JPH07184675A - バクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アセトバクター属に属しセルロース性物質生
産能を有する微生物を、セルロース生成促進因子として
のメチオニンを含有する培地で培養し、培地中にセルロ
ース、セルロース性物質を生成蓄積せしめ、該物質を採
取することを包含するセルロースの製造方法。メチオニ
ンの他に、グルタミン酸、アラニン、グルタミン酸等の
他のアミノ酸を添加するときには、蓄積量がさらに増加
する。 【効果】 セルロース生産性が著しく向上する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アセトバクター属に属
しセルロース性物質を生産する能力を有する微生物が生
産するセルロース性物質の製造方法に関する。より具体
的には、セルロース生成促進因子としてメチオニンを含
有する培地中での該微生物によるセルロース性物質の生
産に関する。

【０００２】このセルロース性物質は可食性であり食品
分野で利用されるほか水系分散性に優れているので食
品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強
化、水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又
は乳化安定化助剤としての産業上利用価値がある。

【０００３】また、該セルロース性物質の離解物はミク
ロフィブリルの構造的物理的特徴に基づき高分子、特に
水系高分子用補強剤として各種の産業用用途がある。こ
のような離解物は高い引張弾性率を示すので該セルロー
ス性離解物を紙状または固型状に固化した物質はミクロ
フィブリルの構造的特徴に基づくすぐれた機械特性が期
待され、各種産業用素材としての応用がある。

【０００４】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来
より、アセトバクター属に属する微生物を培養して、セ
ルロースを生産する方法は知られている（この微生物を
以後「セルロース生産性酢酸菌」と称する）。例えば、
特開昭６２−２６５９９０号公報、特開昭６１−２２１
２０１号公報等に、その記載がある。セルロース生産性
酢酸菌の培養を行なう際に適当とされている栄養培地と
しては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、燐酸ナトリウ
ム及びクエン酸からなる Schramm／Hestrin 培地（Schr
amm ら、J. General Biology, 11, pp.123〜129, 1954
）が知られている。しかしながら、上記栄養培地で振
盪もしくは通気撹拌培養を行なった場合、得られるセル
ロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満足のいくも
のではなかった。また、上記栄養培地の他に、コーンス
チープリカー（ＣＳＬ）や麦芽エキス等を加えた培地が
知られているが、これら天然栄養素（ペプトン、酵母エ
キス、ＣＳＬ、麦芽エキスなど）に含まれる特定成分が
セルロース生成促進に関与していることは知られていな
い。培地中の特定栄養素によるセルロース生成促進因子
として、現在知られているものにはイノシトール、フィ
チン酸、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）（特公平５−
１７１８号公報；高井光男，紙パ技協誌，第４２巻，第
３号，第２３７〜２４４頁）等があるが、セルロース生
成量はまだ不十分であり、またこれらの振盪もしくは通
気撹拌培養における効果も明確ではなかった。

【０００５】本発明の目的は、セルロース生産性酢酸菌
を用いてセルロース性物質の生産性を向上させ安価に製
造する方法を開発することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために種々の研究を行ない、アセトバクタ
ー属に属しセルロース性物質を生産する能力を有する微
生物（すなわちセルロース生産性酢酸菌）をメチオニン
を含有する培地中で培養することにより、従来の製造法
に比べて著しくセルロース性物質の生産性が向上するこ
とを見出した。アミノ酸添加によるこのような生産性の
向上は、これまで知られていなかった。

【０００７】即ち、本発明は、アセトバクター属に属し
セルロース性物質生産能を有する微生物を、セルロース
生成促進因子としてのメチオニンをメチオニン無添加の
場合よりもセルロース、セルロース性物質産生を有意に
向上させる量で含有する培地中で培養し、培地中にセル
ロース、セルロース性物質を生成蓄積せしめ該物質を採
取することを包含するセルロースの製造方法を提供す
る。

【０００８】ここで、「有意に」とは、セルロース性物
質の産生量がメチオニン無添加の場合よりも明らかに高
いことを意味する。また、「含有する」とは、メチオニ
ンを培地に添加してもよく、またはメチオニンがネイテ
ィブに天然もしくは合成培地中に含まれていてもよいこ
とを意図している。

【０００９】メチオニンの含有量は、少なくとも０．５
ｍｇ／ｌ以上、好ましくは５〜１０００ｍｇ／ｌ、より
好ましくは２５〜５００ｍｇ／ｌであり、このときセル
ロース性物質の蓄積量は約１ｇ／ｌ以上である。メチオ
ニンの下限添加量より少ない場合には、セルロース性物
質の蓄積量が低下するし、一方この上限量より多い場合
にはメチオニンの添加効果がプラトーに達し経済的に不
利である。

【００１０】メチオニンの他に、さらに他のアミノ酸類
を１種類以上含有させた場合には、相乗的効果が得られ
セルロース性物質の蓄積量がメチオニンのみの場合と比
べて増大する。他のアミノ酸類としては、特にグルタミ
ン酸、アラニン及びアスパラギン酸が好ましい。これら
他のアミノ酸類の含有量は、特に限定されず、相乗的効
果を発揮する量であればいかなる量であってもよい。好
ましくは５ｍｇ／ｌ以上である。

【００１１】本発明において使用される微生物はアセト
バクター属に属し、セルロース性物質を産生する微生物
であればどのようなものでもよい。例えば、アセトバク
ター・スピーシーズ（Acetobacter sp. ）ＢＰＲ２００
１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、アセトバクター・
キシリナム（Acetobacter xylinum ）ＡＴＣＣ２３７６
８、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ２３７６９、
アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１などが
挙げられる。

【００１２】培地組成物中、炭素源としてはシュークロ
ス、グルコース、フラクトース、マンニトール、ソルビ
トール、ガラクトース、マルトース、エリスリット、ガ
ドニット、グリセリン、エチレングリコール、エタノー
ル等が単独或いは併用して用いられる。更にはこれらの
ものを含有する澱粉水解物、チトラスモラセス、ビート
モラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始め
とする果汁等が使用できる。

【００１３】また、窒素源としては硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源が使用さ
れてもよいし、或いはＢａｃｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａ
ｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、
豆濃などの含窒素天然栄養源が使用されてもよい。有機
微量栄養素として乳酸等の有機酸、ビタミン、脂肪酸、
核酸、２，７，９−トリカルボキシ−１Ｈピロロ［２，
３−５］−キノリン−４，５−ジオンを添加してもよ
い。

【００１４】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。

【００１５】培養のｐＨは３ないし７に、望ましくは５
付近に制御する。

【００１６】培養温度は１０〜４０℃、望ましくは２５
〜３５℃の範囲で行う。

【００１７】培養槽に供給する酸素濃度は１〜１００
％、望ましくは２０〜８０％であれば良い。

【００１８】本発明方法では、培養方法に制限を受け
ず、静置、振盪もしくは通気撹拌培養のいずれでもよ
い。振盪もしくは通気撹拌下での培養であってもセルロ
ース生産性に影響を及ぼさない。

【００１９】本発明の方法によって生成されるセルロー
ス性物質はそのまま採取してもよく、さらに本物質中に
含まれる菌体を始めとするセルロース性物質以外の物質
を取り除く処理をほどこしてもよい。

【００２０】不純物を取り除くためには水洗、加圧脱
水、希酸洗浄、アルカリ洗浄トルエン及び酢酸エチルな
どの極性有機溶媒による処理、次亜塩素酸ソーダ及び過
酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌
体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシ
コール酸などの界面活性剤による処理、常温から２００
℃の範囲の加熱洗浄などを単独及び併用してほどこすこ
とによりセルロース様物質から不純物を除去することが
できる。

【００２１】このようにして得られた本発明でいうセル
ロース性物質とは以下のものをいう。

【００２２】本発明のセルロース性物質とはセルロース
及び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及
びβ−１，３、β−１，２等のグルカンを含むものであ
る。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、
アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、
五炭糖及び有機酸等である。

【００２３】なおこれ等の多糖が単一物質である場合も
あるし２種以上の多糖が水素結合等により混在してもよ
い。

【００２４】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。

【００２５】培養条件 セルロース生産性酢酸菌をフラスコ培養法及びジャーフ
ァメンター培養法を用いて培養した。

【００２６】フラスコ培養法 フラクトース４０ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム１．０ｇ／
Ｌ、硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム
３ｇ／Ｌ、メチオニン１００ｍｇ／Ｌ、乳酸１．４ｍ／
Ｌ、初発ｐＨ５．０の組成の基本培地１００ｍｌを張り
込んだ７５０ｍｌ容Ｒｏｕｘフラスコに、セルロース生
産性酢酸菌の凍結保存菌液１ｍｌを植菌し、低温培養器
内で２８℃で３日間静置培養を行った。このシード培養
後、前記Ｒｏｕｘフラスコをよく振盪した後、無菌条件
下で内容物をガーゼ濾過しセルロース片と菌体を分離し
た。次に１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、培
地成分と菌体（＋微小セルロース）を分離し、さらに滅
菌生理食塩水で１〜２回菌体（＋微小セルロース）を洗
浄、遠心分離を繰り返した。洗浄された菌体に必要量の
滅菌生理食塩水を加え、撹拌後これをシード菌液とし
た。

【００２７】次に、シード菌液７．５ｍｌを検討培地６
７．５ｍｌを張り込んだ３００ｍｌ容スパイラルバッフ
ルフラスコに植菌した。振盪培養機を用い、振幅２ｃ
ｍ、回転速度１８０ｒｐｍ、温度２８℃の条件で回転振
盪しながら４日間メイン培養を行った。

【００２８】産生されたバクテリアセルロースの定量は
次のようにして行った。すなわち、各フラスコ内の固形
物を水洗して培地成分を除去した後、１％ＮａＯＨ水溶
液中で１１０℃、２０分間処理して菌体を除去し、さら
に、洗浄液が中性付近になるまでセルロースを水洗し、
８０℃で真空乾燥して乾燥重量を測定した。

【００２９】ジャーファメンター培養法 上記基本培地１００ｍｌを張り込んだ７５０ｍｌ容Ｒｏ
ｕｘフラスコにセルロース生産性酢酸菌の凍結保存菌液
１ｍｌを植菌し、低温培養機内で２８℃で３日間静置培
養を行なった。静置培養終了後、Ｒｏｕｘフラスコをよ
く振盪し、その内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセ
ルロース片と菌体を分離した。得られた菌液７．５ｍｌ
を基本培地６７．５ｍｌを張り込んだ３００ｍｌ容スパ
イラルバッフルフラスコに植菌し、振盪培養機を用いて
振幅２ｃｍ、回転速度１８０ｒｐｍ、温度２８℃の条件
で回転振盪しながら３日間シード培養を行なった。

【００３０】培養終了後、フラスコの内容物を無菌ブレ
ンダーに移し、１０，０００ｒｐｍで３分間破砕処理を
行なった。この破砕された内容物をシード菌液とし、以
下のメイン培養に使用した。

【００３１】上記シード菌液６０ｍｌを滅菌済み検討培
地５４０ｍｌを張り込んだ小型ジャーファメンター（全
容量１，０００ｍｌ）に無菌的に植菌し、３０℃で２０
時間又は３０時間、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨもしくは１Ｎ
Ｈ₂ ＳＯ₄ でｐＨ５．０にコントロールしながら、ま
た、撹拌回転数を初発４００ｒｐｍで、溶存酸素量（Ｄ
Ｏ）が３．０〜２１．０％内に入るように回転数を自動
制御しながらメイン培養を行なった。

【００３２】培養終了後、ジャーファメンター内の固形
物を集積し、水洗して培地成分を除去した後、１％Ｎａ
ＯＨ水溶液中で１１０℃、２０分間処理して菌体を除去
した。さらに、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロ
ースを水洗した後、８０℃で１２時間真空乾燥して乾燥
重量を測定した。

【００３３】実施例１ 異なるセルロース生産性酢酸
菌によるセルロース産生に及ぼすメチオニンの添加効果 セルロース生産性酢酸菌としてアセトバクター・スピー
シーズＢＰＲ２００１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６
６）、アセトバクター・キシリナム（ＡＴＣＣ２３７６
８）及びアセトバクター・キシリナム（ＡＴＣＣ２３７
６９）を、また、検討培地として下記組成： フラクトース ４０ｇ／ｌ、 ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．０ｇ／ｌ、 ＭｇＳＯ₄ ０．３ｇ／ｌ、 （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ３ｇ／ｌ、 乳 酸 １．５ｍｌ／ｌ、 メチオニン ０または１００ｍｇ／ｌ、 初 発 ｐＨ ５．０ の培地を用いて、上記フラスコ培養法に従ってメイン培
養を４日間行ない、セルロース蓄積量を評価した。

【００３４】その結果を表１に示した。

【００３５】

【表１】

【００３６】表１の結果から分かるように、培地にメチ
オニンを添加するときには、無添加の場合と比較してセ
ルロース蓄積量が約５倍〜約６倍増大した。３つの菌株
はともに類似したセルロース蓄積量を示したが、その中
でも特にアセトバクター・スピーシーズＢＰＲ２００１
株がより高い蓄積量を与えることが分かった。

【００３７】実施例２ メチオニン以外のアミノ酸添
加効果 アミノ酸としてメチオニンの他にグルタミン酸（１００
ｍｇ／ｌ）、アラニン（１００ｍｇ／ｌ）又はアスパラ
ギン酸（１００ｍｇ／ｌ）を添加した以外は、実施例１
と同様に培養して、セルロース蓄積量に及ぼすメチオニ
ン以外のアミノ酸の添加効果を調べた。

【００３８】その結果を表２に示した（アセトバクター
・スピーシーズＢＰＲ２００１株使用）。

【００３９】

【表２】

【００４０】表２から、アミノ酸としてメチオニンの他
にグルタミン酸、アラニン又はアスパラギン酸を添加し
たときには、セルロース蓄積量は無添加の場合と比べて
約７倍以上増大することが判明した。これらのアミノ酸
はメチオニンと組合わせることによって相乗的効果を発
揮し、メチオニン単独の場合よりも約２０％以上のセル
ロース蓄積量の増加が認められた。他の２種の菌株の場
合にも同様の結果が得られた。この結果はさらに、グル
タミン酸、アラニン又はアスパラギン酸自体セルロース
産生を惹起する能力をもつことを示している。

【００４１】実施例３ セルロース蓄積量に及ぼすメ
チオニン添加量の影響 メチオニンを５，２５，５０，１００，５００，１００
０又は４０００ｍｇ／ｌの添加量で用いた以外は、実施
例１と同様に４日間培養してそれぞれの添加量における
セルロース蓄積量を評価した。

【００４２】その結果を表３に示す（アセトバクター・
スピーシーズＢＰＲ２００１株使用）。

【００４３】

【表３】

【００４４】表３の結果は、メチオニン添加量が約５０
０ｍｇ／ｌまではセルロース蓄積量が漸増するが、さら
にメチオニン添加量を増加してもセルロース蓄積量が頭
打ちになる傾向を示している。

【００４５】実施例４ セルロース生産性酢酸菌のジ
ャーファメンター培養 セルロース生産性酢酸菌としてアセトバクター・スピー
シーズＢＰＲ２００１株を、また検討培地として下記組
成： フラクトース ４０ｇ／ｌ、 ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．０ｇ／ｌ、 ＭｇＳＯ₄ ０．３ｇ／ｌ、 （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ３ｇ／ｌ、 乳 酸 １．５ｍｌ／ｌ、 メチオニン ０又は１００ｍｇ／ｌ、 初 発 ｐＨ ５．０ の培地を用いて、上記ジャーファメンター培養法に従っ
てメイン培養を１５時間又は２５時間行ない、メチオニ
ンの存在又は非存在下でのセルロース蓄積量を評価し
た。

【００４６】その結果を表４に示す。

【００４７】

【表４】

【００４８】表４の結果は、ジャーファメンターを使用
してｐＨ、溶存酸素量等の発酵条件を制御するときに
は、メチオニン無添加の場合でもセルロース産生が向上
するが、メチオニン添加により無添加の場合の約２．５
倍にセルロース蓄積量がさらに向上することを示してい
る。

【００４９】

【発明の効果】本発明方法による発酵法を利用したセル
ロース生産において、メチオニンが培地に少量含有する
だけでセルロース生産性が著しく向上する。このこと
は、本方法がセルロースを効率よくかつ安価に製造でき
ることを示している。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アセトバクター属に属しセルロース性物
   質生産能を有する微生物を、セルロース生成促進因子と
   してのメチオニンをメチオニン無添加の場合よりもセル
   ロース、セルロース性物質産生を有意に向上させる量で
   含有する培地中で培養し、培地中にセルロース、セルロ
   ース性物質を生成蓄積せしめ、該物質を採取することを
   包含するセルロースの製造方法。
2. 【請求項２】 メチオニンが培地中に５〜１０００ｍｇ
   ／ｌ含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 グルタミン酸、アラニン及びアスパラギ
   ン酸から成る群から選択される１種以上のアミノ酸をさ
   らに含有させることを特徴とする請求項１又は２記載の
   方法。