BR112021014094A2 - Composição prebiótica e uso da mesma - Google Patents

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Abstract

composição prebiótica e uso da mesma. o presente documento revela uma composição ingerível que compreende um esfingano e o uso da mesma como um prebiótico.

Description

"COMPOSIÇÃO PREBIÓTICA E USO DA MESMA" Pedidos Relacionados
[001] O presente pedido está sendo depositado no dia 15 de janeiro de 2020 como Pedido de Patente Internacional PCT e reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA no 62/794.452, depositado no dia 18 de janeiro de 2019, e ao Pedido Provisório dos EUA no 62/869.248, depositado no dia 1º de julho de 2019, cujas revelações incorporam-se ao presente documento por referência na íntegra. Campo da Invenção
[002] Revelam-se neste documento uma composição ingerível que compreende um esfingano (sphingan) e o uso da mesma como um prebiótico. Antecedentes da Invenção
[003] O trato gastrointestinal humano é um ecossistema microbiano altamente complexo que provou-se extraordinariamente estável (Zoetendal (1998)). Muitas abordagens diferentes são usadas para modular a flora intestinal de uma maneira que seja benéfica à saúde do hospedeiro (vide, por exemplo, Bielecka (2002) e Steer (2000)). Essas diferentes abordagens incluem a adição de micro- organismos vivos aos alimentos (probióticos), a adição de ingredientes alimentares ou de fibra dietética para estimular seletivamente bactérias benéficas no hospedeiro (prebióticos) e uma combinação tanto de probióticos quanto de prebióticos (sinbióticos).
[004] Os prebióticos são substratos não digeríveis que são usados seletivamente pelos micro-organismos do hospedeiro para promover benefícios à saúde (Gibson (2017)). Os efeitos prebióticos no intestino podem ser avaliados com base no desenvolvimento de bactérias promotoras da saúde, tais como lactobacilli e bifidobacteria, na diminuição de patógenos intestinais e no aumento ou redução na produção de metabólitos bacterianos relacionados à saúde. A natureza prebiótica/bifidogênica de prebióticos selecionados (tais como inulina, fruto-
oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, lactulose e um arabino-oligossacarídeo) foi sugerida e/ou confirmada em estudos anteriores (vide, por exemplo, Guimaraes (2018), Karltohn-Senaye (2013), Patel (2013), Saavedra (2002), Tuohy (2001), Tuohy (2002), US8313789B2, US20100092440A1 e WO2004002240A2).
[005] Em termos gerais, os esfinganos são polissacarídeos compostos pelo sacarídeo tetramérico substituído ou não substituído a seguir, representado em geral por [(→3)Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc (β1→4)Rha(α1→)]n. Esfinganos conhecidos incluem, por exemplo, gelano (S-60), welano (S-130), ramsano (S-194) e diutano (S- 657).
[006] O gelano (goma gelana ou S-60) é produzido por linhagens da espécie Sphingomonas elodea (antiga Pseudomonas elodea), por exemplo, linhagem ATCC 31461 (vide, por exemplo, Morrison (2016), Sworn (2009) e US4326053A). Formas comuns de goma gelana incluem gomas gelanas com alto teor de acila (também conhecidas como nativas) não clarificadas (por exemplo, gelano KELCOGEL® LT100), com baixo teor de acila não clarificadas (por exemplo, gelano KELCOGEL® LT) e com baixo teor de acila clarificadas (por exemplo, gomas gelanas KELCOGEL® e KELCOGEL® F) (Sworn (2009)). Uma variedade de graus de especialidade também se faz disponível, por exemplo, com alto teor de acila, sem PHB e clarificada (por exemplo, gelano KELGOGEL® HT) e com baixo teor de acila e clarificada (duplamente precipitada) (por exemplo, gelano GELRITETM MK). A forma nativa, ou com alto teor de acila, do gelano inclui dois substituintes acila (acetato em O6 e glicerato em O2) na unidade (1→3)Glc, e, em média, há um glicerato para cada tetrâmero e um acetato para cada dois tetrâmeros (Kuo (1986)). No gelano com baixo teor de acila, o glicerato e acetato fazem-se ausentes. Gomas gelanas também podem ser produzidas com um teor intermediário de glicerato e acetato. Um produto comercial com teor reduzido de glicerato e acetato é o gelano KELCOGEL® DGA.
[007] Em termos gerais, a goma gelana atua como um agente gelificante ou suspensor em certos produtos ingeríveis e se faz presente em níveis que variam de 0,02% a 0,5% p/v (vide, por exemplo, Fallourd (2009), Morrison (2016), Sworn (2009), US6602996B1, US6663911B2, US5342626A, US8513408B2 e US20080008814A1). Antes de sua aprovação como aditivo alimentar, estudos avaliaram a segurança da goma gelana quando administrada a ratos e seres humanos (vide, por exemplo, Anderson (1988) e Edwards (1995); vide também Anderson (1990)). Por exemplo, Edwards (1995) descreve a alimentação de ratos Wistar durante 28 dias com uma dieta que incluiu 50 g/kg/d de goma gelana (para fins de referência, 50 g/kg para ratos corresponde a uma quantidade equivalente para seres humanos de cerca de 8 g/kg (vide, por exemplo, FDA Guidance (2005)). Interessantemente, Edwards (1995) concluiu que a goma gelana não teve efeito consistente sobre os ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs, tais como acetato, propionato e butirato) cecais ou fecais.
Além disso, Anderson (1988) descreve um estudo onde voluntários humanos ingeriram certa quantidade de goma gelana de acordo com um cronograma de dosagem fixo de 175 mg/kg/d durante 7 dias, seguidos por 200 mg/kg/d por mais 16 dias (para uma faixa de peso humano de 60 kg a 75 kg, 175 mg/kg correspondem a uma faixa de 10,5 a 13 g, ao passo que 200 mg/kg correspondem a uma faixa de 12 g a 15 g). Com base nos resultados apresentados nesse estudo, Anderson (1988) concluiu que a ingestão de goma gelana não provocou efeitos adversos nem dietéticos nem fisiológicos.
Além disso, Anderson (1988) concluiu que a goma gelana exibiu um efeito de intumescência fecal.
Em consonância com o efeito de intumescência fecal observado por Anderson (1988), um estudo posterior demonstrou que a goma gelana reduz a diarreia em gatos (US9028861B2). Em referência a Tetsuguchi (1997), Li (2019) menciona, sem prova ou explicação, que um oligossacarídeo de gelano, ao que consta, possui efeitos prebióticos intestinais, ainda que Tetsuguchi (1997) francamente não tenha avaliado os efeitos prebióticos intestinais de um oligossacarídeo de gelano. Até hoje, nenhum estudo demonstrou definitivamente se a goma gelana, ou um oligossacarídeo derivado da mesma, atua como um agente prebiótico.
[008] O welano (goma welana ou S-130) é produzido pela Sphingomonas sp. (por exemplo, ATCC 31555) (US4342866A e US5175277A). Aproximadamente dois terços das unidades (1→4)Glc do welano são substituídos em O3 com um grupo α-L- ramnopiranosila (isto é, Rha(α1→)), ao passo que as demais unidades (1→4)Glc do welano são substituídas com um grupo α-L-manopiranosila (isto é, Man(α1→)) (Stankowski (1992)). Em aditamento, a unidade (1→3)Glc do welano pode ser substituída em O2 com uma acetila (Stankowski (1992)).
[009] O ramsano (goma ramsana ou S-194) é produzido pela Sphingomonas sp. (por exemplo, ATCC 31961) (US4401760A). O ramsano é substituído na posição O6 da unidade (1→3)Glc com D-Glc(β1→6)-D-Glc(α1→) (Jansson (1986)). O ramsano contém um grupo O-acetila por unidade repetida, distribuído sobre posições secundárias (Jansson (1986)).
[010] O diutano (goma diutana ou S-657) é produzido pela Sphingomonas sp. (por exemplo, ATCC 53159) (US5175278A e US20130189748A1). A unidade (1→4)Glc do diutano é substituída em O3 com um Rha(α1→4)-Rha(α1→), em O6 com uma acetila e a um grau variável nas posições O2 e/ou O6 da unidade (1→3)Glc com uma acetila (Diltz (2001)). Sumário
[011] O presente documento revela uma composição ingerível que compreende um esfingano e o uso da mesma como um prebiótico. Abreviações
[012] O texto a seguir inclui diversos termos abreviados. As abreviações de termos selecionados revelados neste documento são identificadas abaixo.
[013] A: Doador A (sexo feminino, 28 anos)
[014] Ac: Acetato
[015] B: Doador B (sexo feminino, 41 anos)
[016] b-SCFAs: ácidos graxos de cadeia curta ramificados (por exemplo, isobutirato, isovalerato e isocaproato)
[017] C: doador C (sexo feminino, 34 anos)
[018] C1: período controle 1
[019] C2: período controle 2
[020] CON(ave): valor de concentração médio para os períodos controle 1 e 2
[021] CD: doença de Crohn
[022] DC: reator do cólon distal
[023] DP: grau de polimerização
[024] Glc: D-glicopiranosila
[025] GlcA: ácido D-glicopiranossilurônico
[026] Glyc: L-glicerato
[027] GPRs: receptores acoplados a proteína G
[028] HA: com alto teor de acila
[029] HA/LA: com alto teor de acila ou com baixo teor de acila
[030] IBDs: doenças inflamatórias intestinais
[031] IBS: síndrome do intestino irritável
[032] IFN: interferon
[033] IL: interleucina
[034] LA: com baixo teor de acila
[035] LCSs: esfinganos de cadeia longa
[036] LPS: lipopolissacarídeo
[037] MAMPs: padrões moleculares associados a micróbios
[038] Man: L-manopiranosila
[039] mM: milimolar (isto é, milimols por litro)
[040] MN: peso molecular médio nominal
[041] MW: peso molecular médio ponderado
[042] NaB: butirato de sódio
[043] OTU: unidade taxonômica operacional
[044] PHB: poli-hidroxibutirato
[045] PC: cólon proximal
[046] PRRs: receptores de reconhecimento de padrões
[047] Rha: L-ramnopiranosila
[048] ROS: espécie reativa do oxigênio
[049] SCFAs: ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, acetato, propionato e butirato)
[050] SHIME: Simulador do ecossistema microbiano intestinal humano
[051] SOS: oligossacarídeo de esfingano
[052] SPS: polissacarídeo de esfingano
[053] TEER: resistência elétrica transepitelial
[054] Tetrâmero: [Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha], Glc,GlcA,Glc,Rha ou Glc2,GlcA,Rha
[055] Octâmero: [Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha]2 Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha ou Glc4,GlcA2,Rha2
[056] SEC: cromatograma por exclusão de tamanhos
[057] TGF: fator de crescimento transformador
[058] TLR: receptor toll-like
[059] TNF: fator de necrose tumoral
[060] TR1: período de tratamento 1
[061] TR2: período de tratamento 2
[062] TR3: período de tratamento 3
[063] TRT(ave): valor de concentração médio para os períodos de tratamento 1, 2 e 3
[064] UC: colite ulcerativa Breve Descrição dos Desenhos
[065] FIG. 1a. Cromatograma por exclusão de tamanhos para polissacarídeos e oligossacarídeos de esfingano derivados de um gelano com alto teor de acila tratados com ácido (SN9, linha cheia) e enzima (SN18, linha tracejada) exibindo os tempos de eluição dos padrões de peso molecular do pululano (a saber, >50 kDa (6,5 min, quadrado cheio (■)), 12 kDa (8,8 min, círculo cheio (●)), 5 kDa (9,3 min, triângulo cheio (▲)), 1 kDa (10 min, quadrado vazio (□)), 342 Da (10,65 min, círculo vazio (○)) e 180 Da (11,15 min, triângulo vazio ())).
[066] Fig. 1b. Cromatograma por exclusão de tamanhos para polissacarídeos e oligossacarídeos de esfingano derivados de um gelano com baixo teor de acila tratados com ácido (SN10, linha cheia) e enzima (SN17, linha tracejada) exibindo os tempos de eluição dos padrões de peso molecular do pululano (a saber, >50 kDa (6,5 min, quadrado cheio (■)), 12 kDa (8,8 min, círculo cheio (●)), 5 kDa (9,3 min, triângulo cheio (▲)), 1 kDa (10 min, quadrado vazio (□)), 342 Da (10,65 min, círculo vazio (○)) e 180 Da (11,15 min, triângulo vazio ())).
[067] FIG. 2a. Produção média de acetato (mM) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) em um reator do cólon proximal (PC) para três doadores diferentes (A, B e C), onde * indica diferenças estatisticamente significativas em relação ao período anterior, ao passo que letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[068] FIG. 2b. Produção média de acetato (mM) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) em um reator do cólon distal (DC) para três doadores diferentes (A, B e C), onde * indica diferenças estatisticamente significativas em relação ao período anterior, ao passo que letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[069] FIG. 3a. Produção média de propionato (mM) em um reator do cólon proximal (PC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde * indica diferenças estatisticamente significativas em relação ao período anterior, ao passo que letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[070] FIG. 3b. Produção média de propionato (mM) em um reator do cólon distal (DC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde * indica diferenças estatisticamente significativas em relação ao período anterior, ao passo que letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[071] FIG. 4a. Produção média de butirato (mM) em um reator do cólon proximal (PC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde * indica diferenças estatisticamente significativas em relação ao período anterior, ao passo que letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[072] FIG. 4b. Produção média de butirato (mM) em um reator do cólon distal (DC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde * indica diferenças estatisticamente significativas em relação ao período anterior, ao passo que letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[073] FIG. 5a. Produção média de lactato (mM) em um reator do cólon proximal (PC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[074] FIG. 5b. Produção média de lactato (mM) em um reator do cólon distal (DC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[075] FIG. 6a. Produção média de amônio (mg/L) em um reator do cólon proximal (PC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[076] FIG. 6b. Produção média de amônio (mg/L) em um reator do cólon distal (DC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[077] FIG. 7a. Produção média de SCFAs ramificados (mM) em um reator do cólon proximal (PC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[078] FIG. 7b. Produção média de SCFAs ramificados (mM) em um reator do cólon distal (DC) ao longo do período controle (CON(ave), n = 6) e período de tratamento (TRT(ave), n = 9) para três doadores diferentes (A, B e C), onde * indica diferenças estatisticamente significativas em relação ao período anterior, ao passo que letras diferentes indicam uma diferença estatística entre diferentes tratamentos; p < 0,05.
[079] FIG. 8. Índice de diversidade de Simpson recíproco no lúmen e muco do cólon proximal (PC) ou distal (DC) do SHIME em diferentes pontos no tempo durante o período controle (C1 e C2) e o período de tratamento (TR1, TR2 e TR3)
com goma gelana para três doadores humanos diferentes (n = 1). A intensidade do sombreamento indica o índice de diversidade absoluto, normalizado para cada um dos três doadores diferentes (isto é, em cada linha).
[080] FIG. 9. Abundância (%) do filo dominante no lúmen ou muco dos reatores do cólon proximal (PC) ou distal (DC) do SHIME em diferentes pontos no tempo durante o período controle (C1 e C2) e período de tratamento (TR1, TR2 e TR3) com goma gelana para três doadores humanos diferentes (n = 1). Obs.: uma das amostras provou-se claro ponto fora da curva e, portanto, foi removida dessa análise de amostras controle, a saber, a amostra mucosa no PC do Doador A durante a segunda semana de controle (C2).
[081] FIG. 10. Abundância (%) de diferentes famílias pertencentes ao filo específico no lúmen dos reatores do cólon proximal (PC) do SHIME em diferentes pontos no tempo durante o período controle (C1 e C2) e período de tratamento (TR1, TR2 e TR3) com goma gelana para três doadores humanos diferentes (n = 1). A intensidade do sombreamento indica a abundância absoluta, normalizada para cada uma das três famílias diferentes (isto é, em cada linha). A intensidade do sombreamento indica a abundância absoluta, normalizada para cada uma das três famílias diferentes (isto é, em cada linha).
[082] FIG. 11. Abundância (%) de diferentes famílias pertencentes ao filo específico no lúmen dos reatores do cólon distal (DC) do SHIME em diferentes pontos no tempo durante o período controle (C1 e C2) e período de tratamento (TR1, TR2 e TR3) com goma gelana para três doadores humanos diferentes (n = 1). A intensidade do sombreamento indica a abundância absoluta, normalizada para cada uma das três famílias diferentes (isto é, em cada linha).
[083] FIG. 12. Abundância (%) de diferentes famílias pertencentes ao filo específico no muco dos reatores do cólon proximal (PC) do SHIME em diferentes pontos no tempo durante o período controle (C1 e C2) e período de tratamento (TR1,
TR2 e TR3) com goma gelana para três doadores humanos diferentes (n = 1). A intensidade do sombreamento indica a abundância absoluta, normalizada para cada uma das três famílias diferentes (isto é, em cada linha). Digno de nota, uma das amostras provou-se claro ponto fora da curva e, portanto, foi removida dessa análise de amostras controle, a saber, a amostra mucosa no PC do Doador A durante a segunda semana de controle (C2).
[084] FIG. 13. Abundância (%) de diferentes famílias pertencentes ao filo específico no muco dos reatores do cólon distal (DC) do SHIME em diferentes pontos no tempo durante o período controle (C1 e C2) e período de tratamento (TR1, TR2 e TR3) com goma gelana para três doadores humanos diferentes (n = 1). A intensidade do sombreamento indica a abundância absoluta, normalizada para cada uma das três famílias diferentes (isto é, em cada linha).
[085] FIG. 14. Representação esquemática de uma co-cultura de células Caco-2 e THP1. As células Caco-2 são semeadas sobre uma membrana semipermeável, que é posicionada no topo de poços que foram semeados com células THP1. Isso gera um compartimento apical (AP) e um compartimento basolateral (BL). A monocamada de células Caco-2 gera uma barreira contra macromoléculas e permite a passagem, por transporte passivo, de pequenas moléculas entre o espaço intercelular e o transporte ativo de micro e macromoléculas através das membranas celulares. A co-cultura de ambos os tipos de célula permite a relação indireta entre o conteúdo luminar, que está em contato com as células Caco-2, e o conteúdo peri-intestinal, em contato com as células imunológicas (THP1). Em aditamento, os metabólitos usados/transformados pelas células epiteliais podem modular a resposta celular imune, e vice-versa.
[086] FIG 15. Cascata de sinalização ativada mediante dano à barreira epitelial intestinal, fazendo com que o conteúdo luminar rompa a parede celular intestinal. IFN-γ: interferon gama; IL: interleucinas; MCP-1: proteína quimioatraente de monócitos 1; ROS: espécie reativa do oxigênio; TGF-β: fator de crescimento transformador beta; TH: células T auxiliares; TNF-α: fator de necrose tumoral alfa; Treg: células T reguladoras.
[087] FIG 16. Vias de sinalização de LPS e TNF-α que provocam inflamação. AP-1: proteína ativadora 1 (fator de transcrição); IL: interleucinas, LPS: lipopolissacarídeos; NF-κB: fator nuclear kappa B (fator de transcrição); TLR4: receptor toll-like 4 (receptor de LPS); TNF-α: fator da necrose tumoral alfa; TNFR: receptor do TNF-α.
[088] FIG 17. Resistência elétrica transepitelial (TEER) nos testes controle CM e NaB. Mediu-se a TEER 24 h após tratamento de co-culturas Caco-2/THP1- Blue™, e cada valor 24 h foi normalizado a seu valor 0 h correspondente e é representado em termos de porcentagem do valor inicial. A linha tracejada representa 100% (valor inicial). Os dados são representados graficamente por média ± SEM. (*) representa diferença estatística significativa entre CM e NaB. (****) = p < 0,0001. CM: meio completo; NaB: butirato de sódio.
[089] FIG 18. Atividade basolateral do NF-κB de células THP1-Blue™ nos testes controle LPS-, LPS+, LPS+HC e LPS+NaB. Mediu-se a atividade do NF-κB após 6 h de tratamento de co-culturas Caco-2/THP1-Blue™ com LPS no lado basolateral após pré-tratamento por 24 h com NaB ou meio completo no lado apical. Os dados são representados graficamente por média ± SEM. (*) representa diferenças estatísticas significativas em comparação a LPS+. (*) = p < 0,05; (****) = p < 0,0001. LPS-: células tratadas com o meio completo (sem LPS); LPS+: células tratadas com LPS; HC: hidrocortisona; NaB: butirato de sódio.
[090] FIG 19. Secreção basolateral de IL-6 (A) e IL-10 (B) nos testes controle LPS-, LPS+, LPS+HC e LPS+NaB. Mediram-se as citocinas após 6 h de tratamento de co-culturas Caco-2/THP1-Blue™ com LPS no lado basolateral após pré- tratamento por 24 h com NaB ou meio completo no lado apical. Os dados são representados graficamente por média ± SEM. (*) representa diferenças estatísticas significativas em comparação a LPS+. (***) = p < 0,001; (****) = p < 0,0001. LPS-: células tratadas com o meio completo (sem LPS); LPS+: células tratadas com LPS; HC: hidrocortisona; NaB: butirato de sódio.
[091] FIG 20. Secreção basolateral de IL-1β (A), IL-8 (B), CXCL10 (C), TNF- α (D) e MCP-1 (E) nos testes controle LPS-, LPS+, LPS+HC e LPS+NaB. Mediram- se as citocinas após 6 h de tratamento de co-culturas Caco-2/THP1-Blue™ com LPS no lado basolateral após pré-tratamento por 24 h com NaB ou meio completo no lado apical. Os dados são representados graficamente por média ± SEM. (*) representa diferenças estatísticas significativas em comparação a LPS+. (*) = p < 0,05; (**) = p < 0,01; (***) = p < 0,001; (****) = p < 0,0001. LPS-: células tratadas com o meio completo (sem LPS); LPS+: células tratadas com LPS; HC: hidrocortisona; NaB: butirato de sódio.
[092] FIG 21. Efeito das amostras SHIME sobre a resistência elétrica transepitelial (TEER) de co-culturas Caco-2/THP1-Blue™. São exibidos resultados para três doadores diferentes individualmente (A) e a média dos três doadores (B). Mediu-se a TEER 24 h após tratamento de co-culturas, e cada valor 24 h foi normalizado a seu valor 0 h correspondente e é representado pela porcentagem do valor inicial. A linha tracejada cinza representa 100% (valor inicial). A linha tracejada corresponde ao controle experimental CM (meio completo). Os dados são representados graficamente por média ± SEM. Não observou-se nenhuma diferença significativa entre o controle e o tratamento dos três doadores diferentes. PC: amostras do cólon proximal; DC: amostras do cólon distal.
[093] FIG 22. Efeito de amostras SHIME sobre a atividade do NF-κB de células THP-1-Blue™. São exibidos resultados para três doadores diferentes individualmente (A) e a média dos três doadores (B). Mediram-se os níveis de atividade do NF-κB 6 h após tratamento com LPS no lado basolateral de co-culturas
Caco-2/THP-1-Blue™ após pré-tratamento do lado apical por 24 h com amostras SHIME. A linha tracejada corresponde ao controle experimental LPS+. Os dados são representados graficamente por média ± SEM. Não observou-se nenhuma diferença significativa entre o controle e o tratamento dos três doadores diferentes. PC: amostras do cólon proximal; DC: amostras do cólon distal.
[094] FIG 23. Efeito das amostras SHIME sobre a secreção de IL-6 (A e B) e IL-10 (C e D). São exibidos resultados para três doadores diferentes individualmente (A e C), e a média dos três doadores (B e D). Mediram-se os níveis de citocina 6 h após tratamento com LPS no lado basolateral de co-culturas Caco-2/THP-1-Blue™ após pré-tratamento do lado apical por 24 h com amostras SHIME. A linha tracejada corresponde ao controle experimental LPS+. Os dados são representados graficamente por média ± SEM. (*) representa diferenças estatisticamente significativas em comparação ao controle. (*) = p < 0,05. PC: amostras do cólon proximal; DC: amostras do cólon distal.
[095] FIG 24. Efeito de amostras SHIME sobre a secreção de IL-1β (A+B) e TNF-α (C+D). São exibidos resultados para três doadores diferentes individualmente (A a C), e a média dos três doadores (B a D). Mediram-se os níveis de citocina 6 h após tratamento com LPS no lado basolateral de co-culturas Caco-2/THP-1-Blue™ após pré-tratamento do lado apical por 24 h com amostras SHIME. A linha tracejada corresponde ao controle experimental LPS+. Os dados são representados graficamente por média ± SEM. (*) representa diferenças estatisticamente significativas em comparação ao controle. (****) = p < 0,0001; PC: amostras do cólon proximal; DC: amostras do cólon distal.
[096] FIG 25. Efeito de amostras SHIME sobre a secreção de IL-8 (A+B), CXCL10 (C+D) e MCP-1 (E+F). São exibidos resultados para três doadores diferentes individualmente (A-C-E) e a média dos três doadores (B-D-F). Mediram-se os níveis de citocina 6 h após tratamento com LPS no lado basolateral de co-culturas
Caco-2/THP-1-Blue™ após pré-tratamento do lado apical por 24 h com amostras SHIME. A linha tracejada corresponde ao controle experimental LPS+. Os dados são representados graficamente por média ± SEM. Não observou-se nenhuma diferença significativa entre o controle e o tratamento dos três doadores diferentes. PC: amostras do cólon proximal; DC: amostras do cólon distal. Definições
[097] O termo "esfingano", conforme usado neste documento, refere-se a um esfingano com alto teor de acila, um esfingano com teor intermediário de acila, um esfingano com baixo teor de acila, um polissacarídeo de esfingano com alto teor de acila, um polissacarídeo de esfingano com teor intermediário de acila, um polissacarídeo de esfingano com baixo teor de acila, um oligossacarídeo de esfingano com alto teor de acila, um oligossacarídeo de esfingano com teor intermediário de acila, um oligossacarídeo de esfingano com baixo teor de acila, ou uma combinação desses.
[098] O termo "com alto teor de acila" (ou "HA"), conforme usado neste documento, refere-se a um esfingano que compreende um grupo acila (por exemplo, acetila e glicerila). Um esfingano com alto teor de acila inclui, por exemplo, gelano HA, welano HA, ramsano HA, diutano HA etc.
[099] O termo "com teor intermediário de acila" (ou "IA"), conforme usado neste documento, refere-se a um esfingano cujo teor de acila é menor que o de um esfingano com alto teor de acila porém maior que o de um esfingano com baixo teor de acila. Um esfingano com teor intermediário de acila inclui, por exemplo, gelano IA, welano IA, ramsano IA, diutano IA etc.
[0100] O termo "com baixo teor de acila" (ou "LA"), conforme usado neste documento, refere-se a um esfingano do qual o(s) grupo(s) acila foram essencialmente removidos. Um esfingano com baixo teor de acila inclui, por exemplo, gelano LA, welano LA, ramsano LA, diutano LA etc.
[0101] Um esfingano nativo pode incluir, por exemplo, gelano (S-60), welano (S-130), ramsano (S-194), diutano (S-657), S-88, S-198 e S-7 compostos por um sacarídeo tetramérico substituído ou não substituído (“tetrâmero") representado em geral por [(→3)Glc(β1→4)GlcA(β1→4)Glc(β1→4)Rha(α1→)]n, onde Glc e GlcA são açúcares D, ao passo que Rha é um açúcar L, e onde o Man aplicável é um açúcar L. As estruturas químicas de esfinganos selecionados são representadas abaixo, com os termos para os monossacarídeos individuais abreviados (por exemplo, (1→3)Glc, (1→4)GlcA, (1→4)Glc e (1→4)Rha)).
Esfingano R1 R2 R3 R4 R5 R6 Gelano HA Ac ou H Glyc M H H H Gelano LA H H M H H H Diutano Ac ou H Ac ou H M H Rha(α1→4)- H Rha(α1→) Ramsanoa Glc(β1→6)- H M H H H Glc(α1→) Welano H Ac M H Rha(α1→) ou H Man(α1→) aO ramsano contém aproximadamente um grupo O-acetila por tetrâmero, distribuído sobre posições secundárias.
[0102] O termo "M", conforme usado neste documento, refere-se a um cátion fisiologicamente aceitável que inclui, por exemplo, um próton (H+), sódio (Na+), potássio (K+), cálcio (Ca2+), magnésio (Mg2+) ou uma combinação desses.
[0103] O valor de "n" refere-se a um número total ou fracionado e refere-se ao número de unidades tetraméricas que podem ser substituídas ou não substituídas. Entende-se que certos esfinganos nativos têm um valor de n que pode ser correlacionado ao peso molecular do mesmo (por exemplo, goma gelana nativa com MW ≈ 2,5 x 106 e MN ≈ 2,2 x 106) (US6242035B1).
[0104] A expressão "grau de polimerização", ou DP, conforme usada neste documento, refere-se ao número de unidades de monossacarídeo na cadeia de polissacarídeos ou oligossacarídeos. Por exemplo, com referência à estrutura química representada acima, onde n é quatro, o DP é dezesseis.
[0105] A expressão "polissacarídeo de esfingano" (ou "SPS"), conforme usada neste documento, refere-se a um esfingano com alto/baixo teor acila com um DP maior que 30 e um DP menor que o encontrado em um esfingano nativo. Entende-se que um SPS obtido de um esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo pode compreender uma pluralidade de polissacarídeos com diferentes DPs.
[0106] A expressão "oligossacarídeo de esfingano" (ou "SOS"), conforme usada neste documento, refere-se a um esfingano com alto/baixo teor de acila com um DP superior ou igual a dois ou inferior ou igual a trinta (isto é, 2 ≥ DP ≤ 30). Entende-se que um SOS obtido de um esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo (ou esfingano HA/IA/LA) pode compreender uma pluralidade de oligossacarídeos. Descrição Detalhada
[0107] Em termos gerais, as modalidades reveladas neste documento referem-se a uma composição ingerível e ao uso da mesma, a métodos para usar uma composição ingerível, a um processo para preparar um oligossacarídeo de esfingano e a um oligossacarídeo de esfingano preparado pelo referido processo para preparar um oligossacarídeo de esfingano.
[0108] Uma primeira modalidade refere-se a uma composição ingerível que compreende uma quantidade prebiótica eficaz de um esfingano.
[0109] A quantidade prebiótica eficaz de um esfingano pode compreender de cerca de 1 g a cerca de 10 g, e todos os valores entre esses, tal como, por exemplo, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9, cerca de 3,0, cerca de 3,1, cerca de 3,2, cerca de 3,3, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, cerca de 3,9, cerca de 4,0, cerca de 4,1, cerca de 4,2, cerca de 4,3, cerca de 4,4, cerca de 4,5, cerca de 4,6, cerca de 4,7, cerca de 4,8, cerca de 4,9, cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,1, cerca de 8,2, cerca de 8,3, cerca de 8,4, cerca de 8,5, cerca de 8,6, cerca de 8,7, cerca de 8,8, cerca de 8,9, cerca de 9,0, cerca de 9,1, cerca de 9,2, cerca de 9,3, cerca de 9,4, cerca de 9,5, cerca de 9,6, cerca de 9,7, cerca de 9,8 ou cerca de 9,9.
[0110] Em um aspecto da primeira modalidade, a quantidade do esfingano é selecionada de cerca de 1 g a cerca de 10 g, de cerca de 1 g a cerca de 9 g, de cerca de 1 g a cerca de 8 g, de cerca de 1 g a cerca de 7 g, de cerca de 1 g a cerca de 6 g, de cerca de 1 g a cerca de 5 g, de cerca de 1 g a cerca de 4 g, de cerca de 1 g a cerca de 3 g, ou em cerca de 2 g.
[0111] As composições da primeira modalidade podem compreender um esfingano HA/IA/LA, tal como gelano HA, gelano IA, gelano LA, welano HA, welano
IA, welano LA, ramsano HA, ramsano IA, ramsano LA, diutano HA, diutano IA, diutano LA, S-88, S-198, S-7 ou uma combinação desses.
[0112] Composições da primeira modalidade podem compreender um polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA.
[0113] Como explicado em mais detalhes neste documento, um polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA pode ser obtido a partir de um esfingano HA/LA usando, por exemplo, um processo que compreende homogeneização a alta pressão, como descreve, por exemplo, a décima modalidade. Exemplos de polissacarídeos de esfingano HA/IA/LA incluem, entre outros: um polissacarídeo de gelano com alto teor de acila obtido a partir de um gelano com alto teor de acila (por exemplo, gelano KELCOGEL® LT100 e gelano KELGOGEL® HT), um polissacarídeo de gelano com teor intermediário de acila obtido a partir de um gelano com teor intermediário de acila (por exemplo, KELCOGEL® DGA), um polissacarídeo de gelano com baixo teor de acila obtido a partir de um gelano com baixo teor de acila (por exemplo, gelano KELCOGEL® LT, gelano KELCOGEL®, gelano KELCOGEL® F e gelano GELRITETM MK), um polissacarídeo de welano com teor de acila alto/intermediário/baixo obtido a partir de um welano com teor de acila alto/intermediário/baixo, um polissacarídeo de diutano com teor de acila alto/intermediário/baixo obtido a partir de um diutano com teor de acila alto/intermediário/baixo, e um polissacarídeo de ramsano com teor de acila alto/intermediário/baixo obtido a partir de um ramsano com teor de acila alto/intermediário/baixo.
[0114] As composições da primeira modalidade podem compreender um oligossacarídeo de esfingano HA/IA/LA derivado ou de um esfingano HA/IA/LA nativo ou de um polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA. Em um aspecto, as composições da primeira modalidade podem compreender um oligossacarídeo de esfingano HA/IA/LA derivado ou de um esfingano HA/IA/LA nativo ou de um polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA com peso molecular, conforme determinado por cromatografia por exclusão de tamanhos, de cerca de 0,3 kDa a 12 kDa. Em outro aspecto, as composições da primeira modalidade podem compreender um oligossacarídeo de esfingano HA/IA/LA derivado ou de um esfingano HA/IA/LA nativo ou de um polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA com peso molecular, conforme determinado por cromatografia por exclusão de tamanhos, de cerca de 1 kDa.
[0115] Conforme explicado em mais detalhes neste documento, um oligossacarídeo de esfingano HA/IA/LA pode ser obtido a partir de um esfingano HA/IA/LA nativo ou de um polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA, por exemplo, por um processo que compreende hidrolisar uma ligação glicosídica do esfingano HA/IA/LA nativo ou do polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA e submeter a composição hidrolisada a ultrafiltração, cromatografia por exclusão de tamanhos, precipitação, centrifugação ou uma combinação desses, como descreve, por exemplo, a décima modalidade. Exemplos de oligossacarídeos de esfingano HA/IA/LA incluem, entre outros: (i) uma composição que compreende (ou é composta por) Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,GlcA,Rha,-H2O, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O, Glc2,GlcA,Rha,-H2O, Glc2,GlcA,Rha2,Glyc, Glc2,GlcA2,Rha, Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O, Glc2,Rha, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA3,Rha2,
Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac, Glc5,GlcA4,Rha2, Glc6,GlcA3,Rha3, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (ii) uma composição que compreende (ou é composta por) um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha) com acetato e/ou glicerato, um octâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha), um octâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha) com acetato e/ou glicerato, Glc,GlcA,Glc, Rha,Glc,GlcA, Glc,Rha, ou uma combinação desses; (iii) uma composição que compreende (ou é composta por) um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), um octâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha), um pentâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc), GlcA,Glc,Rha, Glc,GlcA,Glc, Glc,GlcA, ou uma combinação desses; (iv) uma composição que compreende (ou é composta por) Glc(Glc- Glc),GlcA, Glc(Glc-Glc), GlcA,Glc, Glc,Glc, ou uma combinação desses; (v) uma composição que compreende (ou é composta por) um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), GlcA,Glc,(Rha-Rha), Glc,(Rha-Rha),Rha, GlcA,Glc,Rha, Glc,GlcA,Glc, Rha,Glc, GlcA,Glc; (vi) uma composição que compreende (ou é composta por) Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac,
Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (vii) uma composição que compreende (ou é composta por) Glc,GlcA, Glc,GlcA,Rha, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA2,Rha, Glc4,GlcA3,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA4,Rha2, Glc6,GlcA3,Rha3, Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (viii) uma composição que compreende (ou é composta por) Glc,GlcA,Rha,- H2O, Glc,Rha, Glc2,GlcA,Rha,-H2O, Glc2,Rha, ou uma combinação desses; (ix) uma composição que compreende (ou é composta por) Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O, Glc2,GlcA,Rha2,Glyc, Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (x) uma composição que compreende (ou é composta por) qualquer uma das Amostras de nº 1 a 18; ou (xi) uma composição que compreende (ou é composta por) qualquer uma das Amostras de nº 9, 10, 17 e 18.
[0116] Como mencionado acima, certos esfinganos podem ser substituídos com uma acila, um monossacarídeo ou uma cadeia lateral de um dissacarídeo (por exemplo, a (1→4)Glc do diutano é substituída em O3 com uma cadeia lateral Rha(α1→4)-Rha(α1→)). Um oligossacarídeo substituído com uma cadeia lateral de um sacarídeo é identificado por parênteses, por exemplo, GlcA,Glc,(Rha-Rha) e Glc,(Rha-Rha),Rha.
[0117] Ademais, entende-se uma referência a um oligossacarídeo de esfingano HA/IA/LA como qualquer um dos exemplos de oligossacarídeos de esfingano HA/IA/LA, ou uma combinação dos mesmos.
[0118] As composições podem ser na forma de líquidos, semissólidos ou sólidos. As composições podem ser na forma de um cereal, uma barra comestível ou outra forma ingerível. As composições podem ser à base de frutas, tal como um suco ou um smoothie, ou à base de laticínios, tal como leite, sorvete ou iogurtes. As composições podem ser adequadamente na forma de bebidas. O termo "bebida" abrange uma forma líquida pronta para beber, bem como um concentrado e uma fórmula em pó para dissolução. Uma bebida pronta para beber pode ser gasosa ou não gasosa.
[0119] As composições podem ser adoçadas ou não com açúcar ou edulcorantes intensos, tais como sucralose, glicirrizinato de amônio, acessulfame-K, aspartame, sacarina, um sal de sacarina (por exemplo, sódio, potássio, cálcio etc.), ciclamato de sódio, estévia, outros adoçantes que não açúcar, e uma mistura desses. As composições também podem conter outros aditivos convencionais, tais como aromatizantes, corantes, estabilizantes etc.
[0120] As composições podem ser armazenadas em forma em pó em uma embalagem ou recipiente fechado que pode compreender instruções para uso.
[0121] Como alternativa, as composições podem ser formuladas como um comprimido ou um produto em cápsula, que pode compreender, em aditamento a um esfingano, outros excipientes aceitáveis, tais como um aglutinante, um enchimento, um lubrificante, um desintegrante, um agente deslizante, um agente de fluxo, um agente antiaglomerante, um sorvente, um conservante, um agente umectante, um edulcorante, um aromatizante, um agente de revestimento etc. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos notórios na técnica. Exemplos de excipientes incluem, entre outros, um carbonato de terra alcalina (por exemplo, carbonato de magnésio, carbonato de cálcio etc.); um polímero reticulado (por exemplo, polivinilpirrolidona reticulada (crospovidona) e carboximetilcelulose sódica reticulada (croscarmelose sódica)); um ácido graxo; uma sílica pirogênica; um lubrificante (por exemplo, ácido esteárico, estearina, estearato de magnésio); um agente para ajuste do pH (por exemplo, um ácido (por exemplo, ácido clorídrico) e uma base (por exemplo, hidróxido de sódio)); uma fibra vegetal (por exemplo, proteína zeína do milho); um polissacarídeo e seus derivados (por exemplo, um amido, uma celulose, uma celulose modificada, tal como celulose microcristalina e éteres de celulose, tais como hidroxipropilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose); uma proteína (por exemplo, gelatina); um sacarídeo e seus derivados (por exemplo, um dissacarídeo, por exemplo, sacarose, lactose etc.); uma goma-laca; um dióxido de silício; um glicolato de amido sódico; um álcool de açúcar (por exemplo, isomalte, xilitol, sorbitol e maltitol); um polímero sintético (por exemplo, polivinilpirrolidona e polietileno glicol); um talco; e uma cera.
[0122] As composições também podem compreender um probiótico e um prebiótico extra.
[0123] Exemplos desses probióticos incluem, entre outros, Lactobacillus rhamnosus GG, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis HN019, Bifidobacterium longum (inclusive a linhagem 35624), Lactobacillus salivarius, Bifodobacterium bifidum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Bifidobacterium breve, Lactobacillus gasseri KS-13, Bacillus coagulans (GBI-30,
6086), Bacillus subtilis DE111, cada um dos quais pode ser usado sozinho, ou uma combinação desses.
[0124] Exemplos de um prebiótico extra incluem, entre outros, inulina, um fruto-oligossacarídeo, um galacto-oligossacarídeo, uma goma guar, uma goma tara, uma goma xantana, um polissacarídeo xantânico, um oligossacarídeo xantânico, uma goma konjac, uma goma karaya, uma arabinogalactana, lactulose, psílio, uma pectina, um polissacarídeo pectínico, um oligossacarídeo pectínico, tragacanto, acácia, carragena, e seus semelhantes.
[0125] Os resultados revelados neste documento demonstram que um esfingano (A) promove o crescimento bacteriano benéfico no cólon de um ser humano; (B) reduz os níveis de propionato e/ou aumenta os níveis de butirato no cólon de um ser humano; (C) intensifica a integridade da barreira intestinal no cólon de um ser humano; e/ou (D) reduz os níveis de TNF-α e/ou IL-8 no cólon de um ser humano. Logo, as modalidades reveladas neste documento referem-se a uma composição ingerível para: (A) promover o crescimento bacteriano benéfico no cólon de um mamífero, a referida composição compreendendo uma quantidade eficaz ao crescimento bacteriano benéfico de um esfingano e um meio ingerível (segunda modalidade); (B) reduzir os níveis de propionato e/ou aumentar os níveis de butirato no cólon de um mamífero, a referida composição compreendendo uma quantidade eficaz de um esfingano e um meio ingerível (terceira modalidade); (C) intensificar a integridade da barreira intestinal no cólon de um mamífero, a referida composição compreendendo uma quantidade eficaz à integridade da barreira intestinal de um esfingano e um meio ingerível (quarta modalidade); ou (D) reduzir os níveis de TNF-α e/ou IL-8 no cólon de um mamífero, a referida composição compreendendo uma quantidade eficaz à redução do TNF-α e/ou IL-8 de um esfingano e um meio ingerível (quinta modalidade).
[0126] No que diz respeito a qualquer uma das modalidades segunda, terceira, quarta e quinta, a quantidade contemplada de um esfingano (isto é, (i) uma quantidade eficaz ao crescimento bacteriano benéfico de um esfingano (segunda modalidade), (ii) uma quantidade eficaz de um esfingano (terceira modalidade), (iii) uma quantidade eficaz à integridade da barreira intestinal de um esfingano (quarta modalidade) e (iv) uma quantidade eficaz à redução do TNF-α e/ou IL-8 de um esfingano (quinta modalidade)) pode compreender de cerca de 1 g a cerca de 10 g de um esfingano, e todos os valores entre esses, tal como, por exemplo, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9, cerca de 3,0, cerca de 3,1, cerca de 3,2, cerca de 3,3, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, cerca de 3,9, cerca de 4,0, cerca de 4,1, cerca de 4,2, cerca de 4,3, cerca de 4,4, cerca de 4,5, cerca de 4,6, cerca de 4,7, cerca de 4,8, cerca de 4,9, cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,1, cerca de 8,2, cerca de 8,3, cerca de 8,4, cerca de 8,5, cerca de 8,6, cerca de 8,7, cerca de 8,8, cerca de 8,9, cerca de 9,0, cerca de 9,1, cerca de 9,2, cerca de 9,3, cerca de 9,4, cerca de 9,5, cerca de 9,6, cerca de 9,7, cerca de 9,8 e cerca de 9,9 g.
[0127] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades segunda, terceira, quarta e quinta, o mamífero é, por exemplo, um ser humano, um cão, um gato, um rato, um camundongo, um hamster, um preá, uma vaca, um bisão, um porco, um carneiro, um cavalo, um bode, um cervo, uma lhama, uma alpaca, e seus semelhantes.
[0128] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades segunda, terceira, quarta e quinta, a quantidade do esfingano é selecionada de cerca de 1 g a cerca de 10 g, de cerca de 1 g a cerca de 9 g, de cerca de 1 g a cerca de 8 g, de cerca de 1 g a cerca de 7 g, de cerca de 1 g a cerca de 6 g, de cerca de 1 g a cerca de 5 g, de cerca de 1 g a cerca de 4 g, de cerca de 1 g a cerca de 3 g, ou em cerca de 2 g.
[0129] E, em um aspecto de qualquer uma das modalidades segunda, terceira, quarta e quinta, a quantidade do esfingano é suficiente para obter uma concentração de esfingano eficaz no cólon, sendo que a referida concentração de esfingano no cólon varia de cerca de 1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL, e todos os valores entre esses, por exemplo, cerca de 1,5 mg/mL, cerca de 2 mg/mL, cerca de 2,5 mg/mL, cerca de 3 mg/mL, cerca de 3,5 mg/mL, cerca de 4 mg/mL, cerca de 4,5 mg/mL, cerca de 5 mg/mL, cerca de 5,5 mg/mL, cerca de 6 mg/mL, cerca de 6,5 mg/mL, cerca de 7 mg/mL, cerca de 7,5 mg/mL, cerca de 8 mg/mL, cerca de 8,5 mg/mL, cerca de 9 mg/mL ou 9,5 mg/mL.
[0130] As composições de qualquer uma das modalidades segunda, terceira, quarta e quinta podem compreender qualquer um de um esfingano HA/IA/LA nativo, um polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA, um oligossacarídeo de esfingano HA/IA/LA, ou uma combinação desses, e opcionalmente compreender ainda um probiótico ou um prebiótico extra, como descrito na primeira modalidade.
[0131] Em aditamento, modalidades reveladas neste documento referem-se a um método ou uso para a fabricação de um medicamento ou suplemento dietético para: (A) promover o crescimento bacteriano benéfico no cólon de um mamífero, o referido método compreendendo ingerir, de acordo com um cronograma eficaz, uma quantidade eficaz ao crescimento bacteriano benéfico de um esfingano e um meio ingerível (sexta modalidade); (B) reduzir os níveis de propionato e/ou aumentar os níveis de butirato no cólon de um mamífero, o referido método compreendendo: ingerir, de acordo com um cronograma eficaz, uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um esfingano e um meio ingerível (sétima modalidade); (C) intensificar a integridade da barreira intestinal no cólon de um mamífero, o referido método compreendendo: ingerir, de acordo com um cronograma eficaz, uma composição compreendendo uma quantidade eficaz à integridade da barreira intestinal de um esfingano e um meio ingerível (oitava modalidade); (D) reduzir os níveis de TNF-α e/ou IL-8 no cólon de um mamífero, o referido método compreendendo: ingerir, de acordo com um cronograma eficaz, uma composição compreendendo uma quantidade eficaz à redução do TNF-α e/ou IL-8 de um esfingano e um meio ingerível (nona modalidade); (E) uso de uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades primeira, segunda, terceira, quarta e quinta sozinha, ou em combinação a um probiótico ou a um prebiótico extra, como descrito neste documento, na fabricação de uma composição para (i) promover o crescimento bacteriano benéfico no cólon de um mamífero (décima modalidade), (ii) reduzir os níveis de propionato e/ou aumentar os níveis de buritano no cólon de um mamífero (décima primeira modalidade), (iii) intensificar a integridade da barreira intestinal no cólon de um mamífero (décima segunda modalidade), ou (iv) reduzir os níveis de TNF-α e/ou IL-8 no cólon de um mamífero (décima terceira modalidade); ou (F) Em um aspecto de qualquer uma das modalidades sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda e décima terceira, o mamífero é, por exemplo, um ser humano, um cão, um gato, um rato, um camundongo, um hamster, um preá, uma vaca, um bisão, um porco, um carneiro, um cavalo, um bode, um cervo, uma lhama, uma alpaca, e seus semelhantes.
[0132] Para essas e outras modalidades descritas e reivindicadas neste documento, um cronograma eficaz para a ingestão pode incluir, por exemplo, (i) ingestão diária, tal como uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia etc.; (ii) ingestão semanal, tal como todo dia durante sete dias, dia sim dia não durante sete dias etc.; (iii) ingestão mensal, tal como ingestão diária por um período de tempo desejado seguida por um período de repouso, retomada por ingestão diária por um período de tempo desejado.
[0133] No que diz respeito a qualquer uma das modalidades sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda e décima terceira, a quantidade contemplada de um esfingano (isto é, (i) uma quantidade eficaz ao crescimento bacteriano benéfico de um esfingano (sexta modalidade), (ii) uma quantidade eficaz de um esfingano (sétima modalidade), (iii) uma quantidade eficaz à integridade da barreira intestinal de um esfingano (oitava modalidade), e (iv) uma quantidade eficaz à redução do TNF-α e/ou IL-8 de um esfingano (nona modalidade)) pode compreender de cerca de 1 g a cerca de 10 g de um esfingano, e todos os valores entre esses, tal como, por exemplo, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9, cerca de 3,0, cerca de 3,1, cerca de 3,2, cerca de 3,3, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, cerca de 3,9, cerca de 4,0, cerca de 4,1, cerca de 4,2, cerca de 4,3, cerca de 4,4, cerca de 4,5, cerca de 4,6, cerca de 4,7, cerca de 4,8, cerca de 4,9, cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6,
cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,1, cerca de 8,2, cerca de 8,3, cerca de 8,4, cerca de 8,5, cerca de 8,6, cerca de 8,7, cerca de 8,8, cerca de 8,9, cerca de 9,0, cerca de 9,1, cerca de 9,2, cerca de 9,3, cerca de 9,4, cerca de 9,5, cerca de 9,6, cerca de 9,7, cerca de 9,8 e cerca de 9,9 g.
[0134] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda e décima terceira, a quantidade do esfingano é selecionada de cerca de 1 g a cerca de 10 g, de cerca de 1 g a cerca de 9 g, de cerca de 1 g a cerca de 8 g, de cerca de 1 g a cerca de 7 g, de cerca de 1 g a cerca de 6 g, de cerca de 1 g a cerca de 5 g, de cerca de 1 g a cerca de 4 g, de cerca de 1 g a cerca de 3 g, ou em cerca de 2 g.
[0135] E, em um aspecto de qualquer uma das modalidades sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda e décima terceira, a quantidade do esfingano é suficiente para atingir uma concentração de esfingano eficaz no cólon, como descrito neste documento.
[0136] Como alternativa, e no que diz respeito a qualquer uma das modalidades sexta, sétima, oitava e nona, o mamífero é um ser humano e a quantidade contemplada de um esfingano (isto é, (i) uma quantidade eficaz ao crescimento bacteriano benéfico de um esfingano (sexta modalidade), (ii) uma quantidade eficaz de um esfingano (sétima modalidade), (iii) uma quantidade eficaz à integridade da barreira intestinal de um esfingano (oitava modalidade) e (iv) uma quantidade eficaz à redução do TNF-α e/ou IL-8 de um esfingano (nona modalidade)) pode compreender de cerca de 10 mg/kg a cerca de 150 mg/kg do peso corporal humano da pessoa que ingere a composição. Em aditamento, contempla-se que a quantidade de esfingano abarque todos os valores entre esses, tal como, por exemplo, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg,
cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg, cerca de 105 mg/kg, cerca de 110 mg/kg, cerca de 115 mg/kg, cerca de 120 mg/kg, cerca de 125 mg/kg, cerca de 130 mg/kg, cerca de 135 mg/kg, cerca de 140 mg/kg ou cerca de 145 mg/kg.
[0137] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades sexta, sétima, oitava e nona, o mamífero é um ser humano e a quantidade do esfingano é selecionada de cerca de 10 mg/kg a cerca de 150 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 140 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 130 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 120 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 110 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 90 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 80 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 70 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 60 mg/kg, 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 40 mg/kg ou de cerca de 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg da pessoa que ingere a composição.
[0138] As composições de qualquer uma das modalidades sexta, oitava e nona podem compreender qualquer um de um esfingano HA/LA nativo, um polissacarídeo de esfingano HA/LA, um oligossacarídeo de esfingano HA/LA, ou uma combinação desses, e opcionalmente compreender ainda um probiótico ou um prebiótico extra, como descrito na primeira modalidade.
[0139] Os resultados revelados neste documento demonstram que um esfingano (por exemplo, uma goma gelana) aumentou os níveis de Bifidobacteriaceae nas porções proximal e distal de um modelo de cólon humano. No nível da Unidade Taxonômica Operacional ("OTU"), as principais mudanças foram atribuídas a um aumento na OTU 2 Bifidobacteriaceae (referente à Bifidobacterium adolescentis). Logo, em um aspecto da segunda modalidade, sexta modalidade ou décima modalidade, as bactérias são Bifidobacteriaceae. Além disso, em outro aspecto da segunda modalidade, sexta modalidade ou décima modalidade, as bactérias são da OTU 2 Bifidobacteriaceae. Os níveis aumentados de Bifidobacteriaceae no lúmen do cólon proximal variam de cerca de 20% a cerca de 180% durante o tratamento em comparação a um controle não tratado, ao passo que os níveis aumentados de Bifidobacteriaceae no lúmen do cólon distal variam de cerca de 330% a cerca de 590% durante o tratamento em comparação a um controle não tratado. Em ainda outro aspecto da segunda modalidade, sexta modalidade ou décima modalidade, o aumento nos níveis de Bifidobacteriaceae no lúmen do cólon proximal varia de cerca de 20% a cerca de 180% durante o tratamento em comparação a um controle não tratado. E, em outro aspecto da segunda modalidade, sexta modalidade ou décima modalidade, o aumento nos níveis de Bifidobacteriaceae no lúmen do cólon distal varia de cerca de 330% a cerca de 590% durante o tratamento em comparação a um controle não tratado.
[0140] Em aditamento, os resultados revelados neste documento demonstram que um oligossacarídeo de esfingano a uma concentração de cerca de 4 mg/mL aumentou os níveis de bactéria (por exemplo, Blautia, Parabacteroides, Faecalibacterium, Clostridium XVIII) in vitro com base em amostras fecais de adultos saudáveis. Os níveis de Blautia in vitro subiram em ao menos cerca de 5 vezes em comparação ao controle não tratado. Os níveis de Parabacteroides in vitro subiram em cerca de 2 vezes a cerca de 40 vezes em comparação ao controle não tratado. Os níveis de Faecalibacterium in vitro subiram em cerca de 10 vezes a cerca de 190 vezes em comparação ao controle não tratado. Os níveis de Clostridium XVIII in vitro subiram em cerca de 12 vezes a cerca de 60 vezes em comparação ao controle não tratado.
[0141] Além disso, os resultados revelados neste documento demonstram que um oligossacarídeo de esfingano a uma concentração de cerca de 4 mg/mL aumentou os níveis de bactéria (por exemplo, Parabacteroides, Faecalibacterium, Clostridium XVIII) in vitro com base nas amostras fecais de pacientes com uma doença inflamatória intestinal. Os níveis de Blautia in vitro subiram em ao menos cerca de 8 vezes em comparação ao controle não tratado. Os níveis de Faecalibacterium in vitro subiram em ao menos cerca de 8 vezes em comparação ao controle não tratado. Os níveis de Clostridium XVIII in vitro subiram em cerca de 20 vezes a cerca de 100 vezes em comparação ao controle não tratado.
[0142] Os resultados revelados neste documento demonstram que um esfingano ingerido (por exemplo, goma gelana) reduziu os níveis de propionato em ambas as porções proximal e distal de um modelo de cólon humano e que uma goma gelana ingerida aumentou os níveis de butirato em ambas as porções proximal e distal de um modelo de cólon. Logo, em um aspecto da terceira, sétima modalidade ou décima primeira modalidade, onde o mamífero é um ser humano, os níveis reduzidos de propionato no cólon proximal variam de cerca de 8% a cerca de 21% durante o tratamento em comparação a um controle. Em um aspecto da terceira modalidade, sétima modalidade ou décima primeira modalidade, onde o mamífero é um ser humano, os níveis de propionato reduzidos no cólon distal variam de cerca de 8% a cerca de 11% durante o tratamento em comparação a um controle. Em um aspecto da terceira modalidade, sétima modalidade ou décima primeira modalidade, onde o mamífero é um ser humano, os níveis aumentados de butirato no cólon distal variam de cerca de 15% a cerca de 24%. Em um aspecto da terceira modalidade, sétima modalidade ou décima primeira modalidade, onde o mamífero é um ser humano, os níveis aumentados de butirato no cólon distal variam de cerca de 4% a cerca de 13%.
[0143] Uma décima quarta modalidade refere-se a um processo para preparar um polissacarídeo de esfingano ("SPS") e/ou um oligossacarídeo de esfingano ("SOS").
[0144] Um processo para preparar um SPS compreende: hidratar um esfingano HA/IA/LA nativo em água e reduzir o peso molecular do esfingano HA/IA/LA nativo por homogeneização, sonicação, radiação, oxidação e/ou hidrólise.
[0145] A redução do peso molecular (isto é, reduzir o comprimento de cadeia) de um esfingano HA/IA/LA nativo pode ser obtida por homogeneização a alta pressão por meio de um processo que compreende: (i) hidratar um produto de esfingano HA/LA em pó em água desionizada para obter uma solução hidratada de esfingano HA/IA/LA (cerca de 1% p/v); (ii) passar a solução hidratada de esfingano HA/IA/LA através de um homogeneizador de 1 a 10 vezes operando a uma pressão de cerca de 8.500 psi a cerca de 12.000 psi (e todos os valores entre esses) para obter uma solução homogeneizada de SPS HA/IA/LA; (iii) adicionar uma quantidade suficiente de um solvente orgânico adequado à solução homogeneizada para obter um precipitado de SPS HA/IA/LA; (iv) coletar o precipitado de SPS HA/IA/LA por centrifugação; e (v) secar e moer o SPS HA/IA/LA em pó coletado.
[0146] Em um aspecto do processo para preparar um SPS HA/IA/LA, o esfingano HA/IA/LA pode ser, por exemplo, gelano com alto teor de acila, gelano com teor intermediário de acila, gelano com baixo teor de acila, diutano com alto teor de acila, diutano com teor intermediário de acila, diutano com baixo teor de acila, ramsano com alto teor de acila, ramsano com teor intermediário de acila e ramsano com baixo teor de acila. Em outro aspecto do processo para preparar um SPS HA/IA/LA, a referida passagem ocorre de 1 a 10 vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4 etc.) a uma pressão de cerca de 8.500 psi. Em ainda outro aspecto do processo para preparar um SPS, a referida passagem ocorre de 1 a 10 vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4 etc.) a uma pressão de cerca de 12.000 psi. Em outro aspecto do processo para preparar um SPS, a referida passagem ocorre 10 vezes a uma pressão de cerca de
12.000 psi. E, em ainda outro aspecto do processo para preparar um SPS, o solvente orgânico adequado é tal que promova a precipitação do polissacarídeo de esfingano HA/IA/LA assim formado, incluindo, por exemplo, isopropanol.
[0147] Um processo para preparar um SOS HA/IA/LA compreende: preparar uma primeira composição compreendendo um esfingano HA/IA/LA nativo ou um SPS HA/IA/LA e um meio líquido; hidrolisar uma ligação glicosídica do esfingano HA/IA/LA ou SPS HA/IA/LA para obter uma segunda composição; submeter a segunda composição a ultrafiltração, cromatografia por exclusão de tamanhos, precipitação, centrifugação ou uma combinação desses para obter uma terceira composição compreendendo o SOS HA/IA/LA; e opcionalmente isolar ou recuperar a terceira composição por uma técnica adequada, tal como, por exemplo, liofilização.
[0148] Em um aspecto do processo para preparar um SOS HA/IA/LA, a referida etapa de hidrolisar pode ser mediada por um ácido, uma enzima, sonicação, homogeneização a alta pressão, radiação ou uma combinação desses.
[0149] Em um aspecto do processo para preparar um SOS HA/IA/LA, a referida etapa de hidrolisar pode ser mediada por um meio aquoso com pH de cerca de 1 a cerca de 3. Em outro aspecto, a referida etapa de hidrolisar pode ser mediada por um meio aquoso com pH de cerca de 1 a cerca de 3 (ou um pH de cerca de 2), sendo que o referido meio aquoso pode compreender um ácido inorgânico ou orgânico adequado. Exemplos de ácidos adequados incluem, entre outros, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoracético ou uma combinação desses.
[0150] Em um aspecto do processo para preparar um SOS HA/IA/LA, a referida etapa de hidrolisar é mediada por hidrólise com ácido fórmico a um pH de cerca de 2 e uma temperatura de cerca de 95° C por tempo suficiente para hidrolisar a ligação glicosídica do esfingano HA/IA/LA ou SPS HA/IA/LA.
[0151] Em um aspecto do processo para preparar um SOS HA/IA/LA, a referida etapa de hidrolisar é mediada por uma enzima, sendo que a enzima é capaz de clivar uma ou mais ligações glicosídicas de esfingano, incluindo, entre outras, uma gelanase, uma ramnogalacturonano endoliase (EC 4.2.2.23), uma ramnogalacturonano exoliase (EC 4.2.2.24), uma gelano liase (EC 4.2.2.25) descrita por Hashimoto, uma gelano liase descrita por Kennedy (1994) ou uma combinação dessas. Entende-se que a expressão "gelanase" refere-se a uma enzima que é capaz de clivar uma ou mais ligações glicosídicas de um esfingano.
[0152] Em um aspecto do processo para preparar um SOS HA/IA/LA, a referida etapa de submeter compreende filtrar a segunda composição através de uma membrana com um corte de peso molecular de cerca de 5 kDa ou cerca de 10kDa para obter um filtrado compreendendo a terceira composição.
[0153] Uma décima quinta modalidade refere-se a uma composição que compreende um oligossacarídeo de esfingano conforme preparado pela décima quarta modalidade.
[0154] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na técnica. Os exemplos a seguir são dados somente para melhor ilustrar as modalidades reivindicadas e reveladas neste documento e não visam a limitar o âmbito da matéria reivindicada. Exemplos I. Exemplo I. Preparo de SPSs e SOSs HA/LA. Preparo de um polissacarídeo de esfingano
[0155] O comprimento de cadeia de um esfingano nativo pode ser reduzido por homogeneização a alta pressão por meio de um processo que compreende: (i) hidratar um produto de esfingano (por exemplo, gelano, diutano e ramsano) em pó a 1% p/v em 1 L de água desionizada para obter uma solução hidratada de esfingano; (ii) digerir mecanicamente a solução hidratada de esfingano em um homogeneizador APV Modelo 1000 a cerca de 12.000 psi (x 10) para obter soluções homogeneizadas; (iii) adicionar uma quantidade suficiente de álcool isopropílico à solução homogeneizada para obter um precipitado de polissacarídeo de esfingano; (iv) coletar o precipitado de polissacarídeo de esfingano por centrifugação; e (v) secar e moer o polissacarídeo de esfingano em pó coletado. Usando desse procedimento em esfinganos selecionados (por exemplo, gelano com alto teor de acila, gelano com baixo teor de acila, diutano com alto teor de acila e ramsano com alto teor de acila), prepararam-se as amostras de polissacarídeo de esfingano a seguir, conforme ilustra a Tabela 1, as quais foram hidratadas em água a uma concentração de 0,8% p/v para estudos subsequentes. Tabela 1. Sumário de polissacarídeos de esfingano (Amostras nº 1 a 7).
Nº da Comentários amostra Polissacarídeo de gelano obtido a partir de gelano KELCOGEL® 1 LT100 (gelano com alto teor de acila não clarificado).
Polissacarídeo de gelano (com alto teor de acila) obtido a partir de 2 gelano KELCOGEL® HT (com alto teor de acila, tratado com enzima e sem PHB).
Polissacarídeo de gelano obtido a partir de gelano GELRITETM MK 3 (com baixo teor de acila, clarificado e duplamente precipitado).
4 Polissacarídeo de diutano obtido a partir de diutano sem PHB.
5 Polissacarídeo de ramsano obtido a partir de ramsano nativo.
6 Polissacarídeo de gelano (da linhagem 438).a 7 Polissacarídeo de gelano (da linhagem 438).b Observações: aA amostra nº 6 é um polissacarídeo de gelano obtido a partir de gelano que foi produzido a partir da linhagem 438, uma linhagem derivada da Sphingomonas elodea do tipo selvagem. O gelano da linhagem 438 foi isolado tratando o caldo de fermentação com protease, EDTA, SDS, lisozima e glicoamilase; seguido por recuperação da goma gelana por precipitação induzida por isopropanol do caldo tratado e aquecido. bA amostra nº 7 é um polissacarídeo de gelano obtido a partir de gelano que foi produzido a partir da linhagem 438. O gelano da linhagem 438 foi isolado centrifugando o caldo de fermentação para obter células peletizadas e um sobrenadante, tratando o sobrenadante coletado com glicoamilase e protease, e recuperando o gelano a partir do caldo aquecido por precipitação com isopropanol.
[0156] Um polissacarídeo de gelano produzido segundo o este documento é diferente dos produtos de gelano comercializados na medida em que seu comprimento de cadeia é reduzido por homogeneização a alta pressão. Na verdade, estudos anteriores demonstraram que a homogeneização a alta pressão reduz o comprimento de cadeia (e, portanto, o peso molecular) do gelano nativo (vide a US6242035B1, incorporada por referência na íntegra, onde a homogeneização a alta pressão de uma goma gelana nativa (MW ≈ 2,5 x 106; MN ≈ 2,2 x 106) resulta em uma goma gelana com um MW menor ou igual a cerca de 1,7 x 106, conforme medido por Cromatografia por Exclusão de Tamanhos/Espalhamento de Luz Laser Multiângulo). Preparo de oligossacarídeos de esfingano (SOSs)
[0157] Em termos gerais, o preparo de um SOS compreende: (i) preparar uma solução de esfingano HA/IA/LA nativo (ou um SPS HA/IA/LA SPS) a 2% p/v; (ii) hidrolisar com ácido fórmico (pH 2) a 95° C de um dia para o outro para obter um hidrolisado; (iii) filtrar o hidrolisado usando uma membrana de ultrafiltração com um corte de peso molecular de 5 kDa ou 10kDa para obter um filtrado; (iv) liofilizar o filtrado para obter um liofilizado; (v) lavar o liofilizado com etanol anidro (x 3) para obter um pó lavado; e (vi) secar o pó lavado para obter um SOS. (Como alternativa,
a hidrólise pode se dar usando: (i) uma enzima adequada, tal como gelanase; (ii) sonicação; (iii) homogeneização a alta pressão; (iv) radiação; ou (v) outros processos conhecidos.) Usando o procedimento de hidrólise ácida (por exemplo, com ácido fórmico) ou hidrólise enzimática (por exemplo, com gelanase japonesa (EC 4.2.2.25) ou gelanase da linhagem 438), prepararam-se as amostras a seguir de oligossacarídeos de esfingano HA/LA, conforme ilustra a Tabela 2a, onde o teor percentual de monossacarídeos refere-se ao teor de monossacarídeos (glicose e ramnose) dividido pela concentração da amostra, e a composição de monossacarídeos, teor de oligossacarídeos e peso molecular são conforme descritos abaixo. Tabela 2a. Sumário de oligossacarídeos de esfingano (Amostras nº 8 a 18).
Nº da Comentários amostra SOSs obtidos a partir de gelano KELCOGEL® LT100; hidrólise ácida; 8 corte de 5k Da (teor de monossacarídeos de 1,7%).
SOSs obtidos a partir de gelano KELCOGEL® HT; hidrólise ácida; corte de 5k Da (teor de monossacarídeos de 1,5%). Composição de monossacarídeos: Rha, Glc, GlcA, Glyc a uma razão aproximada de 3:5:2:2 com um ácido urônico desconhecido presente 9 Teor de oligossacarídeos: oligossacarídeos similares a gelano (tanto acetilados quanto glicerados) com um DP de cerca de 2 a cerca de 9. Peso molecular: Peso molecular das amostras de cerca de 0,5 kDa a cerca de 4 kDa (pico duplo mais baixo e maior que cerca de 1,2 kDa observado).
SOSs obtidos a partir de gelano GELRITE® MK; hidrólise ácida; corte 10 de 5k Da (teor de monossacarídeos de 1,8%). Composição de monossacarídeos: Rha, Glc, GlcA a uma razão aproximada de 3:5:2:2. Somente quantidades residuais de glicerato. Teor de oligossacarídeos: oligossacarídeos similares a gelano (principalmente não esterificados) com um DP de cerca de 2 a cerca de 12. Peso molecular: Peso molecular das amostras de cerca de 0,5 kDa a cerca de 4 kDa (pico duplo mais baixo e maior que 1,2 kDa observado).
SOSs obtidos a partir de diutano nativo sem PHB; hidrólise ácida; 11 corte de 5k Da (teor de monossacarídeos de 0,7%).
SOSs obtidos a partir de ramsano nativo; hidrólise ácida; corte de 5k 12 Da (teor de monossacarídeos de 2,2%).
SOSs obtidos a partir de gelano KELGOGEL® HT; hidrólise ácida; 13 corte de 10k Da.
SOSs obtidos a partir de gelano GELRITE® MK; hidrólise ácida; corte 14 de 10k Da.
SOSs obtidos a partir de diutano nativo sem PHB; hidrólise ácida; 15 corte de 10k Da.
SOSs obtidos a partir de ramsano nativo; hidrólise ácida; corte de 10k 16 Da.
SOSs obtidos a partir de gelano GELRITE™ MK; hidrólise enzimática (gelanase japonesa, EC 4.2.2.25); corte de 5k Da. Composição de monossacarídeos: razão de Rha e Glc de cerca de 1 a cerca de 2 (quantidades residuais de ácido glicurônico e grandes 17 quantidades dos compostos desconhecidos 1 e 2). Teor de oligossacarídeos: cerca de 50% de GlcA,Glc,Rha,Glc insaturado e cerca de 10% de GlcA,Glc,Rha insaturado. Peso molecular: distribuição de tamanho estreita de cerca de 1 kDa
SOSs obtidos a partir de gelano KELCOGEL® HT; hidrólise enzimática (a partir da linhagem 438); corte de 5k Da. Composição de monossacarídeos: Rha, Glc, GlcA, Glyc a uma razão aproximada de 3:5:2:2 com um ácido urônico desconhecido presente. Teor de oligossacarídeos: oligossacarídeos similares a gelano (tanto 18 acetilados quanto glicerados) com um DP de cerca de 2 a cerca de 9 com quantidades ínfimas de compostos insaturados. Peso molecular: Peso molecular das amostras observado de cerca de 0,5 kDa a cerca de 4 kDa (pico duplo mais baixo e maior que cerca de 1,2 kDa observado, mesmo que para SN9).
[0158] O teor de monossacarídeos foi determinado para amostras de SOS selecionadas dissolvendo a amostra de SOS em água desionizada e analisando o teor de glicose e ramnose por meio de um sistema de Cromatografia Iônica da Thermo Fisher. O teor de monossacarídeos total foi calculado como a concentração total de glicose e ramnose dividida pela concentração da amostra.
[0159] Determinou-se a composição de monossacarídeos (para as Amostras nº 9 a 10 e 17 a 18) de acordo com o seguinte. Amostras de SOS foram dissolvidas em ácido sulfúrico a 4% a uma concentração de 3,5 g/L e autoclavadas a 121° C durante uma hora. Quantificaram-se os monossacarídeos usando um sistema Dionex ICS-5000 de acordo com Zeuner (2016). O glicerato foi quantificado usando padrões externos. Quantificaram-se o composto desconhecido 1 ("UNK1"), o composto desconhecido 2 ("UNK2") e o ácido urônico desconhecido 1 ("UNK URON1") como unidades de ácido glicurônico. A Tabela 2b traz a composição de monossacarídeos para cada uma das Amostras nº 9 a 10 e 17 a 18. Tabela 2b. Sumário de Oligossacarídeos de Esfingano (Composição de Monossacarídeos, Amostras nº 9 a 10 e 17 a 18.)
UNK Nº das UNK1 UNK2 Rha Glc Glyc GlcA URON1 amostras % molar (desvio padrão) 0,44 1,58 29,22 50,22 21,56 20,57 8,02 9 (0,07) (0,47) (1,61) (1,05) (1,32) (0,33) (0,44) 0,42 1,60 27,45 53,16 0,00 19,40 7,87 10 (0,09) (0,51) (1,60) (0,43) (0,00) (0,16) (0,16) 21,26 70,71 34,09 65,91 0,00 0,00 0,00 17 (0,90) (2,15) (0,52) (1,83) (0,00) (0,00) (0,00) 0,48 1,18 29,14 50,86 23,17 20,00 7,85 18 (0,04) (0,13) (1,36) (4,44) (1,33) (2,04) (0,45)
[0160] Determinou-se o teor de oligossacarídeos (para as Amostras nº 9 a 10 e 17 a 18) de acordo com o seguinte. A identificação e quantificação relativa dos oligossacarídeos foram realizadas por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem com ionização por eletropulverização (LC- ESI-MS) sobre uma armadilha de íons Amazon SL (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) acoplada a um UHPLC UltiMate 3000 (Dionex, Sunnyvale, CA EUA). Injetaram-se 5 µL da amostra em ACN a 50% (5 g/L finais) em uma coluna de HILIC TSKgel Amide-80 (150 mm × 2 mm; 2 μm, TOSOH, Greisheim, Alemanha). A cromatografia foi realizada a 0,2 mL/min a 45 ° C em um sistema eluente triplo composto por um eluente A (água), eluente B (acetonitrila) e C (formato de amônio a 100 mM, pH 5). Manteve-se o eluente C a 5% o tempo todo. O perfil de eluição foi conforme o seguinte (tempo indicado em min): 0 a 5, B a 75% isocrático; 5 a 25, gradiente linear a B a 25%; 25 a 30, B a 5% isocrático; 30 a 40, B a 75% isocrático. A eletropulverização foi operada em modo negativo com modo UltraScan e uma faixa de varredura de 100 a 2.000 m/z, configuração dos parâmetros inteligente de
1.000 m/z. Os eventos automáticos de MS2 foram excluídos para os dois íons precursores prevalentes mais altos.
Tensão capilar a 4,5 kV, deslocamento da placa final de 0,5 kV, pressão do nebulizador a 3,0 bares, fluxo de gás seco a 12,0 L/min, e temperatura de gás seco a 280° C.
Os compostos foram identificados por MS e MSn, e quantificados por intensidade relativa em um Data analysis 4.2 SR2. Tabela 2c.
Sumário de Oligossacarídeos de Esfingano (Teor de Oligossacarídeos, Amostras nº 9 a 10 e 17 a 18.)
Nº da Amostra / Teor de SOS, % SOSs 9 10 17 18
Glc,GlcA 3,24 2,37 ― 2,71
Glc,GlcA,Glyc 3,28 ― ― 3,06
Glc,GlcA,Rhaa 0,80+14,25 0,79+16,85 ― 1,22+12,79
Glc,GlcA,Rha,Glyc 1,02 ― ― 0,65
Glc,GlcA,Rha,-H2O ― ― 11,92 ―
Glc,Rha 4,33 1,74 1,30 3,39
Glc,Rha 0,89 0,39 ― 0,96
Glc2,GlcA 0,88 ― ― 0,84
Glc2,GlcA,Rha 11,95 15,84 ― 10,07
Glc2,GlcA,Rha,+28 7,52 8,83 ― 8,11
Glc2,GlcA,Rha,Ac 1,36 ― ― 1,04
Glc2,GlcA,Rha,Glyc 10,86 ― ― 10,20
Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28 4,22 ― ― 5,25
Glc2,GlcA,Rha,Glyc,-H2O ― ― ― 0,50
Glc2,GlcA,Rha,-H2O ― ― 54,88 ―
Glc2,GlcA,Rha2,Glyc ― ― ― 1,47
Glc2,GlcA2,Rha ― 0,33 ― ―
Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,- ― ― ― 3,29 H2O
Nº da Amostra / Teor de SOS, % SOSs 9 10 17 18
Glc2,Rha ― ― 23,00 ―
Glc3,GlcA,Rha 0,97 2,10 ― 0,78
Glc3,GlcA,Rha2 0,56 ― ― ―
Glc3,GlcA,Rha2 1,53 2,79 ― 0,56
Glc3,GlcA,Rha2 2,79 ― ― ―
Glc3,GlcA,Rha2,Glyc 2,79 ― ― 2,42
Glc3,GlcA2,Rha ― 1,81 ― ―
Glc3,GlcA2,Rha,Glyc 1,81 ― ― 1,81
Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc 5,47 ― ― 4,82
Glc3,GlcA3,Rha2 ― 2,90 ― ―
Glc3,GlcA3,Rha2 3,36 11,59 ― 3,19
Glc4,GlcA,Rha2,+43 ― 5,40 ― 1,57
Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc 2,70 ― ― 2,72
Glc4,GlcA2,Rha ― 2,59 ― ―
Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O ― ― ― 0,87
Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2 ― ― ― 0,89
Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc 2,04 ― ― 1,68
Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc 5,49 ― ― 3,97
Glc4,GlcA3,Rha2 ― 13,12 ― 2,58
Glc4,GlcA2,Rha3,Ac 0,95 ― ― 0,88
Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rh 2,79 ― ― 2,20 a2,Glyc2
Glc5,GlcA2,Rha2 0,69 0,69 ― 0,44
Glc5,GlcA2,Rha2 ― 0,69 ― ―
Glc5,GlcA2,Rha2,Ac 1,57 ― ― 1,57
Nº da Amostra / Teor de SOS, % SOSs 9 10 17 18 Glc5,GlcA4,Rha2 ― 0,24 ― ― Glc6,GlcA3,Rha3 ― 0,07 ― ― derivado de 1513 desconhecido 3,24 ― ― ― 379z1 desconhecido ― ― 2,86 ― 597z2 desconhecido ― 1,24 ― ― 668z2 desconhecido ― 7,40 ― ― 719z1 desconhecido + Glyc ― ― ― 0,63 719z1 desconhecido ― ― ― 0,89 derivado de Glc2,GlcA,Rha,-H2O ― ― 6,04 ― desconhecido derivado de Glc3,GlcA2,Rha2 ― 0,93 ― ― desconhecido aGlc,GlcA,Rha poderia ser Rha-Glc-GlcA ou GlcA-Glc-Rha.
[0161] O SOS identificado como Glc2,GlcA,Rha,Glyc representa uma unidade de tetrâmero de gelano com um único glicerato, ao passo que o SOS identificado como Glc2,GlcA,Rha,Ac representa uma unidade de tetrâmero de gelano com uma única acetila. Certos SOSs incluem múltiplos grupamentos de açúcar (viz., Glc5,GlcA2,Rha2,Ac) – o oligossacarídeo pode ser deduzido com base nos números de sacarídeos especificados. Por exemplo, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac inclui duas unidades tetraméricas (a saber, Glc-GlcA-Glc-Rha) com uma glicopiranosila adicional (Glc) e uma acetila (Ac). Além disso, Glc6,GlcA3,Rha3 representa um oligossacarídeo que inclui três unidades tetraméricas (a saber, Glc-GlcA-Glc-Rha vezes três). Os SOSs identificados por perda de água ("-H2O", vide, por exemplo, Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O) representam o produto insaturado de uma liase/β- eliminação. Em alguns casos, para os oligômeros similares a gelano mais longos
(por exemplo, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2), são propostas duas estruturas porque a fragmentação espectral de massas é insuficiente para distinguir entre a presença de um ácido glicurônico ou duas substituições de glicerato. Nem todos os SOSs observados puderam ser identificados estruturalmente. Com base na fragmentação, alguns compostos puderam ser identificados parcialmente por causa da semelhança no padrão de fragmentação, daí a denotação "derivado de m/z desconhecida" em alusão ao composto identificado mais semelhante. Outros compostos foram impossíveis de identificar por causa da débil fragmentação ou por ser um tipo de composto diferente dos SOS derivados de gelano esperados. Esses SOSs desconhecidos são designados “desconhecido z1 ou z2 (m/z observada)” a depender de se observaram-se duas ou mais cargas. Como evidenciado pelos dados da Cromatografia por Exclusão de Tamanho, infra, as amostras analisadas podem compreender polissacarídeos de esfingano (DP > 30, mas menos do que um esfingano nativo) e oligossacarídeos de esfingano (2 ≥ DP ≤ 30).
[0162] Determinou-se o peso molecular relatado das amostras de SOS de acordo com o seguinte. A Cromatografia por Exclusão do Tamanho de Alta Eficiência foi realizada usando uma bomba Ultimate iso-3100 SD com um amostrador WPS-3000 (Dionex) conectado a um detector do índice de refração RI- 101 (Shodex). Carregaram-se 100 µL da amostra em uma coluna TSKgel G3000PW (300 x 7,5 mm) equipada com uma coluna TSKgel PWH guard (7,5 x 7,5 mm) (Tosoh Bioscience). A eluição foi realizada com nitrato de sódio a 100 mM a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min a 40° C. Utilizaram-se padrões do pululano como referência.
[0163] A Fig. 1a traz um cromatograma por exclusão de tamanhos ("SEC") para polissacarídeos e oligossacarídeos de esfingano derivados de um gelano com alto teor de acila tratados com ácido (SN9, linha cheia) e enzima (SN18, linha tracejada), ao passo que a Fig. 1b traz um SEC para polissacarídeos e oligossacarídeos de esfingano derivados de um gelano com baixo teor de acila tratados com ácido (SN10, linha cheia) e enzima (SN17, linha tracejada). Tanto a Fig. 1a quanto a Fig. 1b exibem os tempos de eluição dos padrões de peso molecular do pululano (a saber, >50 kDa (6,5 min, quadrado cheio (■)), 12 kDa (8,8 min, círculo cheio (●)), 5 kDa (9,3 min, triângulo cheio (▲)), 1 kDa (10 min, quadrado vazio (□)), 342 Da (10,65 min, círculo vazio (○)) e 180 Da (11,15 min, triângulo vazio ())). Os dados de SEC da Fig. 1a exibem uma distribuição equiparável de polissacarídeos de esfingano (SPSs) e oligossacarídeos de esfingano (SOSs) derivados de um esfingano com alto teor de acila. Isso deve ser comparado aos dados de SEC da Fig. 1b, onde as distribuições de SPSs e SOSs para a amostra tratada com ácido (SN10) diferem das distribuições de SPSs e SOSs para a amostra tratada com enzima (SN17). Os dados de SEC também exibem uma faixa de peso molecular de cerca de 0,5 kDa a cerca de 4 kDa (e possivelmente até cerca de 12 kDa) para as Amostras nº 9, 10 e 18. Interessantemente, a amostra (SN17) derivada de um esfingano com baixo teor de acila por tratamento enzimático exibe uma eluição primária de SOSs com uma faixa de peso molecular de cerca de 0,5 kDa a cerca de 1 kDa (com uma distribuição de tamanho estreita do pico em cerca de 1 kDa).
[0164] Determinou-se o teor de oligômeros dos SOSs por análise espectral de massas. Em geral, uma amostra de SOS foi preparada dissolvendo um SOS a uma concentração de 0,4% com água/acetonitrila (1:1) contendo NaCl a 1 mM. As amostras foram filtradas através de um filtro de 0,22 mícron antes de introduzi-las em um Espectrômetro de Massas Quadrupolo Simples QuMSQ plus da Thermo Fisher. O Espectrômetro de massas foi operado em modo de ionização por eletropulverização negativa, varrendo de 150 a 1.000 m/z. A partir da massa intacta dos oligômeros, descobriram-se diferentes oligossacarídeos nas amostras de SOS. A Tabela 3 traz os oligômeros observados para amostras de SOS selecionadas.
Tabela 3. Oligômeros identificados em SOSs.
Nº da Oligômeros identificados amostra Tetrâmero (663), tetrâmero com glicerato (751), octâmero (654, 9 duas cargas), Glc,GlcA,Glc (517), Rha,Glc,GlcA (501), Glc,Rha (361, aduto de cloreto) tetrâmero (663), octâmero (654, duas cargas), pentâmero 10 (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc, 825), GlcA,Glc,Rha (501), Glc,GlcA,Glc (517), Glc,GlcA (355) Glc(Glc-Glc), GlcA (679), Glc(Glc-Glc) (539, aduto de cloreto), GlcA, 11 Glc (391, aduto de cloreto), Glc,Glc (377, aduto de cloreto) Tetrâmero (663), GlcA,Glc,(Rha-Rha) (683, aduto de cloreto), Glc- 12 (Rha-Rha),Rha (654, aduto de cloreto), GlcA,Glc,Rha (501), Glc,GlcA,Glc (517), Rha,Glc (361, aduto de cloreto), GlcA,Glc (355) ( ) denota cadeia lateral. II. Exemplo II. Efeito dos esfinganos (por exemplo, esfinganos nativos, SPSs e SOSs) sobre a atividade de microbiotas intestinais selecionadas.
[0165] Diluíram-se amostras contendo 8 mg/mL (0,8% p/v) de SPS ou SOS a um fator de dois para obter amostras contendo 4 mg/mL (0,4% p/v) de SPS ou SOS. O efeito das Amostras nº 1 a 12 a uma concentração de 4 mg/mL sobre um painel de mais de vinte e cinco microbiotas intestinais foi avaliado após 24 h de fermentação usando uma plataforma de triagem de fermentação in vitro ("i-screen"), como descrito por Fehlbaum (2018). Mais especificamente, utilizou-se um acervo de microbiotas fecais padrão derivado de 5 a 6 adultos saudáveis (saudáveis com base em critérios de exclusão), o qual foi pré-cultivado de um dia para o outro a partir de um estoque congelado. A isso seguiu-se a diluição em placas de microtitulação, onde as amostras foram adicionadas e subsequentemente anaerobicamente incubadas por 24 h a 37° C. Depois da incubação, amostras de cultura foram coletadas e processadas para nova análise. Em uma placa de 96 poços, utilizaram- se alguns poços para os controles técnicos, controle sem microbiotas (n = 3) e controle negativo só com microbiotas (n = 3), deixando 80 poços disponíveis para os experimentos. Vários extratos vegetais (por exemplo, pectinas, oligossacarídeos de pectina e carragenas) e biogomas (por exemplo, xantana e oligossacarídeos de xantana)) das amostras de esfingano e amostras comparativas foram analisados a uma concentração de cerca de 4 mg/mL, o que corresponde a uma dose de cerca de 4 g/dia (Van den Abbeele (2011)).
[0166] Mudanças na composição das microbiotas foram determinadas por sequenciamento de última geração, que reconhece bactérias a nível de gênero e em muitos casos (mas nem todos) a nível de espécie. Para obter uma distribuição uniforme das amostras no sequenciamento, estabeleceu-se a carga bacteriana total do acervo por Reação em Cadeia da Polimerase ("PCR") quantitativa usando um conjunto iniciador-sonda universal. Amplicons 16s rDNA da região V4 foram preparados por PCR, padronizando assim o nível do DNA modelo e usando iniciadores codificados em código de barras corretores de erro exclusivos e evitando a super-amplificação. Em seguida, os amplicons foram purificados em gel, quantificados e acervados. A análise de sequência foi então realizada no instrumento lllumina MiSeq® por sequenciamento de extremidades pareadas (2x250bp). A análise de sequência a jusante foi realizada usando um fluxo de sequenciamento padronizado desenvolvido pela Netherlands Organization for Applied Scientific Research (Organização Neerlandesa para Pesquisa Científica Aplicada). O fluxo prevê, na montagem das leituras de extremidades pareadas, filtragem de qualidade, remoção de quimeras e classificação taxonômica + clustering das leituras processadas.
[0167] Os controles padrão foram realizados em triplicata. Em particular, o painel de micróbios incluiu Bacteroides, Coprococcus, Lachnospiraceae não classificada, Megasphaera, Escherichia/Shigella, Clostridium XlVa, Allisonella, Bifidobacterium, Dorea, Collinsella, Mogibacterium, Sutterella, Bilophila, Blautia, Clostridium sensu stricto, Phascolarctobacterium, Faecalibacterium, Clostridium XlVb, Clostridium XI, Acidaminococcus, Gemmiger, Lachnospira, Parabacteroides, Paraprevotella e Butyricicoccus. O efeito foi determinado em relação a um controle não tratado. A Tabela 4a traz o efeito observado para uma primeira análise i-screen das Amostras nº 1 a 12 sobre o crescimento da Bifidobacterium e Faecalibacterium, onde os resultados divulgados são dados em relação a um controle não tratado (crescimento indicado por 1,0). Tabela 4a. Dados da atividade de microbiotas intestinais selecionadas para as Amostras nº 1 a 12.
Nº da Crescimento Bacteriano amostra Bifidobacterium Blautia Faecalibacterium Parabacteroides 1 1,42 1,09 0,90 1,80 2 1,11 0,87 0,71 1,63 3 1,23 0,85 0,83 4,03 4 1,16 0,84 0,51 0,93 5 1,32 1,60 0,43 2,51 6 0,85 0,81 1,58 2,37 7 0,88 0,92 0,78 4,62 8 0,96 3,23 112,77 9,47 9 1,00 2,42 58,31 5,37 10 0,78 4,78 188,91 21,11 11 0,91 2,58 41,57 32,57 12 0,96 3,49 70,44 38,69
[0168] Os valores em negrito representam mudanças significativas no crescimento bacteriano em comparação ao controle não tratado. Em consonância com os resultados divulgados no Exemplo III (infra), os polissacarídeos de esfingano (a saber, Amostras nº 1 a 3) promoveram o crescimento da Bifidobacterium. Para surpresa de todos, os oligossacarídeos de esfingano (a saber, Amostras nº de 8 a 12) promoveram o crescimento de cada um de Faecalibacterium, Blautia e Parabacterioides em grau significativo em relação ao controle não tratado. Sabe-se bem que a Bifidobacterium e a Faecalibacterium (por exemplo, Faecalibacterium prausnitzii) são bactérias que produzem butirato. Logo, os resultados i-screen demonstrando que os oligossacarídeos de esfingano promovem o crescimento da Faecalibacterium sugerem que essas composições exibem atividade prebiótica. E, como a Faecalibacterium prausnitzii é conhecida por estar associada à anti- inflamação, os resultados i-screen sugerem que os SOSs atuam como agentes anti- inflamatórios ao promover o crescimento da Faecalibacterium prausnitzii.
[0169] Análises i-screen adicionais foram realizadas nas Amostras nº 9, 10, 17 e 18 usando três acervos fecais diferentes, a saber, dois acervos derivados de adultos saudáveis (H1 e H2) e um acervo obtido de pacientes com doença do intestino irritável ("IBD") para três ou quatro bactérias (a saber, Blautia, Parabacteroides, Faecalibacterium, Clostridium XVIII). Mais especificamente, os acervos fecais usados incluem: (i) o acervo H1 foi derivado de seis voluntários adultos saudáveis (caucasianos, 25 a 60 anos de idade, estilo de vida e nutrição europeus, autoavaliação da saúde, sem uso de antibiótico nos últimos 3 meses), (ii) o acervo H2 foi derivado de (5) voluntários adultos saudáveis (20 a 65 anos de idade, sem uso de antibiótico nos últimos 3 meses, autoavaliação da saúde), e (iii) o acervo IBD foi derivado de quatro pacientes com IBD, a saber, colite ulcerativa. A Tabela 4b traz o efeito observado para as análises i-screen adicionais (a saber, primeira i-screen (nos 1 a 2), segunda i-screen (nos 3 a 4) e terceira i-screen (nos 5 a
16)) das Amostras nos 9 a 10 e 17 a 18 sobre o crescimento de três ou quatro bactérias (a saber, Blautia ("Blaut."), Parabacteroides ("Para."), Faecalibacterium ("Faecal."), Clostridium XVIII ("ClXVIII")), onde os resultados divulgados são dados em relação a um controle não tratado (crescimento indicado por 1,0). Tabela 4b. Dados da atividade de microbiotas intestinais selecionadas para as Amostras nº 9 a 10 e 17 a 18.
Nº Nº da Acervo Blaut. Para. Faecal. ClXVIII amostra 1 9a H1 2,42 5,37 58,31 ― 2 10a H1 4,78 21,11 188,91 ― 3 9b H1 2,21 6,79 30,71 ― 4 10b H1 3,20 15,99 51,54 ― 5 9 H1 1,91 3,56 3,75 ― 6 10 H1 2,67 8,37 23,19 ― 7 17 H1 2,54 4,34 7,86 ― 8 18 H1 1,90 3,82 5,16 ― 9 9 H2 1,10 3,64 6,76 16,63 10 10 H2 1,79 7,25 21,93 31,13 11 17 H2 2,18 6,84 1,39 55,91 12 18 H2 1,27 3,38 7,47 12,66 13 9 IBD ― 1,74 5,11 31,39 14 10 IBD ― 6,92 6,06 30,84 15 17 IBD ― 6,79 2,45 98,28 16 18 IBD ― 1,63 5,26 32,58 a As respostas da Faecal. são dadas na Tabela 4a. b As respostas da Faecal. são dadas na Tabela 5.
[0170] No que diz respeito às entradas 1 a 4 na Tabela 4b, pode-se observar que os SOSs promoveram aumento no múltiplo de modificação da Blautia, Parabacteroides e Faecalibacterium em acervos fecais de adultos saudáveis em comparação a controles saudáveis. Os SOSs derivados de oligômeros de gelano com baixo teor de acila exibiram o múltiplo de modificação mais alto da Faecalibacterium (188.91), bem como dos Parabacteroides (21.11) e da Blautia (4.78).
[0171] No que diz respeito às entradas de 5 a 8 na Tabela 4b, fazem-se as observações a seguir. Os SOSs (tratados com ácido e enzima) promoveram o crescimento da Blautia, Parabacteroides e Faecalibacterium em acervos fecais de adultos saudáveis em comparação a controles não tratados. Esses resultados corroboram as descobertas dos resultados na primeira e segunda i-screen para amostras de oligômeros de gelano com teor de acila alto e baixo. Obtiveram-se valores de múltiplo de modificação mais altos nos três gêneros com oligômeros de gelano com baixo teor de acila tratados com ácido. Além disso, os oligômeros de gelano com teor de acila alto e baixo produzidos com tratamento enzimático também foram eficazes em aumentar o crescimento dos três gêneros no mesmo acervo fecal.
[0172] Usando o acervo fecal H2 (entradas 9 a 12 na Tabela 4b), pode-se observar que os SOSs (tratados com ácido e enzima) aumentaram o múltiplo de modificação da Blautia, Parabacteroides, Faecalibacterium e de bactérias do cluster de Clostridium XVIII. Os SOSs (tratados com ácido) promoveram o mais alto múltiplo de modificação da Faecalibacterium (21.93) e Parabacteroides (7.25). Os valores de múltiplo de modificação do cluster de Clostridium XVIII variaram de 12,66 a 55,91. Como ponto de referência, a maioria dos clusters de Clostridium XVIII e Clostridium XIVa encontrados no intestino produz acetato (algumas linhagens no cluster de Clostridium XIVa também produzem butirato além de acetato), também com base no análise genômica (rede metabólica) nenhum dos clusters produz toxinas (Narushima (2014)).
[0173] Usando o acervo fecal IBD (entradas 13 a 16 na Tabela 4b), os resultados demonstram que os SOSs (de gelano com baixo teor de acila) promoveram os valores de múltiplo de modificação mais altos de Parabacteroides. Os oligômeros de gelano com baixo teor de acila tratados com ácido exibiram o mais alto múltiplo de modificação da Faecalibacterium. O múltiplo de modificação do cluster de Clostridium XVIII também aumentou de 30,84 para 98,28. É digno de nota que há um crescimento significativo de Parabacteroides nos SOSs. Como os Parabacteroides digerem dietas saudáveis ricas em fibras, eles protegem contra a inflamação. Essas bactérias fazem-se ausentes em pacientes que sofrem de doenças intestinais inflamatórias (Martínez (2010), Noor (2010), Segata (2012) e Zitomersky (2013)).
[0174] A Tabela 5 traz o efeito observado para uma segunda análise i-screen das Amostras nº 9 a 16 (e Amostras Comparativas 1 a 16, além do suplemento Livaux™, Inulina e Amoxicilina) em um painel de seis bactérias (Lachnospiraceae não classificadas ("Lachn.U."), Clostridium XlVa ("ClX1Va"), Bifidobacterium ("Bifid."), Coprococcus ("Copro."), Blautia ("Blaut."), Phascolarctobacterium, ("Phasc."), Faecalibacterium ("Faecal."), Butyricicoccus ("Butyr.") e Parabacteroides ("Para.")), onde os resultados divulgados são dados em relação a um controle não tratado (crescimento indicado por 1,0). Tabela 5. Efeito de SOSs selecionados (SN9 a SN16) e de Amostras Comparativas (CS) vs. um painel de oito bactérias.
Lachn, ClX1V Bifi Copr Blau Phas Faec Buty Para. Amostra U. a d. o. t. c. al. r.
SN9 2,42 1,00 0,65 1,02 2,21 1,08 30,71 0,95 6,79 SN10 1,19 0,93 0,73 0,83 3,20 1,37 51,54 0,93 15,99
Lachn, ClX1V Bifi Copr Blau Phas Faec Buty Para. Amostra U. a d. o. t. c. al. r.
SN11 1,20 1,07 0,38 1,22 2,56 1,97 30,24 1,12 26,30 SN12 0,53 1,17 1,34 0,31 2,28 2,90 48,73 0,73 37,79 SN13 2,06 0,96 0,80 0,88 2,12 1,04 17,49 0,91 9,36 SN14 1,16 0,83 0,86 0,78 3,00 1,29 43,63 0,99 17,67 SN15 1,14 0,88 0,67 1,12 4,96 1,24 29,05 0,84 6,59 SN16 1,08 0,80 1,32 0,82 2,30 2,11 11,24 0,92 31,01 CS1 3,90 0,62 1,01 0,52 1,86 1,21 3,74 0,55 0,49 CS2 3,54 0,52 0,62 0,39 1,26 1,31 3,09 0,67 0,53 CS3 3,08 0,54 0,83 0,56 1,91 1,58 3,63 0,77 0,52 CS4 2,82 0,54 0,88 0,51 1,68 1,64 3,20 0,71 0,55 CS5 1,67 0,55 0,43 0,71 1,31 1,94 3,49 0,91 0,71 CS6 2,45 0,54 0,89 0,50 1,74 1,67 2,26 0,84 0,47 CS7 1,52 0,71 0,53 0,93 1,15 1,09 1,35 1,49 0,75 CS8 1,13 0,51 0,65 0,58 0,55 1,27 1,13 1,19 0,46 CS9 1,22 1,02 0,74 1,27 0,92 0,98 1,46 1,25 0,98 CS10 2,03 0,66 0,84 0,87 1,49 1,53 3,64 0,71 0,80 CS11 1,20 1,07 0,60 0,84 1,13 1,86 1,77 0,72 1,38 CS12 2,35 0,54 2,13 0,57 2,72 1,79 2,18 0,67 0,58 CS13 0,72 0,59 1,95 0,56 5,15 2,17 1,81 0,68 0,52 CS14 1,17 1,05 0,56 1,07 1,31 1,24 1,04 0,68 2,80 CS15 1,23 0,81 1,05 0,83 1,79 1,21 1,15 1,33 7,16 CS16 1,38 0,73 1,52 0,82 2,52 1,50 1,25 1,00 8,26 CS17 1,19 0,82 1,11 1,03 1,79 1,28 0,94 1,07 7,01 CS18 0,97 0,72 1,68 1,15 1,53 1,07 1,14 0,74 0,79 CS19 0,73 0,81 3,35 0,82 3,64 0,78 0,93 0,89 0,62
Lachn, ClX1V Bifi Copr Blau Phas Faec Buty Para. Amostra U. a d. o. t. c. al. r.
CS20 0,04 0,03 0,24 0,04 0,23 0,08 0,37 0,00 12,10
[0175] A Tabela 6 traz a composição das Amostras Comparativas 1 a 16 usadas na segunda triagem. Tabela 6. Sumário das Amostras Comparativas ("CS") 1 a 16.
CS Comentários CS1 Pectina do limão semiacabada (67,3% de DE; IV 5,3 dL/g).a Pectina da lima (55,5% de DE; IV 5,0 dL/g; padrão de esterificação ("EP") CS2 aleatório).a CS3 Pectina da laranja semiacabada (55,7% de DE; IV 3,1 dL/g).a CS4 Pectina da laranja (28,3% de DE; IV 3,0 dL/g), EP aleatório.a Pectina da beterraba semiacabada (53,0% de DE, IV 2,4 dL/g, 18,0% CS5 DAc).a CS6 Pectina da laranja (55,1% de DE, IV 1,7 dL/g).a Oligossacarídeos pécticos ("POS") da beterraba obtidos tratando a pectina da beterraba com pectina liase e poligalacturonase; passando CS7 através de um filtro de 0,2 mícrons; e submetendo o permeado a um filtro de 3 kDa.
POS do limão (metilados) obtidos tratando a pectina do limão com CS8 pectina liase; submetendo a um filtro de 70 kDa; e então submetendo o permeado a um filtro de 3 kDa.
POS do limão (não metilados) obtidos tratando a pectina do limão com CS9 pectina metil esterase e pectina liase; submetendo a um filtro de 70 kDa; e então submetendo o permeado a um filtro de 3 kDa.
CS10 Fibra insolúvel de frutas cítricas.
CS11 κ-Carragena (parcialmente modificada: tipicamente 17% a 18% nu).
CS Comentários CS12 Pectina extraída de cascas descartadas.
HR (região peluda, ou RG1, ramnolacturonano 1) da beterraba obtida tratando a HR da beterraba com pectina liase e poligalacturonase; CS13 submetendo a um filtro de 0,2 micro; e submetendo o retentado a um filtro de 10 kDa.
Polissacarídeo de xantana preparado a partir de xantana não piruvilada CS14 ("NPX").
Oligossacarídeo de NPX derivado da CS14 tratando com xantanase; CS15 seguida por passagem através de um filtro de 5 kDa.
Polissacarídeo de xantana derivado da goma xantana clarificada CS16 (xantana KELTROL® T) em pó.
Oligossacarídeo de xantana derivado do polissacarídeo de xantana (cf. CS17 CS16) por digestão adicional da xantanase; seguida por passagem através de um filtro de 5 kDa.
Kiwi em pó Livaux™ (produto comercial que reivindica a promoção da F. CS18 prausnitzii).
CS19 Inulina (disponibilizada comercialmente pela Sigma).
CS20 Amoxicilina (disponibilizada comercialmente pela Sigma). aPara pectinas semiacabadas e oligossacarídeos pécticos (POS), as amostras de pectina foram tratadas usando ou pectina metil esterase para menor grau de esterificação (DE) ou poligalacturonase e pectina liase para pectinas com menor MW/IV (peso molecular/viscosidade intrínseca).
[0176] Com base nos resultados da Tabela 5, observa-se que todos os oligossacarídeos de esfingano exibiram o crescimento mais alto da Faecalibacterium em relação a todas as Amostras Comparativas. Em particular, o crescimento mais alto da Faecalibacterium foi exibido por oligossacarídeos de gelano (cerca de
52 vezes) obtidos a partir do gelano GELRITETM MK (corte de 5 kDa (SN10)), oligossacarídeos de ramsano (cerca de 49 vezes) obtidos a partir de ramsano nativo (SN12) e oligossacarídeos de gelano (43 vezes) obtidos a partir de GELRITE™ MK (corte de 10 kDa (SN14)). Interessantemente, o produto Livaux™ – promovido como tendo atividade de crescimento da Faecalibacterium (vide, por exemplo, livaux.com/livaux-gi-problem/) – exibiu um aumento de apenas 1,14 vezes na atividade de crescimento da Faecalibacterium em comparação a um controle não tratado. A atividade de crescimento da Faecalibacterium relativamente baixa do produto Livaux™ está em consonância com os dados publicados (US20170326190A1).
[0177] Uma comparação dos resultados da Tabela 4 e Tabela 5 demonstra, em certos casos, a variabilidade para amostras selecionadas (cf., SN10 (188.31 v.
51.54) e SN12 (70.44 v. 48.73)). Análises adicionais dos dados selecionados demonstram que o coeficiente de variação (a saber, a razão do desvio padrão para a média) para esfinganos selecionados pode variar de cerca de 7% a cerca de 32% e, em alguns casos, até cerca de 80%.
[0178] Com base nos resultados da Tabela 5, observa-se que todos oligossacarídeos exibiram aumento na atividade de crescimento para a Blautia (a saber, um aumento de 2 a 5 vezes em relação a um controle não tratado).
[0179] Dados não exibidos revelam que todos os oligossacarídeos de esfingano exibiram uma redução na atividade de crescimento para a Escherichia/Shigella (cerca de 9% a 36% de redução em relação a um controle não tratado). Isso deve ser contrastado ao produto Livaux™, que exibiu aumento na atividade de crescimento para a Escherichia/Shigella (aumento de cerca de 45% em relação a um controle não tratado).
III. Exemplo III. Efeito de uma goma gelana sobre a atividade e composição do microbioma intestinal luminal e mucosa no trato gastrointestinal humano. A. Material e Métodos, Concepção do experimento SHIME e Típica configuração do reator SHIME
[0180] Aspectos do Simulador do Ecossistema Microbiano Intestinal Humano (ou SHIME) são conhecidos (vide, por exemplo, Molly (1993), Possemiers (2004), Possemiers (2017), Van de Wiele (2013), Van den Abbeele (2012) e Van den Abbeele (2013)).
[0181] A típica configuração do reator do SHIME, representando o trato gastrointestinal de um ser humano adulto, foi descrita por Molly (1993). Ela consiste em uma sucessão de cinco reatores simulando as diferentes partes do trato gastrointestinal humano (por exemplo, estômago (V1), intestino delgado (V2), cólon ascendente (V3), cólon transverso (V4) e cólon descendente (V5)). Os primeiros dois reatores são do princípio fill-and-draw para simular diferentes etapas na absorção e digestão de alimentos, com bombas peristálticas acrescentando uma quantidade definida de ração SHIME (140 mL 3x/dia) e líquido pancreático e biliar (60 mL 3x/dia), respectivamente, ao compartimento do estômago (V1) e intestino delgado (V2) e esvaziando os respectivos reatores após intervalos de tempo especificados. Os últimos três compartimentos simulam o intestino grosso. Esses reatores são agitados continuamente; eles têm um volume constante e controle do pH. O tempo de permanência e pH dos diferentes vasos são escolhidos com vistas a reproduzir condições in vivo nas diferentes partes do cólon. Quando da inoculação com microbiota fecal, essas reatores simulam o cólon ascendente (V3), transversal (V4) e descendente (V5). O preparo do inóculo, tempo de permanência, pH, configurações de temperatura e composição da ração do reator foram descritas previamente por Possemiers (2004). Quando da estabilização da comunidade microbiana nas diferentes regiões do cólon, estabelece-se uma comunidade microbiana representativa nos três compartimentos do cólon, a qual difere quanto à composição e funcionalidade nas diferentes regiões do cólon.
[0182] O trato intestinal humano abriga uma comunidade grande e complexa de micróbios que estão envolvidos em manter a saúde humana ao prevenir a colonização por patógenos e ao produzir nutrientes. Os micro-organismos não são distribuídos aleatoriamente ao longo do intestino e os que aderem-se à parede intestinal exercem importante papel como 'barreira' contra patógenos, instruindo as respostas imunológicas mucosas e ocupando um nicho às custas de colonizadores potencialmente nocivos. No entanto, as estratégias in vitro atuais não permitem cultivar a fração de micro-organismos que adere-se à mucosa intestinal e limitam-se a modelar a comunidade microbiana luminal. Isso significa que uma parte importante do ecossistema intestinal não é levada em consideração e que informações potencialmente cruciais são perdidas.
[0183] Para superar esse problema, o sistema SHIME foi modificado para levar em conta a colonização da camada mucosa (vide, por exemplo, Van den Abbeele (2012) e Van den Abbeele (2013)). O sistema SHIME modificado é conhecido como M-SHIME, que permite cultivar tanto a comunidade luminal quanto a comunidade microbiana associada ao muco por períodos de várias semanas.
[0184] A inclusão do compartimento da mucosa aumenta o valor e a capacidade de modelagem do SHIME e permite avaliar se um tratamento específico também é capaz de modular a comunidade microbiana associada à mucosa.
1. Configuração do SHIME adaptada para o estudo
[0185] A configuração do SHIME foi adaptada de uma configuração TWINSHIME em uma configuração TripleSHIME, que incluiu um vaso (ou reator) para o estômago, intestino delgado, cólon proximal e cólon distal para cada um dos doadores. A configuração TripleSHIME permitiu a comparação das três condições diferentes em paralelo. Avaliou-se a fermentação em potencial de uma goma gelana pela microbiota de três doadores humanos diferentes (Doador A: sexo feminino, 28 anos; Doador B: sexo feminino, 41 anos; Doador C: sexo feminino, 34 anos). As regiões do cólon limitaram-se a duas regiões, em comparação a três regiões no TWINSHIME. Os tempos de permanência e faixas de pH foram otimizados a fim de obter resultados que fossem representativos de uma simulação completa do trato gastrointestinal. Na prática, nos experimentos TripleSHIME, em vez de trabalhar com 2 unidades, cada uma composta por uma configuração AC-TC-DC (cólon ascendente, transversal e descendente), utilizaram-se 3 unidades PC-DC. Quando da inoculação com a microbiota fecal de uma pessoa adulta, esses reatores simulam o cólon proximal (PC; pH 5,6 a 5,9; tempo de permanência = 20 h; volume de 500 mL) e o cólon distal (DC; pH 6,6 a 6,9; tempo de permanência = 32 h; volume de 800 mL).
[0186] O experimento SHIME para esse estudo foi composto por três estágios (Estabilização, Controle e Tratamento), que prolongaram-se por um período de sete semanas.
[0187] Período de estabilização: Após a inoculação dos reatores do cólon com uma amostra fecal apropriada, um período de estabilização de duas semanas permitiu que a comunidade microbiana se diferenciasse nos diferentes reatores, dependendo das condições ambientais locais. Durante esse período, a matriz nutricional básica foi provida ao SHIME para sustentar a máxima diversidade da microbiota intestinal originalmente presente no inóculo fecal.
[0188] Período controle: Durante esse período de referência de duas semanas, a matriz nutritiva SHIME padrão foi adicionalmente dosada ao modelo por um período de 14 dias. A análise das amostras nesse período permitiu determinar a composição e atividade da comunidade microbiana base nos diferentes reatores, que foi usada como referência para avaliar os efeitos do tratamento.
[0189] Período de tratamento: Durante esse período de três semanas, o reator SHIME foi operado em condições nominais, mas com uma dieta suplementada com o produto teste. As amostras recolhidas dos reatores do cólon nesse período permitiram a investigação do efeito específico sobre a composição e atividade da comunidade microbiana residente. B. Análise da composição e atividade da comunidade microbiana
[0190] Uma característica do SHIME é a possibilidade de trabalhar com uma comunidade de microbiota estabilizada e coletar regularmente amostras das diferentes regiões intestinais para novas análises. Os grandes volumes nas regiões do cólon permitem coletar volumes suficientes de líquidos todos os dias, sem perturbar a comunidade microbiana nem ameaçar o resto do experimento.
[0191] Vários parâmetros microbianos são monitorados ao longo de todo o experimento como parte do experimento SHIME padrão. Essas medições são necessárias para avaliar o desempenho do modelo e permitem monitorar mudanças básicas na composição e atividade da comunidade microbiana devidas ao tratamento prebiótico.
1. Análise da composição e atividade da comunidade microbiana
[0192] Consumo de ácido/base: a produção de metabólitos microbianos nos reatores do cólon modifica o pH. Sem um controle contínuo do pH (através da adição de ácido ou base), o pH ultrapassaria os intervalos fixados. O consumo de ácido/base é monitorado continuamente durante um experimento SHIME.
[0193] Produção total de gás: a avaliação da produção total de gás é um aspecto importante relacionado a potenciais questões de tolerância em caso de aplicação final. No entanto, as medições sobre a produção total de gás em linha são difíceis em modelos contínuos do intestino, devido ao influxo e efluxo contínuos de massas. A análise da produção total de gás, portanto, é avaliada tipicamente em configurações em batelada.
2. Atividade da comunidade microbiana (3x/semana)
[0194] Ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs): analisaram-se as concentrações de ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico.
[0195] Lactato: precursor de SCFAs e potencial agente antimicrobiano.
[0196] O amônio e os SCFAs ramificados (ácido isobutírico, ácido isovalérico e ácido isocaproico) são marcadores da fermentação proteolítica, com efeitos um tanto adversos à saúde do hospedeiro.
[0197] Composição da comunidade microbiana (1x/semana); coletaram-se amostras para o sequenciamento Illumina dirigido ao 16S. C. Goma Gelana usada nos estudos
[0198] O produto teste incluiu uma goma gelana de grau alimentício, goma gelana KELCOGEL® LT100-P ("Goma Gelana"). A goma gelana KELCOGEL® LT100-P é uma goma gelana nativa (com alto teor de acila). O produto foi testado a uma dose in vitro de 1 g/d, que corresponde a uma dosagem in vivo de 2 g/d. D. Estabilidade da configuração do SHIME
[0199] Durante o período controle, os níveis de SCFAs provaram-se bastante estáveis dentro das três unidades do SHIME (em média, os níveis foram 94,4% similares entre pontos no tempo consecutivos no período controle), indicando claramente a estabilidade da comunidade microbiana em termos de atividade e composição. As condições estáveis do reator aumentam a confiança de que qualquer efeito observado durante o tratamento realmente decorre do produto teste administrado. E. Atividade fermentativa geral
1. Consumo de ácido/base
[0200] O consumo de ácido e base reflete a atividade microbiana geral no decorrer de um experimento SHIME. Para garantir que as condições ambientais ideais sejam mantidas, o pH em um sistema SHIME é controlado por controladores de pH para que permaneça entre 5,6 e 5,9 no cólon proximal e entre 6,6 e 6,9 no cólon distal. Quando da estabilização da comunidade microbiana nos diferentes reatores (iniciada 2 semanas após a inoculação), o consumo de base-ácido geralmente é baixo. No entanto, durante um tratamento, as bactérias podem produzir maiores quantidades de SCFAs. Como consequência, o ambiente nos reatores acidulará, exigindo a administração de base aos respectivos reatores para mantê-los nas faixas de pH predefinidas. Como resultado, o consumo de ácido/base aumentará. Ao medir o consumo de ácido/base no decorrer de um experimento, é possível estimar o efeito potencial do produto teste sobre a atividade da comunidade microbiana. No entanto, deve-se ter em mente que o consumo de ácido/base é só um indicador grosseiro da fermentação microbiana, uma vez que nem todos os ácidos produzidos via fermentação causam a mesma redução no pH (os ácidos com pKa mais baixa, como acetato, efetivamente diminuem o pH), ao passo que a conversão de ácidos um no outro também pode afetar o pH (por exemplo, a conversão do acetato/lactato em propionato/butirato aumenta o pH). A medição real dos metabólitos microbianos (como SCFAs e lactato) permite uma leitura mais precisa.
[0201] Os dados na Tabela 7 demonstram que a fermentação geral do produto teste exibiu tendência semelhante nos três doadores testados tanto no compartimento do cólon proximal quanto no compartimento do cólon distal. Tabela 7. Média semanal do consumo de base-ácido (mL/dia) durante duas semanas controle (C1 e C2) e três semanas de tratamento (TR1-TR3) para o tratamento com Goma Gelana para três doadores diferentes (A, B e C) nos reatores do cólon proximal (PC) e consumo médio de ácido/base por todo o período controle (n = 6) e período de tratamento (n = 9).
PC DC Períodos
A B C A B C
PC DC Períodos
A B C A B C C1 1,1 2,2 0,9 15,9 13,8 18,5 C2 0,8 0,5 1,1 17,3 15,4 16,1 TR1 -0,4 -0,7 0,0 21,6 18,2 19,6 TR2 1,6 1,4 0,5 15,0 15,1 17,5 TR3 4,3 3,1 2,9 19,3 17,2 21,1 CON(ave) 1,0 1,3 1,0 16,6 14,6 17,3 TRT(ave) 1,8 1,3 1,1 18,6 16,8 19,4
[0202] No cólon proximal, a acidificação foi muito limitada, porém observou- se tendência a um maior consumo de base durante a semana final do tratamento para todos os doadores testados. No cólon distal, a acidificação foi mais pronunciada durante o período controle em comparação ao cólon proximal. Isso é explicado pelo fato de que a transferência física da suspensão do cólon proximal mais ácida (pH = 5,6 a 5,9) para o cólon distal automaticamente provoca um consumo de base mais alto no cólon distal para manter o pH no intervalo certo (pH = 6,6 a 6,9). A suplementação do produto teste resultou em um consumo de base levemente elevado imediatamente após o início do tratamento para todos os doadores testados.
2. Produção de gás
[0203] Como os gases são um endpoint relevante da atividade fermentativa por micróbios intestinais, mudanças na produção de gás oferecem um indicativo do perfil geral de fermentação. Como a produção de gás não é monitorada no modelo SHIME contínuo, dada a descarga regular do headspace com gás nitrogênio (para garantir a anaerobiose), a produção de gás é avaliada em incubações em batelada de curto prazo separadas. Durante essas incubações, a mesma dose do produto investigado é alimentada a uma microbiota derivada do cólon proximal do SHIME durante o período controle, reproduzindo assim os processos que ocorrem ao iniciar o tratamento no modelo SHIME contínuo.
[0204] Observaram-se efeitos dependentes do doador em termos da produção de gás (dados não ilustrados). Ao passo que observou-se uma produção de gás levemente maior para o Doador B mediante tratamento com o produto teste, o tratamento resultou em uma produção de gás levemente reduzida para os demais doadores. No geral, a produção de gás foi mais intensa durante o intervalo de tempo de 6 a 24 h em todas as condições. Só durante o intervalo de tempo de 4 a 6 h, observou-se um aumento consistente (porém brando) na produção de gás em todos os doadores mediante tratamento com o produto teste, ao passo que os demais intervalos de tempo foram caracterizados por diferenças específicas ao doador.
[0205] No geral, o tratamento com Goma Gelana dificilmente afetou a produção de gás pela microbiota intestinal para os três doadores testados. F. Análise da atividade da comunidade microbiana
1. Produção de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs)
[0206] As informações a seguir descrevem o efeito do produto teste sobre a produção de SCFAs no experimento Triple-SHIME. A produção de SCFAs decorre do metabolismo de carboidratos no cólon e está relacionada a vários efeitos na saúde. Os SCFAs mais abundantes são acetato, propionato e butirato. Os SCFAs são reconhecidos por exercer papel crucial na saúde do intestino. O acetato pode ser usado como fonte de energia para o hospedeiro e como potencial substrato para a síntese de lipídios no corpo. Ademais, ele é um subproduto importante na síntese do butirato e pode exercer efeitos antimicrobianos contra patógenos. No entanto, os efeitos promotores da saúde são atribuídos principalmente ao propionato e butirato, que atuam como as principais fontes de energia para o epitélio intestinal e exibem efeitos protetores contra a inflamação e o câncer de cólon (Cummings (1987)). O propionato é conhecido por ser transportado ao fígado, onde exerce efeito redutor do colesterol no plasma e afeta positivamente o controle glicêmico (vide, Wright (1990), Demigne (1995) e Wong (2006)).
[0207] Em suma, efeitos benéficos dos substratos investigados sobre a produção de SCFAs, portanto, incluem aumento na produção de acetato, propionato e/ou butirato. As informações a seguir consideram uma comparação direta dos resultados para os três doadores.
[0208] Visando a uma comparação ideal dos diferentes doadores, os níveis médios de SCFA para todos os três são dados para cada um dos diferentes SCFAs (por semana e por período).
2. Produção de acetato
[0209] O acetato pode ser produzido por uma ampla variedade de micróbios, inclusive, dentre muitos outros, as Bacteroides spp. (filo dos Bacteroidetes) e Bifidobacteria. Acontece que, embora a Goma Gelana tenha aumentado significativamente os níveis de acetato no cólon proximal dos Doadores A e C, os níveis de acetato não foram afetados para o Doador B (FIG. 2a, Tabela 8). O maior aumento médio foi observado para o Doador A (isto é, um aumento de 1,7 mM ou +21%). Em contrapartida, no cólon distal, níveis aumentados de acetato mediante tratamento com Goma Gelana só foram observados para o Doador B (FIG. 2b, Tabela 8) com um aumento médio de 2,1 mM (+6%) em relação ao período controle. Tabela 8. Efeito do tratamento com Goma Gelana sobre a produção de acetato (em mM) nos reatores do cólon proximal (PC) e distal (DC) para os três diferentes doadores (A, B e C) e produção semanal média de acetato durante as semanas controle (C1 e C2) e semanas de tratamento (TR1-TR3) (vide também as FIGs. 1a a 1B).
PC DC Períodos
A B C A B C C1 8,5 11,7 7,4 38,9 36,0 37,7
PC DC Períodos
A B C A B C C2 8,0 7,4 7,4 35,9 34,8 36,5 TR1 8,5 9,6 8,3 36,4 36,7 36,8 TR2 9,5 8,0 7,5 35,2 37,2 35,5 TR3 11,6 10,1 10,8 39,3 38,5 38,5 CON(ave) 8,2 9,6 7,4 37,4 35,4 37,1 TRT(ave) 9,9 9,2 8,9 37,0 37,5 36,9
3. Produção de propionato
[0210] O propionato pode ser produzido por uma ampla variedade de micróbios, sendo os produtores de propionato mais abundantes as Bacteroides spp. (filo dos Bacteroidetes), Veillonella (filo dos Firmicutes) e Akkermansia muciniphila (filo das Verrucomicrobia). Para todos os três doadores testados, a administração de Goma Gelana resultou em redução significativa dos níveis de propionato em resposta ao tratamento para ambas as regiões do cólon (FIGs. 3a a 3b, Tabela 9). No cólon proximal, observou-se uma forte redução imediata para os Doadores A e B, ao passo que o efeito foi menos pronunciado para o Doador C (isto é, uma redução de 1,7 mM (-8%) para o Doador C vs. -4,3 mM (-18%) e -,.8 mM (-20%) para os Doadores A e B, respectivamente). No cólon distal, por outro lado, observou-se uma redução mais gradativa nos níveis de propionato para todos os doadores. Essas descobertas são surpreendentes tendo em vista os estudos de Edwards (1995) e Anderson (1988). Por exemplo, Edwards (1995) mencionou que, em ratos Wistar, a goma gelana não exibiu efeito consistente sobre o teor de SCFAs, ao passo que Anderson (1988) relata que a ingestão de grandes quantidades de goma gelana resultaram em uma redução de 23% no teor fecal de propionato em voluntários do sexo feminino e em um aumento de 33% no teor fecal de propionato em voluntários do sexo masculino.
Tabela 9. Efeito do tratamento com Goma Gelana sobre a produção de propionato (em mM) nos reatores do cólon proximal (PC) e distal (DC) para os três diferentes doadores (A, B e C), e produção semanal média de propionato durante as semanas controle (C1 e C2) e semanas de tratamento (TR1-TR3) (vide também as FIGs. 2a a 2b).
PC DC Períodos
A B C A B C C1 24,2 23,5 21,3 34,9 34,5 34,4 C2 23,1 23,2 22,6 33,2 36,0 35,0 TR1 19,3 19,1 21,5 32,7 33,9 33,9 TR2 19,1 16,9 18,7 28,4 29,9 30,9 TR3 19,5 19,6 20,4 29,8 30,3 30,7 CON(ave) 23,6 23,4 21,9 34,1 35,2 34,7 TRT(ave) 19,3 18,6 20,2 30,3 31,4 31,8
4. Produção de Butirato
[0211] O butirato é produzido por membros dos clusters de Clostridium IV e XIVa (filo dos Firmicutes). Em um processo chamado de alimentação cruzada, esses micróbios convertem o acetato e/ou lactato (além de outros substratos) no butirato relacionado à saúde. Os níveis de butirato aumentaram gradativamente mediante suplementação com Goma Gelana no cólon proximal e, em menor grau, no cólon distal para todos os doadores testados (FIGs. 4a a 4b, Tabela 10). O efeito foi mais pronunciado no cólon proximal com aumentos significativos de 2,3 mM (+24%), 1,9 mM (+21%) e 1,4 mM (+15%) para o Doador A, Doador B e Doador C, respectivamente. No cólon distal, só o Doador A exibiu níveis significativamente aumentados de butirato mediante suplementação com Goma Gelana (isto é, um aumento de 1,4 mM (+13%)).
Tabela 10. Efeito do tratamento com Goma Gelana sobre a produção de butirato (em mM) nos reatores de cólon proximal (PC) e distal (DC) para os três diferentes doadores (A, B e C) e produção semanal média de butirato durante as semanas controle (C1 e C2) e as semanas de tratamento (TR1-TR3) (vide também as FIGs. 4a a 4b).
PC DC Períodos
A B C A B C C1 9,4 9,2 9,4 10,6 12,2 11,3 C2 9,4 9,2 8,9 10,9 11,3 10,7 TR1 10,8 9,1 9,0 11,4 11,5 10,1 TR2 12,2 11,5 10,4 12,1 13,5 12,1 TR3 12,0 12,8 12,2 13,0 13,2 12,2 CON(ave) 9,4 9,2 9,1 10,8 11,8 11,0 TRT(ave) 11,7 11,1 10,5 12,2 12,7 11,4
5. Produção de Lactato
[0212] O intestino humano abriga tanto bactérias produtoras de lactato quanto bactérias utilizadoras de lactato. O lactato é produzido por bactérias do ácido láctico e reduz o pH do ambiente. Em especial a valores de pH baixos, o lactato pode exercer fortes efeitos antimicrobianos contra patógenos. Outro efeito benéfico do lactato decorre de sua conversão em butirato e/ou propionato. Como diferentes espécies microbianas, portanto, produzem e convertem o lactato, um aumento na concentração de lactato pode decorrer tanto de uma produção mais alta quanto de uma conversão mais baixa. Logo, impõe-se cautela na interpretação dos dados para os resultados de lactato.
[0213] No cólon proximal, as concentrações de lactato aumentaram durante a semana final do tratamento para todos os doadores testados, atingindo significância somente para o Doador A (Tabela 11). No entanto, para os demais doadores, pôde-se observar desvios padrão elevados durante a semana final do tratamento, uma vez que as concentrações de lactato aumentaram gradativamente no curso dessa semana, isto é, de 0,19 mM no início da semana final do tratamento até 0,73 mM ao fim da semana para o Doador B e de 0,13 mM para 0,46 mM para o Doador C. No cólon distal, observaram-se concentrações de lactato significativamente aumentadas durante a semana final do tratamento para o Doador C. Para o Doador A, observou-se a tendência a concentrações de lactato mais altas mediante suplementação com Goma Gelana, ao passo que as concentrações de lactato não foram afetadas quando do tratamento para o Doador B. Tabela 11. Efeito do tratamento com Goma Gelana sobre a produção de lactato (em mM) nos reatores do cólon proximal (PC) e distal (DC) para os três diferentes doadores (A, B e C) e produção semanal média de lactato durante as semanas controle (C1 e C2) e semanas de tratamento (TR1-TR3) (vide também as FIGs. 5a a 5b).
PC DC Períodos
A B C A B C C1 0,03 0,10 0,06 0,61 0,84 0,62 C2 0,02 0,01 0,01 0,65 0,65 0,45 TR1 0,03 0,05 0,05 0,57 0,84 0,60 TR2 0,06 0,15 0,11 0,64 0,74 0,66 TR3 0,32 0,45 0,30 0,79 0,67 0,96 CON(ave) 0,02 0,06 0,04 0,63 0,75 0,54 TRT(ave) 0,14 0,22 0,15 0,67 0,75 0,74
6. Produção de amônio e SCFAs ramificados
[0214] Tanto a produção de amônio (NH4+) quanto a produção de SCFAs ramificados (b-SCFAs = soma de isobutirato, isovalerato e isocaproato) decorrem da degradação proteica e refletem a atividade proteolítica da microbiota intestinal. Como esta foi associada a efeitos deletérios à saúde diretos e indiretos (por exemplo, carcinogênese de cólon), a redução na produção de amônio/b-SCFAs é considerada benéfica. As FIGs. 6a a 6b (Tabela 12) trazem a produção média de amônio (em mg/mL) associada aos diferentes tratamentos nas duas regiões do cólon, ao passo que as FIGs. 7a a 7b (Tabela 13) trazem a produção média de SCFAs ramificados (em mM) associada aos diferentes tratamentos nas duas regiões do cólon.
[0215] Os níveis de amônio não foram afetados pelo tratamento com goma gelana nem no cólon proximal nem no cólon distal para todos os doadores testados, salvo um leve aumento no cólon proximal durante a semana final do tratamento para o Doador C. Esses resultados foram confirmados pelos níveis de SCFAs ramificados, onde só observaram-se leves aumentos perto do fim do tratamento tanto no cólon proximal e quanto no cólon distal para todos os doadores testados. Tabela 12. Efeito do tratamento com Goma Gelana sobre a produção de amônio (mg/L) nos reatores do cólon proximal (PC) e distal (DC) para os três diferentes doadores (A, B e C) e produção semanal média de amônio (mg/L) durante as semanas controle (C1 e C2) e semanas de tratamento (TR1-TR3) (vide também as FIGs. 6a a 6b).
PC DC Períodos
A B C A B C C1 102 110 82 271 280 281 C2 92 85 90 265 285 245 TR1 72 54 89 240 225 281
PC DC Períodos
A B C A B C TR2 120 95 92 268 273 291 TR3 110 114 129 251 299 250 CON(ave) 97 98 86 268 283 263 TRT(ave) 101 88 103 253 266 274 Tabela 13. Efeito do tratamento com Goma Gelana sobre a produção de SCFAs ramificados (mM) nos reatores do cólon proximal (PC) e distal (DC) para os três diferentes doadores (A, B e C) e produção semanal média de SCFAs ramificados (mM) durante as semanas controle (C1 e C2) e semanas de tratamento (TR1-TR3) (vide também as FIGs. 7a a 7b).
PC DC Períodos
A B C A B C C1 1,9 1,7 1,7 2,3 2,3 2,3 C2 1,8 1,8 1,7 2,3 2,3 2,3 TR1 1,7 1,6 1,7 2,2 2,4 2,4 TR2 2,1 1,8 1,7 2,4 2,4 2,5 TR3 2,0 2,1 2,1 2,5 2,7 2,7 CON(ave) 1,9 1,8 1,7 2,3 2,3 2,3 TRT(ave) 1,9 1,8 1,8 2,4 2,5 2,5 G. Análise da composição da comunidade microbiana
[0216] O sequenciamento Illumina dirigido ao 16S é uma técnica molecular que se baseia na amplificação do gene 16S rRNA. Como o método do sequenciamento Illumina baseia-se na PCR, as sequências microbianas são amplificadas até chegar ao nível de saturação. Logo, embora obtenham-se informações sobre um vasto espectro de OTUs (não predefinidas) (> 100 diferentes da maioria das OTUs dominantes), os resultados são dados por valores proporcionais vs. a quantidade total de sequências em cada amostra, provendo assim resultados semiquantitativos. A metodologia aplicada neste documento envolve iniciadores que estendem-se por duas regiões hipervariáveis (V3-V4) do 16S rDNA. Usando uma abordagem de sequenciamento pareado, o sequenciamento de 2x250bp resulta em 424 bp amplicons. Esses fragmentos são taxonomicamente mais proveitosos se comparados a fragmentos menores, que são taxonomicamente menos informativos. Além de processar os dados no nível do filo e da família, é possível identificar OTUs específicas que mudaram, ao passo que também é possível calcular o índice de diversidade de Simpson como uma medida tanto da diversidade quanto da uniformidade. O menor valor possível do índice é 1, representando uma comunidade composta por uma só OTU. O valor mais alto possível é o número total de OTUs. O índice aproximar-se-á mais do valor maximal quando a distribuição das OTUs for mais uniforme, ao passo que uma comunidade que for dominada por um pequeno número de OTUs resultará em valores mais próximos de 1. Quanto mais alto o índice, maior a diversidade e maior a uniformidade.
1. Índice de diversidade
[0217] O índice de Diversidade de Simpson recíproco foi calculado como uma medida de diversidade, tanto em termos tanto de riqueza quanto em termos de uniformidade da espécie. Com base nos índices de diversidade, decorreu que, durante o período controle, cada uma das três unidades do SHIME foi colonizada por comunidades microbianas luminais e mucosas reproduzíveis, tanto no PC quanto no DC. A diversidade foi mais alta no DC, ao passo que também foi significativamente mais alta para a microbiota luminal vs. a microbiota mucosa, tanto no PC quanto no DC (Tabela 14). Tabela 14. Média do Índice de Diversidade de Simpson recíproco no lúmen (L) e no muco (M) do cólon proximal (PC) e distal (DC) de três unidades do SHIME durante o período controle (n = 6). Ademais, também diferenças significativas (p < 0,05) para o Índice de Diversidade de Simpson recíproco entre o L e a M ou entre o PC e o DC, como evidenciado por meio de seu valor p conforme calculado por um teste t de Student.
L M PC vs. DC L vs. M
PC DC PC DC L M PC DC Índice de 4,8 11,3 3,5 7,7 0,000 0,002 0,012 0,037 diversidade
[0218] Além disso, no que diz respeito aos efeitos do tratamento, a Goma Gelana aumentou a diversidade da microbiota intestinal em comparação ao controle para todos os três doadores testados (FIG. 8). Só a diversidade da microbiota luminal no PC diminuiu levemente mediante tratamento com Goma Gelana.
2. Nível do Filo
[0219] Além disso, a composição da microbiota no nível do filo indicou que as três diferentes unidades do SHIME foram colonizadas por comunidades microbianas luminais e mucosas reproduzíveis, tanto no cólon proximal quanto no cólon distal. Como resultado, os valores médios para cada um dos quatro ambientes foram calculados, ao passo que realizaram-se testes estatísticos para entender a preferência de filos específicos por qualquer um dos quatro ambientes (Tabela 15). Tabela 15. A abundância média (%) no nível do filo microbiano no lúmen (L) e no muco (M) do cólon proximal (PC) e distal (DC) de três unidades do SHIME durante o período controle (n = 6). Ademais, diferenças significativas (p < 0,05) para certo filo entre o L e a M ou entre o PC e o DC também são destacadas (em negrito e sublinhadas) por meio de seu valor p conforme calculado por um teste t de Student.
Abundância (%) valor p Filo L M PC vs. DC L vs. M
PC DC PC DC L M PC DC Actinobacteria 34% 2% 44% 5% 0,000 0,000 0,124 0,096 Bacteroidetes 17% 47% 12% 17% 0,001 0,234 0,508 0,000 Firmicutes 44% 38% 43% 40% 0,107 0,579 0,913 0,586 Lentisphaerae 0% 0% 0% 0% 0,060 0,080 >0,05 0,063 Proteobacteria 6% 3% 1% 5% 0,123 0,034 0,044 0,108 Synergistetes 0% 10% 0% 32% 0,000 0,000 0,537 0,000 Verrucomicrobia 0% 0% 0% 0% 0,091 0,287 0,866 0,929
[0220] Isso revelou uma colonização específica ao filo do lúmen vs. a camada mucosa com: (i) níveis mais altos de Bacteroidetes no lúmen (significativos somente no DC); (ii) níveis mais altos de Proteobacteria no lúmen (significativos somente no PC); e (iii) níveis mais altos de Synergistetes no muco (presentes somente no DC). Além disso, observaram-se as diferenças longitudinais a seguir ao longo do cólon: (i) níveis de Actinobacteria aumentados no PC; (ii) níveis de Bacteroidetes aumentados no DC (significativos somente no lúmen); (iii) presença de Synergistetes no DC; e (iv) níveis mais baixos de Proteobacteria no PC na camada mucosa, ao passo que observou-se tendência oposta no lúmen.
[0221] No que diz respeito ao tratamento, acontece que, no principal sítio de fermentação, isto é, no lúmen do cólon proximal (FIG. 9), a Goma Gelana aumentou fortemente os níveis de Actinobacteria às custas de Bacteroidetes e Firmicutes para todos os três doadores testados. Notaram-se observações semelhantes para as amostras luminais do cólon distal (FIG. 9). Em aditamento, no cólon distal, os níveis luminais de Synergistetes e Lentisphaerae aumentaram mediante tratamento com Goma Gelana. No compartimento mucoso (FIG. 9), a variabilidade nas amostras tendeu a aumentar ao longo do tempo. Isso pode ser atribuído à composição mais heterogênea do biofilme que é formado sobre a camada mucosa vs. a suspensão luminal homogênea. Similarmente ao que aconteceu no lúmen, as Actinobacteria mucosas foram enriquecidas tanto no cólon proximal quanto no cólon distal mediante tratamento com Goma Gelana (salvo para o Doador C no PC, que exibiu um estímulo muito forte de Synergistetes), porém isso não foi acompanhado por uma redução de Bacteroidetes e Firmicutes, como aconteceu no lúmen. Na verdade, no compartimento mucoso, observaram-se diferenças entre os indivíduos quanto aos níveis de Firmicutes mediante tratamento com Goma Gelana, isto é, o Doador A exibiu uma redução nos níveis de Firmicutes, ao passo que observou-se aumento para os Doadores B e C. Por fim, o tratamento com Goma Gelana tendeu a aumentar a abundância de Proteobacteria nas amostras mucosas do cólon proximal.
3. Nível da família e OTU
[0222] No nível da família, os efeitos do tratamento com Goma Gelana serão discutidos principalmente quanto ao principal sítio de fermentação, isto é, o lúmen do cólon proximal (FIG. 10). Para os demais ambientes do cólon (cólon distal luminal (FIG. 11), cólon proximal mucoso (FIG. 12) e cólon distal mucoso (FIG. 13)), observou-se muita semelhança e, portanto, só discutir-se-ão mudanças específicas e nítidas do principal sítio de fermentação.
[0223] A Goma Gelana aumentou fortemente os níveis de Bifidobacteriaceae para todos os três doadores testados. As informações dadas nas Figs. 10 a 11 demonstram que os níveis de Bifidobacteriaceae no lúmen dos reatores do cólon proximal para os dois períodos controle tiveram média de 24,7 ± 5,5%, ao passo que os níveis de Bifidobacteriaceae no lúmen dos reatores do cólon proximal para os três períodos de tratamento tiveram média de 39,0 ± 8,8%. Além disso, as informações dadas nas Figs. 10 a 11 demonstram que os níveis de Bifidobacteriaceae no lúmen dos reatores do cólon distal para os dois períodos controle tiveram média de 1,85 ± 1,0%, ao passo que os níveis de Bifidobacteriaceae no lúmen dos reatores do cólon distal para os três períodos de tratamento tiveram média de 8,3 ± 2,3%. No nível da
OTU, as principais mudanças foram atribuídas a um aumento na OTU 2 Bifidobacteriaceae (referente à Bifidobacterium adolescentis). Esse forte efeito bifidogênico corresponde habilmente aos níveis significativamente aumentados de acetato observados para todos os três doadores mediante tratamento com Goma Gelana.
[0224] O tratamento com Goma Gelana reduziu fortemente os níveis de Bacteroidaceae para todos os três doadores testados. A família das Bacteroidaceae contém muitos produtores de propionato conhecidos, que explicam a forte redução nos níveis de propionato que observou-se mediante suplementação com Goma Gelana. Em aditamento, observou-se redução na abundância de Veillonellaceae mediante tratamento com Goma Gelana, que foi atribuída principalmente a uma redução na OTU 1 Veillonellaceae (referente à Megamonas sp.). Como essa OTU é um potente produtor de propionato (ao passo que consome lactato), sua redução provavelmente contribuiu para as concentrações reduzidas de propionato observadas durante o período de tratamento.
[0225] A Goma Gelana também aumentou levemente os níveis de Lachnospiraceae no decorrer do período de tratamento de três semanas para todos os três doadores testados, o que pode ser correlacionado às concentrações aumentadas de butirato observadas durante o mesmo período. Em contrapartida, no cólon distal luminal, os níveis de Lachnospiraceae diminuíram, ao passo que outras famílias produtoras de butirato aumentaram mediante tratamento com Goma Gelana, a saber, as Acidaminococcaceae, as Eubacteriaceae e as Ruminococcaceae. No entanto, durante a semana final do tratamento, os níveis de Ruminococcaceae novamente diminuíram no cólon distal, ao passo que observou-se o estímulo de Veillonellaceae durante a mesma semana. Isto explica a produção aumentada de propionato observada no cólon distal durante a semana final do tratamento e é atribuído principalmente ao estímulo OTU 1 da Veillonellaceae (referente à Megamonas sp.).
[0226] Outra família produtora de butirato que foi enriquecida exclusivamente no ambiente mucoso mediante tratamento com Goma Gelana foi a família das Clostridiaceae, com um aumento nítido da OTU 23 Clostridiaceae (referente à Clostridium butyricum) no cólon proximal vs. a OTU 17 Clostridiaceae (referente à Clostridium tertium) no cólon distal.
[0227] Outra descoberta consistente mediante tratamento com Goma Gelana foi o aumento de várias famílias do filo das Proteobacteria, tal como um aumento de Enterobacteriaceae e Xanthomonadaceae. Essas famílias são conhecidas principalmente por conter várias espécies patogênicas oportunistas, todavia também muitos comensais fazem-se presentes dentro dessas famílias, que são conhecidas por fermentar proteínas nas diferentes regiões do cólon, mas principalmente no cólon distal. Deveras, fizeram-se observações semelhantes para a região do cólon distal, onde diversas famílias do filo das Proteobacteria aumentaram levemente mediante tratamento com Goma Gelana. Essas descobertas podem ser correlacionadas aos leves aumentos nos níveis de SCFAs ramificados que observaram-se rumo ao fim do período de tratamento.
[0228] Por fim, observaram-se algumas mudanças específicas ao doador mediante tratamento com Goma Gelana no cólon proximal luminal: (i) níveis aumentados de Microbacteriaceae para os Doadores B e C; (ii) níveis aumentados de Micrococcaceae para os Doadores A e C; (iii) níveis aumentados de Enterococcaceae, observados em especial para o Doador C (fizeram-se observações semelhantes no cólon distal, o que poderia explicar a concentração aumentada de lactato durante a semana final do tratamento que observou-se nesse doador); e (iv) níveis aumentados de Synergistaceae para o Doador C. Como as Synergistaceae são principalmente colonizadores das regiões do cólon distal,
observaram-se efeitos mais fortes nas amostras do cólon distal luminal, onde observou-se forte enriquecimento das Syngeristaceae para todos os três doadores testados. H. Sumário dos Resultados do Exemplo III
[0229] O consumo de ácido/base e a produção de gás, SCFAs, lactato e amônio foram todos bastante estáveis dentro das três diferentes unidades do SHIME durante o período controle. Isso indicou que o modelo SHIME foi operado em suas condições mais ideias, resultando em uma microbiota do cólon estável. Essa estabilidade é um pré-requisito para afirmar que qualquer efeito observado durante o tratamento realmente decorreu do produto teste administrado a uma concentração correspondente a uma dose in vivo de 2 g/d.
[0230] Ao iniciar o tratamento com Goma Gelana, o consumo de base aumentou no cólon proximal (indicando fermentação microbiana via produção de SCFAs/lactato) durante a semana final do tratamento para todos os doadores testados. Além disso, observaram-se aumentos brandos imediatos no consumo de base no cólon distal. Em termos da produção de gás, observaram-se efeitos dependentes do doador, com a produção de gás aumentando levemente para o Doador B, ao passo que diminuiu para os demais doadores mediante adição do produto.
[0231] Embora o consumo de base e a produção de gás só forneçam uma indicação grosseira de fermentação microbiana, as medições de SCFAs oferecem vislumbres mais detalhados acerca dos processos de fermentação sacarolítica. Isso demonstrou que a Goma Gelana foi fermentada principalmente no cólon proximal, onde reduziu imediatamente os níveis de propionato, ao passo que os níveis de acetato e butirato aumentaram gradativamente. A microbiota do Doador A resultou nos aumentos mais pronunciados tanto nos níveis de acetato quanto nos níveis de butirato mediante tratamento com Goma Gelana. Também no cólon distal, os níveis de acetato e butirato aumentaram gradativamente durante o curso do tratamento, ao passo que os níveis de propionato diminuíram gradativamente, seguidos por aumento durante a semana final do tratamento. Observou-se o maior aumento na produção de acetato para o Doador B, ao passo que o Doador A resultou no maior aumento nos níveis de butirato. Além disso, as concentrações de lactato permaneceram em geral bastante estáveis. No cólon proximal, o lactato só aumentou significativamente durante a semana final do tratamento para o Doador A. No cólon distal, observaram-se concentrações de lactato significativamente aumentadas durante a semana final do tratamento para o Doador C.
[0232] No que diz respeito a marcadores da fermentação proteolítica, acontece que os níveis de amônio não foram afetados para todos os doadores testados nem no cólon proximal nem no cólon distal, salvo um leve aumento no cólon proximal durante a semana final do tratamento para o Doador C. Esses resultados foram confirmados pelos níveis de SCFAs ramificados, onde só observaram-se leves aumentos perto do fim do tratamento em ambos o cólon proximal e o cólon distal para todos os doadores testados.
[0233] As análises por sequenciamento dirigido ao 16S revelaram que o modelo SHIME manteve uma microbiota luminal e mucosa diversa em ambos os compartimentos do cólon proximal e distal para os três doadores testados. Interessantemente, a microbiota mucosa foi, em consonância com as descobertas para adultos humanos, fortemente enriquecida com famílias contendo espécies produtoras de butirato bem conhecidas. Além dessa colonização da camada mucosa específica à espécie, estabeleceram-se também diferenças longitudinais na colonização microbiana (cólon proximal vs. distal).
[0234] No que diz respeito aos efeitos do tratamento sobre a composição da comunidade microbiana, descobriu-se que a Goma Gelana aumentou a diversidade da microbiota intestinal dos doadores testados em relação ao período controle. Além disso, acontece que, no principal sítio de fermentação (lúmen do cólon proximal), a Goma Gelana aumentou fortemente os níveis de Actinobacteria às custas de Bacteroidetes e Firmicutes. O aumento de Actinobacteria foi correlacionado principalmente a um surto de Bifidobacteriaceae, que correspondeu habilmente aos níveis aumentados de acetato para todos os três doadores testados. Interessantemente, o efeito bifidogênico mediante suplementação com Goma Gelana foi atribuído meramente a aumentos em uma OTU referente à Bifidobacterium adolescentis. As reduções nos níveis de Bacteroidetes e Firmicutes foram atribuídas principalmente aos níveis reduzidos de Bacteroidaceae e Veillonellaceae para todos os três doadores testados. Ambas as famílias contêm vários potentes produtores de propionato, o que correlaciona-se às concretizações reduzidas de propionato observadas durante o período de tratamento. Por fim, a produção crescente de butirato no decorrer do período de tratamento de 3 semanas com Goma Gelano foi atribuída potencialmente ao aumento de espécies produtoras de butirato pertencentes a várias famílias de Firmicutes, como as Lachnospiraceae no cólon proximal luminal, as Acidaminococcaceae, Eubacteriaceae e Ruminococcaceae no cólon distal luminal e as Clostridiaceae no ambiente mucoso. IV. Exemplo IV. Efeito da Goma Gelana sobre as Funções da Parede Intestinal. A. Introdução
[0235] Os micro-organismos no intestino representam uma comunidade biologicamente ativa que jaz na interface do hospedeiro com seu ambiente nutricional. Como consequência, eles influenciam profundamente vários aspectos da fisiologia e metabolismo do hospedeiro. Uma ampla variedade de componentes estruturais microbianos e metabólitos interagem diretamente com as células intestinais do hospedeiro para influir na absorção de nutrientes e na saúde epitelial. Tanto os padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs) quanto os metabólitos derivados de bactérias (por exemplo, ácidos graxos de cadeia curta (SCFA)) ativam várias vias de sinalização, tais como maturação dos linfócitos, saúde epitelial, sinalização neuroendócrina, sinalização mediada por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) e sinalização mediada por receptores acoplados a proteína G (GPRs). Por sua vez, essas vias de sinalização ditarão o tom inflamatório, equilíbrio energético, motilidade intestinal e regulação do apetite (examinado em Ha (2014)). A desregulação das interações hospedeiro-microbioma hoje em dia é reconhecida por contribuir com inúmeras doenças (Groschwitz (2009)), inclusive síndrome metabólica e obesidade, doenças intestinais inflamatórias (IBD), como doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC), síndrome do intestino irritável (IBS), doença celíaca, diabetes, alergias, asma e doenças autoimunes.
É comum a esses transtornos a desregulação da barreira epitelial intestinal (mais permeável), dando início à patologia (Fasano (2011)). Quando a função da barreira intestinal é perturbada, o tráfego de moléculas perde o controle, de modo que os conteúdos luminais podem entrar na lâmina própria e ativar o sistema imunológico, provocando assim respostas imunológicas descontroladas (um processo conhecido como 'leaky gut', ou 'intestino permeável'). A barreira epitelial intestinal é composta por junções intercelulares de oclusão, uma rede proteína-proteína complexa que liga mecanicamente células adjacentes e fecha o espaço intercelular.
Logo, a barreira epitelial intestinal controla o equilíbrio entre a tolerância imunológica e a ativação imunológica e, portanto, exerce papel proeminente na patogênese do 'intestino permeável'. Um funcionamento ou regulação impróprios dessas junções de oclusão parecem ser os responsáveis por maiores espaços intercelulares, permitindo assim a passagem de elementos luminais através da barreira, com uma inflamação local e sistêmica em consequência.
B. Co-cultura Caco-2/THP1 no modelo in vitro
[0236] Para reproduzir a interface entre o hospedeiro e o microbioma intestinal, nos últimos anos desenvolveram-se vários modelos in vitro que incluem o uso de células intestinais similares a células epiteliais e células imunológicas de origem humana. O modelo usado neste documento foi um modelo co-cultura de células intestinais do tipo epitelial (células Caco-2) e monócitos/macrófagos humanos (células THP1) (vide a FIG. 14; vide também Possemiers (2013) e Satsu (2006)). A Caco-2, quando semeada em suportes adequados, diferencia-se espontaneamente em células similares a enterócitos maduras, que são caracterizadas por polarização, presença de villi, formação de domos, presença de junções de oclusão e transporte vetorial e expressão de enzimas de borda em escova apicais (examinado por Sambuy (2005)). Os monócitos THP1, isolados de um paciente humano com leucemia aguda, diferenciam-se em células similares a macrófagos mediante tratamento com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). As células THP1 ativadas com PMA adquirem qualidades morfológicas características dos macrófagos, são capazes de aderir-se ao suporte, desenvolvem os lamelipódios necessários à migração e fagocitose e tornam-se iniciadas por resposta dos receptores toll-like (TLRs) (Dumrese (2009)). As proteínas de junção de oclusão mantêm as células epiteliais adjacentes juntas, formando assim uma barreira praticamente impermeável a macromoléculas. A 'oclusão' dessas junções pode ser medida pela resistência elétrica transepitelial (TEER), onde uma TEER alta corresponde a uma barreira mais oclusa. Quando da perda de função de barreira, o transporte paracelular (entre células) dos fluidos aumenta, o que pode ser medido por uma redução na TEER. Quando células Caco-2 são colocadas sobre células THP1 ativadas com PMA, que secretam citocinas no sobrenadante, sua monocamada rompe-se. Isso se dá possivelmente pela ruptura mediada por citocinas de junções de oclusão e pode ser medido por uma redução na TEER.
[0237] Dentro do intestino, a ruptura química, mecânica ou provocada por patógenos da barreira provoca o influxo de bactérias do lúmen à lâmina própria (FIG. 15). Isso ativará o sistema imunológico, que passará de uma inflamação 'tolerogênica' fisiológica para uma inflamação patológica deletéria. Uma cascada de sinalização será iniciada com a produção de moléculas-alarme, tais como citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, fator da necrose tumoral (TNF)-α e interleucina (IL)- 1β). O TNF-α, junto com o interferon (IFN)-γ, é produzido por leucócitos e células TH (auxiliares) do tipo 1 CD4+, defensores celulares importantes contra micro- organismos invasores. Essas citocinas pró-inflamatórias induzirão à produção de quimiocinas (por exemplo, IL-8 e ligante de quimiocinas (motivo C-X-C) (CXCL)-10) e moléculas de adesão), necessárias ao recrutamento de neutrófilos e à produção de espécies reativas do oxigênio (ROS). A produção de ROS é necessária para exterminar as bactérias invasoras e fechar as brechas na parede epitelial. No entanto, elas também podem causar ruptura e inflamação ao tecido, levando à necessidade de resolver a inflamação pela produção de citocinas anti-inflamatórias, como IL-6 e IL-10.
[0238] A IL-6 possui tanto propriedade pró-inflamatória quanto propriedade anti-inflamatória (Scheller (2011)). A IL-6 provoca o recrutamento de monócitos/macrófagos através da ativação da proteína quimioatraente de monócitos (MCP)-1, que promove a depuração dos neutrófilos. A IL-6 também é capaz de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1. Além disso, a IL-6 exerce efeito positivo sobre a regeneração do epitélio intestinal e a cura de feridas (Dann (2008)). Por outro lado, a IL-6, junto com o fator de crescimento transformador (TGF)-β, induz à diferenciação de um subconjunto importante de células T CD4+ – células TH17 – que exercem papel chave na defesa do hospedeiro contra micróbios extracelulares em tecidos mucosos.
[0239] A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória, capaz de suprimir vários tipos de células imunológicas adaptativas e inatas. Além disso, a IL-10 induz à ativação de moléculas anti-inflamatórias e aprimora a função das células T reguladoras (Treg), que restaurarão a homeostasia imunológica (Lyer (2012)). Quando esses mecanismos de troca estão debilitados e a homeostasia imunológica não pode ser restaurada, pode ocorrer uma patologia intestinal, que pode resultar em inflamação crônica (como observado, por exemplo, na IBD, que é caracterizada por uma super- ativação de respostas mediadas por TH1, a saber pela superprodução do TNF-α).
[0240] Em termos de inflamação, o TNF-α é uma das citocinas mais potentes e perigosas produzidas pelo sistema imunológico uma vez que exerce efeitos pleiotrópicos e é capaz de amplificar a sinalização inflamatória (FIG. 16). Quando não neutralizado, o TNF-α pode provocar inflamação crônica e até mesmo óbito em casos de inflamação aguda. Por esse motivo, a terapia anti-TNF-α é difundidamente usada em condições inflamatórias crônicas, incluindo IBD e artrite reumatoide.
[0241] O modelo de co-cultura Caco-2/THP-1 exibe algumas características também observadas em pacientes com IBD, e, portanto, sugere-se que ele é um modelo 'similar a IBD' que pode ser usado para testar o efeito de substâncias que podem tanto proteger a integridade da barreira epitelial intestinal quanto reduzir a inflamação (Satsu (2006)). Como dito, nesse modelo, a proteção da função da barreira intestinal é medida por um aumento na TEER, ao passo que o potencial anti-inflamatório é determinado por análise do perfil das citocinas (aumento das citocinas anti-inflamatórias e redução das citocinas pró-inflamatórias).
[0242] As suspensões do cólon coletadas do SHIME são colocadas em contato com o lado apical das co-culturas (células Caco-2). Os efeitos observados na câmara basolateral (onde residem as células THP1) são então mediados indiretamente por sinais produzidos pelas células Caco-2 e/ou pelo transporte de micromoléculas e macromoléculas. O aspecto excepcional dessa abordagem é que ela permite avaliar o efeito induzido pelo produto e pelos metabólitos derivados da fermentação produzidos pela microbiota intestinal durante as etapas digestivas (logo, não só pelo produto em si) (Daguet (2016)). C. Meta do estudo
[0243] A meta dessa parte do estudo foi de investigar os potenciais efeitos positivos do produto Goma Gelana e de seus metabólitos sobre as funções da parede intestinal em três doadores diferentes. As bactérias interagem intimamente com a parede intestinal, de modo que a modulação da atividade microbiana provavelmente afeta as funções da parede intestinal. Isso será estimado avaliando- se a permeabilidade epitelial intestinal e marcadores imunológicos específicos in vitro. D. Materiais e Métodos
[0244] Utilizaram-se amostras recolhidas do experimento SHIME descrito acima para avaliar in vitro o efeito dos produtos fermentados sobre a função epitelial intestinal e os marcadores imunológicos. Essas incluem amostras dos reatores do cólon proximal e distal de três doadores diferentes, recolhidas ao fim dos períodos controle e tratamento. E. Células Caco-2
[0245] O experimento com co-culturas foi realizado como descrito previamente (Daguet (2016)). Em suma, semearam-se células Caco-2 (HTB-37; American Type Culture Collection) em insertos semipermeáveis de 24 poços. As monocamadas de Caco-2 foram cultivadas por 14 a 21 dias, com três trocas de meio/semana, até obter uma monocamada celular funcional com uma resistência elétrica transepitelial (TEER). As células foram mantidas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo glicose e glutamina e suplementadas com HEPES e soro fetal bovino (FBS) inativado por calor (HI) a 20% (v/v).
F. Células THP1-BlueTM
[0246] Células THP1-Blue™ (InvivoGen) foram mantidas em meio 1640 do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contendo glicose e glutamina, suplementado com HEPES, piruvato de sódio e HI-FBS a 10% (v/v). As THP1-Blue™ são monócitos humanos THP1 estavelmente transfectados com um construto repórter expressando um gene da alcalino fosfatase secretada (SEAP) sob controle de um promotor induzível pelo fator de transcrição fator nuclear kappa B (NF-κB). Quando da ativação dos TLRs (por exemplo, por lipopolissacarídeos (LPS); isolados de bactérias Gram-negativas), o NF-κB torna-se ativado e induz à expressão e secreção da SEAP. A atividade da SEAP pode ser então medida nos sobrenadantes usando o reagente QUANTI-Blue (InvivoGen). As células THP1-Blue™ foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com PMA, que induz à diferenciação das células em células similares a macrófagos, que são capazes de aderir-se e são iniciadas por sinalização do TLR. G. Co-cultura Caco-2/THP1-blueTM
[0247] Antes de estabelecer a co-cultura, mediu-se a TEER das monocamadas de Caco-2 (= ponto no tempo 0 h). A TEER de um inserto vazio foi subtraída de todas as leituras para levar em conta a resistência elétrica residual do inserto. Em seguida, os insertos com Caco-2 foram posicionados sobre células THP1-Blue™ diferenciadas com PMA para novos experimentos, como descrito previamente (Possemiers (2013) e Lyer (2012)).
[0248] Em suma, o compartimento apical (contendo as células Caco-2) foi preenchido com suspensões SHIME do cólon filtradas estéreis (0,22 µm) ou com diferentes concentrações de bactérias vivas. Células também foram tratadas apicalmente com butirato de sódio (NaB) (Sigma-Aldrich) como controle positivo. O compartimento basolateral (contendo as células THP1-Blue™) foi preenchido com meio completo de Caco-2. As células também foram expostas a meio completo de
Caco-2 em ambas as câmaras como controle. As células foram tratadas por 24 h, após o quê mediu-se a TEER (= ponto no tempo 24 h). Depois de subtrair a TEER do inserto vazio, todos os valores 24 h foram normalizados a seu próprio valor 0 h (para levar em conta as diferenças na TEER inicial dos diferentes insertos) e são dados pela porcentagem do valor inicial. Em seguida, o sobrenadante basolateral foi descartado, e as células foram estimuladas no lado basolateral com o meio completo de Caco-2 contendo LPS ultrapuros (Escherichia coli K12, InvivoGen). Células também foram estimuladas no lado basolateral com LPS em combinação a hidrocortisona (HC) (Sigma-Aldrich) e meio sem LPS (LPS-) como controles. Depois do estímulo com LPS, os sobrenadantes basolaterais foram coletados para a medição das citocinas (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, CXCL10 e MCP-1 humanos por multipléx Luminex® (Affymetrix-eBioscience)) e para atividade da NF-κB, de acordo com as instruções do fabricante. As células foram incubadas a 37° C em uma atmosfera umedecida de ar/CO2 (95:5, v/v).
H. Estatísticas
[0249] Os controles experimentais são dados primeiramente em gráficos distintos; esses referem-se aos meios completos controle (CM ou LPS-), às células tratadas com lipopolissacarídeos (LPS+) e aos controles butirato de sódio (NaB) e hidrocortisona (HC). No que tange à TEER, as condições CM e NaB são comparadas e a significância estatística calculada usando o teste t de Student bicaudal não pareado. Para os marcadores imunológicos (citocinas/quimiocinas e atividade da NF-κB), todas as condições (LPS-, LPS+HC e LPS+NaB) são comparadas a LPS+. A significância estatística foi calculada usando a ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Dunnett contra LPS+. (*), (**), (***) e (****) representam p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001 e p < 0,0001, respectivamente.
[0250] Os resultados referentes às amostras SHIME são dados em separado. As amostras controle (C) e tratamento (T), dadas para reatores do cólon (cólon proximal (PC) e distal (DC)), foram coletadas como triplicatas biológicas no experimento SHIME. Os resultados para os três doadores diferentes são dados em separado e também pela média dos três. Para avaliar as diferenças na TEER, a ativação do NF-κB e a produção de citocinas entre cada amostra de tratamento e o controle, realizou-se uma ANOVA unidirecional ordinária com o teste de múltiplas comparações de Tukey (a significância é ilustrada por um asterisco (*)). (*), (**), (***) e (****) representam p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001 e p < 0,0001, respectivamente. Todas as estatísticas foram obtidas usando o software GraphPad Prism™ versão
7.02 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). I. Resultados do Controle
1. Resistência elétrica transepitelial (TEER)
[0251] Após 24 h de incubação da co-cultura, o meio completo (CM) controle exibiu uma redução de quase 40% na TEER devida ao dano induzido por células THP1 ativadas com PMA sobre células Caco-2 (FIG. 17). Como esperado, o butirato de sódio (NaB; controle positivo) foi capaz de proteger as células Caco-2 contra esse dano e manter a TEER da monocamada (Peng (2007)). Observe-se que só adicionam-se os LPS depois de medir a TEER a 24 h. No entanto, os experimentos preliminares demonstraram que a dose de LPS usada não afeta significativamente a integridade de barreira das células Caco-2.
2. Marcadores imunológicos
[0252] Os resultados obtidos para os diferentes marcadores imunológicos podem ser observados na FIG. 18, FIG. 19 e FIG. 20. Como esperado, os LPS foram capazes de aumentar a ativação do NF-κB (FIG. 18), bem como a secreção de todas as citocinas testadas (IL-6 e IL-10 (FIG. 19) e IL-1β, IL-8, CXCL10, TNF-α e MCP-1 (FIG. 20)). Além disso, a hidrocortisona (HC), sendo um corticosteroide, atua como um imunossupressor amplo ao refrear as citocinas e quimiocinas induzidas por LPS (FIG. 19 e FIG. 20) e ao inibir a atividade transcricional do NF-κB induzida por LPS (FIG. 18). Em contrapartida, o butirato de sódio (NaB) exibe efeito dependente do marcador. O NaB aumentou a atividade transcricional do NF-κB (FIG. 18), um efeito que é possivelmente mediado pela atenuação de atividades inibidoras da histona desacetilase (HDAC) sobre proteínas não histona, como o NF-κB (Glozak (2005) e Vinolo (2011)). Além disso, o NaB exibiu claras atividades inibidoras pós- transcricionais seletivas sobre alguns mediadores imunológicos. Mais especificamente, o NaB aumentou seletivamente a secreção de IL-6 e IL-10 induzida por LPS (envolvida na homeosteasia imunológica) (FIG. 19), ao passo que inibiu seletivamente o TNF-α induzido por LPS (citocinas pró-inflamatórias) e a IL-8, CXCL10 e MCP-1 (quimiocinas envolvidas no recrutamento de células imunológicas) (FIG. 20).
[0253] Em conclusão, todos os controles comportaram-se como esperado nesse experimento e os resultados obtidos para as amostras SHIME são dados abaixo. Observe-se que, nesse experimento, a HC e o NaB inesperadamente não reduziram a expressão de IL-1β induzida por LPS. J. Resultados de amostras SHIME
1. Resistência elétrica transepitelial (TEER)
[0254] Amostras SHIME coletadas durante as últimas semanas do controle e tratamento de todos os reatores do cólon foram diluídas (1:5, v/v) em meio completo de Caco-2 após filtragem (0,22 µm) e foram dadas apicalmente às co-culturas por 24 h.
[0255] Em comparação ao meio completo (CM) controle, onde a TEER reduziu aproximadamente 40% (FIG. 17), todas as amostras controle e tratamento coletadas do SHIME foram capazes de manter a TEER aproximadamente no valor inicial (FIG. 21). Observou-se um aumento brando, embora não significativo, na
TEER para o tratamento com Goma Gelana nas amostras do cólon distal de todos os três doadores em comparação ao controle. Dado que esse aumento foi consistentemente observado para todos os três doadores, conclui-se que a fermentação da Goma Gelana tem potencial para aprimorar a função da barreira epitelial intestinal no modelo in vitro usado.
2. Marcadores imunológicos
[0256] Depois de 24 h de pré-tratamento apical das co-culturas Caco-2/THP- 1-Blue™ com amostras SHIME, o sobrenadante basolateral foi descartado e as células foram estimuladas com LPS. Depois de 6 h de estímulo, o sobrenadante basolateral foi coletado para medir as citocinas e quimiocinas secretadas no meio e determinar a atividade do NF-κB.
[0257] Em comparação ao controle LPS+ (linha tracejada vermelha), todas as amostras SHIME aumentaram a atividade transcricional do NF-κB induzida por LPS (FIG. 22). No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras controle e as amostras de tratamento. Logo, o aumento na atividade do NF-κB, em vez disso, reflete o efeito da suspensão do SHIME sobre as células e não do composto teste.
[0258] À semelhança dos resultados obtidos para a atividade do NF-κB, todas as amostras SHIME aumentaram os níveis de IL-6 e IL-10 induzidas por LPS, em comparação ao controle LPS+ (FIG. 23). Embora não significativo, um leve aumento nos níveis de IL-6 e IL-10, em comparação ao controle, foi observado de maneira consistente para todos os doadores nas amostras do cólon distal. Isso só foi diferente de maneira estatisticamente significativa para os níveis de IL-6 no Doador A. Esse aumento nos níveis de IL-6 e IL-10 também foi observado quando a média dos três doadores foi analisada. Interessantemente, ao aplicar um teste t pareado a todas as amostras do cólon proximal e distal, observaram-se níveis de IL-10 significativamente aumentados (p < 0,05) nos três doadores testados.
[0259] Os resultados obtidos para IL-1β e TNF-α são dados na FIG. 24. Todas as amostras SHIME aumentaram a secreção de IL-1β em comparação ao controle LPS+ (linha tracejada vermelha), porém não houve diferença observada nos níveis de IL-1β entre o controle e tratamento, salvo para o Doador B, onde observou- se um aumento significativo nos níveis de IL-1β após tratamento para o reator do cólon proximal. Nenhuma diferença significativa na secreção de IL-1β foi observada entre o controle e tratamento ao analisar a média dos três doadores.
[0260] Em comparação a seus controles, os níveis de TNF-α induzido por LPS foram reduzidos nas amostras do cólon proximal e distal para o Doador A e Doador B, mas não para o Doador C. Ao observar a média dos três doadores, observou-se uma leve redução na secreção de TNF-α nas amostras do cólon proximal em comparação aos controles, mas não observou-se nenhuma diferença estatisticamente significativa.
[0261] Como se vê na FIG. 25, a secreção de IL-8 tendeu a diminuir quando da adição de Goma Gelana, em comparação ao controle, para as amostras do cólon distal para dois dos três doadores. No entanto, essa diferença não foi significativa.
[0262] Os níveis de CXCL10 induzido por LPS tenderam a aumentar levemente para as amostras do cólon distal para todos os doadores após tratamento com Goma Gelana. Nas amostras do cólon proximal, só um doador exibiu uma ínfima redução na expressão do CXCL10 mediante tratamento. Os níveis de MCP-1 tenderam a diminuir levemente após o tratamento para o cólon proximal. Em contrapartida, observou-se um claro aumento para os reatores do cólon distal de todos os doadores. No entanto, não obteve-se significância.
[0263] Para concluir, embora a Goma Gelana tenha exercido um efeito ínfimo sobre a função da barreira epitelial intestinal, ela tendeu a aumentar a expressão das citocinas anti-inflamatórias IL-6 e IL-10. Algumas condições tenderam a diminuir a produção de quimiocinas e citocinas pró-inflamatórias. No entanto, só algumas diferenças estatisticamente significativas puderam ser observadas entre o tratamento e o controle.
[0264] Para que se tenha uma visão geral das mudanças induzidas pelas amostras do tratamento em comparação aos controles, a média das amostras de tratamento SHIME dos três doadores foi normalizada para os reatores do cólon proximal e distal à média das amostras controle SHIME e representada na Tabela
16. Tabela 16. Resultados do experimento celular da média das amostras de tratamento SHIME dos três doadores normalizada à média das amostras controle SHIME.
MCP- Cólon TEER NF-κB IL-6 IL-10 IL-1β TNF-α IL-8 CXCL10 1 Proximal 1,00 1,01 0,90 1,06 1,28 0,88 1,06 0,97 0,85 Distal 1,04 0,99 1,16 1,09 0,93 0,98 0,93 1,12 1,31
[0265] Em termos gerais, é razoável dizer que as mudanças nos marcadores imunológicos nas amostras de tratamento em comparação aos controles foram um tanto brandas. Como se vê na Tabela 16, a Goma Gelana parece intensificar a secreção da IL-10 e reduzir a secreção do TNF-α em ambos os reatores do cólon. A secreção da IL-8 é levemente reduzida, ao passo que a secreção da IL-6 é aumentada somente para as amostras do cólon distal. A secreção da IL-1β parece ser aumentada para as amostras do cólon proximal, mas esses resultados são influenciados por um aumento significativo da IL-1β em um único doador. A secreção da MCP-1 é reduzida pelo tratamento com Goma Gelana para as amostras do cólon proximal mas é aumentada para as amostras do cólon distal. K. Sumário dos resultados do Exemplo IV
[0266] A meta dessa parte do estudo foi investigar os potenciais efeitos positivos da Goma Gelana e de seus metabólitos sobre as funções da parede intestinal em termos de modulação de uma condição de intestino permeável. Isso foi feito avaliando-se a permeabilidade epitelial intestinal e marcadores imunológicos específicos in vitro.
[0267] Quando da fermentação no cólon, a Goma Gelana tendeu a intensificar a integridade da barreira intestinal em termos da TEER. Embora os aumentos não tenham sido significativos, observaram-se aumentos consistentes para todos os três doadores ao expor amostras do cólon distal ao modelo in vitro. Além disso, o produto tendeu a exibir propriedades imunossupressoras, resultando em tendência a níveis mais baixos de vários mediadores imunológicos, incluindo a citocina pró-inflamatória TNF-α e a proteína quimioatraente IL-8, conhecida por exercer papel no recrutamento de neutrófilos. A MCP-1, que promove a depuração de neutrófilos, tendeu a aumentar para os reatores do cólon distal após tratamento com Goma Gelana. Por outro lado, a IL-10, uma citocina anti-inflamatória bona fide, tendeu a aumentar, bem como a IL-6, uma citocina envolvida no reparo de ferida. Todas as mudanças relatadas foram predominantemente observadas nos reatores do cólon distal, sugerindo assim um efeito mais pronunciado dos produtos da fermentação da Goma Gelana sobre células imunológicas do hospedeiro nas regiões distais do cólon. Lista de citações de publicações não patente
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[0324] Modalidades, exemplos e modificações alternativos que, ainda assim, seriam abrangidos pela revelação podem ser elaborados pelos versados na técnica, em particular à luz dos ensinamentos precedentes. Ademais, deve-se ter em mente que a terminologia usada para descrever a revelação visa a ter um caráter descritivo em vez de exaustivo.
[0325] A matéria dos Pedidos Provisórios dos EUA no 62/794.452 e 62/869.248 incorpora-se ao presente documento por referência na íntegra. Em aditamento, as referências descritas neste documento incorporam-se por referência na íntegra na medida necessária. Caso haja diferença de significado entre os termos incorporados e os termos revelados neste documento, o significado dos termos revelados prevalecerá.
[0326] Os versados na técnica também reconhecerão que várias adaptações e modificações às modalidades preferidas e alternativas descritas acima podem ser efetuadas sem divergir do âmbito nem da essência da revelação. Logo, deve-se ter em mente que, dentro do âmbito das reivindicações anexas, a revelação pode ser praticada de outras maneiras que não as especificamente descritas neste documento.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição ingerível CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade prebiótica eficaz de um esfingano.
2. Composição ingerível, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a quantidade do esfingano é selecionada de cerca de 1 g a cerca de 10 g, de cerca de 1 g a cerca de 9 g, de cerca de 1 g a cerca de 8 g, de cerca de 1 g a cerca de 7 g, de cerca de 1 g a cerca de 6 g, de cerca de 1 g a cerca de 5 g, de cerca de 1 g a cerca de 4 g, de cerca de 1 g a cerca de 3 g, ou em cerca de 2 g.
3. Composição ingerível, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o esfingano compreende um esfingano com teor de acila alto, intermediário ou baixo selecionado dentre um gelano com alto teor de acila, um gelano com teor intermediário de acila, um gelano com baixo teor de acila, um welano com alto teor de acila, um welano com teor intermediário de acila, um welano com baixo teor de acila, um ramsano com alto teor de acila, um ramsano com teor intermediário de acila, um ramsano com baixo teor de acila, um diutano com alto teor de acila, um diutano com teor intermediário de acila, um diutano com baixo teor de acila, S-88, S-198, S-7, ou uma combinação desses.
4. Composição ingerível, de acordo com qualquer a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o esfingano compreende um polissacarídeo de esfingano com alto teor de acila, um polissacarídeo de esfingano com teor intermediário de acila, um polissacarídeo de esfingano com baixo teor de acila, ou uma combinação desses.
5. Composição ingerível, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o esfingano compreende um oligossacarídeo de esfingano com alto teor de acila, um oligossacarídeo de esfingano com teor intermediário de acila, um oligossacarídeo de esfingano com baixo teor de acila, ou uma combinação desses.
6. Composição ingerível, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o esfingano compreende um oligossacarídeo de esfingano (SOS) com teor de acila alto, intermediário ou baixo obtido por um processo que compreende: preparar uma primeira composição compreendendo um esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo ou um polissacarídeo de esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo e um meio líquido; hidrolisar uma ligação glicosídica do esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo ou polissacarídeo de esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo para obter uma segunda composição; submeter a segunda composição a ultrafiltração, cromatografia por exclusão de tamanhos, precipitação, centrifugação ou uma combinação desses para obter uma terceira composição compreendendo o SOS com teor de acila alto/intermediário/baixo; e opcionalmente isolar ou recuperar a terceira composição.
7. Composição ingerível, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 5 e 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o esfingano compreende um oligossacarídeo de esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo selecionado dentre: (i) uma composição que compreende Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,GlcA,Rha,-H2O, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O, Glc2,GlcA,Rha,-H2O, Glc2,GlcA,Rha2,Glyc, Glc2,GlcA2,Rha, Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O, Glc2,Rha, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2,
Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac, Glc5,GlcA4,Rha2, Glc6,GlcA3,Rha3, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (ii) uma composição que compreende um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha) com acetato e/ou glicerato, um octâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha), um octâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha) com acetato e/ou glicerato, Glc,GlcA,Glc, Rha,Glc,GlcA, Glc,Rha; (iii) uma composição que compreende um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), um octâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha), um pentâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc), GlcA,Glc,Rha, Glc,GlcA,Glc, Glc,GlcA; (iv) uma composição que compreende Glc(Glc-Glc),GlcA, Glc(Glc-Glc), GlcA,Glc, Glc,Glc; (v) uma composição que compreende um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), GlcA,Glc,(Rha-Rha), Glc,(Rha-Rha),Rha, GlcA,Glc,Rha, Glc,GlcA,Glc, Rha,Glc, GlcA,Glc; (vi) uma composição que compreende Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc,
Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (vii) uma composição que compreende Glc,GlcA, Glc,GlcA,Rha, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA2,Rha, Glc4,GlcA3,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA4,Rha2, Glc6,GlcA3,Rha3, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (viii) uma composição que compreende Glc,GlcA,Rha,-H2O, Glc,Rha, Glc2,GlcA,Rha,-H2O, Glc2,Rha; (ix) uma composição que compreende Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O, Glc2,GlcA,Rha2,Glyc, Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; ou uma combinação desses.
8. Método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (A) promover o crescimento bacteriano benéfico no cólon de um mamífero, o referido método compreendendo ingerir, de acordo com um cronograma eficaz, uma quantidade eficaz ao crescimento bacteriano benéfico de um esfingano e um meio ingerível; (B) reduzir os níveis de propionato e/ou aumentar os níveis de butirato no cólon de um mamífero, o referido método compreendendo: ingerir, de acordo com um cronograma eficaz, uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um esfingano e um meio ingerível; (C) intensificar a integridade da barreira intestinal no cólon de um mamífero, o referido método compreendendo: ingerir, de acordo com um cronograma eficaz, uma composição compreendendo uma quantidade eficaz à integridade da barreira intestinal de um esfingano e um meio ingerível; ou (D) reduzir os níveis de TNF-α e/ou IL-8 no cólon de um mamífero, o referido método compreendendo: ingerir, de acordo com um cronograma eficaz, uma composição compreendendo uma quantidade eficaz à redução do TNF-α e/ou IL-8 de um esfingano e um meio ingerível.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um ser humano e a quantidade do esfingano é selecionada de cerca de 10 mg/kg a cerca de 150 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 140 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 130 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 120 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 110 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 90 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 80 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 70 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 60 mg/kg, 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, ou de cerca de 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg da pessoa que ingere a composição.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o esfingano compreende um esfingano com teor de acila alto, intermediário ou baixo selecionado dentre um gelano com alto teor de acila, um gelano com teor intermediário de acila, um gelano com baixo teor de acila, um welano com alto teor de acila, um welano com teor intermediário de acila, um welano com baixo teor de acila, um ramsano com alto teor de acila, um ramsano com teor intermediário de acila, um ramsano com baixo teor de acila, um diutano com alto teor de acila, um diutano com teor intermediário de acila, um diutano com baixo teor de acila, S-88, S-198, S-7, ou uma combinação desses.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o esfingano compreende um polissacarídeo de esfingano com alto teor de acila, um polissacarídeo de esfingano com teor intermediário de acila, um polissacarídeo de esfingano com baixo teor de acila, ou uma combinação desses.
12. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o esfingano compreende um oligossacarídeo de esfingano com alto teor de acila, um oligossacarídeo de esfingano com teor intermediário de acila, um oligossacarídeo de esfingano com baixo teor de acila, ou uma combinação desses.
13. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o esfingano compreende um oligossacarídeo de esfingano (SOS) com teor de acila alto, intermediário ou baixo obtido por um processo que compreende: preparar uma primeira composição compreendendo um esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo ou um polissacarídeo de esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo e um meio líquido; hidrolisar uma ligação glicosídica do esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo ou polissacarídeo de esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo para obter uma segunda composição;
submeter a segunda composição a ultrafiltração, cromatografia por exclusão de tamanhos, precipitação, centrifugação ou uma combinação desses para obter uma terceira composição compreendendo o SOS com teor de acila alto/intermediário/baixo; e opcionalmente isolar ou recuperar a terceira composição.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9, 12 ou 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o esfingano compreende um oligossacarídeo de esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo selecionado dentre: (i) uma composição que compreende Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,GlcA,Rha,-H2O, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O, Glc2,GlcA,Rha,-H2O, Glc2,GlcA,Rha2,Glyc, Glc2,GlcA2,Rha, Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O, Glc2,Rha, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac, Glc5,GlcA4,Rha2, Glc6,GlcA3,Rha3, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), Glcx,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (ii) uma composição que compreende um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha) com acetato e/ou glicerato, um octâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha), um octâmero
(Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha) com acetato e/ou glicerato, Glc,GlcA,Glc, Rha,Glc,GlcA, Glc,Rha; (iii) uma composição que compreende um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), um octâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc,GlcA,Glc,Rha), um pentâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha,Glc), GlcA,Glc,Rha, Glc,GlcA,Glc, Glc,GlcA; (iv) uma composição que compreende Glc(Glc-Glc),GlcA, Glc(Glc-Glc), GlcA,Glc, Glc,Glc; (v) uma composição que compreende um tetrâmero (Glc,GlcA,Glc,Rha), GlcA,Glc,(Rha-Rha), Glc,(Rha-Rha),Rha, GlcA,Glc,Rha, Glc,GlcA,Glc, Rha,Glc, GlcA,Glc; (vi) uma composição que compreende Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; (vii) uma composição que compreende Glc,GlcA, Glc,GlcA,Rha, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA2,Rha, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA2,Rha, Glc4,GlcA3,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA4,Rha2, Glc6,GlcA3,Rha3, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses;
(viii) uma composição que compreende Glc,GlcA,Rha,-H2O, Glc,Rha, Glc2,GlcA,Rha,-H2O, Glc2,Rha; (ix) uma composição que compreende Glc,GlcA, Glc,GlcA,Glyc, Glc,GlcA,Rha, Glc,GlcA,Rha,Glyc, Glc,Rha, Glc,Rha+28, Glc2,GlcA, Glc2,GlcA,Rha, Glc2,GlcA,Rha,+28, Glc2,GlcA,Rha,Ac, Glc2,GlcA,Rha,Glyc, Glc2,GlcA,Rha,Glyc,+28, Glc2,GlcA,Rha,Glyc.-H2O, Glc2,GlcA,Rha2,Glyc, Glc2,GlcA2,Rha2,Ac2,Glyc2,-H2O, Glc3,GlcA,Rha, Glc3,GlcA,Rha2, Glc3,GlcA,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha,Glyc, Glc3,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc3,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA,Rha2,+43, Glc4,GlcA,Rha2,Ac, Glyc, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc,-H2O, Glc4,GlcA2,Rha,Ac,Glyc2, Glc4,GlcA2,Rha2,Ac,Glyc, Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc, Glc4,GlcA3,Rha2, Glc4,GlcA2,Rha3,Ac, Glc4,GlcA3,Rha2/Glc4,GlcA2,Rha2,Glyc2, Glc5,GlcA2,Rha2, Glc5,GlcA2,Rha2,Ac, Glc(Ac/Glyc)x,GlcAx,Glcx,Rhax (onde x é de 4 a cerca de 25), ou uma combinação desses; ou uma combinação desses.
15. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o esfingano compreende um esfingano nativo e pelo fato de que as bactérias são Bifidobacteriaceae.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o esfingano compreende uma goma gelana.
17. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um ser humano e pelo fato de que o aumento nos níveis de Bifidobacteriaceae no lúmen do cólon proximal variam (a) de cerca de 20% a cerca de 180% durante o tratamento em comparação a um controle ou (b) de cerca de 330% a cerca de 590% durante o tratamento em comparação a um controle não tratado.
18. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um ser humano, pelo fato de que o esfingano compreende um oligossacarídeo de esfingano com alto/baixo teor de acila e pelo fato de que a bactéria é Blautia, Parabacteroides, Faecalibacterium, Clostridium XVIII ou uma combinação dessas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais dos efeitos a seguir acontecem: (a) os níveis de Blautia sobem em ao menos cerca de 5 vezes em comparação a um controle não tratado, (b) os níveis de Parabacteroides sobem em cerca de 2 vezes a cerca de 40 vezes em comparação a um controle não tratado, (c) os níveis de Faecalibacterium sobem em cerca de 10 vezes a cerca de 190 vezes durante o tratamento em comparação a um controle não tratado, e (d) os níveis de Clostridium XVIII sobem em cerca de 12 vezes a cerca de 60 vezes em comparação a um controle não tratado.
20. Processo para preparar um oligossacarídeo de esfingano ("SOS") com teor de acila alto/intermediário/baixo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, o referido processo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: preparar uma primeira composição compreendendo um esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo ou um polissacarídeo de esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo e um meio líquido; hidrolisar uma ligação glicosídica do esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo ou polissacarídeo de esfingano com teor de acila alto/intermediário/baixo para obter uma segunda composição; submeter a segunda composição a ultrafiltração, cromatografia por exclusão de tamanhos, precipitação, centrifugação ou uma combinação desses para obter uma terceira composição compreendendo o SOS com teor de acila alto/intermediário/baixo; e opcionalmente isolar ou recuperar a terceira composição.
21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de hidrolisar é mediada por um ácido, uma enzima, sonicação, homogeneização a alta pressão, radiação ou uma combinação desses.
22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima é uma gelanase, uma ramnogalacturonano endoliase (EC
4.2.2.23), uma ramnogalacturonano exoliase (EC 4.2.2.24), uma gelano liase (EC
4.2.2.25) ou uma combinação dessas.
23. Processo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida etapa de submeter compreende filtrar a segunda composição através de uma membrana com um corte de peso molecular de cerca de 5 kDa ou cerca de 10kDa para obter um filtrado compreendendo a terceira composição.
24. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o SOS preparado, como definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 23.
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