showing prebiotic activity scores of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal groups for various beneficial bacteria.
  • FIG. 1 is for Lactobalcillus rhamnosus MG316
  • FIG. 2 is for Lactobacillus plantarum MG989
  • FIG. 3 is for Lactococcus lactis LL-KF140.
  • Figure 4 is for Bifidobacterium longum KCTC3421
  • Figure 5 is for Bifidobacterium breve KCTC3441
  • Figure 6 is for Bifidobacterium bifidum KCTC3440 7 is for Bacteroides uniformis
  • FIG. 8 is for Bacteroides vulgatus
  • FIG. 9 is for Bacteroides ovatus . it is about
  • the gellan gum of Example 1 according to the present invention showed all bacteria compared to the control group (Normal) that was not treated with anything. It was confirmed that the prebiotic activity for was remarkably excellent.
  • gellan gum is Lactobalcillus rhamnosus MG316, Lactobacillus plantarum MG989, Lactococcus lactis LL-KF14, Bifidobacterium longum longum ) KCTC3421, Bifidobacterium breve KCTC3441, Bifidobacterium bifidum KCTC3440, Bacteroides uniformis , Bacteroides vulgatus and Bacteroi Des ovatus ( Bacteroides ovatus ) It was confirmed to exhibit an excellent prebiotic activity score (2 to 10 times compared to the control group).
  • the gellan gum of the present invention exhibits a prebiotic acticity score of Lactobalcillus rhamnosus MG316 equivalent to fructo-oligosaccharide (FOS) widely known as a conventional prebiotic material.
  • the gellan gum of the present invention had high activity against 9 kinds of beneficial bacteria, and compared to the positive control FOS, a total of 7 strains ( Lactobacillus plantarum ) ) MG989, Lactococcus lactis LL-KF14, Bifidobacterium breve KCTC3441, Bifidobacterium bifidum KCTC3440, Bacteroides uniformis ( Bacteroides uniformis ), Bacteroides vulgatus ( Bacteroides vulgatus ) and Bacteroides ovatus ( Bacteroides ovatus ) Represents a significantly superior prebiotic activity (prebiotic activity score), one strain (Lactobacillus rhamnosus ( Lactobalcillus rhamnosus ) MG316 ) It was confirmed that it had an equivalent level of prebiotic activity (prebiotic activity score).
  • Table 1 shows the pH changes for experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal group.
  • the control group and the FOS group had little change in pH, but it was confirmed that the pH of experimental group 2 to which 0.5% (5 mg/ml) of gellan gum was added was lowered to slightly acidic. That is, it can be seen that, unlike fructooligosaccharide, gellan gum promotes short chain fatty acid (SCFA) production from beneficial bacteria. Therefore, gellan gum can obtain beneficial effects on health, such as an energy source for intestinal epithelial cells, strengthening of the immune system and regulation of metabolism, which cannot be expected from fructooligosaccharide.
  • SCFA short chain fatty acid
  • the prebiotic activity of the above formula was analyzed by the growth support capacity (CFU/ml) rather than the absorbance (OD) of the probiotic strain relative to intestinal bacteria such as E. coli, and was defined based on this.
  • FIG. 10 to 15 are graphs showing the prebiotic activity scores of experimental group 1 (0.1%), experimental group 2 (0.5%), positive control group (FOS) and normal groups by analysis, and FIG.
  • Bacillus plantarum Lactiplantibacillus plantarum
  • Figure 11 is for Lactiplantibacillus rhamnosus ( Lacticaseibacillus rhamnosus ) for MG316
  • Figure 12 is for Lactococcus lactis ( Lactococcus lactis ) LL-KF140
  • 13 is for Bifidobacterium bifidum MG731
  • FIG. 14 is for Bifidobacterium breve MG729
  • FIG. 15 is for Bifidobacterium longum MG723. will be.
  • the gellan gum of Example 1 according to the present invention has significantly excellent prebiotic activity against all bacteria confirmed that
  • experimental group 2 in which 0.5 mg/ml (0.5%) of the gellan gum of the present invention was added showed a significantly superior prebiotic activity score compared to fructooligosaccharide (FOS), which is widely known as a conventional prebiotic material. It became.
  • FOS fructooligosaccharide
  • Bifidobacterium breve MG729 increased the most (33.80).
  • Experimental Example 1-2 experimental groups 1 and 2, in which gellan gum (GG 0.1%, GG 0.5%) was administered to 6 commercial probiotic strains, and control cultures containing only 1 mg/ml glucose were recovered. (37 °C, 4 hours incubation).
  • 300 ng/mL internal standard (glycodeoxycholic-2,2,4,4-d4 acid and taurodeoxycholic-2,2,4,4-d4 acid) was included in each of the above cultures (100 ⁇ L) After adding cold methanol (200 ⁇ L), it was reacted at 4 °C for 20 minutes. When protein precipitated from the culture, it was centrifuged at 4° C. for 10 minutes (14,000 x g) and the supernatant (supernatant) was recovered for metabolite profiling.
  • Reproducibility and reliability verification were measured using QC (quality control) samples. A mixture of all samples was made into a QC sample and analyzed repeatedly. The QC samples were analyzed after every 14 assays. Metabolites were measured by UPLC-MS and analyzed using a Xevo G2-XS qTOF equipped with ACQUITY UPLC (Waters, MA, USA). ACQUITY UPLC BEH C18 column (1.8 ⁇ m, 2.1 ⁇ 100 mm) and ACQUITY UPLC VanGuard C18 column (1.8 ⁇ m, 2.1 ⁇ 5 mm) were used for purification and separation. Mobile phases A and B were set with 0.1% formic acid (FA) solution and 0.1% FA acetonitrile, respectively.
  • FA formic acid
  • the flow rate and column oven temperature were set at 0.3 ml/min at 40 °C.
  • the conditions of complete ionization, capillary voltage, sampling cone, source temperature, desolvation temperature and desolvation gas flow were 2.5 kV, It was set at 20V, 120°C, 400°C and 600L/h.
  • Metabolite peaks were extracted from UPLC-MS raw data using Progenesis QI software (Waters, MA, USA). Peaks with a coefficient of variation (CV) value of about 30 were excluded in this experiment.
  • FIG. 16 is a metabolite analysis result of the culture medium of Lacticaseibacillus rhamnosus MG316 treated with gellan gum
  • FIG. 17 is a result of Lactococcus lactis LL-KF140 treated with gellan gum
  • 18 is a metabolite analysis result for the culture medium of Bifidobacterium longum MG723 according to gellan gum treatment
  • FIG. 19 is a metabolite analysis result for the culture medium of gellan gum treatment.
  • Therium bifidum Bifidobacterium bifidum
  • These are metabolite analysis results for the culture medium of MG731.
  • Experimental Group 2 was confirmed to cause a significant increase in citric aicd in Lacticaseibacillus rhamnosus MG316, and the intensity of 8 metabolites of Lactococcus lactis LL-KF140 was significant. It was found to increase positively. In other words, it was confirmed that gellan gum up-regulates the expression of metabolites from intestinal beneficial bacteria.
  • polysaccharide food additives (gum arabic, guar gum, carrageenan, agarose, pectin, amylopectin, and fucoidan) were compared and analyzed for the proliferation of beneficial bacteria in the intestine. It is also associated with effects on gut health and metabolic diseases including obesity.
  • Strains isolated from the human intestine as intestinal beneficial bacteria Lactobacillus plantarum MG989, Lactobalcillus rhamnosus MG316, Bifidobacterium longum KCTC3421, Bifidobacterium bifidum) bifidum ) KCTC3440, Bifidobacterium breve ( Bifidobacterium breve ) KCTC3441 and Lactococcus lactis ( Lactococcus lactis ) LL-KF140 strain), which are commercially available prebiotics materials isolated from kimchi, were cultured and used, which were cultured and used at the Biological Resource Center. Acquired and used. Escherichia coli KCTC2441 was used as intestinal harmful bacteria.
  • the Lactobacillus strain and the Lactococcus strain were cultured using MRS medium.
  • the culture conditions were static culture at pH 6.5 ⁇ 0.2 and 37° C. for 48 hours, and the oxygen requirement was facultative anaerobic, and the strain was preserved through freeze-drying preservation or cell suspension freezing.
  • Bifidobacteria genus ( Bifidobacteria ) strains and Escherichia coli ( Escherichia coli ) strains are 37 °C using a TSA medium containing 5% sheep blood (sheep blood) and 0.05% L-cysteine (L-cysteine) and cultured for 48-72 hours, and cultured under anaerobic conditions as strict anaerobic bacteria.
  • the culture medium for the prebiotic activity score analysis was M9 MB, in which 2 g/L of glucose, 0.015 g/L of CaCl 2 , and 0.5 g/L of MgSO 4 were added to MB (minimal broth).
  • each of the beneficial bacteria and harmful bacteria are spread on each M9 MB solid medium (agar), cultured for 24-48 hours in a 37 ° C. incubator, and then inoculated into 10 ml of M9 MB broth Secondary culture was carried out for 24-48 hours in a 37 °C incubator.
  • the control group is a group in which 1 mg/ml glucose is added as a sample
  • the positive control group is a group in which 5 mg/ml fructooligosaccharides (FOS) is added as a sample
  • experimental group 1 is a group with 1 mg/ml gellan gum (GG) added as a sample
  • experimental group 2 is a group with 5 mg/ml gellan gum (GG) added as a sample. to be.
  • the comparative group was a group in which 5 mg/ml guar gum, carrageenan, agarose, pectin, amylopectin, or fucoidan were added as polysaccharide food additives, and were labeled as comparative groups 1, 2, 3, 4, 5, and 6 in order.
  • Equation 1 may refer to Equation 1 of Experimental Example 1, and all are the same except that a control group is further included in addition to Experimental Groups 1 and 2 as a prebiotic activity measurement sample).
  • the probiotic log O.D on the prebiotic at 24 h is the absorbance of the positive control group or experimental group 1 or experimental group 2 or control group for each beneficial bacteria after 24 hours.
  • probiotic log O.D. on the prebiotic at 0 h is the absorbance of the positive control group or experimental group 1 or experimental group 2 or control group for each beneficial bacteria at 0 hour (the moment the sample is inoculated).
  • probiotic log O.D. on glucose at 24h is the absorbance of the control group (1 mg/ml glucose) for each beneficial bacteria after 24 hours.
  • probiotic log O.D. on glucose at 0h is the absorbance of a control group (1 mg/ml glucose) for each beneficial bacteria at 0 hour (the moment the sample is inoculated).
  • enteric log OD on the prebiotic at 24 h is the absorbance of the positive control group or experimental group 1 or experimental group 2 or control group for harmful bacteria ( E. coil ) after 24 hours.
  • Enteric log OD on the prebiotic at 0 h is the absorbance of the positive control group or experimental group 1 or experimental group 2 or control group for harmful bacteria ( E. coil ) after 0 hours (the moment the sample is inoculated).
  • Enteric log OD on glucose at 24h is the absorbance of a control (1 mg/ml glucose) against harmful bacteria ( E. coil ) after 24 hours.
  • Enteric log OD on glucose at 0h is the absorbance of the control group (1 mg/ml glucose) against harmful bacteria ( E. coil ) after 0 hours (the moment the sample is inoculated).
  • beneficial bacteria type control group Normal
  • FOS beneficial bacteria type control
  • comparator group 1 comparison group 2 comparator group 3 comparator group 4 comparator group 5 comparator group 6 G-G 0.5% guar gum Karajinan agarose pectin amylopectin fucoidan
  • rhamnosus 0.19 ⁇ 0.03 0.82 ⁇ 0.04 1.82 ⁇ 0.04 0.32 ⁇ 0.03 0.53 ⁇ 0.02 0.58 ⁇ 0.01 0.43 ⁇ 0.01 0.45 ⁇ 0.01 0.01 ⁇ 0.01 L.
  • plantarum 0.31 ⁇ 0.03 0.48 ⁇ 0.03 1.41 ⁇ 0.04 0.17 ⁇ 0.02 0.65 ⁇ 0.03 0.64 ⁇ 0.05 0.05 ⁇ 0.03 0.09 ⁇ 0.02 0.02 ⁇ 0.01 L.
  • the gellan gum of Example 1 according to the present invention was confirmed to have remarkably excellent prebiotic activity against all bacteria compared to other polysaccharide food additives.
  • gellan gum is Lactobalcillus rhamnosus MG316, Lactobacillus plantarum MG989, Lactococcus lactis LL-KF14, Bifidobacterium longum longum ) KCTC3421, Bifidobacterium breve ( Bifidobacterium breve ) KCTC3441, and Bifidobacterium bifidum ( Bifidobacterium bifidum ) KCTC3440 were confirmed to show excellent prebiotic activity scores (compared to other polysaccharide food additives).
  • mice Forty-five 8-week-old male C57BL/6J mice bred at the Korea Food Research Institute SPF breeding facility (Specific pathogen free animal facility) were used, and the mice were acclimatized for 2 weeks before the experiment. Mice were bred with free food in a breeding room maintained at a temperature of 22 ⁇ 2 ° C and a humidity of 40-60% during the experiment, and the light and dark cycles were adjusted at 12-hour intervals. All animal experiments were performed in compliance with the Animal Experimentation and Operation Regulations of the Animal Experimentation Ethics Committee of the Korea Food Research Institute.
  • mice were randomly divided into five groups of nine mice each.
  • the normal group (NC) and the high fat group (HF) were orally administered sterile saline once a day for 12 weeks, and the positive control group, the fructooligosaccharide administration group (FOS), received 40 mg/kg of fructo-oligosaccharide.
  • Lacttooligosaccharide was dissolved in sterile saline and administered orally once a day for 12 weeks.
  • Experimental groups GG10 (gellan gum 10 mg/kg mouse) and GG40 (gellan gum 40 mg/kg mouse) groups, received 10 mg/kg or 40 Each mg/kg of gellan gum was dissolved in sterile saline and orally administered once a day for 12 weeks.
  • the high-fat feed was a Modified AIN 76A purified rodent diet (60 cal% fat) in which caloric content was increased by 60 cal% by adding lard.
  • All experimental results were expressed as the mean ⁇ standard error of the mean (Mean ⁇ Standard Error of Mean), and the statistical significance of the experimental results was verified by one-way ANOVA by Tukey's post hoc test, and the p-value was A case of 0.05 or less was determined to be significant. Data analysis was performed using IBM SPSS Statistics 20 software (IBM Inc., Chicago, IL, USA) (* or #p ⁇ 0.05, ##p ⁇ 0.01, ###p ⁇ 0.001 vs HF).
  • ND division Explanation Normal group
  • ND Normal feeding
  • oral administration of sterile saline solution Normal
  • high fat diet HF or HFD
  • High-fat feed oral administration of sterile saline (HF+Saline) positive control High-fat feed
  • oral administration of fructooligosaccharide 40 mg/kg/day
  • Experimental group GG10 High-fat feed feeding, oral administration of gellan gum (gellan gum 10 mg/kg/day)
  • Experimental group GG40 High-fat feed feeding oral administration of gellan gum (gellan gum 40 mg/kg/day)
  • NGS next-generation sequencing
  • Figure 20 is the result of analyzing the beneficial bacteria growth effect in the intestine from the feces of the normal group (NC), the high-fat diet group (HF or HFD), the positive control group (FOS), and the experimental groups (GG10, GG40).
  • the Lactobacillus strain which was significantly reduced by the high-fat diet, was significantly increased in mice fed gellan gum, and was found to increase the proliferation of beneficial bacteria, Lactobacillus, compared to the positive control fructooligosaccharide. Confirmed.
  • mice raised in an aseptic environment were purchased from Central Laboratory Animals Co., Ltd. and used, and the mice were acclimatized for 2 weeks before the experiment. Mice were bred on an ad libitum diet in a specific pathogen-free animal facility where the temperature was 22 ⁇ 2 °C and humidity was maintained at 40-60% during the experiment, and the light and dark cycles were adjusted at 12-hour intervals. did All animal experiments were performed in accordance with the Korea Food Research Institute's Animal Experiment Operation Regulations (approval no. KFRI-M-20013).
  • mice were randomly divided into five groups of nine mice each.
  • the ND normal diet group
  • HFD high fat diet group
  • sample administration group were fed a high-fat diet (Modified AIN 76A purified rodent diet (60 cal% fat)) was voluntarily provided.
  • PC or FOS positive control group
  • 40 mg/kg of fructo oligosaccharide was orally administered daily
  • sample GG10 or GG40 10 or 40 mg/kg of gellan gum in Example 1 was orally administered daily.
  • the HFD group was orally administered the same amount of distilled water for the same period. Body weight was measured every week at 10 am for a total of 12 weeks.
  • Group 1 (ND, negative control group): intake of normal diet, oral administration of distilled water
  • Group 2 intake of high-fat diet, oral administration of distilled water
  • Group 3 (PC or FOS): intake of high-fat diet, oral administration of fructooligosaccharide 40 mg/kg
  • Group 4 intake of high-fat diet, oral administration of 10 mg/kg of gellan gum in Example 1
  • Group 5 intake of high-fat diet, oral administration of 40 mg/kg of gellan gum in Example 1
  • FIG. 21 is a picture (a) and a graph (b) of body shapes of animal models classified into groups 1 to 5 measured using a body composition analyzer
  • FIG. 22 is classified into groups 1 to 5 measured using a body composition analyzer. It is a graph showing the change in body fat mass (%) of the animal model to be measured.
  • the body composition analyzer was measured according to the protocol using dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) (InAlyzer; Medikors Inc., Seongnam, Korea). Whole body scanning was performed, from which body fat mass was analyzed using InAlyzer software.
  • DXA dual-energy X-ray absorptiometry
  • the ND group consuming the normal diet increased body fat by 111.2%, and when 40 mg/kg (GG40) of gellan gum of Example 1 was administered, the body fat It was confirmed that the content decreased significantly by 22.1% compared to the HFD group.
  • the positive control group (FOS) to which 40 mg/kg of fructooligosaccharide was administered also had a significant decrease in body fat content compared to the HFD group. Therefore, it can be seen that the gellan gum of the present invention has an effect of reducing body fat.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of measuring the weight of white epididymal adipose tissue extracted from animal models classified into groups 1 to 4. The significance analysis of FIG. 23 was verified by one-way ANOVA by Tukey's post hoc test, and it was determined that a p-value of 0.05 or less was significant (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 vs ND, #p ⁇ 0.05, ##p ⁇ 0.01, ###p ⁇ 0.001 vs HFD).
  • the weight of white epididymal adipose tissue in the ND group was significantly increased compared to the HFD group.
  • the group administered with 40 mg/kg of gellan gum (GG40) showed a significant decrease in the weight of white epididymal adipose tissue compared to the HFD group.
  • the group administered with 40 mg/kg of fructooligosaccharide (FOS) there was no significant difference in white epididymal adipose tissue weight compared to the HFD group.
  • the gellan gum of the present invention is effective not only in weight loss but also in reducing body fat compared to conventional dietary fiber.
  • the animal models classified into group 1 (NC, negative control), group 2 (HFD), group 3 (FOS), group 4 (GG10) and group 5 (GG40) were fasted for 18 hours.
  • group 1 negative control
  • group 2 HFD
  • group 3 FOS
  • group 4 GG10
  • group 5 GG40
  • anesthesia was performed, the abdominal and thoracic cavities were incised, blood was collected from the abdominal vena cava, and serum was separated by centrifugation at 3,000 rpm for 15 minutes. The separated serum was stored at -70 °C until analysis.
  • the liver tissue was collected and weighed to confirm the amount of change.
  • the cholesterol and triglyceride assay kit (triglycerides and cholesterol) purchased from Abcam (Cambridge, MA, USA) was used according to the manufacturer's protocol.
  • FIG. 24 is a graph showing liver weights of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 25 is a graph showing triglyceride concentrations in the liver of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 26 is a graph showing blood cholesterol concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 27 is a graph showing blood HDL cholesterol concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 28 is a graph showing blood LDL cholesterol concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • liver weight but also triglyceride significantly increased in the HFD group.
  • GG when GG was administered, the increase in liver weight due to HFD was significantly reduced, and in particular, when gellan gum was administered at 40 mg/kg or more, it was confirmed that the metabolic syndrome value was significantly improved.
  • the group administered with 40 mg/kg of fructooligosaccharide showed a significant decrease in both blood cholesterol and LDL cholesterol compared to the HFD group.
  • gellan gum has an effect of reducing not only body weight and body fat but also blood cholesterol content, and is particularly effective in treating excessive high fat intake for a short or long period of time.
  • 29 is a graph showing endotoxin concentrations in blood of animal models classified into groups 1 to 5.
  • the gellan gum of Example 1 showed an effect even at 10 mg/kg, unlike conventional dietary fiber, and when administered at 40 mg/kg, it was confirmed that obesity or metabolic disease improved, prevented, or cured. . This achieves a remarkable effect that cannot be predicted in conventional dietary fiber (fructooligosaccharide) having a body fat reducing effect.
  • the animal models classified into group 1 (NC, negative control), group 2 (HFD), group 3 (FOS), group 4 (GG10) and group 5 (GG40) were fasted for 18 hours.
  • group 1 negative control
  • group 2 HFD
  • group 3 FOS
  • group 4 GG10
  • group 5 GG40
  • Insulin resistance was analyzed using HOMA-IR (homeostasis model assessment for insulin resistance). This is based on the principle that insulin resistance and insulin secretion have a hyperbolic relationship, that when insulin resistance increases, insulin secretion increases, and when insulin resistance decreases, insulin secretion also decreases, and can be calculated through Equation 3 below.
  • HOMA-IR fasting insulin (mU/L) x fasting glucose (mmol/L)/22.5.
  • 30 is a graph showing blood ALT concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 31 is a graph showing blood AST concentrations of animal models classified into groups 1 to 5.
  • the AST content increased significantly by 154.6% in the HFD group fed a high-fat diet compared to the ND group.
  • the gellan gum-administered group (GG40) of Example 1 it was significantly reduced by 41.9% compared to the HFD group.
  • the group (FOS) administered with 40 mg/kg of fructooligosaccharide showed a significant decrease compared to the HFD group, but it was confirmed that the GG40 group decreased significantly more than the FOS group.
  • the gellan gum of Example 1 was confirmed to show an effect of improving, preventing, or treating obesity or metabolic diseases when administered at 40 mg/kg, unlike conventional dietary fiber. In particular, it achieves a significantly more significant effect on non-alcoholic fatty liver than conventional dietary fiber (fructooligosaccharide) having a body fat reducing effect.
  • Figure 32 is a graph showing the serum insulin concentration of animal models classified into groups 1 to 5
  • Figure 33 is a graph showing the HOMA-IR of animal models classified into groups 1 to 5
  • Figure 34 is a graph showing the group to 5 It is a graph showing the serum leptin concentration of animal models divided into groups.
  • group 1 negative control
  • group 2 HFD
  • group 3 FOS
  • group 4 GG10
  • group 5 GG40
  • mice mice classified into group 1 (NC, negative control), group 2 (HFD), group 3 (FOS), group 4 (GG10) and group 5 (GG40) were fasted for 12 hours, and blood was collected. collected. Thereafter, glucose at a concentration of 2 g/kg was orally administered, and then blood glucose was measured. Blood glucose levels were measured every 0, 30, 60, 90 and 120 minutes after glucose administration using a glucometer (Accu-Chek; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA).
  • FIG. 35 is a graph showing fasting blood glucose measurements of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 37 is a graph of oral glucose tolerance test results of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 37 is blood glucose levels. It is a graph shown by measuring AUC (Area Under the Curve) for the curve (FIG. 36).
  • the animal models classified into group 1 (NC, negative control), group 2 (HFD), group 3 (FOS), group 4 (GG10) and group 5 (GG40) were fasted for 18 hours and then using IFRAN solution. After anesthesia, an abdominal and thoracic incision was made and the liver was removed. After obtaining liver tissue from the excised liver, it was immediately immersed in liquid nitrogen and quickly frozen, and then stored at -80 ° C., and then thawed before the experiment to isolate proteins.
  • the tissue was disrupted by a combination of mechanical grinding and sonication in lysis buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 100 mM DTT) to which protease inhibitors were added. Then, the supernatant was recovered by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 5 minutes at 4 °C. The protein concentration in the recovered supernatant was measured and quantified by ELISA using the Bradford method.
  • Electrophoresis was performed with proteins isolated from the collected liver tissue. Specifically, after electrophoresis using 10% SDS-polyacrylamide gel (Bio-Rad, CA, USA), PVDF membrane (Bio-Rad, CA, USA) transferred to. After blocking nonspecific binding sites in 5% skim milk (0.1% Tween 20 containing PBS, PBST) solution, primary antibodies (anti- ⁇ -actin, anti-SREBP1c, anti-ACC, Anti-FAS, anti-ChREBP, Abcam) at 4 °C overnight (overnight), secondary antibody (anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG linked with horseradish peroxidase, Cell signaling Technology) for 1 hour at room temperature After culturing, it was detected using streptavidin-horseradish peroxidase and a ChemiDoc XRS device (Bio-Rad, USA).
  • 38 is a Western blot showing changes in the expression of proteins related to lipid metabolism (SREBP1, ChREBP, FAS, ACC) in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 39 is a graph showing SREBP1 protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 40 is a graph showing ChREBP protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • 41 is a graph showing FAS protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 42 is a graph showing ACC protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • 43 is a graph showing CD36 protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • the group (FOS) administered with 40 mg/kg of fructooligosaccharide did not show a significant decrease compared to the HFD group.
  • SREBP1 sterol regulatory element binding protein-1
  • ChREBP carbohydrate response element binding protein
  • the gellan gum of Example 1 was confirmed to significantly and remarkably reduce the expression of lipid metabolism-related proteins in the liver, unlike conventional dietary fibers. Therefore, it can be seen that the gellan gum of the present invention exhibits an effect of improving, preventing or treating obesity or metabolic diseases.
  • the animal models classified into group 1 (NC, negative control), group 2 (HFD), group 3 (FOS), group 4 (GG10) and group 5 (GG40) were fasted for 18 hours and then using IFRAN solution. After anesthesia, an abdominal and thoracic incision was made and the liver was removed. After obtaining liver tissue from the excised liver, it was immediately immersed in liquid nitrogen and quickly frozen, and then stored at -80 ° C., and then thawed before the experiment to isolate proteins. Liver tissues were stained with H&E. After fixing with 4% formaldehyde and treating with tissue-Tek OCT compound (Sakura Finetek, CA, USA), paraffin-embedded, cut to 4 ⁇ m in size, and then stained with H&E.
  • the liver tissue was sectioned at 10 ⁇ m using a cryostat (Leica CM1850, Wetzlar, Germany) and then stained with Oil Red O.
  • the stained sections were scanned using a pannoramic 250 Flash III slide scanner (3DHistech, Ltd., Budapest, Hungary) and captured with CaseViewer software (3DHistech, Ltd.).
  • Steatosis scores (0, none; 1, ⁇ 33%; 2, 33-66%; 3, >66%) of H&E stained slides were evaluated by Kato et al. (Kato, K. i., Takeshita, Y., Misu, H., Zen, Y., Kaneko, S., & Takamura, T. (2015).
  • Liver steatosis is associated with insulin resistance in skeletal muscle rather than in The liver in J apanese patients with non-alcoholic fatty liver disease.Journal of diabetes investigation, 6(2), 158-163) was determined, and the area stained with Oil Red was determined by ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA) was calculated using
  • FIG. 44 is H&E staining results for liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 45 is steatosis score results for liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 46 is 1 Oil Red O staining results of liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 47 shows liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5 using Oil Red O ), it is a graph showing the measurement of the positive staining area when stained.
  • the animal models classified into group 1 (NC, negative control), group 2 (HFD), group 3 (FOS), group 4 (GG10) and group 5 (GG40) were fasted for 18 hours. After anesthesia, an incision was made in the abdomen and thoracic cavity, and the liver was removed. After obtaining liver tissue from the excised liver, it was immediately immersed in liquid nitrogen and quickly frozen, and then stored at -80 ° C., and then thawed before the experiment to isolate proteins.
  • the tissue was disrupted by a combination of mechanical grinding and sonication in lysis buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 100 mM DTT) to which protease inhibitors were added. Then, the supernatant was recovered by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 5 minutes at 4 °C. The protein concentration in the recovered supernatant was measured and quantified by ELISA using the Bradford method.
  • Electrophoresis was performed with proteins isolated from the collected liver tissue. Specifically, after electrophoresis using 10% SDS-polyacrylamide gel (Bio-Rad, CA, USA), PVDF membrane (Bio-Rad, CA, USA) transferred to. After blocking nonspecific binding sites in 5% skim milk (0.1% Tween 20 containing PBS, PBST) solution, primary antibodies (anti- ⁇ -actin, anti-IL1 ⁇ , anti-IL6, Anti-TNF- ⁇ , TLR4, MCP1) (Abcam (Cambridge, MA, USA)) was reacted with overnight at 4 °C, secondary antibody (anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG linked with horseradish peroxidase) (Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)) was incubated at room temperature for 1 hour, and then detected using streptavidin-horseradish peroxidase and a ChemiDoc XRS device (Bio-Rad, USA). At this time,
  • 48 is a Western blot showing changes in the expression of inflammatory-related cytokines and macrophage-inducing proteins in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • 49 is a graph showing IL6 expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 50 is a graph showing TNF- ⁇ expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • 51 is a graph showing MCP1 protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 52 is a graph showing TLR4 protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5
  • 53 is a graph showing IL-1 ⁇ protein expression in liver tissues of animal models classified into groups 1 to 5.
  • interleukin-6 IL6
  • tumor necrosis factor ⁇ TNF- ⁇
  • IL6 and TNF ⁇ are cytokines involved in inflammation caused by fat accumulation in liver tissue.
  • GG40 gellan gum of Example 1
  • IL6 and TNF ⁇ were significantly decreased by 17.1% and 38.8%, respectively, compared to the HFD group.
  • the group (FOS) administered with 40 mg/kg of fructooligosaccharide did not show a significant decrease compared to the HFD group.
  • TLR4 which upregulates the expression and secretion of inflammatory cytokines and chemotines, was also greatly increased in the HFD group and then significantly decreased through the administration of gellan gum.
  • TLR4 expression was slightly increased compared to the HFD group.
  • MCP1 monocyte chemoattractant protein-1
  • GG40 gellan gum-administered group of Example 1
  • MCP1 expression was significantly decreased by 23.5% compared to the HFD group.
  • the group (FOS) administered with 40 mg/kg of fructooligosaccharide did not show a significant decrease compared to the HFD group.
  • the gellan gum of Example 1 was confirmed to significantly and remarkably reduce the expression of inflammatory factors caused by fat accumulation in the liver, unlike conventional dietary fiber. Therefore, it can be seen that the gellan gum of the present invention exhibits an effect of improving, preventing or treating obesity or metabolic diseases.
  • Group 1 (ND, negative control group): intake of normal diet, oral administration of distilled water
  • Group 2 intake of high-fat diet, oral administration of distilled water
  • Group 3 (PC or FOS): intake of high-fat diet, oral administration of fructooligosaccharide 40 mg/kg
  • Group 4 intake of high-fat diet, oral administration of 10 mg/kg of gellan gum in Example 1
  • Group 5 intake of high-fat diet, oral administration of 40 mg/kg of gellan gum in Example 1
  • fecal samples were collected from groups 1 to 5.
  • the fecal sample was transferred to a 20 mL SPME vial, then 5 mL of distilled water containing 1.5 g monosodium phosphate (pH 2.5, adjusted with sulfuric acid) was added followed by 10 mL of internal standard stock solution.
  • Short chain fatty acids (SCFAs) were analyzed by GC-MS (7890 GC system equipped with 7000C Triple Quad MSD, Agilent) coupled to a headspace solid-phase microextraction system (Gerstel, Kortrijk, Belgium).
  • a CAR/PDMS 85 mm SPME fiber (Supelco, Bellefonte, PA, USA) and a DB-WAXetr column (30 m ⁇ 0.25 mm ⁇ 0.25 ⁇ m, Agilent Technology) were used.
  • the oven temperature conditions were 80 °C for 2 min, 10 °C/min to 100 °C, 2 °C/min to 150 °C, and 20 °C/min to 220 °C, and held for 2 min.
  • a splitless mode was selected, and helium was used as a carrier gas and injected at a constant flow rate of 1 mL/min.
  • MS was performed in electron ionization mode with an ionization voltage of 70 eV.
  • the scan range was set to 40-200 m/z, the scan speed to 0.2 s/scan, and the electron energy to 70 eV.
  • Multiple reaction monitoring (MRM) mode was used, and parameter switching for SCFA was applied.
  • Each peak area was quantified and normalized to the internal standard area.
  • a linear regression equation for each compound was calculated from the calibration curve for peak area versus compound concentration ( ⁇ M).
  • the results of quantitative analysis of SCFA (short chain fatty acid) from the animal models classified into groups 1 to 5 are shown in Table 4 below.
  • the experimental results were expressed as mean ⁇ standard error of mean (Mean ⁇ Standard Error of Mean), and the statistical significance of the experimental results was verified by one-way ANOVA by Tukey's post hoc test, and the p-value was 0.05.
  • the following cases were determined to be significant and marked with different letters (a and b).
  • Animal models divided into 5 groups were prepared in the same way as in Experimental Example 4, and intestinal microflora, ⁇ -glucuronidase activity and intestinal permeability were analyzed at 12 weeks. Through this, we tried to analyze the effect of gellan gum on the intestinal microflora and barrier function in an animal model induced by a high-fat diet.
  • Group 1 (ND, negative control group): intake of normal diet, oral administration of distilled water
  • Group 2 intake of high-fat diet, oral administration of distilled water
  • Group 3 (PC or FOS): intake of high-fat diet, oral administration of fructooligosaccharide 40 mg/kg
  • Group 4 intake of high-fat diet, oral administration of 10 mg/kg of gellan gum in Example 1
  • Group 5 intake of high-fat diet, oral administration of 40 mg/kg of gellan gum in Example 1
  • ⁇ -glucuronidase activity and MPO Myeloperoxidase activity were evaluated by Lee et al (Lee, H.-B., Oh, M.-J., Do, M. H., Kim, Y.-S., & Park, H.- Y. (2020). Molokhia leaf extract prevents gut inflammation and obesity.Journal of Ethnopharmacology, 257, 112866. https://doi.org/doi:10.1016/j.jep.2020.112866) was analyzed with reference to the method described. ⁇ -glucuronidase activity was analyzed through the release rate of p-nitrophenol. Enzyme activity was analyzed using a microplate reader at 550 nm and calculated using a standard curve of p-nitrophenol.
  • MPO activity was determined by homogenizing 50 mg clone sections in 50 mM sodium phosphate buffer containing 0.5% hexadecyltrimethyl ammonium bromide, then freezing and thawing the homogenate three times, followed by 12,000 ⁇ g, 5 min, 4 ° C. conditions were centrifuged. After recovering 100 ⁇ L of the supernatant, 400 ⁇ L of 50 mM sodium phosphate buffer containing 0.129 mg/mL O-dianisidine and 0.0005% H 2 O 2 was mixed therein, and analyzed using a microplate reader at 492 nm. /mg protein was confirmed.
  • FITC-dextran 500 mg/kg was orally administered after each group was starved for 6 hours at 12 weeks, and blood was collected from the tail vein 2 and 5 hours later. Plasma was separated from each of the collected blood by centrifugation, and a standard solution was prepared using serial dilution of FITC-dextran in untreated plasma. Fluorescence levels of the plasma were measured at 485/535 nm (excitation/emission) using a microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
  • the HFD group confirmed that the intestinal microbial richness (OUTs), diversity index (shannon), and homogeneity index (simpson) all decreased, which was somewhat reduced through the administration of gellan gum (GG10, GG40). recovery can be confirmed.
  • FIG. 55 is a plot showing the relative abundance of intestinal microflora in animal models classified into groups 1 to 5.
  • the significant changes in microorganisms in the HFD group were Desulfovibrionales, Deferribacterales, and Clostridiales, which increased significantly, and Bacteroidales and Lactobacillales. It can be seen that there is a significant decrease in It can be confirmed that gellan gum treatment promotes the growth of Bacteroidales and Lactobacillales, and greatly suppresses the increase of Desulfovibrionales, Deferribacterales, and Clostridiales.
  • FIG. 56A is a graph of plasma FITC-dextran concentration over time in animal models classified into groups 1 to 5, and FIG. 56B is a graph of plasma FITC-dextran concentration (Area Under the Curve) (AUC) for the graph (FIG. 56A). This is a graph showing measurements.
  • the concentration of FITC-dextran was significantly increased in the HFD group.
  • the concentration of FITC-dextran was significantly decreased. In other words, it can be seen that the weakening of the barrier function induced by the high-fat diet is restored by gellan gum.
  • Figure 57A is a graph showing the measurement of ⁇ -glucuronidase activity in animal models classified into groups 1 to 5
  • Fig. 57B is a graph showing the measurement of myeloperoxidase activity in animal models classified into groups 1 to 5.
  • FIG. 58A is a graph showing TNF- ⁇ mRNA expression levels in animal models classified into groups 1 to 5
  • FIG. 58B is a graph showing IL-1 ⁇ mRNA expression levels in animal models classified into groups 1 to 5.
  • ⁇ -glucuronidase activity As shown in FIG. 57, ⁇ -glucuronidase activity, MPO activity, and inflammatory cytokine expression increased in the HFD group (FIG. 3D, E). GG treatment dramatically restored intestinal inflammation and enzyme activity.
  • 59 is a heatmap showing the correlation between the intestinal microflora and metabolic parameters, and the color scale is the Pearson correlation coefficient from blue (negative correlation) to red (positive correlation). mean, and the metabolite type is indicated by the color bar on the right. Significant correlations were analyzed using a two-tailed unpaired Student t-test. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001
  • NAFLD non-alcoholic fatty liver disease
  • a powder is prepared by mixing the above ingredients and filling them in an airtight bag.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional tablet manufacturing method.
  • Capsules are prepared by mixing the above ingredients and filling them into gelatin capsules according to a conventional capsule preparation method.
  • each component is dissolved in purified water, lemon flavor is added in an appropriate amount, the above components are mixed, and then purified water is added to adjust the total amount to 100g, and then filled into a brown bottle to be sterilized. to prepare a liquid.
  • Vitamin A Acetate 70 ⁇ g
  • Vitamin B6 0.5 mg
  • Vitamin B12 0.2 ⁇ g
  • composition ratio of the above vitamin and mineral mixture was prepared by mixing ingredients suitable for granules in a preferred embodiment, the mixing ratio may be arbitrarily modified, and after mixing the above ingredients according to a conventional granule manufacturing method, It can be prepared and used for preparing a health functional food composition according to a conventional method.
  • the resulting solution is filtered and collected in a sterilized 2 L container, sealed and sterilized, and then refrigerated. It is used for preparing the functional beverage composition of the present invention.
  • composition ratio is a mixture of ingredients suitable for a relatively favorite beverage in a preferred embodiment
  • the mixing ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as the class of demand, the country of demand, and the purpose of use.

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Abstract

본 발명은 장내 균총을 개선하고, 대사성 질환을 개선, 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것으로, 젤란검을 유효성분으로 함유함으로써 장내 유익균의 증식을 촉진하고, 체중과 체지방의 증가를 감소시키며, 혈청 내 엔도톡신, 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤을 감소시키고, 간 조직 내에서의 간 손상 지표, 간 염증 기표의 발현을 억제하는 조성물에 관한 것이다.

Description

젤란검을 유효성분으로 하는 장내 균총 개선용 조성물 및 이를 포함하는 대사성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 젤란검을 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것으로, 젤란검을 유효성분으로 함유함으로써, 장내 균총을 개선하는 프리바이오틱 조성물과 대사성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현대사회는 서구화된 식단으로 인해 지질 및 당질대사 이상에 의한 비만, 당뇨병, 고지혈증, 비알코올성 지방간, 이상지질혈증 등 대사질환의 발병이 급속하게 증가하였다. 특히 장관 기능과 관련된 질환의 발병이 점차 증가하고 있는 추세이다. 인체의 장관은 음식물의 소화, 흡수, 배설이라는 기본적인 기능 이외에 장관 점막이 관내 미생물이나 이들의 부산물, 항원, 독소 등의 혈류로의 유입을 차단하는 방어벽으로서의 면역학적 기능을 수행하는 중요한 기관이다.
장 건강에 있어서, 장관 내에 존재하는 장내 균총 환경은 매우 중요하다. 장내에는 400여종 이상의 세균이 대장 내용물 g당 100조 정도의 숫자로 서식하고 있다. 장내 균총은 유익균과 유해균으로 나뉘는데, 이러한 장내 균총의 균형이 망가지면, 병원성균에 의한 장 감염이 일어나며, 장의 염증이 발생하여 장내 투과성이 증가되면서 장누수 증후군을 유발하게 된다. 장누수 상황에서 점막세포를 지나 세균항원이나 세균 부산물 및 내독소 등의 이물질들이 체내로 들어오면 염증반응을 일으키게 되어, 인슐린 저항성이 높아지고, 간기능이 저하되어 탄수화물을 과도하게 섭취하지 않더라도 지방이 축적되는 염증성 비만이 야기되게 된다.
상기 비만은 과다하게 체지방이 축적된 상태를 말한다. 현재 사용되고 있는 비만 치료제의 약리기전은 크게 1) 지방흡수 억제, 2) 지방 분해 및 열 발생 촉진, 3) 식욕 및 포만감의 조절, 4) 단백질 대사 저해 그리고 5)　음식물의 섭취와 관련된 정서 조절 등으로 나눌 수 있다. 대표적인 비만 치료제로는 지방 흡수를 억제하는 제니칼™ (Xenical™), 교감신경계를 자극하여 식욕을 억제하는 리덕틸™(Reductil™)을 들 수 있다. 상기 비만 치료제는 일시적 체중감소, 신속한 체중손실, 약물들에 의한 심장, 혈압, 신경계에 대해 부작용을 일으키는 것으로 보고된 바 있다.
상기 당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 발생하는 질병으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당 및 소변으로 포도당이 배출되는 증상을 특징으로 한다. 현재 사용되고 있는 당뇨병 치료제로는 PPAR-γ 활성제, GLP-1 유도체, DPP-IV 저해제 등이 있으나, 이러한 종래의 약제들은 체중 증가 및 간, 신장, 근육, 심장 등에 독성을 나타내는 부작용이 있는 것으로 보고되고 있다.
상기 고지혈증은 필요 이상으로 많은 지방 성분 물질이 혈액 내에 존재하면서 혈관 벽에 쌓여 염증을 일으키고, 그 결과 심근경색, 뇌졸중이나 뇌경색 등과 같은 심혈관계 질환을 일으키는 원인이 되는 질병으로 알려져 있다. 현재 사용되고 있는 고지혈증 치료제로는 HMG-CoA 환원효소 억제활성을 갖는 '스타틴' 계열의 약물이 있으나, 이는 장기간 사용할 경우 간이나 근육 등에 독성을 나타내는 부작용이 있는 것으로 보고되고 있다.
상기 이상지질혈증은 혈중 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 또는 중성 지방이 증가된 상태, 또는 HDL 콜레스테롤이 감소된 상태를 의미하는 것으로, 심장마비, 뇌졸중 등 심혈관계 질환의 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 현재 이상지질혈증의 치료제로 이용될 수 있는 약물은 MTP(microsomal triglyceride transfer protein)의 활성을 억제시키는 약물인 Bayer 사의 BAY13-9952(implitapide) 등이 있으나, 이러한 약물은 세포 내에서의 작용 기작이 구체적으로 규명되어 있지 않아 부작용을 유발할 가능성이 있다는 문제가 있다.
현재 장내 유해균의 생육을 억제하는 프리바이오틱과 대사성 질환에 대한 탁월한 치료제의 개발이 미비한 상태이고, 치료효과가 미비하거나 부작용이 존재하는 것으로 보고된 바 있으므로, 본 발명자들은 천연물로부터 새로운 프리바이오틱, 대사성 질환 치료 약물을 개발하고자 예의 노력하였고, 그 결과 젤란검(gellan gum)이 장내 유익균의 증식을 촉진하고 장내 유해균의 생육을 억제하는 활성을 가지면서 고지방식이 섭취 동물모델에서 체징방 감소, 체중 감소, 혈중 지질 감소 등의 효과를 갖는 것을 확인함으로서, 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 공개특허공보 제10-2020-0109175호
(특허문헌 2) 대한민국 등록특허공보 제10-0673068호
본 발명의 목적은 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 하는 프리바이오틱 또는 장 건강 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 젤란검을 유효성분으로 하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한 본 발명은 장내 균총 개선, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한 젤란검을 유효성분으로 포함하는 조성물의 치료 용도(for use in therapy)를 제공한다.
또한 본 발명은 장 건강이 약화되거나, 대사성 질환 환자에게 젤란검을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대사성 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 하는 프리바이오틱 또는 장 건강 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 프리바이오틱 조성물은 장내 유해균 대비 장내 유익균을 상대적으로 증식시키는 프리바이오틱 활성을 가지며, 상기 장내 유익균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 상기 장내 유해균은 대장균일 수 있다.
상기 젤란검은 로우 아실 젤란검(low acyl gellan gum)일 수 있다.
상기 조성물은, 젤란검(gellan gum)을 5 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 대사성 질환(metabolic disease) 개선 또는 예방용일 수 있다.
상기 조성물은 체중과 체지방 증가를 억제하고, 혈중 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤 증가를 낮추며, 혈중 엔도톡신 농도를 감소시킬 수 있다.
상기 조성물은 간 조직에서 간 손상 지표인 TLR4(tall-like receptor 4), ALT(alanine aminotransferase) 및 AST(aspartate aminotransferase) 효소 활성을 감소시키고, ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP1-C(Sterol response element binding protein), CD36(Cluster of differentiation-36) 및 ChREBP(carbohydrate response element binding protein)의 발현을 억제할 수 있다.
상기 조성물은 간 조직에서, 염증에 관여하는 사이토카인인 IL6(interleukin-6)과 TNF-α(tumor necrosis factor α)의 발현을 억제하고, 대식세포유인 단백질인 MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
상기 대사성 질환은 이상지질혈증, 비알코올성 지방간, 인슐린 저항성 증후군, 당뇨 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 젤란검을 유효성분으로 하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 젤란검은 로우 아실 젤란검(low acyl gellan gum)일 수 있다.
상기 대사성 질환은 이상지질혈증, 비알코올성 지방간, 인슐린 저항성 증후군, 당뇨 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 하는 프리바이오틱 또는 장 건간 개선용 식품 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 함유하는 프리바이오틱 조성물; 장내 균총 개선용 조성물 및 장 건강 개선용 조성물일 수 있다.
또한 본 발명은 장내 균총 개선을 통해 프리바이오틱 또는 장 건간 개선용 식품 조성물 제조를 위한 젤란검의 신규 용도를 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 함유함으로써 장내 유해균 대비 장내 유익균의 증진을 촉진하는 프리바이오틱 활성을 갖고, 장내 균총 개선 효과를 가지며, 장 건강과 장 기능을 개선하는 효과를 갖는다.
상기 젤란검(gellan gum)은 포도당, 글루콘산, 람노스가 규칙적으로 반복된 곧은 사슬 모양의 다당류로, 제품으로 출시되고 있고, 이의 제조방법도 잘 알려져 있다. 예컨대 젤란검은 엘로데아속의 수초로부터 분리된 슈도모나스 엘로데아(Pseudomonas elodea)를 사용하여 탄수화물을 순수배양 발효시켜서 얻은 고분자 다당류 검물질을 정제·건조·분쇄하여 얻은 것일 수 있다. 상기 젤란검은 아실기가 제거된 타입 및 아실기가 결합된 것일 수 있으나, 그 종류를 제한하지 않고 사용 가능하다.
젤란검의 아세틸화 정도에 따라 젤란검의 젤 성질이 달라지는데, 바람직하게 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 로우 아실 젤란검(low acyl gellan gum)을 사용하였으며, 분자량이 2 × 105 내지 3 × 105인 것을 사용하였다. 로우 아실 젤란검은 주쇄에 2개의 글루코오스, 1개의 글루쿠론산, 1개의 람노오스의 4당이 결합되어 있는 다당류이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022006863-appb-img-000001
상기 화학식 1에서 R1 및 R2은 서로 상이하거나 동일하고, 각각 독립적으로 수소 원자, 글리세릴기, 아세틸기 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, n은 2 이상의 정수이다.
다만, 상기 R1이 글리세릴기이면, R2는 아세틸기일 수 있고, 상기 아세틸기 및 글리세릴기의 함유량은 전체 50% 이하, 바람직하게는 7.5% 이하일 수 있다.
상기 젤란검은 로우 아실 젤란검을 사용하는 것이, 장내 락토바실러스 유익균 증식 효능을 위해서 가장 바람직하다.
본 발명에서 'Prebiotic' 또는 '프리바이오틱' 이란, 체내에서 잘 소화되지 않는 식품 구성성분으로, 위장관 상부에서 가수분해나 흡수가 이루어지지 않으면서, 제한된 특정 공생박테리아의 생육 또는 활성에 자극을 주어 장내 균총을 숙주의 건강에 유익한 방향으로 유도하는 물질이다. 구체적으로 장내 유해균 대비 장내 유익균의 증식을 촉진하는 물질을 의미한다. 구체적으로 상기 프리바이오틱스 조성물은 장내 미생물 또는 균총 개선용 조성물이라고도 할 수 있다. 이는 프로바이오틱스의 효능을 증감시키고 장건강을 개선하거나 장기능을 개선하는 효과를 갖는다.
본 발명에서 '장내 미생물 개선' 또는 '장내 균총 개선'이란 장내 유익균의 생장은 촉진하고 장내 유해균의 생장은 억제하되, 장내 유익균과 유해균의 균형을 유지하는 것을 의미한다.
본 발명에서 '장 건강' 또는 '장 기능'의 개선이란 장내 유익균 및 유해균의 균총을 조절하여 장내 환경을 정상으로 유지할 수 있는 작용을 의미하며 이는 장내 유익균의 균총을 증진시키고 유해균의 균총을 억제할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 장의 밀착연접 장벽 기능을 강화시켜 장의 전반적인 기능을 개선 및 활성화 시킬 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 '장내 유익균'이란 숙주의 장내에 존재하던 유익균 및 섭취되어 장에 도달하였을 때 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 의미한다. 이들은 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하며, 장관 내에서 유용한 효과를 나타내고, 독성이 없으며 비병원성인 조건을 만족하는 균을 의미한다. 즉, 프로바이오틱스(probiotics)로 이해될 수 있다.
상기 장내 유익균으로는 락토바실러스 속, 락토코쿠스 속, 비피도박테리움 속 및 박테로이데스 속 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF14, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440, 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)일 수 있다.
본 발명의 유효성분인 젤란검(gellan gum)은 장내 유해균 대비 장내 유익균을 상대적으로 증식시키는 프리바이오틱 활성을 가지며, 여기서 상기 장내 유익균은 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 상기 장내 유해균은 대장균일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 유효성분인 젤란검(gellan gum)은 종래 프락토 올리고당(FOS)보다 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF14, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440, 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)에 대해 현저히 높은 프리바이오틱 활성을 가지고 있으므로, 상기 장내 유익균으로 상기 6종의 균주를 포함하는 것이 가장 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명의 유효성분인 젤란검(gellan gum)은, 실제 생체 내에서도 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum)과 비피도박테리움 피비덤(Bifidobacterium. bifidum)과 같은 프로바이오틱 균주의 생육을 증가시키는 것을 확인할 수 있다.
후술하는 실험예를 통해, 본 발명의 유효성분인 젤란검(gellan gum)은 장 건강을 개선하거나 장 기능을 개선하는 효과를 갖는 것으로 알려진 다양한 장내 유익균의 생장을 장내 유해균 대비 현저히 촉진시키는 것을 확인한 바, 프리바이오틱 활성과 함께 장 건강 또는 장 기능 개선, 억제 또는 예방, 장내 균총 개선 효과를 달성하고 있다고 할 수 있다.
본 발명의 젤란검(gellan gum)은, 앞서 살펴본 바와 같이 유익균의 생장을 촉진하며, 유익균에 의해 소비되어 대사산물로 단쇄지방산(SCFA)을 생성함으로써, 유해균의 생장은 억제하고, 장 건강은 현저히 촉진한다. 젤란검(gellan gum)은 상기 유익균을 제외한 대부분의 비프로바이오틱(non-probiotic) 균주의 생장에는 별로 기여하지 않거나, 거의 영향을 미치지 않으므로, 젤란검(gellan gum)은 유익균에 대하여 선택적 성장 촉진효과를 갖는다는 것을 알 수 있고, 이외에 비프로바이오틱스 균에 대해서는 미미한 정도의 프리바이오틱 특성을 나타내는 바, 원하는 유익균의 생장에만 영향을 미치므로, 장내 균총 조절에 적절할 뿐만 아니라 목적하지 않는 2차적 효과를 방지할 수 있다는 점에서 유리한 효과를 갖는다.
본 발명의 유효성분인 젤란검(gellan gum)은 유익균에 의해 분해되어, 배양 환경의 pH를 약산성화함으로써, 유해균의 생장을 저해하는데 영향을 미친다는 것을 확인하였다.
본 발명의 유효성분인 젤란검(gellan gum)은, 다른 변성전분들과는 전혀 상이한 프리바이오틱 속 균주, 종 균주의 성장 특성을 나타내며, 젤란검(gellan gum)이 다른 변성전분에 비해 현저히 우수한 프리바이오틱 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서 '유효성분으로 하는' 또는 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 젤란검(gellan gum)의 프리바이오틱 활성 특히, 장내 유익균 증식 촉진 효능을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 조성물은, 젤란검(gellan gum)을 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 5 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 5 mg/ml 내지 100 mg/ml, 보다 더욱 바람직하게는 40 mg/ml 내지 100 mg/ml 포함할 수 있다. 상기 젤란검은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 젤란검의 양적 상한 및 하한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강기능식품(health function food), 식품 첨가제(food additives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 '식품 조성물'에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 젤란검(gellan gum)을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미의 건강기능식품 또는 건강보조식품을 모두 포함한다.
본 발명 식품 조성물에서 상기 젤란검(gellan gum)은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물에서 젤란검(gellan gum)의 첨가량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 상기 젤란검(gellan gum)을 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%로 포함하는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 젤란검(gellan gum) 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 젤란검(gellan gum) 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 하는 프리바이오틱 조성물, 장내 균총 개선용 조성물, 장건강 또는 장기능의 개선, 억제 또는 예방용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 젤란검(gellan gum)을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 젤란검(gellan gum)의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
한편 상기 젤란검을 유효성분으로 하는 식품 조성물은 단독으로 "프리바이오틱 활성에 도움을 주는 건강기능식품" 또는 "장내 균총 개선에 도움을 주는 건강기능식품"으로 이용될 수 있고, 또는 "장 건강 개선에 도움을 주는 건강기능식품"으로 이용될 수 있다.
상기 '건강기능식품'은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 법적 기준에 따라 제조(가공을 포함)한 식품(건강기능식품에 관한 법률 제3조 제1호)을 말한다. 상기 '건강기능식품'은 국가마다 용어나 범위에 차이가 있을 수 있으나, 미국의 '식이 보충제(Dietary Supplement)', 유럽의 '식품 보충제(Food Supplemnet)', 일본의 '보건기능식품' 또는 '특정보건용식품(Food for Special Health Use, FoSHU)', 중국의 '보건식품' 등에 해당할 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 '식품첨가물공전'의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 따른다.
또한 상기 건강기능식품에는 상기 젤란검과 함께 "프리바이오틱 활성에 도움을 주는 건강기능식품" 또는 "장내 균총 개선에 도움을 주는 건강기능식품"으로 이용될 수 있고, 또는 "장 건강 개선에 도움을 주는 건강기능식품"에 사용되는 '기능성 원료'로 고시된 원료 또는 개별인정된 원료로서, 구아검, 구아검가수분해물, 대두식이섬유, 밀식이섬유, 아라비아검, 이눌린, 프락토올리고당, 글루코만난, 라피노스, 알로에겔, 분말한천, 알로에전잎 등의 프리바이오틱 활성, 장내 균총 개선 또는 장 건강 개선과 관련된 건강기능식품 소재를 복합하여 사용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 대사성 질환의 개선 또는 예방용일 수 있다. 구체적으로 상기 식품 조성물은 젤란검을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물일 수 있다.
본 발명에서 '대사성 질환'이란, 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환으로, 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 동맥경화증, 관상동맥증, 비알코올성지방간 등과 같은 여러가지 질환이 복합적으로 발생되는 질환 및 이로 인한 합병증을 총칭하며, 이로 인한 합병증으로는 당뇨병성 합병증인 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 족부병증, 당뇨병성 신경병증 등, 심혈관계 질환인 고지혈증, 뇌졸중, 협심증, 심근경색증, 말초혈관질환 등이 있으나, 대사성 질환으로 인하여 발생되는 모든 질환이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 대사성 질환은 이상지질혈증, 비알코올성 지방간, 인슐린 저항성 증후군, 당뇨 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 '이상지질혈증'은 고지혈증(hyperlipidemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesteronemia) 및 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 '지방간(fatty liver)'은 간의 지방대사 장애로 지방이 간세포에 과도한 양으로 축적되는 상태 또는 질환을 의미하며, 구체적으로 비알코올성 지방간일 수 있다.
본 발명에서 '고지혈증'은 혈액 중에 지방 성분, 특히 콜레스테롤(cholesterol) 또는 중성 지방(triglyceride)의 농도가 정상 수치에 비해 높은 상태 또는 질환을 의미하며, 혈액 중의 지질 농도를 저하시키는 것이 요구되는 모든 상태를 포함하는 광범위한 의미로 사용된다.
본 발명에서 '고콜레스테롤혈증'은 혈액 내 콜레스테롤이 과도하게 높은 상태 또는 질환을 의미하고, 고중성지방혈증은 혈액 내 중성지방의 농도가 과도하게 높은 상태 또는 질환을 의미한다.
본 발명에서 '인슐린 저항성 증후군'은 혈당을 낮추는 인슐린의 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하여 발생하는 질환을 총칭하는 개념이다. 인슐린 저항성이 높을 경우, 인체는 너무 많은 인슐린을 만들어 내고 이를 원인으로 하여 다양한 질환이 발생할 수 있는 상태를 의미할 수 있으며, 관련 질환으로는 인슐린 작용에 대한 세포의 저항성, 고인슐린혈증, 초저밀도지단백(very low density lipoprotein, VLDL)과 중성지방의 증가, 고밀도지단백(high density lipoprotein, HDL)의 감소 및 고혈압 등을 특징으로 하는 질환을 의미하며, 심혈관질환과 제2형 당뇨병의 위험인자로 인식되고 있는 개념이다(Diabetes, 37:1595-607(1988)). 또한 인슐린 저항성은 고혈압, 당뇨, 흡연 등의 위험인자들과 함께 세포 내 산화스트레스를 증가시키고 신호전달체계를 변화시켜 염증반응을 유발하여 죽상경화증을 진행시킨다고 알려져 있다(Biology of disease. 47:412-26(1982); Pathophysiological concentrations of glucose promote oxidative modification of low density lipoprotein by a superoxide-dependent pathway. 94:771-8(1994)).
상술한 인슐린 저항성 증후군 치료는, 인슐린 저항성 상태에서 인슐린이 체내에서 제대로 기능을 수행할 수 있도록 만들어주는 것을 말한다. 이러한 의미에서, 인슐린 저항성 증후군의 치료는 인슐린 저항성 개선, 인슐린 저항성 조절, 인슐린 감수성 항진, 인슐린 감수성 조절 등으로 사용될 수 있고, 인슐린 저항성 상태에서 벗어날 수 있는 작용에 해당하는 의미라면 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명에서 '당뇨'는 포도당-비관용(intolerance)를 초래하는 인슐인의 상대적 또는 절대적 부족으로 특징되는 만성질환을 의미한다. '당뇨'는 모든 종류의 당뇨병을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨 및 유전성 당뇨를 포함한다. 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨병으로서, β-세포의 파괴에 의해 주로 초래된다. 제2형 당뇨는 인슐린 비의존성 당뇨병으로서, 식사 후 불충분한 인슐린 분비에 의해 초래되거나 또는 인슐린 내성에 의해 초래된다.
본 발명에서 '비만'은 단순히 체중이 많이 나가는 것이 아니라 체지방이 과도하게 축적된 상태를 말한다. 특히 본 발명에서는 장누수 증후군에 의한 염증성 비만일 수 있다. 즉, 탄수화물을 과도하게 섭취하지 않더라도 장누수 증후군에 의한 간기능 저하와 지속적인 염증반응으로 인한 체중 또는 체지방 비율이 증가하는 것일 수 있다. 보통 비만을 판정하는 방법은 체질량지수(BMI)를 이용하게 되는데 23~24.9인 경우에 과체중, 25~29.9까지를 경도비만으로 판정하며, 30~34.9는 중등도비만, 35 이상일 경우는 고도비만으로 판정하고 있다. 비만은 한가지 원인보다는 여러 원인이 복합적으로 작용하여 발생하는데, 서구화된 식습관을 포함하여 잘못된 식습관과 활동량 감소, 정서적 요인, 유전적 요인 등을 들 수 있으며 이렇게 발생한 비만은 결국 고지혈증, 당뇨병, 고혈압 등 만성질환의 발생 위험을 높이게 된다.
상기 대사성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 상기 다양한 원인에 의해 체중 또는 체지방이 증가되는 것을, 개선, 예방, 완화, 억제 및 치료하는 조성물이라고도 할 수 있다. 보다 바람직하게 고지방 식이에 의해 유발된 대사성 질환을 개선, 예방, 치료하는 효과를 갖는 것이며, 보다 더 바람직하게는 고지방 식이에 의해 유발된 장누수 증후군에 의한 염증성 비만 또는 대사성 질환을 개선, 예방, 치료하는 효과를 갖는 것이라고도 할 수 있다.
본 발명의 실험결과에 의하면, 고지방 식이를 단기간 또는 장기간 투여하였을 때, 체중과 체지방이 유의하게 증가하였다. 이는 시간이 경과함에 따라 체중과 체지방 및 백색 부고환 지방 무게를 증가시키며, 혈중 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤뿐만 아니라 엔도톡신의 농도를 증가시키며, 간 손상 지표(트리글리세라이드, TLR4, ALT, AST, ACC, FAS, SREBP1, ChREBP)와 간 염증 지표(IL6, TNF-α, CD36 및 MCP1)의 발현을 촉진하여 인슐린 저항성을 증가시키고, 혈당 내성을 손상시키며 엑도톡신으로 유도된 등으로 인해 당과 인슐린 항상성 장애를 유발하고, 이는 비만 또는 대사성 질환을 유도하게 된다.
이때, 젤란검을 투여하면 체중과 체지방 및 백색 부고환 지방 무게의 증가를 감소시키고, 혈중 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 농도의 증가도 감소시키며, 혈청 내 엔도톡신 농도의 증가를 억제하여 정상수준으로 낮추는 것을 확인할 수 있다. 또한 렙틴과 인슐린 저항성을 회복시키고, 혈액내 엔도톡신 수준을 감소시키며, 장벽기능을 회복시킴과 동시에 간 지방 축적을 제지하는 것을 확인할 수 있다. 또한 간 조직 내에서의 간 손상 지표(ALT, AST, ACC, FAS, SREBP1, ChREBP)와 간 염증 지표(IL6, TNF-α 및 MCP1)의 발현을 낮추는 것을 확인할 수 있는 바, 본 발명에 따른 젤란검을 유효성분으로 하는 조성물은 대사성 질환 개선, 예방 또는 치료 효과를 가짐을 알 수 있다.
본 발명에서 '유효성분으로 하는' 또는 '유효성분으로 함유하는'이란 본 발명의 젤란검의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미하며, 구체적으로 대사성 질환을 개선, 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 조성물은, 젤란검(gellan gum)을 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 5 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 5 mg/ml 내지 100 mg/ml 포함할 수 있다. 상기 젤란검은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 젤란검의 양적 상한 및 하한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 대한 구체적인 내용은 '프리바이오틱 조성물'의 식품 조성물에서 전술한 바를 참고할 수 있으나, 대사성 질환 용도에 대한 내용을 고려하여, 하기에서 별도로 다시 설명하고자 한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강기능식품(health function food), 식품 첨가제(food additives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 '식품 조성물'에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 젤란검(gellan gum)을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미의 건강기능식품 또는 건강보조식품을 모두 포함한다.
본 발명 식품 조성물에서 상기 젤란검(gellan gum)은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물에서 젤란검(gellan gum)의 첨가량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 상기 젤란검(gellan gum)을 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%로 포함하는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 젤란검 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 무청 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 젤란검을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 개선, 억제 또는 예방용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 젤란검을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 젤란검의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
한편 상기 젤란검을 유효성분으로 하는 식품 조성물은 단독으로 "대사성 질환에 개선에 도움을 주는 건강기능식품" 또는 "비만 개선에 도움을 주는 건강기능식품"으로 이용될 수 있다.
상기 '건강기능식품'은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 법적 기준에 따라 제조(가공을 포함)한 식품(건강기능식품에 관한 법률 제3조 제1호)을 말한다. 상기 '건강기능식품'은 국가마다 용어나 범위에 차이가 있을 수 있으나, 미국의 '식이 보충제(Dietary Supplement)', 유럽의 '식품 보충제(Food Supplemnet)', 일본의 '보건기능식품' 또는 '특정보건용식품(Food for Special Health Use, FoSHU)', 중국의 '보건식품' 등에 해당할 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 '식품첨가물공전'의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 따른다.
또한 상기 건강기능식품에는 상기 젤란검과 함께 "대사성 질환 개선에 도움을 주는 건강기능식품" 또는 "비만 개선에 도움을 주는 건강기능식품"으로 이용될 수 있고, 이에 사용되는 '기능성 원료'로 고시된 원료 또는 개별인정된 원료로서, 가르시니아캄보지아 추출물, 공액리놀레산, 녹차추출물, 키토산, 구아검, 구아바잎 추출물, 이눌린, 바나바잎 추출물, EPA 및 DHA 함유 유지, 난소화성말토덱스트린 등의 대사성 질환과 관련된 건강기능식품 소재를 복합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 젤란검을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한 젤란검을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 동물용 약학 조성물; 젤란검을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물; 또는 젤란검을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 사료 첨가제; 또는 젤란검을 인간, 또는 인간을 제외한 포유동물에 적용하는 것을 함유하는 대사성 질환 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 젤란검을 유효성분으로 함유하는 조성물의 치료 용도(for use in therapy)를 제공하는데 있다.
또한 본 발명은 대사성 질환 치료용 의약, 또는 동물용 의약 제조를 위한 젤란검의 신규 용도를 제공한다.
본 발명에서 젤란검에 대한 구체적인 내용은 '식품 조성물'의 젤란검에서 전술한 바를 참고할 수 있다. 상기 조성물은 체중과 체지방 증가를 억제하고, 혈중 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤 증가를 낮추며, 혈중 엔도톡신 농도를 감소시킬 수 있다. 상기 조성물은 간 조직에서 간 손상 지표인 ALT(alanine aminotransferase) 및 AST(aspartate aminotransferase) 효소 활성을 감소시키고, ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP1-C(Sterol response element binding protein) 및 ChREBP(carbohydrate response element binding protein)의 발현을 억제할 수 있다. 상기 조성물은 간 조직에서, 염증에 관여하는 사이토카인인 IL6(interleukin-6)과 TNF-α(tumor necrosis factor α)의 발현을 억제하고, 대식세포유인 단백질인 MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 유효성분인 젤란검 외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.0001-10 g/㎏이며, 보다 바람직하게는 0.001 g/kg 내지 1 g/kg, 보다 더 바람직하게는 0.004 g/kg 내지 0.1 g/kg의 용량으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 대사성 질환의 개선, 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 젤란검의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 젤란검은 대사성 질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 젤란검을 투여하는 것을 포함하는 대사성 질환의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 발명에서 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 비만정도, 체중, 체지방, 혈청 내 중성지방 및 엔도톡신 농도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 젤란검을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.0001 g/㎏ 내지 10 g/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.001 g/kg 내지 10 g/kg, 보다 더 바람직하게는 0.004 g/kg 내지 0.1 g/kg의 용량으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 치료방법에서 젤란검을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있고, 바람직하는 경구 내에 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 젤란검을 유효성분으로 함유하며, 생체 외에서(in vitro) 간 조직의 ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate aminotransferase), ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP1-C(Sterol response element binding protein), ChREBP(carbohydrate response element binding protein), IL6(interleukin-6), TNF-α(tumor necrosis factor α) 및 MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 억제용 시약조성물을 제공한다.
보다 바람직하게는 생체 외에서(in vitro) 간 조직의 트리글리세라이드, TLR4(tall-like receptor 4), ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate aminotransferase), ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP1-C(Sterol response element binding protein), CD36(Cluster of differentiation-36), ChREBP(carbohydrate response element binding protein), IL6(interleukin-6), TNF-α(tumor necrosis factor α) 및 MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)를 포함하는 이들 모두의 발현을 한번에 억제하는 것일 수 있다.
상기 시약조성물은 생체 외에서 간 세포의 트리글리세라이드, TLR4(tall-like receptor 4), ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate aminotransferase), ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP1-C(Sterol response element binding protein), CD36(Cluster of differentiation-36), ChREBP(carbohydrate response element binding protein), IL6(interleukin-6), TNF-α(tumor necrosis factor α) 및 MCP1(monocyte chemoattractant protein-1) 중에서 어느 하나 이상 또는 이들 모두의 발현을 제어할 수 있는 조성물로 사용할 수 있으며, 특히 생체 외에서 상기 간 세포의 트리글리세라이드, TLR4(tall-like receptor 4), ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate aminotransferase), ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP1-C(Sterol response element binding protein), CD36(Cluster of differentiation-36), ChREBP(carbohydrate response element binding protein), IL6(interleukin-6), TNF-α(tumor necrosis factor α) 및 MCP1(monocyte chemoattractant protein-1) 중에서 어느 하나 이상 또는 이들 모두의 발현을 억제하는 배지조성물로 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 젤란검을 유효성분으로 하는 장질환, 예컨대 염증성 장질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물 또는 장질환의 개선 및 예방을 위한 식품 조성물로 제공될 수 있다.
상기 염증성 장 질환은 특발성 질환으로 소화기관에 만성 및 재발성 염증과 장 점막 조직에 손상이 유발되는 질환을 지칭한다. 예를 들어, 상기 장 질환은 크론병(Crohn's disease, CD), 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC), 기타 원인이 명확히 밝혀지지 않았지만 유전적 소견, 면역과 환경적 요인 및 일부 미생물(병원균)에 의해 발병하는 질환을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물로, 유효성분인 젤란검(gellan gum) 외에 약학으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약학으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.0001 g/㎏ 내지 10 g/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.001 g/kg 내지 10 g/kg, 보다 더 바람직하게는 0.004 g/kg 내지 0.1 g/kg의 용량으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 젤란검(gellan gum)을 투여하는 것을 포함하는 장 건강 또는 염증성 장질환 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 장건강 정도 또는 염증성 장질환 정도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 젤란검(gellan gum)을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.0001 g/㎏ 내지 10 g/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.001 g/kg 내지 10 g/kg, 보다 더 바람직하게는 0.004 g/kg 내지 0.1 g/kg의 용량으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 치료방법에서 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 장내 미생물 개선용 또는 프리바이오틱 조성물은 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 포함하는 것으로써, 장내 유익균은 증식시키고 장내 유해균의 생육은 억제시켜, 장내 환경을 개선함으로써, 장내 균총의 균형을 유지할 수 있다.
또한 본 발명의 유효성분인 젤란검은 고지방식이 동물모델의 체중과 체지방 증가를 억제하며, 혈청 내 엔도톡신, 총 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤 농도를 낮추고, 간 손상 지표인 ALT, AST 효소 활성을 억제하고, 트리글리세라이드, TLR4, ACC, FAS, SREBP1, ChREBP의 발현을 억제하며, 간 염증 지표인 IL6, TNF-α, CD36 및 MCP-1 발현을 억제하는 효과를 가지므로, 비만을 포함하는 대사성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus) MG316에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) KCTC3421에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis)에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus)에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG989에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 락티플랜티바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) MG316에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) MG729에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) MG723에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 젤란검 처리에 따른 락티플랜티바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) MG316의 배양배지에 대한 대사산물 분석결과이다.
도 17은 젤란검 처리에 따른 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140의 배양배지에 대한 대사산물 분석결과이다.
도 18은 젤란검 처리에 따른 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) MG723의 배양배지에 대한 대사산물 분석결과이다.
도 19는 젤란검 처리에 따른 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731의 배양배지에 대한 대사산물 분석결과이다.
도 20은 정상군(NC), 고지방식이군(HF 또는 HFD), 양성대조군(FOS) 및 실험군(GG10, GG40)의 분변으로부터 장내 유익균 증식효능을 분석한 결과이다.
도 21은 체성분분석기를 이용하여 측정한 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 체형 사진(a)과 그래프(b)이다.
도 22는 체성분분석기를 이용하여 측정한 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 체지방량 변화(%)를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 체성분분석기는 DXA(dual-energy X-ray absorptiometry)(InAlyzer; Medikors Inc., Seongnam, Korea)를 사용하여 프로토콜대로 측정하였다. 전체 바디 스캐닝을 수행하고, 이로부터 InAlyzer software를 사용하여 체지방량을 분석하였다.
도 23은 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델로부터 백색 부고환 지방 조직을 적출하여, 백색 부고환 지방 조직의 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 무게를 나타낸 그래프이다.
도 25는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 내에서 트리글리세라이드 농도를 나타낸 그래프이다.
도 26은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 콜레스테롤 농도를 나타낸 그래프이다.
도 27은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 HDL 콜레스테롤 농도를 나타낸 그래프이다.
도 28은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 LDL 콜레스테롤 농도를 나타낸 그래프이다.
도 29는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 엔도톡신 농도를 나타낸 그래프이다.
도 30은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 ALT 농도를 나타낸 그래프이다.
도 31은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 AST 농도를 나타낸 그래프이다.
도 32는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈청 인슐린 농도를 나타낸 그래프이다.
도 33은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 HOMA-IR을 나타낸 그래프이다.
도 34는 군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈청 렙틴 농도를 나타낸 그래프이다.
도 35는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 공복 혈당을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 37은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 경구 포도당 내성 검사 결과 그래프이다.
도 37은 혈당 수치 곡선(도 36)에 대한 AUC(Area Under the Curve)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 38은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간조직에서 지질대사 관련 단백질(SREBP1, ChREBP, FAS, ACC) 발현 변화를 나타낸 웨스턴블롯 결과이다.
도 39는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 SREBP1 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 40은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 ChREBP 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 41은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 FAS 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 42는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 ACC 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 43은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 CD36 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 44는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에 대한 H&E 염색 결과이다.
도 45는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에 대한 지방증 점수 결과이다.
도 46은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에 대한 오일레드 오(Oil Red O) 염색 결과이다.
도 47은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직을 오일레드 오(Oil Red O)로 염색하였을 때, 양성염색부위(positive staining area)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 48은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간조직에서 염증 관련 사이토카인 및 대식세포유인 단백질 발현 변화를 나타낸 웨스턴블롯 결과이다.
도 49는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 IL6 발현을 나타낸 그래프이다.
도 50은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 TNF-α 발현을 나타낸 그래프이다.
도 51은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 MCP1 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 52는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 TLR4 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 53은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 IL-1β 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 54는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서의 장내 미생물총의 알파 다양성(Alpha-diversity)를 나타낸 그래프로, 시료 간의 군집 다양성 확인을 위해 Observed Operational Taxonomic Unit(Observed OTU)(A), Shannon index(B), Simpson index(C)를 이용하여 분석하였다.
도 55는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서의 장내 미생물총의 상대적 풍부도를 나타낸 플롯이다.
도 56A는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 시간에 따른 혈장 FITC-덱스트란 농도 그래프이고, 도 56B는 혈장 FITC-덱스트란 농도 그래프(도 56A)에 대한 AUC(Area Under the Curve)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 57A는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 β-glucuronidase 활성을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 57B는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 myeloperoxidase 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 58A는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 TNF-α mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이고, 도 58B는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 IL-1β mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 59는 장내 미생물총과 대사 매개변수 간의 상관관계를 나타내는 히트맵(heatmap)이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 젤란검(gellan gum)
식품첨가물 등급의 젤란검(gellan gum)(GG)은 Low acyl 젤란검(KELCOGEL®, Atlanta, GA, USA)(CP Kelco U.S. Inc)로부터 구매하여 사용하였다.
실험예 1-1. 유산균의 증식 평가
A. 균주 및 배양방법
젤란검(gellan gum, GG)의 장내 유익균 증식 효능을 평가하기 위한 방법으로 프리바이오틱 활성(prebiotic acticity score) 분석을 실시하였다. 장내 유익균로 인간 장에서 분리한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989, 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus) MG316, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) KCTC3421, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441과 김치에서 분리한 프리바이오틱스 상용화 소재인 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140 균주를 이용하였고, 이는 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다.
또한 한국인 장으로부터 분리한 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus), 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)를 장내 유익균으로 사용하였다. 장내 유해균으로는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) KCTC2441을 사용하였다.
균주를 배양하기 위해, 락토바실러스속(Lactobacillus) 균주와 락토코쿠스속(Lactococcus) 균주는 MRS 배지를 이용하여 배양하였다. 배양조건은 pH 6.5±0.2, 37 ℃에서 48시간 동안 정치 배양하였으며, 산소 요구성은 통성혐기성이고 동결건조보존 또는 세포현탁액 동결을 통해 균주를 보존하였다.
비피도박테리아속(Bifidobacteria) 균주와 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주는 5% 양의 혈액(sheep blood)과 0.05% L-시스테인(L-cysteine)이 포함된 TSA(tryptic soy agar) 배지를 사용하여, 37 ℃ 및 48-72 시간 동안 배양하였으며, 편성 혐기성균으로 혐기조건에서 배양하였다. 편성혐기성 균인 박테로이데스(Bacteroides) 균주는 BHI(Brain Heart Infusion broth) 배지로 배양하였으며, 37 ℃ 및 48-72 시간 동안 혐기배양 하였다.
B. 프리바이오틱 활성(prebiotic acticity score) 분석
프리바이오틱 활성(prebiotic acticity score) 분석을 위한 배양 배지는 MB(minimal broth)에 glucose 2 g/L, CaCl2 0.015 g/L, MgSO4 0.5 g/L를 첨가한 M9 MB를 사용하였다.
상기 각각의 유익균 및 유해균의 콜로니를 각각의 M9 MB 고체배지(agar)에 도말하고, 37 ℃ 배양기에서 24-48 시간 1 차 배양한 다음, 이를 다시 M9 MB 액체배지(broth) 10 ㎖에 접종하여 37 ℃ 배양기에서 24-48 시간 2차 배양하였다.
각각의 M9 MB 액체배지(broth)에, 상기 2차 배양한 각 균주 배양액 1%(v/v)을 넣고, 여기에 시료를 첨가한 후, 시료를 접종한 순간(0 시간)과 24-48 시간이 지난 후 마이크로 플레이트 리더기를 사용하여 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 이들 값을 아래의 식 1에 대입하여 장내 유익균 활성(prebiotic activity score) 수치를 얻었다. 시료 첨가하기 전(Before)과 첨가하고 24시간 후(After) 배양액의 pH를 pH meter(Orion star A211, Thermo Fisher Scientific)로 3회 반복 측정하고, 평균 수치를 기록하였다. 모든 실험결과는 평균값±표준편차(Mean±Standard Error)로 표시하였고, 실험결과에 대한 통계학적 유의성은 Tukey's post hoc test에 의한 일원 분산 분석으로 검증하여 p값(p-value)이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다. 데이터 분석은 IBM SPSS Statistics 20 소프트웨어(IBM Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다.
대조군(Normal)은 시료로 1 mg/ml 글루코스를 첨가한 군이고, 양성대조군(FOS)은 시료로 5 mg/ml 프락토 올리고당(Fructooligosaccharides, FOS)을 첨가한 군이고, 실험군 1(GG 0.1%)은 시료로 1 mg/ml 젤란검(gellan gum)(GG)를 첨가한 군이며, 실험군 2(GG 0.5%)는 시료로 5 mg/ml 젤란검(gellan gum)(GG)를 첨가한 군이다.
[식 1]
Figure PCTKR2022006863-appb-img-000002
상기 식에서,
*) probiotic log O.D on the prebiotic at 24 h는 24 시간 후, 각 유익균에 대한 양성대조군 또는 실험군 1, 2의 흡광도이다.
*) probiotic log O.D. on the prebiotic at 0 h는 0 시간 후(시료 접종한 순간), 각 유익균에 대한 양성대조군 또는 실험군 1, 2의 흡광도이다.
*) probiotic log O.D. on glucose at 24h는 24 시간 후, 각 유익균에 대한 대조군(1 mg/ml 글루코스)의 흡광도이다.
*) probiotic log O.D. on glucose at 0h은 0 시간 후(시료 접종한 순간), 각 유익균에 대한 대조군(1 mg/ml 글루코스)의 흡광도이다.
*) enteric log O.D on the prebiotic at 24 h는 24 시간 후, 유해균(E. coil)에 대한 양성대조군 또는 실험군 1, 2의 흡광도이다.
*) enteric log O.D. on the prebiotic at 0 h는 0 시간 후(시료 접종한 순간), 유해균(E. coil)에 대한 양성대조군 또는 실험군 1, 2의 흡광도이다.
*) enteric log O.D. on glucose at 24h는 24 시간 후, 유해균(E. coil)에 대한 대조군(1 mg/ml 글루코스)의 흡광도이다.
*) enteric log O.D. on glucose at 0h은 0 시간 후(시료 접종한 순간), 유해균(E. coil)에 대한 대조군(1 mg/ml 글루코스)의 흡광도이다.
C. 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score) 분석 결과
도 1 내지 9는 다양한 유익균에 대한 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 1은 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus) MG316에 대한 것이고, 도 2는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989에 대한 것이며, 도 3은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140에 대한 것이며, 도 4는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) KCTC3421에 대한 것이며, 도 5는 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441에 대한 것이며, 도 6은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440에 대한 것이며, 도 7은 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis)에 대한 것이며, 도 8은 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus)에 대한 것이며, 도 9는 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)에 대한 것이다.
도 1 내지 9에 나타난 바와 같이, 장내유해균인 대장균 대비 유익균의 증식능력을 평가한 결과, 본 발명에 따른 실시예 1의 젤란검(gellan gum)은 아무것도 처리하지 않은 대조군(Normal)에 비하여 모든 균에 대한 프리바이오틱 활성이 현저히 우수함을 확인하였다. 구체적으로 젤란검(gellan gum)은 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus) MG316, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF14, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) KCTC3421, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440, 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)에 대해 우수한 prebiotic activity score(대조군 대비 2~10배)를 나타내는 것으로 확인되었다.
한편 본 발명의 젤란검(gellan gum)을 0.5 mg/ml(0.5%) 첨가한 실험군 2과, 종래 프리바이오틱 소재로 널리 알려진 프락토 올리고당(FOS)과 비교할 경우, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF14, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440, 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)에 대해 우수한 prebiotic activity score(FOS 대비 약 3배)를 나타내는 것으로 확인되었다.
한편 본 발명의 젤란검(gellan gum)은 종래 프리바이오틱 소재로 널리 알려진 프락토 올리고당(FOS)과 동등한 정도의 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus) MG316 prebiotic acticity score를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명의 젤란검(gellan gum)은 대조군과 비교하였을 때, 9종의 유익균에 대해 높은 활성을 가졌으며, 양성대조군인 FOS와 비교하였을 때는 총 7종의 균주(락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF14, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440, 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus))에 대해 현저히 유수한 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 나타내며, 1종의 균주(락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus) MG316)에 대해 동등한 정도의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 가짐을 확인하였다.
D. 각 군에 대한 pH 변화 분석
실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군에 대한 pH 변화를 측정하여 표 1에 나타내었다.
유익균
종류		 대조군
(Normal)		 양성대조군
(FOS)		 실험군 1 실험군 2
GG 0.1% GG 0.5%
Before After Before After Before After Before After
L. rhamnosus 7.05±0.01 6.98±0.00 7.05±0.01 6.98±0.00 7.05±0.01 6.98±0.00 7.05±0.01 6.97±0.01
L. plantarum 7.02±0.01 6.90±0.03 7.11±0.01 6.93±0.03 7.02±0.01 6.90±0.01 7.04±0.01 6.86±0.00
L. lactis 7.11±0.01 6.83±0.06 7.08±0.00 6.72±0.03 7.02±0.01 6.58±0.05 7.06±0.01 6.42±0.03
B. longum 7.02±0.01 6.96±0.01 7.01±0.01 6.94±0.01 6.97±0.01 6.49±0.19 6.99±0.01 6.39±0.01
B. breve 7.02±0.01 6.99±0.00 7.08±0.01 6.80±0.28 6.98±0.01 6.96±0.01 7.02±0.01 6.87±0.02
B. bifidum 7.03±0.00 6.82±0.01 7.05±0.01 6.73±0.09 7.05±0.01 6.58±0.01 7.04±0.00 6.27±0.04
B. uniformis 7.02±0.01 6.97±0.01 7.02±0.01 6.61±0.01 6.99±0.01 6.59±0.04 6.98±0.01 6.33±0.15
B. vulgatus 7.01±0.01 6.94±0.01 7.02±0.01 6.92±0.01 7.02±0.01 6.88±0.10 7.01±0.01 6.66±0.44
B. ovatus 7.02±0.01 6.97±0.01 7.02±0.01 6.49±0.24 7.00±0.01 6.86±0.01 7.01±0.02 6.56±0.35
표 1에 나타난 바와 같이, 대조군 및 FOS군은 pH 변화가 미미하나, 젤란검(gellan gum) 0.5%(5 mg/ml)를 첨가한 실험군 2는 pH가 약산성으로 낮아지는 것을 확인하였다. 즉, 젤란검(gellan gum)은 프락토 올리고당과 달리, 유익균으로부터 단쇄지방산(short chain fatty acid; SCFA) 생산을 촉진함을 알 수 있다. 따라서, 젤란검(gellan gum)은 프락토 올리고당에서는 기대할 수 없는, 장 상피세포의 에너지원, 면역계의 강화 및 대사 조절 등 건강에 유익한 효과를 얻을 수 있다.
또한 젤란검(gellan gum)은 환경 자체를 약산성으로 유지함으로써, 다른 프리바이오틱 소재와 달리 유해균의 증식을 억제하는 효과가 현저히 우수함을 알 수 있다.
실험예 1-2. 유산균의 증식 평가
실험예 1과 동일하게 장내 유익균의 증식 효능을 평가하였으며, 장내 유익균으로는 6종의 상업용 프로바이오틱 균주를 사용한 것을 제외하고는 모두 동일하게 수행하였다. 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) MG723, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) MG729, 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG989 및 락티플랜티바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) MG316을 사용하였고, 이는 한국 문화재 수집품(Jeongeup, Republic of Korea)으로부터 구입하여 사용하였다. 또한 한국식품연구원에서 얻은 김치유래 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140 균주를 준비하였다.
이때, 프리바이오틱 활성은 다음 식 2로 계산하였다.
[식 2]
Figure PCTKR2022006863-appb-img-000003
상기 식의 프리바이오틱 활성은 대장균과 같은 장내 박테리아에 대한 상대적 프로바이오틱 균주의 흡광도(O.D)가 아닌 생장지원 능력(CFU/ml)으로 분석하여, 이를 기준으로 정의하였다.
모든 실험결과는 평균값±표준편차(Mean±Standard Error)로 표시하였고, 실험결과에 대한 통계학적 유의성은 Tukey's post hoc test에 의한 일원 분산 분석으로 검증하여 p값(p-value)이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다. 데이터 분석은 IBM SPSS Statistics 20 소프트웨어(IBM Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다.
도 10 내지 15는 실험군 1(0.1%), 실험군 2(0.5%), 양성대조군(FOS) 및 정상군의 프리바이오틱 활성(prebiotic activity score)을 분석하여 나타낸 그래프로, 도 10은 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG989에 대한 것이고, 도 11은 락티플랜티바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) MG316에 대한 것이며, 도 12는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140에 대한 것이며, 도 13은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731에 대한 것이며, 도 14는 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) MG729에 대한 것이며, 도 15는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) MG723에 대한 것이다.
도 10 내지 15에 나타난 바와 같이, 장내 유해균인 대장균 대비 유익균의 증식능력을 평가한 결과, 본 발명에 따른 실시예 1의 젤란검(gellan gum)은 모든 균에 대한 프리바이오틱 활성이 현저히 우수하다는 것을 확인하였다. 특히 본 발명의 젤란검(gellan gum)을 0.5 mg/ml(0.5%) 첨가한 실험군 2는 종래 프리바이오틱 소재로 널리 알려진 프락토 올리고당(FOS) 대비 유의적으로 우수한 prebiotic activity score를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명의 젤란검 투여에 따라 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) MG729가 가장 크게 증가하였다(33.80). 0.5% 젤란검이 투여된 실험군 2는 FOS에 비해 더 높은 프리바이오틱 활성 점수를 나타내었고, 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG989과 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731(각각 p = 0.0060 and p = 0.0373)에서 유의적으로 더 높은 활성을 갖는 것을 확인하였다.
실험예 1-3. 대사산물 프로파일링
실험예 1-2에서 6종의 상업용 프로바이오틱 균주에 젤란검(GG 0.1%, GG 0.5%) 투여한 실험군 1, 2 및 1 mg/ml 글루코스만 첨가한 대조군(control)의 배양액을 회수하였다(37 ℃, 4시간 배양).
상기 각각의 배양액(100 μL)에 300 ng/mL 내부 표준물질(internal standard)(glycodeoxycholic-2,2,4,4-d4 acid and taurodeoxycholic-2,2,4,4-d4 acid)이 포함된 차가운 메탄올(200 μL)을 첨가한 후, 4 ℃에서 20분 동안 반응시켰다. 배양액으로부터 단백질이 침전되면, 4 ℃에서 10분 동안(14,000 ×g) 원심분리하고, 상등액(상청액)을 대사산물 프로파일링을 위해 회수하였다.
재연성과 신뢰성 검증은 QC(quality control) 시료를 이용하여 측정하였다. 전체 시료의 혼합물을 QC 시료로 만들어 반복 분석하였다. 상기 QC 시료는 매 14개 분석 후 분석하였다. 대사산물 측정은 UPLC-MS으로 측정되었고, 이는 Xevo G2-XS qTOF equipped with ACQUITY UPLC(Waters, MA, USA)을 사용하여 분석하였다. 정제 및 분리를 위해 ACQUITY UPLC BEH C18 column(1.8 μm, 2.1 × 100 mm) 및 ACQUITY UPLC VanGuard C18 column(1.8 μm, 2.1 × 5 mm)을 사용하였다. Mobile phases A 및 B는 각각 0.1% 포름산(FA) 용액과 0.1% FA 아세토니트릴로 설정하였다. 유속과 컬럼 오븐 온도는 40 ℃에서 0.3 ml/min으로 설정하였다. 본 실험에서 완전한 이온화(intact ionization), 모세관 전압(capillary voltage), 샘플링 콘(sampling cone), 소스 온도, 탈용매화 온도(desolvation temperature) 및 탈용매화 가스 유속(desolvation gas flow) 조건은 각각 2.5kV, 20V, 120℃, 400°C 및 600L/h로 설정하였다. 대사산물 피크는 Progenesis QI software(Waters, MA, USA)를 사용한 UPLC-MS raw data로부터 추출하였다. 본 실험에서 약 30의 CV(coefficient of variation) 수치를 갖는 피크는 배제하였다.
본 실험으로부터 얻은 데이터는 SIMCA 17(Sartorius, Goettingen, Germany)을 사용하여 판별 분석(discriminant analysis, DA)(PLS-DA)를 시행하여 구분되는 양상을 분석하였다. 선택된 피크는 2개의 대사산물 데이터베이스(HMDB, KEGG)와 자체 대사산물 라이브러리를 기반으로 확인하였다.
6가지 유기산(ascorbic acid, azelaic acid, citric acid, glutamic acid, α-ketoglutaric acid, malic acid, and succinic acid)과 3가지 아미노산(glutamic acid, phenylalanine, and tryptophan) 및 한가지 단당류(글루코스) 및 2가지 핵염기(구아닌, 크산틴)를 포함하는 12개의 대사산물은 ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS)을 사용하여 검출하였다.
도 16은 젤란검 처리에 따른 락티플랜티바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) MG316의 배양배지에 대한 대사산물 분석결과이고, 도 17은 젤란검 처리에 따른 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140의 배양배지에 대한 대사산물 분석결과이며, 도 18은 젤란검 처리에 따른 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) MG723의 배양배지에 대한 대사산물 분석결과이며, 도 19는 젤란검 처리에 따른 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731의 배양배지에 대한 대사산물 분석결과이다.
도 16 내지 19에 나타난 바와 같이, 젤란검이 투여된 실험군 1 및 2의 장내 유익균들은 대사산물에서 유의적인 변화가 관찰되었다(p < 0.0001). 특히 실험군 2에서 유의적 차이가 확인되었다. 구체적으로 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731에 젤란검이 첨가되면, ascorbic acid, citric acid, glucose 및 succinic acid의 유의적 증가가 유도되었고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) MG723에서는 ascorbic acid, citric acid 및 glucose이 상향 조절되었다. 특히 실험군 2는 락티플랜티바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) MG316에서 citric aicd의 유의적 증가를 야기하는 것으로 확인되었고, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140의 8 가지 대사산물의 강도를 유의적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. 다시 말해 젤란검은 장내 유익균으로부터 대사산물의 발현을 상향 조절하는 것으로 확인되었다.
실험예 2. 다당류 식품첨가소재별 장내 유익균 증식 효능 평가
젤란검 외에 다당류 식품첨가소재(아라비아검, 구아검, 카라지난, 아가로스, 펙틴, 아밀로펙틴, 푸코이단)에 대한 장내 유익균 증식 효능을 비교분석하였다. 이는 장 건강 및 비만을 포함하는 대사성 질환에 미치는 효과와도 연관이 있다.
A. 균주 및 배양방법
젤란검(gellan gum, GG)의 장내 유익균 증식 효능을 평가하기 위한 방법으로 실험예 1과 같이 프리바이오틱 활성(prebiotic acticity score) 분석을 실시하였다.
장내 유익균으로 인간 장에서 분리한 균주(락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989, 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus) MG316, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) KCTC3421, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441 및 김치에서 분리한 프리바이오틱스 상용화 소재인 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF140 균주)를 배양하여 사용하였고, 이는 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. 장내 유해균으로는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) KCTC2441을 사용하였다.
상기 락토바실러스속(Lactobacillus) 균주와 락토코쿠스속(Lactococcus) 균주는 MRS 배지를 이용하여 배양하였다. 배양조건은 pH 6.5±0.2, 37 ℃에서 48시간 동안 정치 배양하였으며, 산소 요구성은 통성혐기성이고 동결건조보존 또는 세포현탁액 동결을 통해 균주를 보존하였다.
비피도박테리아속(Bifidobacteria) 균주와 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주는 5% 양의 혈액(sheep blood)과 0.05% L-시스테인(L-cysteine)이 포함된 TSA 배지를 사용하여, 37 ℃ 및 48-72 시간 동안 배양하였으며, 편성 혐기성균으로 혐기조건에서 배양하였다.
B. 프리바이오틱 활성(prebiotic acticity score) 분석
프리바이오틱 활성(prebiotic acticity score) 분석을 위한 배양 배지는 MB(minimal broth)에 glucose 2 g/L, CaCl2 0.015 g/L, MgSO4 0.5 g/L를 첨가한 M9 MB를 사용하였다.
상기 각각의 유익균 및 유해균의 콜로니를 각각의 M9 MB 고체배지(agar)에 도말하고, 37 ℃ 배양기에서 24-48 시간 1 차 배양한 다음, 이를 다시 M9 MB 액체배지(broth) 10 ㎖에 접종하여 37 ℃ 배양기에서 24-48 시간 2차 배양하였다.
각각의 M9 MB 액체배지(broth)에, 상기 2차 배양한 각 균주 배양액 1%(v/v)을 넣고, 여기에 시료를 첨가한 후, 시료를 접종한 순간(0 시간)과 24-48 시간이 지난 후 마이크로 플레이트 리더기를 사용하여 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 이들 값을 식 2에 대입하여 장내 유익균 활성(prebiotic activity score) 수치를 얻었다. 시료 첨가하기 전(Before)과 첨가하고 24시간 후(After) 배양액의 pH를 pH meter(Orion star A211, Thermo Fisher Scientific)로 3회 반복 측정하고, 평균 수치를 기록하였다. 모든 실험결과는 평균값±표준편차(Mean±Standard Error)로 표시하였고, 실험결과에 대한 통계학적 유의성은 Tukey's post hoc test에 의한 일원 분산 분석으로 검증하여 p값(p-value)이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다. 데이터 분석은 IBM SPSS Statistics 20 소프트웨어(IBM Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다.
대조군(Normal)은 시료로 1 mg/ml 글루코스를 첨가한 군이고, 양성대조군(FOS)은 시료로 5 mg/ml 프락토 올리고당(Fructooligosaccharides, FOS)을 첨가한 군이고, 실험군 1(GG 0.1%)은 시료로 1 mg/ml 젤란검(gellan gum)(GG)를 첨가한 군이며, 실험군 2(GG 0.5%)는 시료로 5 mg/ml 젤란검(gellan gum)(GG)를 첨가한 군이다. 비교군은 다당류 식품첨가소재로 5 mg/ml 구아검, 카라지난, 아가로스, 펙틴, 아밀로펙틴 또는 푸코이단을 첨가한 군으로, 순서대로 비교군 1, 2, 3, 4, 5, 6으로 표기하였다(식 1은 실험예 1의 식 1을 참고할 수 있고, prebiotic 활성 측정 시료로 실험군 1 및 2외에 비교군을 더 포함한다는 것을 제외하고는 모두 동일하다).
[식 1]
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상기 식에서,
*) probiotic log O.D on the prebiotic at 24 h는 24 시간 후, 각 유익균에 대한 양성대조군 또는 실험군 1 또는 실험군 2 또는 비교군의 흡광도이다.
*) probiotic log O.D. on the prebiotic at 0 h는 0 시간 후(시료 접종한 순간), 각 유익균에 대한 양성대조군 또는 실험군 1 또는 실험군 2 또는 비교군의 흡광도이다.
*) probiotic log O.D. on glucose at 24h는 24 시간 후, 각 유익균에 대한 대조군(1 mg/ml 글루코스)의 흡광도이다.
*) probiotic log O.D. on glucose at 0h은 0 시간 후(시료 접종한 순간), 각 유익균에 대한 대조군(1 mg/ml 글루코스)의 흡광도이다.
*) enteric log O.D on the prebiotic at 24 h는 24 시간 후, 유해균(E. coil)에 대한 양성대조군 또는 실험군 1 또는 실험군 2 또는 비교군의 흡광도이다.
*) enteric log O.D. on the prebiotic at 0 h는 0 시간 후(시료 접종한 순간), 유해균(E. coil)에 대한 양성대조군 또는 실험군 1 또는 실험군 2 또는 비교군의 흡광도이다.
*) enteric log O.D. on glucose at 24h는 24 시간 후, 유해균(E. coil)에 대한 대조군(1 mg/ml 글루코스)의 흡광도이다.
*) enteric log O.D. on glucose at 0h은 0 시간 후(시료 접종한 순간), 유해균(E. coil)에 대한 대조군(1 mg/ml 글루코스)의 흡광도이다.
유익균
종류		 대조군
(Normal)		 양성대조군
(FOS)		 실험군 2 비교군 1 비교군 2 비교군 3 비교군 4 비교군 5 비교군 6
GG 0.5% 구아검 카라지난 아가로스 펙틴 아밀로펙틴 푸코이단
L. rhamnosus 0.19±0.03 0.82±0.04 1.82±0.04 0.32±0.03 0.53±0.02 0.58±0.01 0.43±0.01 0.45±0.01 0.01±0.01
L. plantarum 0.31±0.03 0.48±0.03 1.41±0.04 0.17±0.02 0.65±0.03 0.64±0.05 0.05±0.03 0.09±0.02 0.02±0.01
L. lactis 0.029±0.02 0.72±0.03 1.15±0.03 0.79±0.02 0.75±0.03 0.85±0.05 0.37±0.04 0.06±0.02 0.02±0.02
B. longum 0.98±0.02 3.24±0.05 1.99±0.04 1.09±0.04 1.73±0.01 0.49±0.2 0.44±0.04 0.26±0.05 0.09±0.01
B. breve 0.98±0.01 3.26±0.05 33.8±1.11 19.5±0.59 17.4±0.25 4.60±0.52 4.44±0.51 2.19±0.51 1.06±0.21
B. bifidum 0.13±0.00 1.71±0.04 5.42±0.05 1.86±0.04 1.79±0.05 0.82±0.03 0.93±0.03 0.52±0.04 0.03±0.01
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 젤란검과 다른 다당류 식품첨가소재들을 준비하고, 이들의 유해균인 대장균 대비 유익균의 증식능력을 평가한 결과, 본 발명에 따른 실시예 1의 젤란검(gellan gum)은 다른 다당류 식품첨가소재에 비하여 모든 균에 대한 프리바이오틱 활성이 현저히 우수함을 확인하였다. 구체적으로 젤란검(gellan gum)은 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus) MG316, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) MG989, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LL-KF14, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) KCTC3421, 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) KCTC3441, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) KCTC3440에 대해 우수한 prebiotic activity score(다른 다당류 식품 첨가소재 대비)를 나타내는 것으로 확인되었다.
실험예 3. 생체 내에서의 장내 유익균 증식 효능 평가
A. 실험동물
한국식품연구원 SPF 사육시설(Specific pathogen free animal facility)에서 사육된 8주령의 수컷 C57BL/6J계 마우스 45마리를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한국식품연구원 동물실험윤리위원회의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
B. 시료의 투여 및 샘플링
시료의 투여를 위하여 마우스는 무작위로 9마리씩 다섯 그룹으로 나누어 진행하였다. 정상군(normal group, NC)과 고지방식이군(high fat group, HF)은 멸균식염수를 1일 1회씩 12 주간 경구 투여하였고, 양성 대조군인 프락토올리고당 투여군(FOS)은 40 mg/kg의 프락토올리고당을 멸균식염수에 용해하여 1일 1회씩 12주간 매일 경구 투여하였고, 실험군인 GG10(젤란검 10 mg/kg mouse)과 GG40(젤란검 40 mg/kg mouse)군은 10 mg/kg 또는 40 mg/kg의 젤란검을 각각 멸균식염수에 용해하여 1일 1회씩 12 주간 매일 경구 투여하였다. 정상군을 제외한 모든 그룹들에는 고지방 사료(high fat diet)로 자유급식하였다. 상기 고지방 사료는 Lard를 첨가하여 열량을 60 cal%를 증가시킨 Modified AIN 76A purified rodent diet(60 cal% fat)를 사용하였다. 모든 실험결과는 평균값±평균의 표준편차(Mean±Standard Error of Mean)로 표시하였고, 실험결과에 대한 통계학적 유의성은 Tukey's post hoc test에 의한 일원 분산 분석으로 검증하여 p값(p-value)이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다. 데이터 분석은 IBM SPSS Statistics 20 소프트웨어(IBM Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다(* 또는 #p＜0.05, ##p＜0.01, ###p＜0.001 vs HF).
구분 설명
정상군
(ND)		 정상 사료 급여, 멸균식염수 경구 투여(Normal)
고지방식이군
(HF 또는 HFD)		 고지방 사료 급여, 멸균식염수 경구 투여(HF+Saline)
양성 대조군 고지방 사료 급여, 프락토올리고당 경구 투여(40 mg/kg/day)
실험군 GG10 고지방 사료 급여, 젤란검 경구 투여(젤란검 10 mg/kg/day)
실험군 GG40 고지방 사료 급여, 젤란검 경구 투여(젤란검 40 mg/kg/day)
상기 그룹들로부터 12 주동안 매일 신선한 분변을 수집한 후 드라이아이스로 급속 냉동하여 보관하였다. 실험이 완료된 후, 상기 분변으로부터 DNA를 분리하여 차세대 염기서열 분석법(NGS)을 이용하여 장내 미생물 균총을 분석하였다.
3-3. 장내 유익균 증식효능 분석 결과
도 20은 정상군(NC), 고지방식이군(HF 또는 HFD), 양성대조군(FOS) 및 실험군(GG10, GG40)의 분변으로부터 장내 유익균 증식효능을 분석한 결과이다.
도 20에 나타난 바와 같이, 고지방식이에 의해 유의적으로 감소한 락토바실러스 균주가 젤란검을 섭취한 마우스에서 유의적으로 증가하였으며, 양성대조군인 프락토올리고당에 비해서도 유익균인 락토바실러스의 증식을 증가시키는 것으로 확인되었다.
실험예 4. 생체 내에서의 대사성 질환 개선, 예방 및 치료 효능
A. 실험동물
무균 환경에서 사육된 6주령의 수컷 C57BL/6J계 마우스를 (주)중앙실험동물에서 구입하여 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 SPF 사육실(specific pathogen-free animal facility)에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한국식품연구원 동물실험운영규정(approval no. KFRI-M-20013)에 준하여 수행하였다.
B. 시료의 투여 및 샘플링
시료의 투여를 위하여 마우스는 무작위로 9마리씩 다섯 그룹으로 나누어 진행하였다. ND(normal diet group)은 정상식이를 먹은 음성대조군이고, HFD(high fat diet group)과 시료 투여 그룹은 Lard를 첨가하여 열량을 60 cal%를 증가시킨 고지방 사료(Modified AIN 76A purified rodent diet(60 cal% fat))를 자율적으로 급여하였다. 양성대조군(PC 또는 FOS)은 프락토올리고당(fructo oligosaccharide) 40 mg/kg을 매일 경구투여하였으며, 시료 GG10 또는 GG40은 실시예 1의 젤란검 10 또는 40 mg/kg를 매일 경구투여하였으며, ND와 HFD 그룹은 같은 양의 증류수를 같은 기간동안 경구투여하였다. 총 12주 동안 매주 오전 10시에 체중을 측정하였다.
모든 실험결과는 평균값±표준편차(Mean±Standard Error)로 표시하였고, 실험결과에 대한 통계학적 유의성은 Tukey's post hoc test에 의한 일원 분산 분석으로 검증하여 p값(p-value)이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하여, 서로 다른 문자(a-c)로 표시하였다. 데이터 분석은 IBM SPSS Statistics 20 소프트웨어(IBM Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다.
5개 군의 동물모델
1군(ND, 음성대조군) : 정상식이 섭취, 증류수 경구 투여
2군(HFD) : 고지방식이 섭취, 증류수 경구 투여
3군(PC 또는 FOS) : 고지방식이 섭취, 프락토올리고당 40 mg/kg 경구 투여
4군(GG10) : 고지방식이 섭취, 실시예 1의 젤란검 10 mg/kg 경구 투여
5군(GG40) : 고지방식이 섭취, 실시예 1의 젤란검 40 mg/kg 경구 투여
C. 체성분 및 체지방 측정
도 21은 체성분분석기를 이용하여 측정한 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 체형 사진(a)과 그래프(b)이고, 도 22는 체성분분석기를 이용하여 측정한 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 체지방량 변화(%)를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 체성분분석기는 DXA(dual-energy X-ray absorptiometry)(InAlyzer; Medikors Inc., Seongnam, Korea)를 사용하여 프로토콜대로 측정하였다. 전체 바디 스캐닝을 수행하고, 이로부터 InAlyzer software를 사용하여 체지방량을 분석하였다.
도 21 및 22에 도시된 바와 같이, 고지방식이만 섭취한 HFD 그룹과 대비하여 정상식이를 먹은 ND 그룹은 체지방이 111.2% 높아지며, 실시예 1의 젤란검을 40 mg/kg(GG40) 투여하면 체지방 함량이 HFD 그룹 대비 22.1% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 양성대조군(FOS) 역시 체지방 함량이 HFD 그룹 대비 유의적으로 감소하였다. 따라서 본 발명의 젤란검은 체지방 감소 효능을 갖는 것을 알 수 있다.
D. 백색 부고환 지방 측정
도 23은 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델로부터 백색 부고환 지방 조직을 적출하여, 백색 부고환 지방 조직의 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 23의 유의성 분석은 Tukey's post hoc test에 의한 일원 분산 분석으로 검증하여 p값(p-value)이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다(*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001 vs ND, #p＜0.05, ##p＜0.01, ###p＜0.001 vs HFD).
도 23에 도시된 바와 같이, ND 그룹은 HFD 그룹에 대비하여 백색 부고환 지방조직 무게가 유의미하게 증가하였다. 실시예 1의 젤란검 40 mg/kg을 투여한 그룹(GG40)은 HFD 그룹 대비 백색 부고환 지방조직의 무게가 유의미하게 감소하였다. 한편 프락토올리고당을 40 mg/kg 투여한 그룹의 경우(FOS) HFD 그룹과 비교하여 백색 부고환 지방조직 무게에 있어서, 유의미한 차이를 보이지 않았다.
따라서 본 발명의 젤란검은 종래 식이섬유에 비해 체중 감량뿐만 아니라 체지방 감소에도 효능이 있는 것을 확인할 수 있다.
E. 간무게, 간 트리글리세라이드 및 혈중 지질 측정
12주후, 1군(NC, 음성대조군), 2군(HFD), 3군(FOS), 4군(GG10) 및 5군(GG40)으로 구분되는 동물모델을 18시간 절식시킨 후 아이프란액을 이용하여 마취하고 복부와 흉강을 절개하여 배대정맥에서 혈액을 채취한 후, 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 분석전까지 -70 ℃에서 보관하였다. 또한 간조직을 회수하고, 무게를 재어 변화량을 확인하였다.
상기 혈청으로부터 총 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤, 트리글리세라이드를 분석하기 위해 Abcam (Cambridge, MA, USA)으로부터 구입한 콜레스테롤과 트리글리세라이드 Assay kit(triglycerides and cholesterol)를 이용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.
도 24는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 무게를 나타낸 그래프이고, 도 25는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 내에서 트리글리세라이드 농도를 나타낸 그래프이다.
도 26은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 콜레스테롤 농도를 나타낸 그래프이다. 도 27은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 HDL 콜레스테롤 농도를 나타낸 그래프이다. 도 28은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 LDL 콜레스테롤 농도를 나타낸 그래프이다.
도 24 및 도 25에 따르면 HFD 그룹은 간무게 뿐만 아니라 트리글리세라이드도 유의적으로 증가한 것으로 확인되었다. 그러나 GG를 투여하면 HFD로 인한 간무게 증가가 유의적으로 감소하였고, 특히 젤란검이 40 mg/kg 이상 투여될 때 대사성 증후군 수치가 현저히 개선되는 것을 확인하였다.
도 26 내지 도 28에 도시된 바와 같이, 정상식이를 섭취한 ND 그룹과 대비하여 고지방 식이를 먹은 HFD 그룹은 혈중 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 모두 108.5%, 198.2% 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 실시예 1의 젤란검 40 mg/kg 투여시에는 이러한 증가가 HFD 그룹에 비해 19.1%, 28.8% 유의미하게 감소하는 것을 확인할 수 있다.
한편 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 그룹은 HFD 그룹 대비 혈중 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 모두 유의미한 감소를 나타내었다. 본 실험 결과, 젤란검은 체중 및 체지방 뿐만 아니라 혈중 콜레스테롤 함량을 감소시키는 효과가 있으며, 특히 단기간 또는 장기간 과량의 고지방 섭취시 이를 처리하는 효과가 있음을 확인하였다.
F. 혈중 엔도톡신 측정
12주후, 1군(NC, 음성대조군), 2군(HFD), 3군(FOS), 4군(GG10) 및 5군(GG40)으로 구분되는 동물모델을 18시간 절식시킨 후 아이프란액을 이용하여 마취하고 복부와 흉강을 절개하여 배대정맥에서 혈액을 채취한 후, 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 분석 전까지 -70 ℃에서 보관하였다. 상기 혈청으로부터 엔도톡신 농도를 분석하기 위하여 Pierce™ LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit(Thermo scientific)를 이용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.
도 29는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 엔도톡신 농도를 나타낸 그래프이다.
도 29에 도시된 바와 같이, ND 그룹 대비 고지방 식이를 먹인 HFD 그룹에서 엔도톡신이 102.7% 유의적으로 크게 증가하는 것으로 확인되었다. 실시예 1의 젤란검이 투여된 그룹(GG10, GG40)의 경우 HFD 그룹과 대비하여 유의적으로 감소하였으며, ND 그룹과 동일한 수준으로 혈중 엔도톡신 농도를 낮춰주는 효과가 있음을 확인하였다. 한편 GG40과 동량이고 체지방 억제 효과가 있음에도 불구하고, 종래 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 그룹(FOS)은 HFD 그룹 대비 유의적 차이가 나타나지 않았다.
실시예 1의 젤란검은 앞선 결과들을 종합하였을 때, 종래 식이섬유와 달리 10 mg/kg에서도 효과를 나타내며, 40 mg/kg 투여될 경우에는 비만 또는 대사질환 개선, 예방 또는 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 체지방 감소효과를 갖는 종래 식이섬유(프락토올리고당)에서는 예측할 수 없는 현저한 효과를 달성하고 있는 것이다.
G. 생화학적 분석
12주후, 1군(NC, 음성대조군), 2군(HFD), 3군(FOS), 4군(GG10) 및 5군(GG40)으로 구분되는 동물모델을 18시간 절식시킨 후 아이프란액을 이용하여 마취하고 복부와 흉강을 절개하여 배대정맥에서 혈액을 채취한 후, 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 분석 전까지 -70 ℃에서 보관하였다. 혈청과 간 생화학적 분석을 위해 commercial ELISA kits(Thermo Fisher Scientific)(insulin), ALT Assay Kit(Cell Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA), AST Assay Kit(Cell Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA), R&D systems (leptin; Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.
인슐린 저항성은 HOMA-IR(homeostasis model assessment for insulin resistance)를 사용하여 분석하였다. 이는 인슐린 저항성과 인슐린 분비가 쌍곡선 관계를 가지며, 인슐린 저항성이 올라가면 인슐린 분비가 증가하고 인슐린 저항성이 낮아지면 인슐린 분비도 낮아진다는 원리를 이용한 것으로, 하기 식 3을 통해 계산할 수 있다.
[식 3]
HOMA-IR = 공복 인슐린(fasting insulin)(mU/L) × 공복 혈당(fasting glucose)(mmol/L)/22.5.
도 30은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 ALT 농도를 나타낸 그래프이다. 도 31은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈중 AST 농도를 나타낸 그래프이다.
도 30 및 도 31에 도시된 바와 같이, ND 그룹 대비 고지방 식이를 먹인 HFD 그룹에서 ALT 함량이 463.3% 유의적으로 크게 증가하는 것으로 확인되었다. 실시예 1의 젤란검이 투여된 그룹(GG40)의 경우 HFD 그룹과 대비하여 54.1% 유의적으로 감소하였다. 한편 종래 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 그룹(FOS)은 HFD 그룹과 대비하여 유의적 감소가 확인되었으나, GG40 그룹이 FOS 그룹보다 유의적으로 더 감소하는 것을 확인하였다.
또한, ND 그룹 대비 고지방 식이를 먹인 HFD 그룹에서 AST 함량이 154.6% 유의적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 실시예 1의 젤란검이 투여된 그룹(GG40)의 경우 HFD 그룹과 대비하여 41.9% 유의적으로 감소하였다. 한편 종래 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 그룹(FOS)은 HFD 그룹과 대비하여 유의적 감소가 확인되었으나, GG40 그룹이 FOS 그룹보다 유의적으로 더 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 1의 젤란검은 앞선 결과들을 종합하였을 때, 종래 식이섬유와 달리 40 mg/kg 투여되면 비만 또는 대사질환 개선, 예방 또는 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다. 특히 체지방 감소효과를 갖는 종래 식이섬유(프락토올리고당)보다 비알코올성 지방간에 대해 유의적으로 현저한 효과를 달성하고 있는 것이다.
도 32는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈청 인슐린 농도를 나타낸 그래프이고, 도 33은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 HOMA-IR을 나타낸 그래프이며, 도 34는 군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 혈청 렙틴 농도를 나타낸 그래프이다.
도 32 내지 도 33을 살펴보면, HFD 그룹에서 혈청(serum) 인슐린 수준과 HOMA-IR 수준이 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한, HFD 그룹과 같이 대사성 질환이 유도되면 콜레스테롤 뿐만 아니라 혈청 렙틴 수치를 상향조절하는 것으로 확인되었다. 반면 젤란검이 처리되면 앞서 살펴본 바와 같이 endotoxemia(내독소혈증)이 유의하게 감소됨과 동시에(도 29 참조), 내당능과 인슐린 저항성이 개선된다는 것을 확인하였다. 특히 젤란검이 40 mg/kg 이상으로 처리될 경우(GG40), 혈청 렙틴과 총- 및 LDL-콜레스테롤 수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인한 바, 대사성 질환에 대하여 유의적으로 현저한 효과를 달성할 수 있다는 것을 알 수 있다.
H. 경구 포도당 내성 검사
12주후, 1군(NC, 음성대조군), 2군(HFD), 3군(FOS), 4군(GG10) 및 5군(GG40)으로 구분되는 동물모델을 12시간동안 절식시킨 후, 혈액을 채취하였다. 이후 2g/kg 농도의 포도당(glucose)을 경구투여한 다음 혈당을 측정하였다. 혈당 수치는 혈당 측정기(glucometer (Accu-Chek; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA))를 사용하여 글루코스 투여후 0, 30, 60, 90 및 120 분마다 측정하였다.
도 35는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 공복 혈당을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 37은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 경구 포도당 내성 검사 결과 그래프이며, 도 37은 혈당 수치 곡선(도 36)에 대한 AUC(Area Under the Curve)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 35 내지 37에 나타난 바와 같이, 공복(Fasting) 혈당과 시간에 따른 혈당 변화는 HFD 그룹에서 현저히 높은 것을 확인하였다.
I. 간의 지질대사 관련 단백질 변화 분석
12주후, 1군(NC, 음성대조군), 2군(HFD), 3군(FOS) 4군(GG10) 및 5군(GG40)으로 구분되는 동물모델을 18시간 절식시킨 후 아이프란액을 이용하여 마취하고 복부와 흉강을 절개하여 간을 적출하였다. 적출된 간으로부터 간 조직을 얻은 후, 즉시 액체 질소에 담가 급속 냉동시킨후 - 80 ℃에 보관하였고, 실험전에 해동하여 단백질을 분리하였다.
상기 조직을 단백질 분해효소(protease) 저해제(inhibitor)가 첨가된 lysis buffer(7 M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 100 mM DTT) 속에서 기계적 분쇄와 초음파 분해를 병용하여 파쇄한 후, 4 ℃에서 5 분 동안 10,000 ×g로 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 상기 회수한 상청액 내의 단백질의 농도를 은 Bradford method를 사용하여 ELISA법으로 측정하여 정량하였다.
채취한 간 조직에서 분리된 단백질로 전기영동을 실시하였다, 구체적으로 10% SDS-polyacrylamide gel(Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 전기영동 후, PVDF 막(Bio-Rad, CA, USA)에 이동시켰다(transfer). 5% skim milk(0.1% Tween 20 containing PBS, PBST) 용액에서 비특이적 결합부위(nonspecific binding site)를 블로킹(blocking)시킨 후, 1차 항체(anti-β-actin, anti-SREBP1c, anti-ACC, anti-FAS, anti-ChREBP, Abcam)로 4 ℃에서 밤새(overnight)와 반응시키고, 2차 항체(anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG linked with horseradish peroxidase, Cell signaling Technology)로 상온에서 1 시간 동안 배양한 다음, streptavidin-horseradish peroxidase와 ChemiDoc XRS device(Bio-Rad, USA)를 이용하여 검출하였다.
도 38은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간조직에서 지질대사 관련 단백질(SREBP1, ChREBP, FAS, ACC) 발현 변화를 나타낸 웨스턴블롯 결과이다. 도 39는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 SREBP1 단백질 발현을 나타낸 그래프이고, 도 40은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 ChREBP 단백질 발현을 나타낸 그래프이며, 도 41은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 FAS 단백질 발현을 나타낸 그래프이며, 도 42는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 ACC 단백질 발현을 나타낸 그래프이며, 도 43은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 CD36 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 38 내지 도 43에 도시된 바와 같이, 지방산 합성에 관여하는 효소인 ACC(acetyl CoA carboxylase)와 FAS(fatty acid synthase)의 발현은 ND 그룹 대비 고지방 식이를 먹인 HFD 그룹에서 각각 133.2%, 258% 유의적으로 크게 증가하는 것으로 확인되었다. ACC와 FAS는 실시예 1의 젤란검이 투여된 그룹(GG40)의 경우 HFD 그룹과 대비하여 각각 44.2%, 42.0% 유의적으로 감소하였다. 또한 CD36은 HFD 그룹에서 극적으로 상향조절되었다가, 실시예 1의 젤란검이 투여되면 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 다시 말해 젤란검의 처리는 대사성 질환과 관련된 인자의 발현을 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있다.
한편 종래 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 그룹(FOS)은 HFD 그룹과 대비하여 유의적 감소가 확인되지 않았다.
지방대사를 조절하는 전사인자인 SREBP1(sterol regulatory element binding protein-1)과 지방합성을 촉진하는 단백질인 ChREBP(carbohydrate response element binding protein)의 변화를 확인한 결과, ND 그룹 대지 고지방 식이를 먹인 HFD 그룹에서 SREBP1, ChREBP 발현이 각각 301.0%, 91.7% 유의적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 실시예 1의 젤란검이 투여된 그룹(GG40)의 경우 HFD 그룹과 대비하여 SREBP1, ChREBP 발현이 각각 60.5%, 46.3% 유의적으로 감소하였다. 한편 종래 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 그룹(FOS)은 HFD 그룹과 대비하여 유의적 감소가 확인되지 않았다.
실시예 1의 젤란검은 앞선 결과들을 종합하였을 때, 종래 식이섬유와 달리 간에서 지질대사 관련 단백질의 발현을 유의적으로 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 젤란검은 비만 또는 대사질환 개선, 예방 또는 치료효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
J. 조직학적 분석(Histological analysis)
12주후, 1군(NC, 음성대조군), 2군(HFD), 3군(FOS) 4군(GG10) 및 5군(GG40)으로 구분되는 동물모델을 18시간 절식시킨 후 아이프란액을 이용하여 마취하고 복부와 흉강을 절개하여 간을 적출하였다. 적출된 간으로부터 간 조직을 얻은 후, 즉시 액체 질소에 담가 급속 냉동시킨후 - 80 ℃에 보관하였고, 실험전에 해동하여 단백질을 분리하였다. 간 조직을 H&E으로 염색하였다. 4% 포름알데히드로 고정하고 tissue-Tek OCT 화합물(Sakura Finetek, CA, USA)로 처리한 후, 파라핀으로 포매하고, 4 ㎛ 크기로 절단한 다음 H&E로 염색하였다. 오일레드 오(Oil Red O) 염색을 위해서 상기 간 조직을 cryostat(Leica CM1850, Wetzlar, Germany)을 사용하여 10 ㎛로 절단한 다음, 오일레드 오(Oil Red O)로 염색하였다. pannoramic 250 Flash III slide scanner(3DHistech, Ltd., Budapest, Hungary)를 사용하여 상기 염색된 절편을 스캔하고, CaseViewer software(3DHistech, Ltd.)로 캡처하였다. H&E 염색된 슬라이드의 지방증 점수(0, none; 1, <33%; 2, 33-66%; 3, >66%)를 Kato et al. (Kato, K. i., Takeshita, Y., Misu, H., Zen, Y., Kaneko, S., & Takamura, T. (2015). Liver steatosis is associated with insulin resistance in skeletal muscle rather than in the liver in J apanese patients with non-alcoholic fatty liver disease. Journal of diabetes investigation, 6(2), 158-163) 방법으로 결정하였고, 오일레드 오 염색 영역은 ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 계산하였다.
도 44는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에 대한 H&E 염색 결과이고, 도 45는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에 대한 지방증 점수 결과이며, 도 46은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에 대한 오일레드 오(Oil Red O) 염색 결과이고, 도 47은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직을 오일레드 오(Oil Red O)로 염색하였을 때, 양성염색부위(positive staining area)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 44 내지 도 47에 나타난 바와 같이, HFD 그룹의 간은 지방 침착이 유의적으로 증가한다는 것을 확인하였다. 반면 젤란검이 투여된 GG10과 GG40 그룹은 고지방 식이로 인해 유도되는 간 조직에서의 지방 침적을 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있다.
K. 간에서의 염증 분석
12주후, 1군(NC, 음성대조군), 2군(HFD), 3군(FOS), 4군(GG10) 및 5군(GG40)으로 구분되는 동물모델을 18시간 절식시킨 후 아이프란액을 이용하여 마취하고 복부와 흉강을 절개하여 간을 적출하였다. 적출된 간으로부터 간 조직을 얻은 후, 즉시 액체 질소에 담가 급속 냉동시킨후 - 80 ℃에 보관하였고, 실험전에 해동하여 단백질을 분리하였다.
상기 조직을 단백질 분해효소(protease) 저해제(inhibitor)가 첨가된 lysis buffer(7 M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 100 mM DTT) 속에서 기계적 분쇄와 초음파 분해를 병용하여 파쇄한 후, 4 ℃에서 5 분 동안 10,000 ×g로 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 상기 회수한 상청액 내의 단백질의 농도를 은 Bradford method를 사용하여 ELISA법으로 측정하여 정량하였다.
채취한 간 조직에서 분리된 단백질로 전기영동을 실시하였다, 구체적으로 10% SDS-polyacrylamide gel(Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 전기영동 후, PVDF 막(Bio-Rad, CA, USA)에 이동시켰다(transfer). 5% skim milk(0.1% Tween 20 containing PBS, PBST) 용액에서 비특이적 결합부위(nonspecific binding site)를 블로킹(blocking)시킨 후, 1차 항체(anti-β-actin, anti-IL1β, anti-IL6, anti-TNF-α, TLR4, MCP1)(Abcam(Cambridge, MA, USA))로 4 ℃에서 밤새(overnight)와 반응시키고, 2차 항체(anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG linked with horseradish peroxidase)(Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA))로 상온에서 1 시간 동안 배양한 다음, streptavidin-horseradish peroxidase와 ChemiDoc XRS device(Bio-Rad, USA)를 이용하여 검출하였다. 이때 β-액틴은 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)으로 구입한 것을 사용하였다.
도 48은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간조직에서 염증 관련 사이토카인 및 대식세포유인 단백질 발현 변화를 나타낸 웨스턴블롯 결과이다. 도 49는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 IL6 발현을 나타낸 그래프이고, 도 50은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 TNF-α 발현을 나타낸 그래프이며, 도 51은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 MCP1 단백질 발현을 나타낸 그래프이며, 도 52는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 TLR4 단백질 발현을 나타낸 그래프이며, 도 53은 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 간 조직에서 IL-1β 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 48 내지 도 52에 도시된 바와 같이, 간 조직에서 지방 축적에 의한 염증에 관여하는 사이토카인인 IL6(interleukin-6)과 TNF-α(tumor necrosis factor α)의 발현은 ND 그룹 대비 고지방 식이를 먹인 HFD 그룹에서 각각 유의적으로 크게 증가하는 것으로 확인되었다. IL6, TNFα는 실시예 1의 젤란검이 투여된 그룹(GG40)의 경우 HFD 그룹과 대비하여 각각 17.1%, 38.8% 유의적으로 감소하였다. 한편 종래 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 그룹(FOS)은 HFD 그룹과 대비하여 유의적 감소가 확인되지 않았다.
또한, 염증성 사이토카인과 케모타인의 발현 및 분비를 상향조절하는 TLR4 역시 HFD 그룹에서 크게 증가하였다가 젤란검의 투여를 통해 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 반면 FOS 그룹은 HFD 그룹과 유의적 차이가 관찰되지 않을 뿐만 아니라 오히려 TLR4 발현이 HFD 그룹보다 다소 증가하는 것을 확인할 수 있다.
대식세포유인 단백질인 MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)의 변화를 확인한 결과, ND 그룹 대지 고지방 식이를 먹인 HFD 그룹에서 MCP1 발현이 유의적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 실시예 1의 젤란검이 투여된 그룹(GG40)의 경우 HFD 그룹과 대비하여 MCP1 발현이 23.5% 유의적으로 감소하였다. 한편 종래 프락토올리고당 40 mg/kg을 투여한 그룹(FOS)은 HFD 그룹과 대비하여 유의적 감소가 확인되지 않았다.
실시예 1의 젤란검은 앞선 결과들을 종합하였을 때, 종래 식이섬유와 달리 간에서 지방축적에 의한 염증성 관련 인자의 발현을 유의적으로 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 젤란검은 비만 또는 대사질환 개선, 예방 또는 치료효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실험예 5. 생체 내에서 젤란검에 의한 SCFA 생산 분석
실험예 4에서와 동일하게 5개 군으로 구분되는 동물모델을 준비하였다.
1군(ND, 음성대조군) : 정상식이 섭취, 증류수 경구 투여
2군(HFD) : 고지방식이 섭취, 증류수 경구 투여
3군(PC 또는 FOS) : 고지방식이 섭취, 프락토올리고당 40 mg/kg 경구 투여
4군(GG10) : 고지방식이 섭취, 실시예 1의 젤란검 10 mg/kg 경구 투여
5군(GG40) : 고지방식이 섭취, 실시예 1의 젤란검 40 mg/kg 경구 투여
12주후, 상기 1군 내지 5군으로부터 배설물 샘플을 회수하였다. 상기 배설물 샘플은 20mL SPME 바이알에 옮긴 후, 1.5g 인산일나트륨(pH 2.5, 황산으로 조정) 함유 증류수 5mL를 첨가한 다음, 내부 표준 스톡 용액 10mL를 첨가하였다. SCFA(short chain fatty acid)는 headspace solid-phase microextraction system (Gerstel, Kortrijk, Belgium)와 결합된 GC-MS(7890 GC system equipped with 7000C Triple Quad MSD, Agilent)로 분석하였다. SCFA 추출 및 크로마토그래피 분리를 위해 CAR/PDMS 85mm SPME 섬유(Supelco, Bellefonte, PA, USA), DB-WAXetr column(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm, Agilent Technology)를 사용하였다. 오븐 온도 조건은 80 ℃에서 2분, 10℃/min로 100 ℃까지, 2℃/min로 150℃까지, 20℃/min에서 220 ℃까지 가열하고, 2 분동안 유지하였다. 비분할 모드(splitless mode)를 선택하고, 운반기체로 헬륨을 사용하여 1mL/min의 일정한 유속 투입하였다. MS는 70 eV의 이온화 전압으로 전자 이온화 모드에서 수행하였다. 스캔 범위는 40-200 m/z, 스캔 속도는 0.2 s/scan, 전자 에너지는 70 eV로 설정하였다. MRM(multiple reaction monitoring) 모드를 사용하였고, SCFA에 대한 매개변수 전환을 적용하였다. 각 피크 면적은 정량화한 후 내부 표준 면적으로 정규화하였다. 각 화합물에 대한 선형 회귀 방정식은 피크 면적 대 화합물 농도(μM)에 대한 검정그래프(calibration curve)로부터 계산하였다. 상기 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델로부터 SCFA(short chain fatty acid)의 정량적 분석결과를 하기 표 4에 나타내었다. 실험결과는 평균값±평균의 표준편차(Mean±Standard Error of Mean)로 표시하였고, 실험결과에 대한 통계학적 유의성은 Tukey's post hoc test에 의한 일원 분산 분석으로 검증하여 p값(p-value)이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하여, 서로 다른 문자(a 및 b)로 표시하였다.
Groups Short chain fatty acids (mM/g)
Acetic acid, AA Propionic acid, PA Butyric acid, BA Valeric acid, VA Hexanoic acid, HA Isobutyric acid, IBA Isovaleric acid, IVA 2-methylbutyric acid, MBA
1군
ND		 4848.22 ± 802.89a 1230.85 ± 263.39a 614.36 ± 142.21a 25.01 ± 3.04 1.55 ± 0.50 37.35 ± 3.23 12.47 ± 0.72 9.27 ± 2.86
2군
HFD		 538.27 ± 59.99b 102.27 ± 19.95b 55.76 ± 5.22b 14.24 ± 2.90 1.02 ± 0.04 17.82 ± 3.46 13.87 ± 2.59 10.96 ± 2.32
3군
PC		 1275.69 ± 468.34b 392.48 ± 178.70b 148.60 ± 57.28b 45.01 ± 11.93 1.03 ± 0.22 60.72 ± 26.93 35.05 ± 11.91 29.72 ± 10.55
4군
GG10		 1135.85 ± 193.49b 294.61 ± 100.67b 97.15 ± 43.41b 25.95 ± 8.34 1.00 ± 0.10 40.81 ± 18.67 24.94 ± 9.16 21.18 ± 7.86
5군
GG40		 1877.27 ± 387.83b 563.26 ± 117.07a,b 146.42 ± 60.80b 47.24 ± 11.39 1.04 ± 0.29 81.08 ± 21.39 41.21 ± 11.37 38.55 ± 9.87
표 4에 나타난 바와 같이, HFD 그룹은 ND 그룹 대비 세가지 주요한 SCFA의 수준이 상당히 감소되었고(AA, PA, BA), 유의적이지는 않으나 VA, IBA 수준도 다소 감소하는 것으로 확인할 수 있다. 젤란검이 처리되는 경우(GG10, GG40) HA를 제외한 모든 SCFA 수준이 HFD 그룹 대비 증가하였고, AA, PA, BA의 경우에는 유의적으로 증가하여 ND 그룹의 수준으로 회복시키는 것을 확인할 수 있다.
실험예 6. 생체 내에서 젤란검이 장 건강에 미치는 영향 분석
실험예 4에서와 동일하게 5개 군으로 구분되는 동물모델을 준비하고, 12주 째 장내 미생물총과 β-glucuronidase 활성 및 장 투과성을 분석하였다. 이를 통해 고지방식이로 유도된 동물모델에서 젤란검이 장내 미생물총과 장벽기능에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
1군(ND, 음성대조군) : 정상식이 섭취, 증류수 경구 투여
2군(HFD) : 고지방식이 섭취, 증류수 경구 투여
3군(PC 또는 FOS) : 고지방식이 섭취, 프락토올리고당 40 mg/kg 경구 투여
4군(GG10) : 고지방식이 섭취, 실시예 1의 젤란검 10 mg/kg 경구 투여
5군(GG40) : 고지방식이 섭취, 실시예 1의 젤란검 40 mg/kg 경구 투여
우선, 장내 미생물총과 β-glucuronidase 활성을 분석하기 위하여, 12주째 각 군으로부터 배설물 샘플을 회수하고, 즉시 -80 ℃에 보관하였다. 배설물 샘플로부터 DNA를 DNeasy PowerSoil kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하고, Macrogen(Seoul, Korea)의 MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)로 16S rRNA 유전자 증폭을 수행하였다. 모든 실험은 제조사의 지시에 따라 진행하였다. 페어리 엔드 데이터(Paired-end data)는 FLASH version 1.2.11(Magoc & Salzberg, 2011)를 사용하여 수행하였다. 서열오류로 간주되는 서열을 제거하고, 97% 이상의 유사도를 갖는 서열끼리 클러스터링하였다. 다음으로 NCBI 16S Microbial database를 기반으로 하는 BLAST+(version 2.9.0)를 사용하여, 각 시료의 시퀀스 동정(taxonomic assignmen)을 수행하였다. hannon index and inverse Simpson index는 QIIME (version 1.9)을 사용하여 얻었다.
β-glucuronidase 활성과 MPO(Myeloperoxidase) 활성은, Lee et al(Lee, H.-B., Oh, M.-J., Do, M. H., Kim, Y.-S., & Park, H.-Y. (2020). Molokhia leaf extract prevents gut inflammation and obesity. Journal of Ethnopharmacology, 257, 112866. https://doi.org/doi:10.1016/j.jep.2020.112866)에 기재된 방법을 참고하여 분석하였다. β-glucuronidase 활성은 p-니트로페놀의 방출속도를 통해 분석하였다. 효소 활성은 550 nm에서 microplate reader를 사용하여 분석하고, p-nitrophenol의 표준곡선을 통해 계산하였다.
MPO 활성은 50 mg 클론 섹션을 0.5% hexadecyltrimethyl ammonium bromide를 포함하는 50 mM sodium phosphate buffer에 균질화한 후, 상기 균질물(homogenate)을 3회 동결-해동한 다음, 12,000×g, 5 min, 4 ℃ 조건에서 원심분리하였다. 상등액 100 μL를 회수한 후, 여기에 0.129 mg/mL O-dianisidine과 0.0005% H2O2를 포함하는 50 mM sodium phosphate buffer 400 μL를 혼합하고, 492 nm에서 microplate reader를 사용하여 분석하였고, absorbance/mg protein을 확인하였다.
다음 장 투과성을 분석하기 위하여, 12주째 각 군을 6시간 굶긴 후, FITC-dextran(500 mg/kg)를 경구 투여한 다음, 2 시간과 5 시간 후에 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 상기 채취한 각각의 혈액을 원심분리를 통해 혈장을 분리하고, 비처리된 혈장에 FITC-dextran의 연속희석을 사용하여 표준용액을 준비하였다. 상기 혈장의 형광 수준을 485/535 nm(excitation/emission)에서 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
실험결과는 평균값±평균의 표준편차(Mean±Standard Error of Mean)로 표시하였고, 실험결과에 대한 통계학적 유의성은 Tukey's post hoc test에 의한 일원 분산 분석으로 검증하여 p값(p-value)이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하여, 서로 다른 문자(a-c)로 표시하였다.
도 54는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서의 장내 미생물총의 알파 다양성(Alpha-diversity)를 나타낸 그래프로, 시료 간의 군집 다양성 확인을 위해 Observed Operational Taxonomic Unit(Observed OTU)(A), Shannon index(B), Simpson index(C)를 이용하여 분석하였다.
도 54에 나타난 바와 같이 HFD 그룹은 장내 미생물 풍부도(OUTs), 다양성 지수(shannon), 균둥성 지수(simpson)가 모두 감소하는 것을 확인하였고, 이는 젤란검의 투여(GG10, GG40)를 통해 어느정도 회복되는 것을 확인할 수 있다.
도 55는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서의 장내 미생물총의 상대적 풍부도를 나타낸 플롯으로, 이에 따르면 HFD 그룹에서 미생물의 큰 변화는 Desulfovibrionales, Deferribacterales 및 Clostridiales이 크게 증가하였고, Bacteroidales 및 Lactobacillales가 크게 감소하였다는 것을 확인할 수 있다. 젤란검 처리를 통해 Bacteroidales 및 Lactobacillales의 생장을 촉진하며, Desulfovibrionales, Deferribacterales 및 Clostridiales의 증가를 크게 억제하는 것을 확인할 수 있다.
도 56A는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 시간에 따른 혈장 FITC-덱스트란 농도 그래프이고, 도 56B는 혈장 FITC-덱스트란 농도 그래프(도 56A)에 대한 AUC(Area Under the Curve)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 56에 나타난 바와 같이, 장내 투과성 분석결과 HFD 그룹에서는 FITC-dextran 농도가 유의적으로 증가하였다. 그러나 젤란검을 투여한 GG40 그룹에서는 FITC-dextran 농도가 유의적으로 감소하였다. 다시 말해 고지방식이로 인해 유도된 장벽기능 약화가 젤란검으로 인해 회복된다는 것을 알 수 있다.
도 57A는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 β-glucuronidase 활성을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 57B는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 myeloperoxidase 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 58A는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 TNF-α mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이고, 도 58B는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서 IL-1β mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 57에 나타난 바와 같이, β-glucuronidase 활성, MPO 활성 및 염증성 사이토카인 발현은 HFD 그룹에서는 증가하였다(도 3D, E). GG 처리로 인해 장내 염증과 효소 활성을 극적으로 회복시켰다.
실험예 7.비알콜성 지방간질환과 장내 미생물군의 상관관계
Pearson's correlation analysis을 사용하여 장내 미생물총과 대사 매개변수(metabolic parameter) 간의 상관관계를 평가하여, 도 59에 나타내었다. cor.test 함수(method="pearson")를 사용하여 계산하였고, pheatmap 패키지를 사용하여 R 소프트웨어(버전 3.3.3.)를 사용하여 구축하였다.
도 59는 장내 미생물총과 대사 매개변수 간의 상관관계를 나타내는 히트맵(heatmap)으로, 색상 척도(color scale)는 파란색(음의 상관관계)에서 빨간색(양의 상관관계)까지의 Pearson 상관계수를 의미하고, 대사산물(metabolite) 유형은 오른쪽 컬러바로 표시된다. two-tailed unpaired Student t-검정을 사용하여 유의미한 상관관계를 분석하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
도 59에 나타난 바와 같이, NAFLD(비알콜성 지방간질환)와 관련된 변수와 장내 미생물총 간의 상관관계는 Pearson's correlation analysis을 통해 확인하였다. HFD 그룹에서 증가한 Desulfovibrionales, Deferribacterales, 및 Clostridiales는, NAFLD와 관련된 마커와 양의 상관관계가 있는 것으로 확인되었고, SCFA와는 음의 상관관계가 있는 것을 확인되었다.
젤란검의 투여시, 고지방식이에 의해 감소된 Bacteroidales 및 Lactobacillales의 생육이 회복되었는데, 이는 NAFLD 관련 마커와 음의 상관관계를 가졌고, SCFA와는 양의 상관관계를 갖는 것으로 확인되었다. 종합하면, HFD로 인해 유발된 NAFLD가 장내 미생물총의 불균형을 야기하는데, 본 발명에 따른 젤란검은 고지방 식이에 의해 불균형해진 장내 미생물총을 조절 및 회복시킴으로써 NAFLD를 본질적으로 개선할 수 있다는 것을 알 수 있다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1의 젤란검 500 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1의 젤란검 300 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1의 젤란검 200 ㎎
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
락토오스 14.8 ㎎
마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1의 젤란검 600 ㎎
만니톨 180 ㎎
주사용 멸균 증류수 2974 ㎎
Na2HPO4,12H2O 26 ㎎
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1의 젤란검 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1의 젤란검 1,000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1의 젤란검 1,000 ㎎
구연산 1,000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (9)

  1. 젤란검(gellan gum)을 유효성분으로 하는 프리바이오틱 또는 장 건간 개선용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프리바이오틱 조성물은 장내 유해균 대비 장내 유익균을 상대적으로 증식시키는 프리바이오틱 활성을 가지며,
    상기 장내 유익균은 락토바실러스 람노서스(Lactobalcillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며,
    상기 장내 유해균은 대장균인 것을 특징으로 하는 프리바이오틱 또는 장 건간 개선용 식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 젤란검은 로우 아실 젤란검(low acyl gellan gum)인 것을 특징으로 하는 프리바이오틱 또는 장 건간 개선용 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 젤란검(gellan gum)을 5 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 프리바이오틱 또는 장 건간 개선용 식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 대사성 질환 개선 또는 예방용인 것을 특징으로 하는 프리바이오틱 또는 장 건간 개선용 식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 이상지질혈증, 비알코올성 지방간, 인슐린 저항성 증후군, 당뇨 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  7. 젤란검을 유효성분으로 하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 젤란검은 로우 아실 젤란검(low acyl gellan gum)인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
  9. 제7항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 이상지질혈증, 비알코올성 지방간, 인슐린 저항성 증후군, 당뇨 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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