JP2929065B2 - サルファ剤耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents
サルファ剤耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法Info
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Description
しセルロース性物質を生産する能力を有する微生物(こ
の微生物を以後「セルロース生産性酢酸菌」と称する)
に属するサルファ剤耐性株及び該株を用いるセルロース
性物質(バクテリアセルロース:BC)の製造方法に関
する。
野で利用されるほか水系分散性に優れているので食品、
化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、
水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳
化安定化助剤としての産業上利用価値がある。また、該
セルロース性物質の離解物はミクロフィブリルの構造的
物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤と
して各種の産業用用途がある。このようなセルロース性
離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾
性率を示すので、ミクロフィブリルの構造的特徴に基づ
くすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材として
の応用がある。
物を培養して、セルロースを生産する方法は知られてい
る。例えば、特開昭62−265990号公報、特開昭
61−221201号公報等に、その記載がある。セル
ロース生産性酢酸菌の培養を行なう際に適当とされてい
る栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、
燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm/Hestri
n 培地(Schramm ら、J. General Biology, ll, pp.123
〜129, l954 )が知られている。しかしながら、上記栄
養培地で振盪もしくは通気攪拌培養を行なった場合、得
られるセルロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満
足のいくものではなかった。また、上記栄養培地の他
に、コーンスチープリカー(CSL)や麦芽エキス等を
加えた培地が知られているが、これら天然栄養素(ペプ
トン、酵母エキス、CSL、麦芽エキスなど)に含まれ
る特定成分がセルロース生成促進に関与していることは
知られていない。培地中の特定栄養素によるセルロース
生成促進因子として、現在知られているものにはイノシ
トール、フィチン酸及びピロロキノリンキノン(PQ
Q)(特公平5−1718号公報;高井光男,紙パ技協
誌,第42巻,第3号,第237〜244頁)等がある
が、セルロース生成量はまだ不十分であり、またこれら
の振盪もしくは通気攪拌培養における効果も明確ではな
かった。また、本出願人は、カルボン酸又はその塩(特
願平5−191467号)、インベルターゼ(特願平5
−331491号)及びメチオニン(特願平5−335
764号)を培地中に添加することによって、セルロー
ス性物質の生産性が向上することを見い出している。
ロース生産性酢酸菌を用いて、経済的かつ高収率でセル
ロース性物質を生産させる新たな方法を提供することに
ある。
的を達成するために種々の研究を行なった。特に、BC
生合成に関与する酵素の菌体内濃度を増加させるか、又
は該酵素の基質の菌体内濃度を増加させることでBC生
合成能が強化できるのではないかとの考えに基づき、こ
のような酵素を阻害する阻害剤の存在下でも生育するこ
とができるような耐性株をスクリーニングすることで、
所望の酵素又はその基質濃度が増加した菌株を得ようと
試みた。驚くべきことに、各種実験の結果、P−アミノ
安息香酸と拮抗阻害し、BCの前駆体であるUDP−G
lucose(糖核酸)の核酸の生合成に関与する葉酸
の前駆体であるジヒドロプテロイン酸を合成する酵素で
あるジヒドロプテロイン酸シンターゼ(EC2.5.
1.15)の阻害剤の一種であるサルファ剤に対するセ
ルロース生産性酢酸菌の耐性株を取得することにより上
記課題を達成することができたのである。即ち、本発明
は、セルロース生産性酢酸菌に属するサルファ剤耐性
株、該耐性株を培養し、培地中にセルロース、セルロー
ス性物質を生成蓄積せしめ該物質を採取することから成
るセルロース性物質の製造方法及び該製造方法により得
ることのできるセルロース性物質を提供する。
株は、セルロース生産性酢酸菌、例えば、アセトバクタ
ー・スピーシーズ(Acetobacter sp. )BPR200
1、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinu
m )ATCC23768、アセトバクター・キシリナム
ATCC23769、アセトバクターパスツリアヌス
(A.pasteurianus)ATCC10245、アセトバクタ
ーキシリナムATCC14851、アセトバクターキシ
リナムATCC11142及びアセトバクター・キシリ
ナムATCC10821等、並びにそれらの菌株より各
種突然変異処理及び遺伝子組み換え技術などによって誘
導・育種して得られた菌株等にNTG(ニトロソグアニ
ジン)を用いた公知の方法によって化学的変異処理する
ことにより創製することができる。この中でも、アセト
バクター・スピーシーズBPR2001(Acetobacter
sp. BPR2001)株と命名された株の分類学的性質は、形態
は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は陰性、酸素
に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽性、オキシダ
ーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成は陽性、酢酸
塩の酸化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性であり、本発明の
サルファ剤耐性株の創製に好適である。従って、アセト
バクター・スピーシーズに属するサルファ剤耐性株が本
発明の好ましい態様の一つである。尚、アセトバクター
・スピーシーズBPR2001株は、平成5年2月24
日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許
微生物寄託センターに寄託され(受託番号FERM P
−13466)、その後1994年2月7日付で特許手
続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づ
く寄託(受託番号FERM BP−4545)に移管さ
れている。
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988), J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−292
9 (1989) 及び FEMS Microbiol Lett., Vol. 71, p.33
7−343 (1990)等に記載されているものがある。従っ
て、当業者であればこれら公知の方法に基づき本発明の
サルファ剤耐性株を得ることができる。本発明のサルフ
ァ剤耐性株は、他の変異方法、例えば放射線照射等によ
っても得ることができる。本発明で用いることのできる
サルファ剤の例としては、スルフィンキサゾール、スル
ファメチゾール、スルファジメトキシン、スルファモノ
メトキシン、スルファメトキサゾール及びサルファグア
ニジン等がある。この中でもサルファグアニジン(S
G)が好適に用いられる。該サルファ剤耐性株の一例で
あるBPR3001D株は1994年5月25日付で通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物
寄託センターに寄託され、受託番号FERM P−14
330を付されている。尚、本発明の範囲が寄託された
この菌株に限定されないことは言うまでもない。BPR
3001D株は本発明の一具体例にすぎないものであ
り、セルロース生産性酢酸菌に属し、サルファ剤のみな
らずジヒドロプテロイン酸シンターゼを阻害する薬剤に
対して実質的に耐性を示す株であれば、本発明の「セル
ロース生産性酢酸菌に属するサルファ剤耐性株」に包含
されるものである。その他の例として、例えば同様にB
PR2001株から得られたBPR3001E及びBP
R3001F株がある。
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、ガドニット、グリセリン、
エチレングリコール、エタノール等を単独或いは併用し
て使用することができる。更にはこれらのものを含有す
る澱粉水解物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビ
ート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等
をシュークロスに加えて使用することもできる。また、
窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
等有機或いは無機の窒素源を使用することができ、或い
はBact−Peptone、Bact−Soyton
e、Yeast−Extract、豆濃などの含窒素天
然栄養源を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミ
ノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、2,7,9−トリカル
ボキシ−1Hピロロ〔2,3−5〕−キノリン−4,5
−ジオンを添加してもよい。生育にアミノ酸等を要求す
る栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄
養素を補添することが必要である。無機塩類としてはリ
ン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガ
ン塩、コバルト塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート
金属類等が使用される。
付近に制御する。培養温度は10〜40℃、好ましくは
25〜35℃の範囲で行う。培養槽に供給する酸素濃度
は1〜100%、望ましくは21〜80%であれば良
い。これら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する
菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得
るものである。本発明の製造方法に於いてサルファ剤耐
性株を使用することにより、従来の方法と比較してセル
ロース性物質の収率が向上することが判明した。本発明
方法では、培養方法に制限を受けず、静置、振盪もしく
は通気攪拌培養のいずれでもよい。振盪もしくは通気攪
拌下での培養であってもセルロース生産性に影響を及ぼ
さないことも本発明方法の特徴の1つである。また、い
わゆる回分発酵法、フィード回分発酵法、反復回分発酵
法及び連続発酵法のいずれも使用することができる。更
に攪拌手段としては従来公知の手段、例えばインペラ
ー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循
環、及びこれら手段の組合せ等から任意に選択すること
ができる。
ス性物質はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に
含まれる菌体を始めとするセルロース性物質以外の物質
を取り除く処理をほどこしてもよい。不純物を取り除く
ためには水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄トル
エン及び酢酸エチルなどの極性有機溶媒による処理、次
亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処
理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリ
ル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤によ
る処理、常温から200℃の範囲の加熱洗浄などを単独
及び併用してほどこすことによりセルロース性物質から
不純物を除去することができる。このようにして得られ
た本発明でいうセルロース性物質とは、セルロース及
び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及び
β−1,3、β−1,2等のグルカンを含むものであ
る。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、
アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、
五炭糖及び有機酸等である。なおこれ等の多糖が単一物
質である場合もあるし2種以上の多糖が水素結合等によ
り混在してもよい。
説明する。実施例1 以下に記載する方法で、BPR2001株を用いて本発
明のサルファ剤耐性株を創製した。BPR2001株の変異処理 菌体をCSL−Fru培地(1) で28℃、3時間培養
し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM燐酸
緩衝液(pH6.0)で洗浄し、10μgNTG/ml(10
mM燐酸緩衝液)中で30℃、30分間で変異処理した。
変異処理した菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次に
CSL−Fru培地で28℃、一夜培養し変異を固定化
した。この結果、生存率約0.24%で変異株を得た。サルファグアニジン(SG)耐性株の取得 上記で変異処理したBPR2001株(約5000コロ
ニー)を最小培地(2)1ml当たりSG500μgを含む
プレートに塗抹した。(約330コロニー/プレート) 28℃、7日間培養し出現したコロニーのうち、明らか
に生育の悪いもの(コロニーの小さいもの)、BCの生
産の低いもの(副生多糖を多量に生産しコロニーが透明
なもの)を除き、41株を得た。
行ない、BC蓄積量及び対消費糖収率を求めた。前培養
として、50mlCSL−Fru培地の入った250ml容
ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、3日間静置培養
した。次に、ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥
し、この菌液を68mlCSL−Fru培地の入った30
0ml容三角フラスコ(バッフル付き)に7.5ml植菌し
た。28℃、4日間、150rpm で振盪することによっ
て本培養した。この結果、以下に示すように、特にサル
ファ剤耐性株3株がBPR2001株に較べて優れたB
C生産性を示すことが判った。
た物をプレートとする。
は、培養終了後、培養液中の固形物を集積し、水洗して
培地成分を除去した後、1NNaOH水溶液中で80
℃、20分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液
が中性付近になるまで生成セルロースを水洗した後、8
0℃で12時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで
求めた。また収率(%)は以下のようにして求めた。 対消費糖収率(%)の計算 対消費糖収率は、対消費糖収率として以下のように計算
した。
産において、セルロース生産性酢酸菌のサルファ剤耐性
株を用いることによって、セルロース性物質の生産性が
従来法と比べて著しく向上する。このことは、本発明方
法がセルロース性物質を効率よくかつ安価に製造できる
ことを示している。
Claims (3)
- 【請求項1】 セルロース生産性酢酸菌に属するサルフ
ァ剤耐性株。 - 【請求項2】 セルロース生産性酢酸菌に属するサルフ
ァグアニジン耐性株。 - 【請求項3】 請求項1又は2に記載の耐性株を培養
し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積させ、該物質
を回収することから成る、該セルロース性物質の製造方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15172994A JP2929065B2 (ja) | 1994-06-10 | 1994-06-10 | サルファ剤耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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JP15172994A JP2929065B2 (ja) | 1994-06-10 | 1994-06-10 | サルファ剤耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07327669A JPH07327669A (ja) | 1995-12-19 |
JP2929065B2 true JP2929065B2 (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=15525021
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15172994A Expired - Lifetime JP2929065B2 (ja) | 1994-06-10 | 1994-06-10 | サルファ剤耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2929065B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR19990022043A (ko) * | 1996-04-23 | 1999-03-25 | 가부시키가이샤 바이오 폴리머 리서치 | 신규 셀룰로스 생산균 |
-
1994
- 1994-06-10 JP JP15172994A patent/JP2929065B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH07327669A (ja) | 1995-12-19 |
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