SE443804B - Polysackarid och sett att framstella denna genom odling av pseudomonas viscogena - Google Patents

Description

ii79o341s-3 « 2 konstituenter innehåller allos, galaktos, glukos, mannos och glukuronsyra, varvid allos-halten är ca 6-12 mo1% och summan av halterna av allos och galaktos är ca 50-72 mo1%, och att polysackaríden ackumuleras i mediu- Smet, separeras från detta och utvinnes.

Strukturella och fysikaliska-kemiska egenskaper hos polysackariden enligt uppfinningen är följande: (1) Sockerkonstituent och halt därav: Allos cirka 6 - 12 mol% 10 Galaktos cirka 50 -60 mol% Glukos« cirka 10 - 20 mol% Mannos cirka 7 - 14 mol% Glukuronsyra cirka lO -'12 mol% På grund av att bindningarna mellan mannos och 15 glukuronsyra är relativt motståndskraftiga mot hydrolys, kan analysvärdet för mannos vara lägre beroende på den analysmetod som används. (2) Elementaranalys" Värden nära de beräknade från den allmänna formeln 20 CnH2nOn ges. (3) Smältpunkt Polysackariden uppvisar ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas över en temperatur av cirka 210-220°C. (4) Infrarött spektrum 25 Spektrumet uppvisar absorptioner enligt nedan: i närheten av I340O.cm_1 0-H-sträckning i närheten av 2 890 cnfl C-H-sträckning i närheten av 1.620 cmal sträckning av karboxy- å . á latanjoner 30 i närheten av 880 cm_1 på grund av oriente- ' ringen hos ß-glukosid- bindningarna (5) Ultraviolett absorptionsspektrum Spektrumet uppvisar ingen distinkt karaktäristisk 35 absorption. (6) 13C-kärnmagnetiskt resonansspektrum En metylsignal för acetylgrupper och en karboxyl- signal i karbonylabsorptionsområdet iakttogs. Karbonylsig~ 5 10 15 20 25 30 35 7903415-3 3 nal för acetylgrupper kunde emellertid inte bekräftas.

Följaktligen förmodas det att, fastän en del hydroxyl= grupper är acetylerade, är acetyleringsgraden ganska ringa. V (7) Löslighet i lösningsmedel Polysackariderna är lösliga i vatten, men olösliga i metanol, etanol, etrar, aceton eller liknande. (81 Färgreaktion Antronreaktion positiv Ninhydrinreaktion negativ Dische's karbazolreaktion- positiv Dische's cystein-svavelsyrareaktion positiv (9) Açiditet ' sur (10) utseende Det uppvisar ett vitt, bomullsliknanue'cller fibröst utseende i torrt tillstånd. (ll) Molekylvikt Fördelad mellan cirka l x 104 och cirka 1 x 107. (12) Specifik vridning lalfif = cirka +3o° till cirka +3s° (c = 1, vatten) (13) Utseende hos vattenlösning . En vattenlösning av polysackariden är färglös och transparent samt viskös. (14) Uppträdande gentemot kalciumsalter.

Polysaekariden aggregeras till gel i en alkalisk vattenldsning när kalciumhydroxid eller ett kalciumsalt, såsom kalciumklorid, sätts till lösningen.

Polysackariderna är användbara som visköst material, g stabiliseringsmedel, emulgeringsmedel, kvalitetsförbätt- T rande medel och liknande, liksom vid dextran, xantan- gummi, gummi från växter och liknande, i vidsträckt be- f märkelse för framställning av livsmedel, läkemedel, kosmetika osv. Polysackariderna kan också användas som formbara råmaterial för biologiskt nedbrytbar formad film, eftersom polysackariderna kan bearbetas till filmer. 79oz41s-3 10 15 20 25 30 35 4 Vidare kan pølysackariden användas som flockulerings- ~hjälpmede1, eftersom polysackariderna aggregeras till gel i en vattenlösning i närvaro av ett kalciumsalt.

Som mikroorganism används vid sättet enligt uppfin- ningen Pseudomonas viscøgena, FERM-P nr 3811 (ATCC 31504; TS-1004), som isølerats från jord av uppfinnarna.

De systematiska egenskaperna beskrivs i den ej granskade japanska patentansökan med publiceringsnummer llssss/lsva och är sam fenjer: i (A) Studium av cellmorfologi efter inokulering vid 30°C under 6-24 1. s2. 3. 4? SI 6I 7. h på en näringsbuljongagar: Cellform Cellstorlekt Arrangemang Rörlighet flageller Ändspør Gramfärgning Syrafasthet _(B) Kulturegenskaperz l. Odling på en näringsbuljongagarplatta efter inokulering vid 30°C.under 2 dagar: a) b) c) dl e) f) 9)_ h) i) 1) Kolonibildningshastighet Koloniernas form Køloniernas yta Tillväxtens upphöjníng Koloniernas kant Kolonïernas innehåll Koloniernas färgton Koloniernas transmittans Kóloniernas'glans Bildning av lösligt färg- givande material stavar cirka 1,0 x 0,7 (pm) ensamma eller parvisa rörliga medelst pølära inga negativ negativ .vanlig cirkulära, cirka 3,5 mm diameter " slät konvex sammanhängande amorft blekgul opak glänsande ingen 10 15 20 25 -30 2. a) Förvätskning av gelatin lingen Odling 1 mjölk: al Reaktion avfärgning hl Gasbildning ingen A~c) Koagulering eller för- . ïoagulering 'inokulering vid 20°C under 2 veckor: 7903415-3 5 Odling på en snedagarnäringsbuljong efter in- okulering vid 30°C under 2 dagar: a) Tillväxt ,riklig tillväxt bl Tillväxtens form utbredande c) Koloniernas tvärsektion 1 vertikalledl ^ platt d) Odlingens glans glänsande e) Koloniernas yta _ V slät fl Køloniernas transmittans opak g) Kbloniernas fårgton blekgul h) Koloniernas reologiska degenskaper klibbig Odling i en näringsbuljong efter ínokulering vid 30°C under 2 dagar: al Tillväxt på ytan ïembranartad b) Grumlighet måttligt grumlig c) Bildning av fällning kompakt d) Gasalstring ingen e) Färgning av medium ingen Odling i en näringsbuljongagarstav efter in- É okulering vid.30°C under 2 dagar: 3 a) Tillväxtens lokalisering bäst vid toppen bl Punkteringslinje pappilär Odling i en näringsbuljonggelatinstav efter vätskning ”w79os41s-3 § 6 (C) Fysiologiska egenskaper: ~l. Reduktiøn av nitrat reduktiontJJJ.N2 inträffar 2. Denitrifiering , - .ß Mza-test" VP-test Bildning av indol Bildning av svavelväte Hydrolys av stärkelse - Utnyttjande av citrøn- + -+ + -F æQíuïfiU-I lo o 10 “ syra - - 9. Utnyttjande av oorga- kvävekällai.antingen N03- nisk kvävekälla eller NH3-form utnyttjas 10. Bildning av färggivande grönt flucrescent material material bildas 15 ll. Ureas - ¿ 12 . oxmas 4 . ,¿ 13. Katalas ' + 14. Tillväxtomrâde , pH 4-10 vid en temperatur . av 1>o-42°c 20 15. Syrebehov aerob 16. 0-F-test , cxidation 17. Syra- eller gasbildning från socker: 5°Ckef Tillväxt Syra Gas L~arab1nos + _ - + - 25 _ D-xylos D-glukos + _ Q (+) ~ D-mannos D+fruktos' D-galaktos 30 Maltos Sackaros Laktøs_ Trefaros D-sorbit 35 , D-mannit Inosit Glycerin Stärkelse + + | + -P + -F + -¥ + -F + -F + -P + '¥ l I 7903415-3 7 _ Pseudomonas viscogena kan odlas med användning av olika klasser av organiska ämnen, ekempelvis metanol, etanol, isopropanol, etylenglykol, propylenglykol, glycerin, glukos och liknande, som kolkälla. Isynnerhet 5 kan polysackariderna enligt uppfinningen ackumuleras i avsevärd mängd i mediumet när mikroorganismen odlas med användning av metanol som kolkälla. Mängden metanol i kulturen är lämpligen lägre än S vikt% och särskilt föredrages en koncentration av 0,5-3 vikt% för god 10 bakterietillväxt och propagering.

Som mediumetskvävekälla används oorganiska kväve- föreningar liksom vid konventionell fermentation, såsom ammo- niumsulfat, ammoniumklorid, amoniak, diammoniumfosfat, ammoniumnitrat och natriumnitrat, och/eller material 15 som innehåller organiskt kväve, såsom urea,-majstöp- vätska, kasein, pepton, jästextrakt och köttextrakt.

Förutom vad som angivits ovan kan man använda mineralsalter, t ex kalciumsalter, magnesiusalter, kaliumsalter, fosfater, järnsalter, mangansalter, 20 zinksalter och kopparsalter. Tillsats av organiskt material, såsom sojabönproteinhydrolysatlösning, jäst- extrakt, vitaminer eller aminosyror, är effektivt för att befrämja bakterietillväxten. Odlingen utföres aero- biskt vanligen vid ett temperaturområde av 20-4200, 25 företrädesvis vid 25-38°C, samt vid ett pH av 5-9, företrädesvis 5,5-7,5 med hjälp av skakkultur eller - nedsänkt kultur. Tabell l visar ett exempel på ett syn-u tetiskt medium, som innehåller metanol och som kan an- vändas vid uppfinningen. 7903415-3 10 20 25 _30 35 V hjälpmedel för att avlägsna celler. Kulturen späds på 8 TABELL 1 Viktâ Metanol 1,5 Diammoniummonovätefosfat 0,40 Monokaliumdivätefosfat 0,10 Dikaliummonovätefosfat 0,10 Magnesiumsulfat, heptahydrat 0,05 Ferrosulfat, heptahydrat 0,001 Kalciumklorid, dihydrat 0,001 Jästextrakt 0,02 Vattenva resten pH 7,0 Under odlingen kan kulturens pH-värde ändras till ett lägre värde beroende på det medium som används. I ett sådant fall kan ett alkali, såsom ammoniak, natrium- hydroxid eller kaliumhydroxid, tillsättas för att upp- rätthålla pH-värdet vid ett förutbestämt värde.

Polysackariderna enligt uppfinningen har en mole- J kylvikt, som är fördelad i området cirka l x 104 till ä cirka l x 107, såsom nämnts ovan. Molekylviktsvärdena kan ändras något beroende på odlingsbetingelserna, t ex koncentrationsförhâllandet mellan kolkälla och kvävekälla, förändring i fosfatkoncentrationen. Molekylvikten kan också ändras något beroende på förhållandet mellan meta- nol och ammoniak när en blandad lösning av metanol och ammoniak används som neutralisationsmedel. Separationen av polysackariderna, som innehåller allos som en socker- konstituent, från kulturen utförs exempelvis enligt följande. Efter odlingen separeras kulturen genom centri- fugering eller filtrering med användning av ett filter- tillämpligt sätt och därefter avlägsnas cellerna, såsom nämnts ovan, när kulturens viskositet är hög. Råa poly- sackarider erhålles i form av vita fibrer genom till- sats av ett vattenlösligt organiskt lösningsmedel, såsom aceton, metanol, etanol eller liknande, till den ovan b erhållna supernatanten. De råa polysackariderna löses 10 15 20 25 30 35 7903415-3 9 åter i vatten och tvättas med en eter och etanol och utsätts för en värmebehandling, såsom vid 80°C i 15 min, behandlas för avlägsnande av protein genom tillsats av ptriklorättiksyra, centrifugeras eller filtreras osv för att avlägsna fällningar. Den erhållna supernatanten utsätts för dialys och lyofilisering för att ge renade polysackarider i form av vita fibrer. Det är naturligt- vis inte nödvändigt att separera polysackariden i form av ett torrt fastämne om den kan användas i form av en vattenlösning.

Pseudomonas viscogena kan alstra polysackariderna enligt föreliggande uppfinning, vilka innehåller allos som en sockerkonstituent 1 hög koncentration och med mycket hög utnyttjandegrad med avseende på kolkällan.

Så t ex är det möjligt att alstra polysackariderna i en mängd av 30 g/liter, baserat på odlingsmediumet, när odlingen utföres i en nedsänkt kultur med använd- ning av metanol som kolkälla. Det är också möjligt att uppnå ett polysackaridutbyte av cirka 30 %, baserat på mängden använd metanol. , Uppfinningen belyses ytterligare genom följande exempel.

EXEMPEL 1 1,0 liter av en lösning med samma sammansättning som i tabell l,.utom.att den inte innehöll metanol, satsades i ett 2,0 liters fermentationskärl av mini- behâllartyp. Sedan kärlet steriliserats vid l20°C under 15 min, infördes 20 ml metanol i kärlet under bibehål- lande av steriliteten för att bereda ett medium. 50 ml av en ympkultur, som'framställts genom odling av Pseudomonas viscogena stam TS-1004 i ett medium med samma sammansättning som det ovan iordningställda medi- umet vid 30°C i 24 h, inplanterades i kärlet. Odlingen utfördes vid 3ø°c 1 48 n med hjälp av neasänxt kultur vid en omrörarhastighet av 800 varv/min och en genom- bubblad luftmängd av l liter/min, varunder ammoniak- vatten innehållande metanol tillsattes för att bibehål- la kulturen vid pH 7,0. “ 10 15 20 25 30 35 7903415-3 10 Molförhållandet mellan metanol och ammoniak i ammoniakvattnet, som innehöll metanol, var l0:l. Mängden metanol, som sattes till kulturen under odlingen, var 73 g. I ' Efter odlingen sattes 2 liter vatten till kulturen 0011 därefter centrifugerades kulturen vid 5°C, 10 000 varv/min under 30 min för att avlägsna bakterieceller och fast material. Den erhållna supernatanten hälldes i 9 liter aceton under omröring. Den acetonolösliga produkten filtrerades och tvättades tillräckligt med etanol och en eter samt lyofiliserades, varvid man erhöll 15,3 g rå polysackarid. _ ' 10 g av den sålunda erhållna, råa polysackariden löstes i l liter vatten och triklorättiksyra sattes till lösningen till en koncentration av 3 viktt triklor- ättiksyra i lösningen. Sedan lösningen fått stå över natten centrifugerades den vid 5§C, 10 000 varv/min i 20 min för att avlägsna fast material. Supernatanten hälldes åter i en 3 ggr så stor mängd aceton för att åter htfälla polysackariden.

V Efter separation av den erhållna polysackaridfäll- ningen, löstes den åter i vatten och en vattenhaltig lösning av cetyltrimetylamoniumbromid sattes till lös- ningen för att utfälla polysackariden som ett komplex med cetyltrimetylammoniumbromid. Komplexet tvättades tillräckligt med vatten och etanol för att avlägsna överskott av cetyltrimetylamoniumbromid. Därefter sat- tes en vattenlösning av natriumklorid till komplexet I för att upplösa det. Till den erhållna lösningen av polysackariden sattes en 3 ggr så stor mängd etanol för att utfälla polysackariden. Fällningen separerades, lyofiliserades och löstes åter i vatten. Den erhållna lösningen satsades i ett cellofanrör för dialys och ut- sattes för dialys i rinnande vatten under 3 dagar. Där- efter sattes en.3 ggr så stor mängd aceton till lösningen för utfällning. Fällningen separerades genom filtrering och lyofiliserades för att ge en renad polysackarid.

Utbytet var 8 g. 10 15 20 25 30 _35 7903415-3 ll De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos den sålunda erhållna, renade polysackariden var följande: Elementaranalys: Funnet Beräknat värde (%) (s) från cànznon C 40,25 40,00 H 6,06 6,67 O 53,02 53,33 N 0,67 Smältpunkt: Polysackariden uppvisade ingen tydlig smältpunkt.

Viktförlust, som började vid en temperatur av 210-220°C, och åtföljdes av exotermiskt värme, iakttogs på en differentiell termisk våg, som var försedd med en skrivare, vid en upphettningshastig- het av lO°C/min i närvaro av luft.

Infraröd~absorptionsspektrum: Spektrum, som erhållits med hjälp av KBr-tablett, visas i fig l. Av figuren framgår de tidigare nämn- da, karaktäristiska absorptionerna.

Ultraviolett-absorptionsspektrum: 13 Ultraviolett-absorptionsspektrum, som observerades i en vattenlösning, vari koncentrationen av poly- sackariden var 0,097 vikt%, visas i fig 2. Av fig 2 framgår att spektrumet inte har någon tydlig, karak- täristisk absorption, men absorptionen ökar något under §l0 nm och under 250 nm.

C-kärnmagnetisk-resonans-absorptionsspektrum: Signaler på grund av kemiska förskjutningar obser- verades vid 27,l5 ppm och 176,97 ppm i 6-värde i en tungvattenlösning; Det kan hänföras till 13C hos metylgrupper i acetylgrupper och hos karbonyl- gruppen i karbokylgrupper.'Karbonylsignalen hos acetylgrupperna, som förväntas i närheten av 169,0 ppm i 6-värde, återfanns emellertid ej.

Följaktligen antogs det, att fastän en del av hydroxylgrupperna är acetylerade, är acetylerings- graden ringa. 10 15 20 25 V30 35 007903415-3 12 Utseende, löslighet och färgreaktion: Samma egenskaper och reaktioner som tidigare nämnts observerades.

Molekylvikt: Molekylvikten var fördelad mellan 1,0 x 105 och 5 x 106. Fördelningens topp låg vid 2 x 106. Mät- ningen utfördes med hjälp av gelpermeationskroma- tografi på en lösning av polysackariden. Betingel- serna var följande: , Provmängd: 100 pl Kolonn: . 0,96 cm x 60 cm Packningsmaterial: hydrofil gel en blandad lösning av Eluent: 3/15 xuzpov M/ls Na2n1>o4 4 och M/lo KCI Detektor: differentiell refraktometer Standard: dextran Specifik vridning: +32,2 (c = l, vatten) Utseende hos vattenlösning, aciditet, och uppträdande gentemot kalciumsalter: Polysackariden var färglös och transparent i vatten- lösning. Lösningen hade en viskositet av 180 cP vid rumstemperatur vid mätning i en rotationsviskometer.

Tillsättning av en vattenlösning av cetyltrimetyl- amoniumbromid till lösningen resulterade i en vit fällning. Detsamma erhölls vid tillsats av en lösning av cetylpyridiniumklorid. Följaktligen var polysac- kariden sur. Tillsats av en kalciumkloridvattenlös-\ ning till en vattenlösning av polysackariden, som justerats till pH 10 genom tillsats av natriumhydr- oxidvattenlösning, resulterade i en aggregation till gel. Tillsats av kalciumhydroxidvattenlösning i stället för kalciumkloridlösningen och natrium- hydroxidvattenlösningen gav samma resultat.

Sockerkonstituenter, sammansättning och kemisk struktur: 10 mg av den renade polysackariden löstes i 0,5 ml svavelsyra (28) och upphettades i ett slutet rör vid 10 15 20 25 30 35 p79o341s+s 13 l00°C under 8 h för hydrolys. Den erhållna hydro- lyslösningen neutraliserades med bariumkarbonat och filtrerades; På filtratet utfördes tunnskikts- kromatografi. Å Filtratet anbringades punktvis på en silikagel- ~lJ platta och framkallades med användning av ett framkallarlösningsmedelssystem bestående av n-buta- nol, pyridin och vatten (volymförhållande 6:4:3).

Därefter sprutades vattenmättad n-butanol innehål- lande p-anisidinhydroklorid i en mängd av 3 % och upphettning skedde vid_llO-l20°C. Som resultat konstaterades förekomst av allos; galaktos, glukos, mannos och en uronsyra. _ för den kvantitativa bestämningen av neutralsocker _ q passerades filtratet genom en kolonn packad med ett 4 starkt surt katjonbytarharts i H+-form och kolonnen tvättades med vatten. Efter passagen indunstades lös- ningen. ~ _ ' _ _ _ Alditolacetyleringen följt av gaskromatografi ut- i fördes på den indunstade lösningen enligt den metod somfibeskrivs i "General Polysaccaride Chemistry" samman- ställd av Harada och Koizumi; utgiven av Kodansha (1974), sid 68 enligt följande:A 1 ml av den indunstade lösningen fick stå över natten efter tillsats av 10 mg natriumboro-“ hydrid. Till lösningen sattes en överskottsmängd av ett starkt surt katjdnbytarharts i E+-form och blandningen skakades kraftigt under flera minuter för att sönder- dela överskottsmängden av natriumborohydrid. Efter fil- trering torkades filtratet 1 vakuum; Metanol sattes till, den erhållna torkade produkten, sdm åter torkades i_ vakuum vid rumstemperatur. Därefter upprepades tillsatsen av metanol och torkningen i vakuum 10 ggr. * Acetyleringen utfördes genom att till den torra produkten sätta 0,2 ml av en lösning av pyridin och ättik- syraanhydrid i volymförhållandet 1:1 samt upphetta vid lOO°C under 2 h. Efter kylning sattes en liten mängd vatten till reaktionsprodukten och den torkades i vakuum vid rumstemperatur. Tillsatsen av vatten och torkningen 10 20 25 A30 35 ”i79os41s-3 14 i vakuum upprepades 4 ggr. Den kvarvarande produkten löstes i en liten mängd kloroform och den erhållna lösningen användes som prov vid gaskromatografi.

Betingelserna var följande: Kolonn: 0,4 cmlx 200 cm glaskolonn Packningsmaterial: .3g% ECNSS-M uppburen på en diatomacéjord behandlad med nmcs uoo-lzo mean) Kolonntemperatur: l90°CW Ingångstemperatur: '240°C Bärare: kväve, 40 ml/min Detektor: vätejonflamtyp Identifiering av uronsyran utfördes enligt följande: 7,0 g av den renade polysackariden löstes i 900 ml svavelsyra (ZN) och upphettades i kokande vatten under 8 h för hydrolysen. Den erhållna hydrolyslösningen neu- traliserades med bariumkarbonat och filtrerades. Fil- tratet passerades genom en kolonn med måtten 2,0 cm: vilken kolonn var packad med ett starkt surt katjonbytar- harts i H+-form och kolonnen tvättades med vatten. När lösningen passerat indunstades den till sirap. 5 g av sirapen utsattes för kolonnkromatografi, varvid man an- vände en vcellulosakolonn (CF-ll, 4 ,1 cmx 54 cm, tillverkad av Whatman), en blandning av n-butanol, pyridin och vatten i volymförhållandet l0:3:3 som första eluent och en blandad lösning av etanol och vatten i volymförhållandet 1:2 som andra eluent. Elueringsbetingelserna var 27 ml/h och 17 ml/rör. Varje fraktion underkastades papperskromato- grafi med nedåtgående förfarande med användning av papper (BMM från Whatman) och en blandad lösning av n-butanol, pyridin och vatten som framkallningsmedel, för att frak- tionera och isolera fraktionerna av mannos, glukos, galak- tos och uronsyra. Den erhållna uronsyrafraktionen löstes i en liten mängd vatten och en överskottsmängd av natrium- borohydrid sattes till den erhållna lösningen, som därefter fick stå vid rumstemperatur över natten. Till lösningen sattes en överskottsmängd av starkt surt katjonbytarharts i Hf-form och den erhållna blandningen skakades kraftigt 10 15 20 25 _30 -35 7903415-3 15 för att sönderdela överskott av natriumborohydrid. Efter filtrering torkades filtratet i vakuum, följt av till- sats av metanol. Proceduren med metanoltillsats och tork- ning upprepades 10 ggr. Därefter införlivades produkten med ett starkt surt katjonbytarharts i H+-form och vattenfri metanol och upphettades vid l00°C under 2 h.

Efter kylning och filtrering sattes vatten och natrium- borohydrid till lösningen, som sedan fick stå över natten.

Alditolacetylering och gaskromatografi utfördes på samma sätt som vid den ovannämnda alditolacetyleringen och gaskromatografin vid neutralsockren.

Som resultat konstaterades att uronsyran utgjordes av endast glukuronsyra, eftersom endast en topp motsva- rande den hos acetylerad alditol av glukos observerades.

Kvantitativ bestämning av glukoronsyran utfördes medelst karbasol-svavelsyrametoden. 1,60 mg av den renade polysackariden löstes 1 0,50 ml vatten och iskyldes. 3,0 ml koncentrerad svavelsyra införlivades 1 lösningen under kylning med is och noggrann omröring. Lösningen upphettades 1 kokande vatten i 20 min och kyldes omedel- bart till rumstemperatur med kallt vatten. Till lösningen sattes 0,1 ml av en 0,1 % lösning av karbasol, som fram- ställts genom att lösa 10 mg karbasol i 10 ml 95 % alko- hol. Mängden glukuronsyra bestämdes genom att mäta ab- sorbansen vid S35 mm efter 2 h från tillsatsen av karba- sollösningen. Resultatet visade att glukuronsyra fanns i en mängd av 11,0 mol% i den renade polysackariden.

På grundval av detta värde och resultaten av de ovan- nämnda gaskromatografiska analyserna av neutralsockren fann man att den renade polysackaridens halt av socker- konstituenter var följande: n “Mol%^ Allos 9,8 Galaktos 55,4 Glukos 10,7 Mannos 13,1 Glukuronsyra 11,0 *“w79os41s-zh 10 15 20 25 30 35 16 Identifieringen och bekräftelsen av allos utfördes inte endast på grundval av att retentionstiden samman- föll med den hos ett autentiskt prov vid gaskromato- grafin, utan också genom följande metoder: Pâ den glukosfraktion som framställts genom den ovannämnda kolonnkromatografin, följt av papperskroma- tografi, utfördes elektrofores med användning av papper (3MM från Whatman) i en natriumboratlösning (0,lM, pH 9,2) vid en elektrisk potentialgradient av 15 V/cm, varvid 2 fläckar erhölls. Det konstaterades att dessa 'hade samma mobilitet som de hos autentiska prover av glukos respektive allos. Dessutom löstes 40 mg av glukos- fraktionen i 19,5 ml av en fosfatbuffertlösning (0,05 M, pH 6,8). Till lösningen sattes 15 ml av en vattenlösning av glukosoxidas (typ V, framställd av Sigma Chemical Co.

V från Aspergillus niger) med en proteinhalt av 5,7 mg/ml, för reaktion. Reaktionen fortsattes vid 37°C under 10 h.

Därefter upphettades reaktionslösningen för att deaktivera enzymet och centrifugerades för att separera olösligt material. Lösningen avjoniserades med en blandning av ett starkt surt katjonbytarharts i H+-form och ett starkt basiskt anjonbytarharts i OH--form och underkastades 'papperskromatografi under de ovannämnda betingelserna för att isolera allos. Fysikaliska och kemiska karaktäristika för den isolerade allosen sammanföll i huvudsak full- ständigt med de hos ett autentiskt prov av allos. Genom mätning av specifika vridningen för varje isolerad socker- konstituent konstaterades att varje sockerkonstituent förelåg i D-form. Genom metylering enligt Hakomoris metod, sönderdelning enligt Smith, sönderdelning enligt Smith inbegripet relaxationshydrolys, ovannämnda infra- röd-spektra, etc, konstaterades också att polysackari- dens huvudkedja bestod av galaktos kopplat i B-l,3- länkar med sidokedjor i 4- och G-ställningarna, vilka sidokedjor hade galaktos, mannos och glukos liksom gluko- ronsyra i ändställningarna. 10 ml av en vattenlösning av den renade polysacka- riden (2 viktt) sattes tillsammans med 10 ml av en vatten- 10 15 20 25 30 35 79os41s+s 17 lösning av xaiaiunmlaria (Lo vikta) :in 1 11:e;- av en fermentationsvätska, som erhållits vid en lysin- fermentation och som'hade ett pH av 8,0 och befann sig i ett stadium före borttagning av mikrobiella cel- ler, och därefter justerades vätskans pH till l0. Där- efter bringades de mikrobíella cellerna att aggregera och sedimentera. Detta resulterade i att supernatanten blev klar.

Den sålunda behandlade vätskan kunde mycket lätt filtreras och L-lysin kunde utvinnas från filtratet.

A andra sidan iakttogs ingen väsentlig förändring hos samma fermentationsvätska när enbart vattenlösningen av kalciumklorid sattes till vätskan följt av justering av vätskans.pH, såsom ovan, Vid det senare fallet var det inte lika lätt att filtrera vätskan som vid fil- trering av den ursprungliga fermentationsvätskan. I huvudsak samma resultat erhölls vid användning av den råa polysackariden i stället för den renade polysacka- riden. I EXEMPEL 2 .

Odlingen genomfördes på motsvarande sätt som exem- pel l med användning av ett medium, som hade samma sam- mansättning som i tabell l, utom att det innehöll 0,05 vikt% ammoniumsulfat, 0,05 vikt! ammoniumklorid och 0,05 víkt% diamoniumonovätefosfat i stället för 0,40 vikt% diammoniumonovätefosfat, samt att det saknade 0,02 vikt% jästextrakt. Odlingstiden var 45 h och det metanolinnehållande.ammoniakvatten som tillsattes för reglering av pH-värdet hade ett förhållande mellan amoniak och metanol av lS:l. Den förbrukade mängden av metanolinnehållande ammoniakvatten var l2S ml. En rå polysackarid erhölls i en mängd av 30,0 g, vilken renades ' på samma sätt som i exempel l för framställning av poly- sackariden. _ Den sålunda erhållna, renade polysackariden utsattes för de mätningar och analyser som angivits i exempel 1.

Resultaten var följande: fra-Eau »mm v. flwvuaflL-lu-z < 10 15 20 25 30 35 79os41s-3 18 Elementaranalys: _ Funnet Beräknat värde från (%l CnH2n0n (%) C 40,93 40,00 H 6,30 6,67 0 52,24 53,33 N 0,53' --~ Molekylvikt: Molekylvikten var fördelad mellan 1,0 x 104 och 1,0 x 106 5 och.fördelníngens topp låg vid 2,0 x 10 .

Specifik vridning: ' lalšf = +3l,9 (c = l, vatten) Sammansättning av sockerkonstituenterna: J Mol% Allos 6,2 Galaktos 52,4 Glukos 17,8 Mannos 12,5 Glukuronsyra 11,0 De andra egenskaperna var 1 huvudsak desamma som i exempel l.

EXEMPELU3' 1,0 liter av en lösning med samma sammansättning som i tabell l, utom att den ej innehöll metanol, sat- sades i ett 2,0 liters fermentationskärl av minibehållar~ typ. Efter det att kärlet steriliserats vid l20°C under 15nüninfördes 20 ml metanol 1 kärlet under upprätthål- lande av steriliteten för att framställa ett medium. 50 ml av en ympkultur, som framställts genom att odla Pseudomonas viscogena stam TS-1004 1 ett medium med samma samansättning som det ovan framställda media umet vid 30°C under 24 h, inplanterades i kärlet.

Odling utfördes vid 30°C under 16 h medelst ned- sänkt kultur vid en omrörarhastighet av 800 varv/min och genombubblad luftmängd av l liter/min, varunder natriumhydroxid (2N) tillsattes för att hålla kulturen _ vid pH 7,0. Därefter uttogs en del av kulturen så att fermentationskärlets vätskeinnehåll blev 780 ml. Efter 10 15 20 25 30 IYUJWÄJWJ 19 uttagningen inmatades en ny steriliserad lösning, som hade samma sammansättning utom att metanolkoncentrationen var 0,5 vikt%, i kärlet med en hastighet av 135 ml/h och kulturen uttogs samtidigt med samma hastighet som inmatningen av den steriliserade lösningen. Odling med kontinuerligt flöde utfördes på detta sätt. Kulturen som uttogs 45 h efter igângsättningen av den kontinuerliga odlingen, innehöll mikrobiella celler i en mängd av 11,7 g/liter och polysackariden i 17,1 g/liter.

Till 200 ml av den uttagna kulturen sattes 400 ml vatten och blandningen centrifugerades vid 5°C, 10 000 varv/min under 30 min för att avlägsna mikrobi- ella celler och fastämnen. Den erhållna supernatanten hälldes i 1,8 liter aceton under omröring. Behandling av blandningen på motsvarande sätt som i exempel l gav en rå polysackarid i en mängd av 3,4 g. Vidare genom- fördes rening på motsvarande sätt som i exempel l för att ge den renade polysackariden. Den erhållna poly- sackariden underkastades mätningar och analyser på sam- ma sätt som i exempel l. Resultaten var följande: Elementaranalys: Funnet Beräknat värde från (%)' CnH2n0n (%) C 39,67 40,00 H 6,41 6,67 0 53,20 53,33 N 0,72 \ Molekylvikt: Molekylvikten fiördelades mellan 2,0 x 104 och 1,0 x 106 och fördelningens topp låg vid 2,0 x 105.

Specifik vridning: [a]25 = +32,l°, D (c = 1, vatten) 10 15 20 25 30 -35 ï l19os41s-3 t 20 Sammansättning av sockerkonstituenterna: ëelâ Alløs ' Q 1o,9 Galaktos 59,3 c1ukos ' 11,0 Mannos 7,5 Glukuronsyra 11,3 Övriga egenskaper var i huvudsak desamma som 1 exempel 1; EXEMPEL'4 Odlingen utfördes på motsvarande sätt som i exem- pel l med användning av ett medinm, som hade samma samansättning som i tabell l, utom att det innehöll 0,20 vikt% ammoniumsulfat, ammoniumklorid respektive diammoniummonovätefosfat i stället för 0,40 vikt% di- ammoniummonovätefosfat. Odlingstiden var 48 h.

Den ammoniakvatten innehållande metanolen hade ett förhållande mellan metanol och ammoniak av l0:1 och föfbrukaaes 1 en mängd av 103 mi.

Den erhållna kulturvätskan behandlades på samma sätt som i exempel 1 för att ge 19,8 g av en rå poly- sackarid. Rening av den råa polysackariden och mätning- arna och analyserna av den erhållna, renade polysackari- den genomfördes på samma sätt som I exempel l. Resultaten anges i det följande:" Elementaranalys: ' Funnet Beräknat värde från (2) CnH2nOn (%) C 40,12 40,00 H 6,35 V 6,67 ø s3¿oa 53,33 N 0,45 'Molekylvikt: _ ma1eky1v1k:en föraelaaes meiiaá 3,0 x 104 och 2 x 106 och fördelningens topp låg vid 5,0 x 105.

Specifik vridning: [a]25 D = +32,3° _(c =V1, vattenl. 10 15 20 25 ~30 35 7903å15-3 21 Sammansättning av sockerkonstituenter: k ' ¶ Allos 11,3 Galaktos 51,7 Glukos 13,4 Mannos 12,9 Glukuronsyra 10,8 De övriga egenskaperna var i huvudsak desamma som i exempel 1. ' EXEMPEL 5 Odling och isolering av rå polysackarid utfördes på samma sätt som i exempel 4, utom att man utnyttjade en odlingstemperatur av 27°C och en odlingstid av 40 h.

Mängden erhâllen rå polysackarid var 12,5 g. Rening av den råa polysackariden och mätningarna och analyserna av den erhållna, renade polvsackariden utfördes på sam- ma sätt som i exempel l. Resultaten anges nedan: Elementaranalys: Funnet Beräknat värde från ,(il CnH2n0n (%) C 39,89 40,00 H_ 6,45 6,67 0 53,15 53,33 N ,0,51 Molekylvikt: Molekylvikten fördelades-mellan 1,0 x 104 ocg 5,0 x 105 och fördelningens topp låg vid 5,0 x 10 .

Specifik vridning: Ialïš = +31,§° (c = 1, vatten) Sammansättning av sockerkonstituenter: Lisää Allos 3,7 Galaktos 53,6 Glukos 10,5 Mannos 11,1 Glukuronsyra 11,0 Övriga egenskaper var i huvudsak desama som i exem- PÉJ. 11 790341543 _ qæzg-c* _ 22 f Kortfattad. riftningsbeskrivning: Pig l och 2 visar infraröd-absorptionsspektrum respektive ultravioleizt-absorptionsspektrxm f för pcly- sackariden enligt uppfinningen. n'“”å1" " 7903415-3 ”" ' ' 23 Formulär nr 4 MEDDELANDE OM TILLGÄNGLIGHETSNUMMER FÖR MIKROORGANISM Publikation nr 3392 1 mars 1977 Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd mir-aktör 'snukichi Aon Den mikroorganism som Ni anhöll att få deponera den 17 november 1976 under nr 3811 har erhållit tillgänglighets- nummer enligt fö1jande:_ Mikroorganismens namn Psedomonas viscogena TS-1004 Tillgänglighetsnummer ' FERM-P_ nr 3811 Fermentation Research Institute Direktör Mitsunobu Misono

Claims (6)

; l"MW1 isfisafisfiå 24 PATENTKRAV

1. Polysackarid, k ä n n e t e c k n a d därav, att den som sockerkonstituent innehåller allos, galaktos, glukos, mannos och glukuronsyra, varvid allos-halten år ca 6-12 mol% och summan av halten av allos och galaktos 5 är ca 50-72 mo1% och att polysackariden är en extra- cellulär produkt av Pseudomonas viscogena ATCC_nr 31504.

2. Polysackarid enligt kravet l, k ä n n e - W t e c k n a d därav, att halterna allos, galaktos, glukos, mannos och glukuronsyra i nämnd ordning är ca 10 6-12 mol%, ca 50-60 mol%, ca 10-20 mol%, ca 7-14 mol% respektive ca 10-12 mol%.

3. Polysackarid enligt något av kraven l eller 2, k ä n~n e t ehc k n a d därav, att polysackariden har en molekylvikt av ca l x 104 till ca l x 107, saknar 15 tydlig smältpunkt samt är löslig i vatten, men olöslig i metanol, etanol, en eter och aceton.

4. Sätt att framställa en polysackarid enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att man i ett odlingsmedium odlar bakterier, som 20 uppvisar de väsentliga egenskaperna hos Pseudomonas viscogena, ATCC nr 31504 och som extracellulärt kan alstra en polysackarid, vilken som sockerkonstituenter innehåller allos, galaktos, glukos, mannos och glukuron- syra, varvid allos-halten är ca 6-12 mol% och summan av 25 halterna av allos och galaktos är ca SO~72 mol%, och att polysackariden ackumuleras inædiumet, separeras fràn detta och utvinnes.

5. Sätt enligt kravet 4, k ä n n e t e c k n a t därav, att mediumet innehåller metanol som huvudsaklig 30 kolkälla.

6. Sätt enligt kravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att metanol föreligger i_en koncentration av högst 5 s. ' "