JP3096838B2 - ピリミジンアナログ耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents
ピリミジンアナログ耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アセトバクター属に属
しセルロース性物質を生産する能力を有する微生物（こ
の微生物を以後「セルロース生産性酢酸菌」と称する）
に属するピリミジンアナログ耐性株及び該株を用いるセ
ルロース性物質（バクテリアセルロース：ＢＣ）の製造
方法に関する。
しセルロース性物質を生産する能力を有する微生物（こ
の微生物を以後「セルロース生産性酢酸菌」と称する）
に属するピリミジンアナログ耐性株及び該株を用いるセ
ルロース性物質（バクテリアセルロース：ＢＣ）の製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】セルロース性物質は可食性であり食品分
野で利用されるほか水系分散性に優れているので食品、
化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、
水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳
化安定化助剤としての産業上利用価値がある。また、該
セルロース性物質の離解物はミクロフィブリルの構造的
物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤と
して各種の産業用用途がある。このようなセルロース性
離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾
性率を示すので、ミクロフィブリルの構造的特徴に基づ
くすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材として
の応用がある。
野で利用されるほか水系分散性に優れているので食品、
化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、
水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳
化安定化助剤としての産業上利用価値がある。また、該
セルロース性物質の離解物はミクロフィブリルの構造的
物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤と
して各種の産業用用途がある。このようなセルロース性
離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾
性率を示すので、ミクロフィブリルの構造的特徴に基づ
くすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材として
の応用がある。
【０００３】従来より、アセトバクター属に属する微生
物を培養して、セルロースを生産する方法は知られてい
る。例えば、特開昭６２−２６５９９０号公報、特開昭
６１−２２１２０１号公報等に、その記載がある。セル
ロース生産性酢酸菌の培養を行なう際に適当とされてい
る栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、
燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／Hestri
n 培地（Schramm ら、J. General Biology, 11, pp.123
〜129, 1954 ）が知られている。しかしながら、上記栄
養培地で振盪もしくは通気攪拌培養を行なった場合、得
られるセルロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満
足のいくものではなかった。また、上記栄養培地の他
に、コーンスチープリカー（ＣＳＬ）や麦芽エキス等を
加えた培地が知られているが、これら天然栄養素（ペプ
トン、酵母エキス、ＣＳＬ、麦芽エキスなど）に含まれ
る特定成分がセルロース生成促進に関与していることは
知られていない。培地中の特定栄養素によるセルロース
生成促進因子として、現在知られているものにはイノシ
トール、フィチン酸及びピロロキノリンキノン（ＰＱ
Ｑ）（特公平５−１７１８号公報；高井光男，紙パ技協
誌，第４２巻，第３号，第２３７〜２４４頁）等がある
が、セルロース生成量はまだ不十分であり、またこれら
の振盪もしくは通気攪拌培養における効果も明確ではな
かった。また、本出願人は、カルボン酸又はその塩（特
願平５−１９１４６７号）、インベルターゼ（特願平５
−３３１４９１号）及びメチオニン（特願平５−３３５
７６４号）を培地中に添加することによって、セルロー
ス性物質の生産性が向上することを見い出している。
物を培養して、セルロースを生産する方法は知られてい
る。例えば、特開昭６２−２６５９９０号公報、特開昭
６１−２２１２０１号公報等に、その記載がある。セル
ロース生産性酢酸菌の培養を行なう際に適当とされてい
る栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、
燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／Hestri
n 培地（Schramm ら、J. General Biology, 11, pp.123
〜129, 1954 ）が知られている。しかしながら、上記栄
養培地で振盪もしくは通気攪拌培養を行なった場合、得
られるセルロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満
足のいくものではなかった。また、上記栄養培地の他
に、コーンスチープリカー（ＣＳＬ）や麦芽エキス等を
加えた培地が知られているが、これら天然栄養素（ペプ
トン、酵母エキス、ＣＳＬ、麦芽エキスなど）に含まれ
る特定成分がセルロース生成促進に関与していることは
知られていない。培地中の特定栄養素によるセルロース
生成促進因子として、現在知られているものにはイノシ
トール、フィチン酸及びピロロキノリンキノン（ＰＱ
Ｑ）（特公平５−１７１８号公報；高井光男，紙パ技協
誌，第４２巻，第３号，第２３７〜２４４頁）等がある
が、セルロース生成量はまだ不十分であり、またこれら
の振盪もしくは通気攪拌培養における効果も明確ではな
かった。また、本出願人は、カルボン酸又はその塩（特
願平５−１９１４６７号）、インベルターゼ（特願平５
−３３１４９１号）及びメチオニン（特願平５−３３５
７６４号）を培地中に添加することによって、セルロー
ス性物質の生産性が向上することを見い出している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、セル
ロース生産性酢酸菌を用いて、経済的かつ高収率でセル
ロース性物質を生産させる新たな方法を提供することに
ある。
ロース生産性酢酸菌を用いて、経済的かつ高収率でセル
ロース性物質を生産させる新たな方法を提供することに
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために種々の研究を行なった。特に、ＢＣ
生合成系を強化する為に、ＵＤＰ−Ｇの前駆体であるＵ
ＴＰの生合成系の強化を検討した。５−フルオロウラシ
ル等のピリミジンアナログは図１に示すように、ｄＴＭ
Ｐ合成酵素等のピリミジン合成に関与する酵素を阻害す
ることが知られている。
的を達成するために種々の研究を行なった。特に、ＢＣ
生合成系を強化する為に、ＵＤＰ−Ｇの前駆体であるＵ
ＴＰの生合成系の強化を検討した。５−フルオロウラシ
ル等のピリミジンアナログは図１に示すように、ｄＴＭ
Ｐ合成酵素等のピリミジン合成に関与する酵素を阻害す
ることが知られている。
【０００６】従って、ピリミジンアナログ耐性を有する
変異株はこの拮抗阻害に対抗するためにｄＵＭＰの量が
増加していることが考えられる。即ち、ｄＵＭＰの量が
増加された結果、Ｇｌｎ＋２ＡＴＰ＋ＨＣＯ3 - からの
ＵＴＰ生合成系が強化されている可能性がある訳であ
る。驚くべきことに、各種実験の結果、本発明者は、５
−フルオロウラシル等のピリミジンアナログに耐性を有
するセルロース生産性酢酸菌の変異株が大変優れたセル
ロース性物質の生産性を示すことを見出した。即ち、本
発明は、セルロース生産性酢酸菌に属するピリミジンア
ナログ耐性株、該耐性株を培養し、培地中にセルロー
ス、セルロース性物質を生成蓄積せしめ該物質を採取す
ることから成るセルロース性物質の製造方法及び該製造
方法により得ることのできるセルロース性物質を提供す
る。
変異株はこの拮抗阻害に対抗するためにｄＵＭＰの量が
増加していることが考えられる。即ち、ｄＵＭＰの量が
増加された結果、Ｇｌｎ＋２ＡＴＰ＋ＨＣＯ3 - からの
ＵＴＰ生合成系が強化されている可能性がある訳であ
る。驚くべきことに、各種実験の結果、本発明者は、５
−フルオロウラシル等のピリミジンアナログに耐性を有
するセルロース生産性酢酸菌の変異株が大変優れたセル
ロース性物質の生産性を示すことを見出した。即ち、本
発明は、セルロース生産性酢酸菌に属するピリミジンア
ナログ耐性株、該耐性株を培養し、培地中にセルロー
ス、セルロース性物質を生成蓄積せしめ該物質を採取す
ることから成るセルロース性物質の製造方法及び該製造
方法により得ることのできるセルロース性物質を提供す
る。
【０００７】本発明において使用されるピリミジンアナ
ログ耐性株は、セルロース生産性酢酸菌、例えば、アセ
トバクター・スピーシーズ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐ．）ＢＰＲ２００１、アセトバクター・キシリナム
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ２
３７６８、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ２３７
６９、アセトバクターパスツリアヌス（Ａ．ｐａｓｔｅ
ｕｒｉａｎｕｓ）ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバクター
キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクターキシリ
ナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター・キシリナ
ムＡＴＣＣ１０８２１等、並びにそれらの菌株より各種
突然変異処理及び遺伝子組み換え技術などによって誘導
・育種して得られた菌株等にＮＴＧ（ニトロソグアニジ
ン）を用いて公知の方法によって化学的変異処理するこ
とにより創製することができる。
ログ耐性株は、セルロース生産性酢酸菌、例えば、アセ
トバクター・スピーシーズ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐ．）ＢＰＲ２００１、アセトバクター・キシリナム
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ２
３７６８、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ２３７
６９、アセトバクターパスツリアヌス（Ａ．ｐａｓｔｅ
ｕｒｉａｎｕｓ）ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバクター
キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクターキシリ
ナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター・キシリナ
ムＡＴＣＣ１０８２１等、並びにそれらの菌株より各種
突然変異処理及び遺伝子組み換え技術などによって誘導
・育種して得られた菌株等にＮＴＧ（ニトロソグアニジ
ン）を用いて公知の方法によって化学的変異処理するこ
とにより創製することができる。
【０００８】この中でも、アセトバクター・スピーシー
ズＢＰＲ２００１（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．
ＢＰＲ２００１）株と命名された株の分類学的性質は、
形態は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は陰性、
酸素に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽性、オキ
シダーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成は陽性、
酢酸塩の酸化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性であり、本発
明のピリミジンアナログ耐性株の創製に好適である。従
って、アセトバクター・スピーシーズに属するピリミジ
ンアナログ耐性株が本発明の好ましい態様の一つであ
る。尚、アセトバクター・スピーシーズＢＰＲ２００１
株は、平成５年２月２４日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され
（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後１９９
４年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５４５）に移管されている。
ズＢＰＲ２００１（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．
ＢＰＲ２００１）株と命名された株の分類学的性質は、
形態は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は陰性、
酸素に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽性、オキ
シダーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成は陽性、
酢酸塩の酸化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性であり、本発
明のピリミジンアナログ耐性株の創製に好適である。従
って、アセトバクター・スピーシーズに属するピリミジ
ンアナログ耐性株が本発明の好ましい態様の一つであ
る。尚、アセトバクター・スピーシーズＢＰＲ２００１
株は、平成５年２月２４日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され
（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後１９９
４年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５４５）に移管されている。
【０００９】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. 1, p.297-302
(1988), J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917-2929
(1989)及び FEMS Microbiol Lett., Vol. 71, p.337-34
3 (1990)等に記載されているものがある。従って、当業
者であればこれら公知の方法に基づき本発明のピリミジ
ンアナログ耐性株を得ることができる。本発明のピリミ
ジンアナログ耐性株は他の変異方法、例えば放射線照射
等によっても得ることができる。本発明の一例である５
−フルオロウラシル耐性株であるＢＰＲ３００１Ｉ株は
１９９４年６月１０日付で通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３６２を付されている。
尚、本発明の範囲が寄託されたこの菌株に限定されない
ことは言うまでもない。株は本発明の一具体例にすぎな
いものであり、セルロース生産性酢酸菌に属し、ｄＴＭ
Ｐ合成酵素等のピリミジン合成に関与する酵素の阻害剤
に対して実質的に耐性を示す株であれば、本発明の「セ
ルロース生産性酢酸菌のピリミジンアナログ耐性株」に
包含されるものである。その他の例として、例えば同様
にＢＰＲ２００１株から得られたＢＰＲ３００１Ｇ株、
ＢＰＲ３００１Ｈ株、ＢＰＲ３００１Ｊ株及びＢＰＲ３
００１Ｋ株がある。ピリミジンアナログの他の例として
は、５−フルオロＵＤＰ、５−フルオロＵＤＰ−ガラク
トース、２−アミノ−６−メルカプトウリジン、６−ア
ザウラシル及び６−メルカプトピリミジン等を挙げるこ
とができる。
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. 1, p.297-302
(1988), J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917-2929
(1989)及び FEMS Microbiol Lett., Vol. 71, p.337-34
3 (1990)等に記載されているものがある。従って、当業
者であればこれら公知の方法に基づき本発明のピリミジ
ンアナログ耐性株を得ることができる。本発明のピリミ
ジンアナログ耐性株は他の変異方法、例えば放射線照射
等によっても得ることができる。本発明の一例である５
−フルオロウラシル耐性株であるＢＰＲ３００１Ｉ株は
１９９４年６月１０日付で通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３６２を付されている。
尚、本発明の範囲が寄託されたこの菌株に限定されない
ことは言うまでもない。株は本発明の一具体例にすぎな
いものであり、セルロース生産性酢酸菌に属し、ｄＴＭ
Ｐ合成酵素等のピリミジン合成に関与する酵素の阻害剤
に対して実質的に耐性を示す株であれば、本発明の「セ
ルロース生産性酢酸菌のピリミジンアナログ耐性株」に
包含されるものである。その他の例として、例えば同様
にＢＰＲ２００１株から得られたＢＰＲ３００１Ｇ株、
ＢＰＲ３００１Ｈ株、ＢＰＲ３００１Ｊ株及びＢＰＲ３
００１Ｋ株がある。ピリミジンアナログの他の例として
は、５−フルオロＵＤＰ、５−フルオロＵＤＰ−ガラク
トース、２−アミノ−６−メルカプトウリジン、６−ア
ザウラシル及び６−メルカプトピリミジン等を挙げるこ
とができる。
【００１０】本発明の製造方法に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、ガドニット、グリセリン、
エチレングリコール、エタノール等を単独或いは併用し
て使用することができる。更にはこれらのものを含有す
る澱粉水解物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビ
ート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等
をシュークロスに加えて使用することもできる。また、
窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
等有機或いは無機の窒素源を使用することができ、或い
はＢａｃｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎ
ｅ、Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、豆濃などの含窒素天
然栄養源を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミ
ノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカル
ボキシ−１Ｈピロロ〔２，３−５〕−キノリン−４，５
−ジオンを添加してもよい。生育にアミノ酸等を要求す
る栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄
養素を補添することが必要である。無機塩類としてはリ
ン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガ
ン塩、コバルト塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート
金属類等が使用される。
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、ガドニット、グリセリン、
エチレングリコール、エタノール等を単独或いは併用し
て使用することができる。更にはこれらのものを含有す
る澱粉水解物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビ
ート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等
をシュークロスに加えて使用することもできる。また、
窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
等有機或いは無機の窒素源を使用することができ、或い
はＢａｃｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎ
ｅ、Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、豆濃などの含窒素天
然栄養源を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミ
ノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカル
ボキシ−１Ｈピロロ〔２，３−５〕−キノリン−４，５
−ジオンを添加してもよい。生育にアミノ酸等を要求す
る栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄
養素を補添することが必要である。無機塩類としてはリ
ン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガ
ン塩、コバルト塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート
金属類等が使用される。
【００１１】培養のｐＨは３ないし７に、好ましくは５
付近に制御する。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは
２５〜３５℃の範囲で行う。培養槽に供給する酸素濃度
は１〜１００％、望ましくは２１〜８０％であれば良
い。これら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する
菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得
るものである。本発明の製造方法に於いてピリミジンア
ナログ耐性株を使用することにより、従来の方法と比較
して約六割もセルロース性物質の収率が向上することが
判明した。本発明方法では、培養方法に制限を受けず、
静置、振盪もしくは通気攪拌培養のいずれでもよい。振
盪もしくは通気攪拌下での培養であってもセルロース生
産性に影響を及ぼさないことも本発明方法の特徴の１つ
である。また、いわゆる回分発酵法、フィード回分発酵
法、反復回分発酵法及び連続発酵法のいずれも使用する
ことができる。更に攪拌手段としては従来公知の手段、
例えばインペラー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスの
ポンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等から任意に
選択することができる。
付近に制御する。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは
２５〜３５℃の範囲で行う。培養槽に供給する酸素濃度
は１〜１００％、望ましくは２１〜８０％であれば良
い。これら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する
菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得
るものである。本発明の製造方法に於いてピリミジンア
ナログ耐性株を使用することにより、従来の方法と比較
して約六割もセルロース性物質の収率が向上することが
判明した。本発明方法では、培養方法に制限を受けず、
静置、振盪もしくは通気攪拌培養のいずれでもよい。振
盪もしくは通気攪拌下での培養であってもセルロース生
産性に影響を及ぼさないことも本発明方法の特徴の１つ
である。また、いわゆる回分発酵法、フィード回分発酵
法、反復回分発酵法及び連続発酵法のいずれも使用する
ことができる。更に攪拌手段としては従来公知の手段、
例えばインペラー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスの
ポンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等から任意に
選択することができる。
【００１２】本発明の方法によって生成されるセルロー
ス性物質はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に
含まれる菌体を始めとするセルロース性物質以外の物質
を取り除く処理をほどこしてもよい。不純物を取り除く
ためには水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄トル
エン及び酢酸エチルなどの極性有機溶媒による処理、次
亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処
理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリ
ル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤によ
る処理、常温から２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独
及び併用してほどこすことによりセルロース性物質から
不純物を除去することができる。このようにして得られ
た本発明でいうセルロース性物質とは、セルロース及
び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及び
β−１，３、β−１，２等のグルカンを含むものであ
る。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、
アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、
五炭糖及び有機酸等である。なおこれ等の多糖が単一物
質である場合もあるし２種以上の多糖が水素結合等によ
り混在してもよい。
ス性物質はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に
含まれる菌体を始めとするセルロース性物質以外の物質
を取り除く処理をほどこしてもよい。不純物を取り除く
ためには水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄トル
エン及び酢酸エチルなどの極性有機溶媒による処理、次
亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処
理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリ
ル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤によ
る処理、常温から２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独
及び併用してほどこすことによりセルロース性物質から
不純物を除去することができる。このようにして得られ
た本発明でいうセルロース性物質とは、セルロース及
び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及び
β−１，３、β−１，２等のグルカンを含むものであ
る。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、
アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、
五炭糖及び有機酸等である。なおこれ等の多糖が単一物
質である場合もあるし２種以上の多糖が水素結合等によ
り混在してもよい。
【００１３】
【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。実施例１ 以下に記載する方法で，ＢＰＲ２００１株を用いて本発
明のピリミジンアナログ耐性株を創製した。ＢＰＲ２００１株の変異処理 菌体をＣＳＬ−Ｆｒｕ培地（１）で２８℃、３時間培養
し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、１０ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、１０μｇＮＴＧ／ｍ
ｌ（１０ｍＭ燐酸緩衝液）中で３０℃、３０分間で変異
処理した。変異処理した菌体を集菌し、前記のように洗
浄し、次にＣＳＬ−Ｆｒｕ培地で２８℃、一夜培養し変
異を固定化した。この結果、生存率約０．２４％で変異
株を得た。ピリミジンアナログ耐性株の取得 上記で変異処理したＢＰＲ２００１株（約４０，０００
コロニー）を最少培地（２）１リットル当たり５ｍｍｏ
ｌの５−フルオロウラシルを含むプレートに塗抹した。
（約３，０００コロニー／プレート）２８℃、７日間培
養し出現したコロニー６７株のうち、５−フルオロウラ
シルに耐性を示し、ＢＣ生産性が向上した２６株を得
た。以下に代表的な株につき、５−フルオロウラシル耐
性の程度を示す。
説明する。実施例１ 以下に記載する方法で，ＢＰＲ２００１株を用いて本発
明のピリミジンアナログ耐性株を創製した。ＢＰＲ２００１株の変異処理 菌体をＣＳＬ−Ｆｒｕ培地（１）で２８℃、３時間培養
し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、１０ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、１０μｇＮＴＧ／ｍ
ｌ（１０ｍＭ燐酸緩衝液）中で３０℃、３０分間で変異
処理した。変異処理した菌体を集菌し、前記のように洗
浄し、次にＣＳＬ−Ｆｒｕ培地で２８℃、一夜培養し変
異を固定化した。この結果、生存率約０．２４％で変異
株を得た。ピリミジンアナログ耐性株の取得 上記で変異処理したＢＰＲ２００１株（約４０，０００
コロニー）を最少培地（２）１リットル当たり５ｍｍｏ
ｌの５−フルオロウラシルを含むプレートに塗抹した。
（約３，０００コロニー／プレート）２８℃、７日間培
養し出現したコロニー６７株のうち、５−フルオロウラ
シルに耐性を示し、ＢＣ生産性が向上した２６株を得
た。以下に代表的な株につき、５−フルオロウラシル耐
性の程度を示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】実施例２ 実施例１で得られた２６株につき、以下の方法で培養を
行ない、ＢＣ蓄積量及び対消費糖収率を求めた。前培養
として、５０mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った２５０ml容
ルーフラスコに菌株を植菌し、２８℃、３日間静置培養
した。次に、ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥
し、この菌液を７５mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った３０
０ml容三角フラスコ（バッフル付き）に７．５ml植菌し
た。２８℃、４日間、１５０rpm で振盪することによっ
て本培養した。この結果、以下に示すように、これらの
５−フルオロウラシル耐性株がＢＰＲ２００１株に較べ
て優れたＢＣ生産性を示すことが判った。
行ない、ＢＣ蓄積量及び対消費糖収率を求めた。前培養
として、５０mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った２５０ml容
ルーフラスコに菌株を植菌し、２８℃、３日間静置培養
した。次に、ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥
し、この菌液を７５mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った３０
０ml容三角フラスコ（バッフル付き）に７．５ml植菌し
た。２８℃、４日間、１５０rpm で振盪することによっ
て本培養した。この結果、以下に示すように、これらの
５−フルオロウラシル耐性株がＢＰＲ２００１株に較べ
て優れたＢＣ生産性を示すことが判った。
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】培地組成 （１）ＣＳＬ−Ｆｒｕ フルクトース ４．０ （％） ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ３．３ ビタミン混合液 １．０ 塩類混合液 １．０ ＣＳＬ（コーンステープリカー） ２．０ ｐＨ ５．０
【００１８】
【表４】 ビタミン混合物 化合物 ｍｇ／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２
【００１９】
【表５】培地組成 （２）最少培地プレート組成 Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０１ （％） ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２５ ＫＣｌ ０．０１ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０１ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．００５ グルタミン酸Ｎａ・Ｈ２Ｏ ０．４ フルクトース ３．０ ｐＨ ５．０ 上記の無機培地１００ml当たり２．０ｇの寒天を加えた
ものをプレートとする。
ものをプレートとする。
【００２０】尚，上の表２中、ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ）
は、培養終了後、培養液中の固形物を集積し、水洗して
培地成分を除去した後、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中で８０
℃、２０分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液
が中性付近になるまで生成セルロースを水洗した後、８
０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで
求めた。また収率（％）は以下のようにして求めた。 対消費糖収率（％）の計算 収率は、対消費糖収率として以下のように計算した。
は、培養終了後、培養液中の固形物を集積し、水洗して
培地成分を除去した後、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中で８０
℃、２０分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液
が中性付近になるまで生成セルロースを水洗した後、８
０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで
求めた。また収率（％）は以下のようにして求めた。 対消費糖収率（％）の計算 収率は、対消費糖収率として以下のように計算した。
【数１】ＹＢＣ＝ＢＣ／（ＲＣＭＦ−ＲＣＢＦ）＊１０
０ ＹＢＣ ：対消費糖収率（％） ＢＣ ：ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ） ＲＣＭＦ：培地の糖濃度（ｇ／ｌ） ＲＣＢＦ：培養後の培地の糖濃度（ｇ／ｌ）
０ ＹＢＣ ：対消費糖収率（％） ＢＣ ：ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ） ＲＣＭＦ：培地の糖濃度（ｇ／ｌ） ＲＣＢＦ：培養後の培地の糖濃度（ｇ／ｌ）
【００２１】
【発明の効果】本発明方法によるセルロース性物質の生
産において、セルロース生産性酢酸菌のピリミジンアナ
ログ耐性株を用いることによって、セルロース性物質の
生産性が従来法と比べて著しく向上する。このことは、
本発明方法がセルロース性物質を効率よくかつ安価に製
造できることを示している。
産において、セルロース生産性酢酸菌のピリミジンアナ
ログ耐性株を用いることによって、セルロース性物質の
生産性が従来法と比べて著しく向上する。このことは、
本発明方法がセルロース性物質を効率よくかつ安価に製
造できることを示している。
【図１】核酸（ピリミジン）合成経路を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 吉永 文弘 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１ 号 株式会社バイオポリマー・リサーチ 内 (56)参考文献 特開 平１−273599（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−308986（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−327669（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/20 C12P 19/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 セルロース生産性酢酸菌に属するピリミ
ジンアナログ耐性株。 - 【請求項２】 セルロース生産性酢酸菌に属する５−フ
ルオロウラシル耐性株。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の耐性株を培養
し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積させ、該物質
を回収することから成る該セルロース性物質の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15820194A JP3096838B2 (ja) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | ピリミジンアナログ耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15820194A JP3096838B2 (ja) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | ピリミジンアナログ耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08260A JPH08260A (ja) | 1996-01-09 |
| JP3096838B2 true JP3096838B2 (ja) | 2000-10-10 |
Family
ID=15666492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15820194A Expired - Fee Related JP3096838B2 (ja) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | ピリミジンアナログ耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3096838B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19990022043A (ko) * | 1996-04-23 | 1999-03-25 | 가부시키가이샤 바이오 폴리머 리서치 | 신규 셀룰로스 생산균 |
-
1994
- 1994-06-17 JP JP15820194A patent/JP3096838B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08260A (ja) | 1996-01-09 |
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