KR19990022043A

KR19990022043A - 신규 셀룰로스 생산균

Info

Publication number: KR19990022043A
Application number: KR1019970708522A
Authority: KR
Inventors: 다카야스 추치다; 나오토 도노우치; 아키라 세토; 유키코 고지마; 마사노부 마츠오카; 후미히로 요시나가
Original assignee: 가부시키가이샤 바이오 폴리머 리서치
Priority date: 1996-04-23
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 1999-03-25
Also published as: EP0834555A4; EP0834555B1; EP0834555A1; US6110712A; WO1997040135A1; DE69736581D1; DE69736581T2; US5962278A; JP3341017B2

Abstract

본 발명은, 셀룰로스성 물질을 생산할 능력을 갖는 미생물(이 미생물을 이후 「셀룰로스 생산균」이라고 칭한다.)으로서, 아세트산염 및 유산염의 산화능이 실질적으로 없거나, 또는 미약함을 특징으로 하는 신규한 아종, 및 셀룰로스 생산균을 유도, 육종하여 얻어진 신규한 당 아날로그 내성균주, 아미노산 아날로그 내성균주 및 레반슈크라제 결손균주에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 이들의 신규한 균주를 배양하여, 그 셀룰로스성 물질(이하, 「박테리아 셀룰로스」 또는 「BC」라고 한다.)을 제조하는 방법, 및 그 제조방법에 의해 얻을 수 있는 셀룰로스성 물질에 관한 것이다.

본 발명의 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스 및 셀룰로스 생산균으로부터 유도, 육종하여 얻어진 각종 내성균주 및 레반슈크라제 결손균주를 배양함으로써, 탄소원으로서 특히 슈크로스 또는 글루코스를 사용하여 종래의 BPR2001주를 배양한 경우와 비교하여, 박테리아 셀룰로스를 보다 다량으로 생산할 수 있다.

Description

신규 셀룰로스 생산균

[기술분야]

본 발명은, 셀룰로스성 물질을 생산할 능력을 갖는 미생물(이 미생물을 이후 「셀룰로스 생산균」이라고 칭한다.)로서, 아세트산염 및 유산염의 산화능이 실질적으로 없거나, 또는 미약함을 특징으로 하는 신규한 아종, 및 셀룰로스 생산균을 유도, 육종하여 얻어진 신규한 당 아날로그 내성균주, 아미노산 아날로그 내성균주 및 레반슈크라제 결손균주에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 이들의 신규한 균주를 배양하여, 그 셀룰로스성 물질(이하, 「박테리아 셀룰로스」 또는 「BC」라고 한다.)을 제조하는 방법, 및 그 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 셀룰로스성 물질에 관한 것이다.

[배경기술]

BC는 가식성이고 무미무취이기 때문에, 식품분야에서 이용되는 외에, 수계 분산성이 우수하므로 식품, 화장품 또는 도료 등의 점도의 유지, 식품 원료 성질의 강화, 수분의 유지, 식품안정성 향상, 저칼로리 첨가물 또는 유화안정화 조제로서의 산업상 이용가치가 있다.

BC는 목재 펄프 등으로부터 제조되는 셀룰로스에 비하여, 피브릴의 단편폭이 2자리수 정도나 작은 것을 특징으로 한다.

따라서, BC의 이해물(離解物)은 마이크로 피브릴의 이러한 구조적 물리적 특징에 의거하여 고분자, 특히 수계 고분자용 보강제로서 각종 산업용 용도가 있다. 이와 같은 셀룰로스성 이해물을 종이상 또는 고형상으로 고화한 물질은 높은 인장탄성율을 나타내므로 마이크로 피브릴의 구조적 특징에 의거하는 우수한 기계적 특성이 기대되고, 각종 산업용 소재로서의 응용이 있다.

이와 같은 BC의 생산에 지금까지 사용되어 온 균주에는, 예를 들어, BPR2001주로 대표되는 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·슈크로파멘탄스(Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans), 아세토박터·크실리늄(Acetobacter xylinum) ATCC23768, 아세토박터·크실리늄 ATCC23769, 아세토박터·파스트리아누스(A. pasteurianus) ATCC10245, 아세토박터·크실리늄 ATCC14851, 아세토박터·크실리늄 ATCC11142 및 아세토박터·크실리늄 ATCC10821 등의 아세트산균, 및 그들의 균주로부터 각종 돌연변이처리및 유전자 재조합 기술 등에 의해 유도·육종하여 얻어진 균주, 또한 그들로부터 NTG(니트로소 구아니딘)등을 사용하는 공지 방법에 의해 변이처리하여 제조되는 각종 변이균주가 있다.

이 중에서도, BPR2001주로 명명된 균주의 분류학적 성질은, 형태는 간균, 그램 염색성은 음성, 포자 형성능은 음성, 산소에 대한 태도는 호기성, 카타라제 반응 양성, 옥시다제 반응 음성, 에탄올로부터의 아세트산 생성은 양성, 아세트산염의 산화는 양성, 유산염의 산화는 양성이다. 또한, 이러한 BPR2001주로부터 얻어진 PQQ 비생성균주도 있다. 이러한 PQQ 비생성균주의 일례인 BPR3001c주는 1994년 5월 2일부로 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1반 3고 (우편번호 305)의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어, 수탁번호 FERM P-14297을 부여받고, 그 후 1995년 5월 12일부로 특허 수속상의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하는 기탁(수탁번호 FERM BP-5100)으로 이관되어 있다.

변이균주로는, 예를 들어 레반의 생성이 억제된 레반슈크라제 결손 변이 균주가 있다.

그 밖의 각종 변이균주, 즉, 설파제 내성균주(BPR3001D주; 수탁번호 FERM P-14330, 1994년 5월 25일부), 피리미딘 아날로그 내성균주(BPR3001I주; 수탁번호 FERM P-14362, 1994년 6월 10일부) 및 DHO-DHase 등 저해제 내성균주(BPR3001N주; 수탁번호 FERM P-14361, 1994년 6월 10일부)도, 각각, 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고(우편번호 305)의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어 있다. 또한, 슈크로스 대사에 관한 효소의 유전자에 의해 형질전환된 셀룰로스 생산균(국제공개 WO95/32279)이나, 균체외 인베르타제 유전자 및 분비 유전자에 의해 형질전환된 셀룰로스 생산균(일본국 특허출원 평 7-252021호)도 있다.

또한, BPR2001주는 평성 5년 2월 24일에 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고(우편번호 305)의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되고(수탁번호 FERM P-13466), 그 후 1994년 2월 7일부로 특허수속상의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하는 기탁(수탁번호 FERM BP-4545)으로 이관되어 있다.

본 발명자는, 슈크로스 또는 글루코스 등을 당원으로서 사용하여, BC를 효율 좋고, 보다 다량으로 생산할 수 있는 신규한 셀룰로스 생산균을 개발하기 위하여 여러가지의 연구를 행하고, 이번에 아세트산염 및 유산염의 산화능이 실질적으로 없거나, 또는 미약함을 특징으로 하는 신규한 아종을 밝혀냈다.

또한, 셀룰로스 생산균은 당 등의 탄소원을 취입하고·대사함으로써, 또한 아미노산을 생합성하거나 배지중의 아미노산을 취입하고·대사함으로써 생육·셀룰로스를 생산한다. 따라서 본 발명자들은 셀룰로스 생산성이 향상된 균주를 취득하기 위하여, 당 및 아미노산의 취입·대사의 강화에 착안하여 여러가지의 검토를 행하였다. 그 결과, 노랄ㅂ게도, 어떤 종류의 화합물(당 아날로그 또는 아미노산 아날로그)의 첨가에 의해 생산균의 생육이 저해된다는 것을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자들은 이들의 아날로그에 대한 내성균주를 선택함으로써 더욱 생산성이 향상된 균주를 취득하는 데에 성공하고, 본 발명을 완성시켰다.

그런데, 레반슈크라제(EC 2. 4. 1.10)는 슈크로스를 분해, 대사하는 효소로서 알려져 있다. 그 효소는, ① 슈크로스를 글로코스와 프럭토스를 분해하는 슈크로스 가수분해 활성과, ② 슈크로스로부터 글루코스와 레반을 생성하는 프럭토실 전이활성의 2종의 활성을 갖고 있다. 이 중, 두 번째의 활성은 레반을 부생하므로, BC의 생산상 그다지 바람직하지 않다. 따라서, 이 부생 레반의 축적을 억제할 수 있다면 생산·정제상 보다 유리하다. 본 발명자들은 이미, 일본국 특허 출원 평 7-252021호에 있어서, 레반슈크라제 결손균주를 유도하고, 균체외 인베르타제 또는 레반 생성능이 저하된 레반슈크라제 유전자를 도입함으로써 레반의 축적을 저감하여, 효율적인 셀룰로스 생산을 행하는 것을 개시하고 있다.

[발명의 개시]

따라서, 본 발명은, 아세트산염 및 유산염의 산화능이 실질적으로 없거나 (음성), 또는 미약한 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스(Acetobacter xylinum subsp. nonacetoxidans)에 관한 것이다.

상기한 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스에 속하는 구체적인 균주의 예로서, S-35'-3, 757-3-5-11 및 184-2-2로 명명된 균주가 있고, 이들은, 1996년 4월 12일부로 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고(우편번호 305)의 통산산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어, 각각 수탁번호 FERM P-15563, FERM P-15564, 및 FERM P-15565를 부여받고, 그 후, 1997년 2월 10일부로 특허수속상의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하는 기탁(각각, 수탁번호 FERM BP-5814, FERM BP-5815, 및 FERM BP-5816)으로 이관되어 있다.

또한, 본 발명은 셀룰로스 생산균의 당 아날로그 내성균주 및 아미노산 아날로그 내성균주에 관한 것이다.

여기에서, 「당 아날로그」란 글루코스 등의 탄소원이 되는 물질에 관련 있는 화합물이고, 그 첨가에 의해 당과 경합하여 생산균의 생육 또는 셀룰로스 생산이 저해 억제되는 물질로 정의한다.

따라서, 당 아날로그의 예로는, 2-데옥시-D-글루코스(DG), 6-데옥시-글루코사민, 1-티오-D-글루코스, 5-티오-D-글루코스, 1-메틸-글루코스 및 플로리딘 등을 구체적으로 들 수 있는데, 이들의 물질로 한정되는 것은 아니다.

또한, 「아미노산 아날로그」란 아미노산과 관련있는 화합물이고, 그 첨가에 의해 아미노산과 경합하여 생산균의 생육 또는 셀룰로스 생산이 저해 억제되는 물질로 정의한다.

따라서, 아미노산 아날로그의 예로는, 페닐알라닌, 세린 또는 메티오닌 등의 아미노산의 아날로그인 p-플루오로페닐알라닌, o-메틸세린 또는 에티오닌 등을 구체적으로 들 수 있는데, 이들의 물질로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 신규한 내성균주는, 앞서 서술한 각종 균주, 예를 들어, 본 발명에 관계되는 신규한 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스에 NTG(니트로소 구아니딘)등을 사용하는 공지의 화학적 변이처리 방법에 의해서 제조할 수 있다.

또한, 상기 757-3-5-11주로부터, 동일한 변이수단에 의해 레반슈크라제 결손균주를 유도, 육종하여, 신규한 LD-2주를 얻었다. 이것은 1997년 1월 22일부로 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고(우편번호 305)의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 특허수속상의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하는 기탁이 되어, 수탁번호 FERM BP-5789가 부여되어 있다.

또한, 본 발명은 이들의 신규한 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스 및 각종 내성균주 및 결손균주를 배양함으로써 이루어지는 셀룰로스성 물질의 제조 방법, 및 그 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 셀룰로스성 물질에 관계된다.

본 발명의 신규한 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스는, 꽃 또는 과일 등의 천연 분리원에서 고셀룰로스 생산능을 갖는 아세트산균을 단리하고, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 균주를 스크리닝하여, 해당하는 균주의 균학적 성질을 고정한다고 하는 과정에서 제조된 것이고, 이하의 표 1에 나타난 각 균주의 균학적 성질의 비교로부터, 이들의 균주는 IF015237주나 BPR2001주로 대표되는 종래 공지된 아세토박터·크실리늄속에 속하는 균과 다르고, 아세트산염 및 유산염의 산화능이 실질적으로 없거나(음성), 또는 미약하다는 등의 특징을 갖는 신규한 아종임을 판명하였다.

[표 1]

균학적 성질

NG; 시험배지에 생육하지 않음

본 발명의 제조 방법에 사용할 배지의 조성물 중, 탄소원으로는 슈크로스, 글로코스, 프럭토스, 만니톨, 솔비톨, 갈락토스, 말토스, 에리스릿트, 글리세린, 에틸렌글리콜 및 에탄올 등을 병용하여 사용할 수도 있다. 또한, 이들을 함유하는 전분수해물, 시트라스모라세스, 비트모라세스, 사탕무우즙, 사탕수수즙, 감귤류를 비롯한 과즙 등을 사용할 수도 있다.

또한, 질소원으로는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염, 질산염, 요소 등 유기 또는 무기의 질소원을 사용할 수 있고, 또는 Bact-Peptone, Bact-Soytone, Yeast-Extract, 두농(豆濃) 등의 질소함유 천연 영양원을 사용하여도 좋다. 유기 미량 영양소로서 아미노산, 비타민, 지방산, 헥산, 2, 7, 9-트리카복시-1H피롤로[2, 3-5]-퀴놀린-4, 5-디온을 첨가하여도 좋다.

생육에 아미노산 등을 요구하는 영양 요구성 변이균주를 사용할 경우에는, 요구되는 영양소를 보조 첨가하는 것이 필요하다. 무기염류로는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염, 코발트염, 몰리브덴산염, 적혈염, 칼레이트 금속류 등이 사용된다.

종래부터, 아세토박터속에 속하는 미생물과 같은 셀룰로스 생산균을 배양하여 셀룰로스를 생산하는 방법은 알려져 있고, 본 발명의 제조 방법은, 이하에 예시하는 이들의 종래의 방법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들어, 일본국 특허 공개 소 62-265990호 공보, 일본국 특허 공개 소 63-202394호 공보 및 일본국 특허 공고 평 6-43443호 공보 등에 기재되어 있다. 셀룰로스 생산균의 배양을 행할 때에 적당한 영양배지로는, 탄소원, 펩톤, 효모엑기스, 인산나트륨 및 구연산으로 이루어지는 Schramm/Hestrin 배지(Schramm등, J. General Biology, 11, p. 123~129, 1954)가 알려져 있다.

또한, 상기 영양배지 외에, 콘 스팁 라쿠어(CSL)나 맥아 엑기스 등을 가한 배지가 알려져 있다.

또한, 배지 중의 특정 영양소에 의한 셀룰로스 생성 촉진 인자로서, 현재 알려져 있는 것에는 이노시톨, 피틴산 및 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)(일본국 특허 공고 평 5-1718호 공보; 高井光男, 지파기협지, 제42권, 제3호, 제237~244 페이지) 등이 있다.

또한, 본 출원인은 카르복실산 또는 그의 염(일본국 특허 공개 평 7-39386호), 인베르타제(일본국 특허 공개 평 7-184677호), 메티오닌(일본국 특허 공개 평 7-184675호) 및 사포닌(일본국 특허출원 평 6-214334호)을 배지 중에 첨가함으로써, 셀룰로스성 물질의 생산성이 향상함을 밝혀냈다.

배양의 pH는 3 내지 7로, 바람직하게는 5부근으로 조절한다. 배양온도는 10~40℃, 바람직하게는 25~35℃의 범위에서 행한다. 배양조에 공급하는 산소 농도는 1~100%, 바람직하게는 21~80% 이면 좋다. 이들 배지 중의 각 성분의 조성 비율 및 배지에 대한 균체의 접종 등은 배양 방법에 따라서 당업자가 적당히 선택할 수 있는 것이다.

본 발명의 제조방법에서는, 배양 형식에 제한을 받지 않고, 정치, 진탕 또는 통기교반배양 중 어느 것이어도 좋다. 진탕 또는 통기교반하에서의 배양이어도 셀룰로스 생산성에 영향을 미치지 않는 점도 본 발명 방법의 특징의 하나이다. 또한, 배양 조작 방법에 관해서도, 소위 회분발효법, 유기회분발효법, 반복회분발효법 및 연속발효법 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 또한, 이들 배양 형식, 배양 조작 방법에 적당히 수정 또는 변경을 가한 방법도 사용할 수 있다.

또한 교반수단으로는 종래 공지의 수단, 예를 들어 임펠러, 에어리프트 발효조, 발효브로스의 펌프구동순환, 및 이들 수단의 조합 등에서 임의로 선택할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생성되는 셀룰로스성 물질은 그대로 회수하여도 좋고, 또한 본 물질 중에서 포함되는 균체를 비롯한 셀룰로스성 물질 이외의 물질을 제거하는 처리를 행하여도 좋다.

불순물을 제거하기 위해서는 수세, 가압탄수, 묽은 산세척, 알칼리세척, 차아염소산소다 및 과산화수소 등의 표백제에 의한 처리, 리조팀 등의 균체용해효소에 의한 처리, 라우릴황산소다, 데옥시콜산 등의 계면활성제에 의한 처리, 상온으로부터 200℃의 범위의 가열세척 등을 단독 및 병용하여 행함으로써 셀룰로스성 물질로부터 불순물을 제거할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 본 발명에서 말하는 셀룰로스성 물질이란, 셀룰로스 및, 셀룰로스를 주쇄로 한 헤테로다당을 포함하는 것 및 β-1, 3, β-1, 2 등의 글루칸으 포함하는 것이다. 헤테로다당의 경우의 셀룰로스 이외의 구성성분은 만노스, 프럭토스, 갈락토스, 크실로스, 아라비노스, 라무노스, 클루클론산 등의 6탄당, 5탄당 및 유기산 등이다.

또한 이들 다당이 단일물질인 경우도 있고 2종 이상의 다당이 수소결합등에 의해 혼재하여도 좋다.

[발명의 실시하기 위한 최량의 형태]

이하의 실시예에 의해, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1

아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스의 제조

아세토박터속 세균은, 일반적으로 꽃, 과일 등에 존재함이 알려져 있고 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1984) Vol. 1, p268), 본 균도 이들을 분리원으로서 단리하였다. 우선, 분리원을 살균한 슈람/헤스트린 배지(Biochemical Journal, 58 (1954), 345-352)를 기본으로 하는 액체 배지 [글루코스 20g/ℓ, 효모엑기스 5g/ℓ, 펩톤 5g/ℓ, Na₂HPO₄2.7g/ℓ, 구연산·H₂O 1.2g/ℓ, 에탄올 2㎖/ℓ, 아세트산 5㎖/ℓ, 사이클로헥시미드(항진균제) 100㎎/ℓ, pH 5.0]로 희석하고, 이 희석액을 동일한 액체 배지에 식균하여 집적 배양을 실시한 후, 28℃에서 7일간 정치 배양을 행하고, 베리클 형성이 인정된 컬쳐의 배양 브로스를 희석하며, 상기 배지에 한천 20gℓ을 가한 한천 평판 플레이트에 접동하여 28℃에서 7일간 배양하고, 셀룰로스 생산균 콜로니를 단리하였다. 이 콜로니 중에서, 본 발명의 목적에 적합한 균주를 스크리닝하고, 해당하는 균주의 균학적 성질을 해당 기술분야에 있어서 주지의 표준적 방법에 의해서 동정하였다. 그 결과는 상기 표 1에 나타나 있다.

실시예 2

아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스의 배양에 의한 박테리아 셀룰로스의 제조

(1) 자(jar) 배양

배지:메인 배지 CSL(4%)-슈크로스(4%) 또는

CSL(4%) - 글루코스(4%)

균주:184-2-2, 757-3-5-11, BPR2001

배양 방법:상기 메인 배지 100㎖를 채운 750㎖ 용량의 Roux 플라스크에 상기 균주의 동결보존균액 1㎖를 식균하고, 저온 배양조내에서 28℃에서 3일간 정치배양을 행하였다. 정치배양 종료 후, Roux 플라스크를 잘 진탕하고, 그 내용물을 무균 조건하에서 가제 여과하여 셀룰로스편과 균체를 분리하였다. 얻어진 균액 7.5㎖를 메인 배지 67.5㎖를 채운 300㎖ 용량의 스파이럴 버플 플라스크에 식균하고, 진탕배양기를 사용하여 진폭 2cm, 회전속도 180rpm, 온도 28℃의 조건으로 회전 진탕하면서 3일간 씨드 배양을 행하였다.

배양 종료 후, 플라스크의 내용물을 무균 블렌더에 옮기고, 10,000rpm으로 3분 동안 파쇄 처리를 행하였다. 이 파쇄된 내용물을 씨드 균액으로 하고, 이하의 메인 배양에 사용하였다.

상기 씨드 균액 60㎖를 멸균이 끝난 검토 배지 540㎖를 채운 소형 자파멘타(전체용량 1,000㎖)에 무균적으로 식균하고, 30℃에서 pH를 IN NaOH 또는 IN H₂SO₄로 pH5.0으로 콘트롤하면서, 또한, 교반 회전수를 초발 400rpm으로, 용존산소량(DO)이 3.0~21.0% 내에 들어가도록 회전수를 자동 제어하면서 메인 배양을 행하였다. 그 결과, 얻어진 BC 축적량을 표 2 및 표 3에 나타낸다.

결과:

[표 2]

슈크로스로부터의 BC 축적(배양시간 45 시간)

[표 3]

글루코스로부터의 BC 축적(배양시간 45시간)

(2) 정치배양

배지:메인 배지 CSL(2%)-Suc(4%)

균주:S-35'-3, BPR2001

배양 방법:전배양으로서, 동결보존균액 0.5㎖를 250㎖ 용량의 루 플라스크에 50㎖ 채운 배지에 식균하고, 3일간 28℃에서 정치배양하였다. 배양 후, 그 배양액을 메인 배지로의 식균액으로 하였다.

메인 배양은 250㎖ 용량의 루 플라스크에 45㎖ 채운 배지에 식균액을 5㎖ 식균하였다. 이에 의해 배양 스케일은, 배양 표면적이 75cm², 액심이 0.67cm로 되었다. 이상의 조건으로 메인 배양을 3일간, 28℃에서 정치배양한 결과, 이하의 표 4에 나타나는 것과 같은 BC 축적이 얻어졌다.

[표 4]

[표 5]

CSL-Suc (또는 Glc)배지

(특히 지정되지 않는 한, 슈크로스 또는 글로크스 40g/ℓ, CSL 40 또는 20㎖/ℓ)

[표 6]

비타민 혼합물

실시예 3:당 아날로그 내성균주의 제조

2-데옥시-D-글루코스(DG) 내성의 확인

757-3-5-11주를, 표 10에 나타내는 최소 배지에 각 농도의 DG를 포함하는 플레이트에 도말하였다. 28℃에서 7일간 배양 후, 각 플레이트상의 콜로니 출현수를 관찰하였다.

[표 7]

757-3-5-11주의 DG 함유 플레이트상에서의 콜로니 출현수

757-3-5-11주의 변이처리

균체를 CSL(2%)-Fru 배지(표 11)에서 28℃로 3시간 동안 배양하여 균체를 증식시켰다. 이 전배양액을 집균 후, 10mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 세척하고, 40㎍ NTG/㎖(10mM 인산 완충액)중에서 30℃로 30분 동안 변이처리하였다. 변이처리한 균체를 집균하여, 전술한 바와 같이 세척하고, 다음에 CSL(2%)-Fru 배지에서 28℃로 하룻밤 배양하고 변이를 고정화하였다.

이 결과, 생존율 약 1% 로 변이균주를 얻었다.

당 아날로그(DG) 내성균주의 취득

상기에서 변이처리한 757-3-5-11주(약 4,000 콜로니)를 최소 배지에 DG200mmol/L을 포함하는 플레이트에 도말하였다.(약 170 콜로니/플레이트)

28℃에서 7일간 배양하여 출현 콜로니 중, 109주를 획득하였다.

실시예 4

실시예 3에서 얻어진 109주에 대하여, 이하의 방법으로 배양을 행하고, BC 축적량을 구하였다.

전배양으로서, 50㎖ CSL(2%)-Fru 배지가 들어간 250㎖ 용량의 루 플라스크에 균주를 식균하고, 28℃에서 3일간 정치배양하였다.

(1) 플라스크 배양

루 플라스크를 잘 흔들어 균막으로부터 균제를 벗기고, 이 균액을 68㎖ CSL(2%)-Glc(2%)배지(표 11)가 들어간 300ml 용량의 삼각 플라스크(버플이 붙음)에 7.5㎖ 식균하였다. 28℃에서 3일간, 150rpm으로 진탕함으로써 본배양하였다.

이 결과, 이하의 표 8에 나타내듯이, 특히 DG 내성균주 6주가 친주인 757-3-5-11주에 비하여 더욱 우수한 BC 생산성을 나타냄을 알았다.

이들의 DG 내성균주 중, d-40-3은 1996년 4월 25일부로 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고(우편번호 305)의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어, 수탁번호 FERM P-15603을 부여받고, 그 후 1997년 2월 10일부로 특허수속상의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하는 기탁(수탁번호 FERM BP-5817)으로 이관되어 있다.

[표 8]

DG 내성균주의 BC 생산성의 향상(플라스크 평가)

(2) 자 배양

균주:DG 내성균주(d-40-3), 757-3-5-11

배양 방법:CSL(2%)-Glc 배지 100㎖를 채운 750㎖ 용량의 Roux 플라스크에 상기 균주의 동결보존균액의 각각 1㎖를 식균하고, 항온 배양조내에서 28℃로 3일간 정치배양을 행하였다. 정치배양 종료후, Roux 플라스크를 잘 흔들고, 그 내용물을 무균 조건하에서 가제 여과하여 셀룰로스편과 균체를 분리하였다. 얻어진 균액 7.5㎖를 CSL(2%)-Glc(2%) 배지 67.5㎖를 채운 300㎖ 용량의 스파이랄 버플 플라스크에 식균하고, 진탕 배양기를 사용하여 진폭 2cm, 회전속도 180rpm, 온도 28℃의 조건으로 회전진탕하면서 3일간 씨드 배양을 행하였다.

배양종료 후, 플라스크의 내용물을 무균 블렌더에 옮기고, 10,000rpm으로 3분 동안 파쇄처리를 행하였다. 이 파쇄된 내용물을 씨드 균액으로하여, 이하의 메인 배양에 사용하였다.

상기 씨드 균액 60㎖를 멸균이 끝난 CSL(4%)-Glc(4%) 배지(표 11) 540㎖를 채운 소형 쟈파멘타(전체용량 1,000㎖)에 무균적으로 식균하고, 30℃에서 pH를 암모니아 가스 또는 1N H₂SO₄로 pH 5.0으로 콘트롤하면서, 또한, 교반 회전수를 초발 400rpm으로, 용존산소량(DO)이 3.0~21.0% 내에 들어가도록 회전수를 자동 제어하면서 메인 배양을 행하였다. 그 결과, 얻어진 BC 축적량을 표 9에 나타낸다.

[표 9]

DG 내성균주의 BC 생산성의 향상(자 평가)

[표 10]

최소 배지 플레이트 조성

[표 11]

CSL-Fru(Glc) 배지

[표 12]

염류혼합액

[표 13]

비타민 혼합물

실시예 5:p-플루오로페닐알라닌(PEP) 내성균주

PFP 내성의 확인

184-2-2주를, 표 10에 나타내는 최소 배지에 각 농도의 PFP를 포함하는 플레이트에 도말하였다. 28℃에서 7일간 배양 후, 각 플레이트상의 콜로니 출현수를 관찰하였다.

[표 14]

184-2-2주의 PFP 함유 플레이트상에서의 콜로니 출현수

184-2-2주의 변이처리

균체를 CSL(2%)-Suc 배지(표 23)에서 28℃, 3시간 동안 배양하여, 균체를 증식시켰다. 이 전배양액을 집균 후, 10mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 세척하고, 40㎍ NTG/㎖(10mM 인산 완충액)중에서 30℃, 30분 동안 변이처리하였다, 변이처리한 균체를 집균하여, 전술한 바와 같이 세척하고, 다음에 CSL(2%)-Suc 배지에서 28℃, 하룻밤 배양하여 변이를 고정화하였다.

이 결과, 생존율 약 1%로 변이균주를 얻었다.

PFP 내성균주의 취득

상기에서 변치러한 184-2-2주(약 12,000 콜로니)를 최소 배지에 PFP 1mM을 포함하는 플레이트에 도말하였다. (약 120 콜로니/플레이트)

28℃, 7일 동안 배양하여 출현한 콜로니 중, 62주를 취득하였다.

BC의 생산

이렇게 해서 얻어진 62주에 대하여, 이하의 방법으로 배양을 행하고, BC 축적량을 구하였다.

전배양으로서, 100㎖ CSL(2%)-Suc 배지(표 23)가 들어간 750㎖ 용량의 루 플라스크에 균주를 식균하고, 28℃, 3일 동안 정치배양하였다.

(1) 플라스크 배양

루 플라스크를 잘 흔들어 균막으로부터 균체를 벗기고, 이 균액을 68㎖ CSL(2%)-Suc 배지(표 23)가 들어간 300㎖ 용량의 삼각 플라스크(버플이 붙음)에 7.5㎖ 식균하였다. 28℃, 3일 동안, 150rpm으로 진탕함으로써 본배양하였다.

이 결과, 이하의 표 15에 나타내듯이, 특히 PFP 내성균주 6주가 친주인 184-2-2주에 비하여 더욱 우수한 BC 생산성을 나타냄을 알 수 있다.

이들의 PFP 내성균주 중, BPR-M6은, 1996년 5울 30일부로 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고(우편번호 305)의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어, 수탁번호 FERM P-15657 이 부여되고, 그 후, 1997년 2월 10일부로 특허수속상의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하는 기탁(수탁번호 FERM BP-5820)으로 이관되어 있다.

[표 15]

PFP 내성균주의 BC 생산성의 향상(플라스크 평가)

(2) 자 배양

균주:PFP 내성균주(BPR-M6), 184-2-2

배양 방법:CSL(2%)-Suc 배지(표 23) 100㎖를 채운 750㎖ 용량의 루플라스크에 상기 균주의 동결보존균액의 각각 1㎖를 식균하고, 항온 배양조내에서 28℃로 3일 동안 정치배양을 행하였다. 정치배양 종료 후, 루 플라스크를 잘 흔들고, 그 내용물을 무균 조건하에서 가제 여과하여 셀룰로스편과 균체를 분리하였다. 얻어진 균액 7.5㎖를 CSL(2%)-Suc 배지(표 23) 67.5㎖를 채운 300㎖ 용량의 삼각 플라스크(버플이 붙음)에 식균하고, 진탕 배양기를 사용하여 회전속도 150rpm, 온도 28℃의 조건으로 회전 진탕하면서 3일 동알 씨드 배양을 행하였다.

재양 종료 후, 플라스크의 내용물을 무균 블렌더에 옮기고, 10,000rpm 으로 3분 동안 파쇄처리를 행하였다. 이 파쇄된 내용물을 씨드 균액으로하여, 이하의 메인 배양에 사용하였다.

상기 씨드 균액 60㎖를 멸균이 끝난 CSL(2%)-Suc 배지(표 23) 540㎖를 채운 소형 쟈파멘타(전체용량 1,000㎖)에 무균적으로 식균하고, 30℃, pH를 암모니아 가스 또는 1N H₂SO₄로 pH 5.0으로 콘트롤하면서, 또한, 교반 회전수를 초반 400rpm으로, 용존산소량(DO)이 3.0~21.0% 내에 들어가도록 회전수를 자동 제어하면서 메인 배양을 행하였다. 그 결과, 얻어진 BC 축적량을 표 16에 나타낸다.

[표 16]

PFP 내성균주의 BC 생산성의 향상(자 평가)

실시예 6:o-메틸세린 내성균주

o-메틸세린 내성의 확인

184-2-2주를, 표 10에 나타내는 최소 배지에 각 농도의 o-메틸세린을 포함하는 플레이트에 도말하였다. 28℃, 7일 동안 배양 후, 각 플레이트상의 콜로니 출현수를 관찰하였다.

[표 17]

184-2-2주의 o-메틸세린 함유 플레이트상에서의 콜로니 출현수

184-2-2주의 변이처리

균체를 CSL(2%)-Suc 배지(표 23)에서 28℃, 3시간 동안 배양하여 균체를 증식시켰다. 이 전배양액을 집균 후, 10mM 인산 완충액(ph 6.0)으로 세척하고, 40㎍ NTG/㎖(10mM 인산 완충액)중에서 30℃, 30분 동안 변이처리하였다. 변이처리한 균체를 집균하여, 전술한 바와 같이 세척하고, 다음에 CSL(2%)-Suc 배지(표 23)에서 28℃, 하룻밤 배양하여 변이를 고정화하였다.

이 결과, 생존율 약 1%로 변이균주를 얻었다.

o-메틸세린 내성균주의 취득

상기에서 변이처리한 184-2-2주(약 12,000 콜로니)를 최소 배지에 o-메틸세린 40mM을 포함하는 플레이트 도말하였다.(약 120 콜로니/플레이트)

28℃, 7일 동안 배양하여 출현한 콜로니 중, 60주를 취득하였다.

BC의 생산

이렇게 해서 얻어진 60주에 대하여, 이하의 방법으로 배양을 행하고, BC의 축적량을 구하였다.

전배양으로서, 100㎖ CSL(2%)-Suc 배지(표 23)가 들어간 750㎖ 용량의 플라스크에 균주를 식균하고, 28℃, 3일 동안 정치배양하였다.

(1) 플라스크 배양

이 결과, 이하의 표 18에 나타내듯이, 특히 o-메티리세린 내성균주 7주가 친주인 184-2-2주에 비하여 더욱 우수한 BC 생산성을 나타냄을 알 수 있다.

이들의 o-메틸세린 내성균주 중, BPR-N52는 1996년 5월 30일부로 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고(우편번호 305)의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어, 수탁번호 FERMP-15655가 부여되고, 그 후, 1997년 2월 10일부로 특허수속상의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하는 기탁(수탁번호 FERM BP-5818)으로 이관되어 있다.

[표 18]

o-메틸세린 내성균주의 BC 생산성의 향상(플라스크 평가)

(2) 자 배양

균주:o-메틸세린 내성균주(BPR-N52), 184-2-2

배양 방법:CSL(2%)-Suc 배지 100㎖를 채운 750㎖ 용량의 루 플라스크에 상기 균주의 동결보존균액의 각각 1㎖를 식균하고, 항온 배양조내에서 28℃로 3일 동안 정치배양을 행하였다. 정치배양 종료후, 루 플라스크를 잘 흔들고, 그 내용물을 무균 조건하에서 가제 여과하여 셀룰로스편과 균체를 분리하였다. 얻어진 균액 7.5㎖를 CSL(2%)-Suc(2%) 배지(표 23) 67.5㎖를 채운 300㎖ 용량의 삼각 플라스크(버플이 붙음)에 식균하고, 진탕 배양기를 사용하여 회전속도 150rpm, 온도 28℃의 조건으로 회전 진탕하면서 3일간 씨드 배양을 행하였다.

배양 종료 후, 플라스크의 내용물을 무균 블렌더에 옮기고, 10,000rpm으로 3분 동안 파쇄처리를 행하였다. 이 파쇄된 내용물을 씨드 균액으로 하여, 이하의 메인 배양에 사용하였다.

상기 씨드 균액 60㎖를 멸균이 끝난 CSL(2%)-Suc(4%) 배지(표 23) 540㎖를 채운 소형 쟈파멘타(전체용량 1,000㎖)에 무균적으로 식균하고, 30℃, pH를 암모니아 가스 또는 1N H₂SO₄로 pH 5.0으로 콘트롤하면서, 또한, 교반 회전수를 초발 400rpm으로, 용존산소량(DO)이 3.0~21.0% 내에 들어가도록 회전수를 자동 제어하면서 메인 배양을 행하였다. 그 결과, 얻어진 BC 축적량을 표 19에 나타낸다.

[표 19]

o-메틸세린 내성균주의 BC 생산성의 향상(자 평가)

실시예 7:에티오닌 내성균주의 제조

에티오닌 내성의 확인

757-3-5-11주를, 표 10에 나타내는 최소 배지에 각 농도의 에티오닌을 포함하는 플레이트에 도말하였다. 28℃, 7일 동안 배양 후, 각 플레이트상의 콜로니 출현수를 관찰하였다.

[표 20]

757-3-5-11주의 에티오닌 함유 플레이트상에서의 코롤니 출현수

757-3-5-11주의 변이처리

이 결과, 생존율 약 1%로 변이균주를 얻었다.

에티오닌 내성균주의 취득

상기에서 변이처리한 757-3-5-11주(약 6,000 콜로니)를 최소 배지에 에티오닌 0.2mM을 포함하는 플레이트 도말하였다.(약 60 콜로니/플레이트)

28℃, 7일 동안 배양하여 출현한 콜로니 중, 76주를 취득하였다.

BC의 생산

이렇게 해서 얻어진 76주에 대하여, 이하의 방법으로 배양을 행하고, BC의 축적량을 구하였다.

(1) 플라스크 배양

이 결과, 이하의 표 21에 나타내듯이, 특히 에티오닌 내성균주 7주가 친주인 757-3-5-11주에 비하여 더욱 우수한 BC 생산성을 나타냄을 알 수 있다.

이들의 에티오닌 내성균주 중, BPR-N52는 1996년 5월 30일부로 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고(우편번호 305)의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어, 수탁번호 FERMP-15656가 부여되고, 그 후, 1997년 2월 10일부로 특허수속상의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하는 기탁(수탁번호 FERM BP-5819)으로 이관되어 있다.

[표 21]

에티오닌 내성균주의 BC 생산성의 향상(플라스크 평가)

(2) 자 배양

균주:에티오닌 내성균주(BPR-P35), 757-3-5-11

배양 방법:CSL(2%)-Suc 배지(표 23) 100㎖를 채운 750㎖ 용량의 루 플라스크에 상기 균주의 동결보존균액의 각각 1㎖를 식균하고, 항온 배양조내에서 28℃로 3일 동안 정치배양을 행하였다. 정치배양 종료후, 루 플라스크를 잘 흔들고, 그 내용물을 무균 조건하에서 가제 여과하여 셀룰로스편과 균체를 분리하였다. 얻어진 균액 7.5㎖를 CSL(2%)-Suc(2%) 배지(표 23) 67.5㎖를 채운 300㎖ 용량의 삼각 플라스크(버플이 붙음)에 식균하고, 진탕 배양기를 사용하여 회전속도 150rpm, 온도 28℃의 조건으로 회전 진탕하면서 3일간 씨드 배양을 행하였다.

상기 씨드 균액 60㎖를 멸균이 끝난 CSL(2%)-Suc 배지(표 23) 540㎖를 채운 소형 쟈파멘타(전체용량 1,000㎖)에 무균적으로 식균하고, 30℃, pH를 암모니아 가스 또는 1N H₂SO₄로 pH 5.0으로 콘트롤하면서, 또한, 교반 회전수를 처음 400rpm으로, 용존산소량(DO)이 3.0~21.0% 내에 들어가도록 회전수를 자동 제어하면서 메인 배양을 행하였다. 그 결과, 얻어진 BC 축적량을 표 22에 나타낸다.

[표 22]

에티오닌 내성균주의 BC 생산성의 향상(자 평가)

[표 23]

한편, 염류 혼합액 및 비타민 혼합액은, 각각, 표 12 및 표 13에 기재된 조성의 것을 사용하였다.

실시예 8:레반슈크라제 결손균주의 제조

757-3-5-11주를 상기와 동일한 방법으로 변이처리를 행하고, 표 10의 글로크스를 슈크로스로 바꾼 최소 배지에 도포하였다. 레반을 생성하지 않는 작은 비무코이드상의 콜로니를 후보균주로서 단리하고, 그들내 글루코스-CSL 배지 (표 11)에서 양호하게 셀룰로스를 생산하는 균주 2주(LD-1, LD-2)를 선택하였다.

이들 균주의 CSL-글루코스 및 CSL-슈크로스 배지(표 5)에 있어서의 셀룰로스 생산과 부생 다당의 축적을 표 24에 나타낸다. 또한, 이들의 균주에 관해서 레반슈크라제 활성을 통상의 방법 (H. Yanase 등, Biosci. Biotech. Biochem. 55권, 1383-1390 페이지 (1991년))에 의해 측정한 바, 활성이 검출되지 않고, 이들의 균주가 레반슈크라제 결손균주임을 확인하였다.

[표 24]

레반슈크라제 결숀균주에 의한 글루코스 및 슈크로스로부터의 셀룰로스 생산과 다당축적

이 레반슈크라제 결손균주 LD-2를 숙주주로서 사용하여, 일본국 특허출원 평 7-252021호에 기재된 자이모모나스균 유래의 균체 외 인베르타제 유전자 및 그 분비촉진 유전자를 포함하는 플라스미드 pSAZE3S, 및 고초균 유래의 레반 생성활성이 저하된 레반슈크라제 유전자를 포함하는 플라스미드 pSARH를 도입하였다. 이들 도입균주에 의한 CSL-슈크로스 배지(표 5)에서의 셀룰로스 생산의 예를 표 25에 나타낸다. 이들 레반슈크라제 결손균주에의 유전자 도입에 의해, 슈크로스로부터의 셀룰로스 생산에 있어서 부생의 레반이 현저하게 저감된 균주를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

[표 25]

LD-2주의 유전자 도입에 의한 셀룰로스 생산

실시예 9:플로리딘 내성균주의 취득

실시예 3과 동일한 방법으로 얻어진 친주 d-40-3의 NTG 변이균주로부터, 당 아날로그인 플로리딘에 대하여 내성을 나타내는 균주를 취득(표 26)하고, 그 BC 생산성을 평가(표 27)하였다.

Glc 2%를 포함하는 최소 배지(표 10) 플레이트에, d-40-3은 3000개 세포/플레이트, d-40-3 NTG 변이균주는 4000개 세포/플레이트의 비율로 스프레터하고, 28℃에서 약 1주일 동안 배양한 결과, 이하에 나타내는 결과를 얻었다.

[표 26]

콜리니 출현 상황

표 26으로부터, d-40-3 NTG 변이균주로 5mM 플로리딘 플레이트에 출현한 콜로니로부터 무작위로 100주를 선택하여, 실시예 4와 동일하게 플라스크 배양하였다. 그 결과, 표 27에 나타내듯이, 친주 d-40-3보다 높은 축적을 나타낸 균주로서, e-51, e-61 및 e-87이 얻어졌다.

[표 27]

한편, 본 명세서 중, 셀룰로스량(g/L)은 배양 종료 후, 플라스크내의 고형몰을 집적하고, 수세하여 배지 성분을 제거한 후, 1% NaOH 수용액 중에서 80℃, 20분 동안 처리하여 균체를 제거하였다. 또한, 세척액이 중선부근이 될 때까지 생성 샐룰로스를 수세한 후, 80℃에서 12시간 동안 진공건조시켜 건조 중량을 측정함으로써 구하였다.

또한 수율(%)은 아래와 같이 하여 구하였다.

수율(%)의 계산

수율은, 대 소비 당수율로서 아래와 같이 계산하였다.

Y_BC=BC/(RC_MF-RC_BF)*100

Y_BC:대 소비 당수율(%)

BC:BC 축적량(g/ℓ)

RC_MF:배지의 당농도(g/ℓ)

RC_BF:배양 후의 배지의 당농도(g/ℓ)

[산업상의 이용 분야]

본 발명의 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스 및 셀룰로스 생산균으로부터 유도, 육종하여 얻어진 각종 내성균주 및 레반슈크라제 결손균주를 배양함으로써, 탄소원으로서 특히 슈크로스 또는 글루코스를 사용하여 종래의 BPR2001주를 배양한 경우와 비교하여, 박테리아 셀룰로스를 보다 다량으로 생산할 수 있었다.

Claims

아세트산염 및 유산염의 산화능이 실질적으로 없거나, 또는 미약함을 특징으로 하는 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스 (Acetobacter xylinum subsp. nonacetoxidans).
제1항에 있어서, FERM BP-5814인 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스.
제1항에 있어서, FERM BP-5815인 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스.
제1항에 있어서, FERM BP-5816 아세토박터·크실리늄·서브스피시즈·논아세토옥시단스.
셀룰로스 생산균의 당 아날로그 내성균주.
제5항에 있어서, 셀룰로스 생산균이 제1항 또는 3항에 기재된 세균인 내성균주.
제5항 또는 6항에 있어서, 당이 글루코스인 내성균주.
제7항에 있어서, 당 아날로그가 2-데옥시-D-글루코스인 내성균주.
제8항에 있어서, FERM BP-5817인 내성균주.
셀룰로스 생산균의 아미노산 아날로그 내성균주.
제9항에 있어서, 셀룰로스 생산균이 제1항, 3항 또는 4항에 기재된 세균인 내성균주.
제10항 또는 11항에 있어서, 아미노산이 페닐 알라닌, 세린 또는 메티오닌인 내성균주.
제12항에 있어서, 아미노산 아날로그가 p-플루오로페닐알라닌, o-메틸세린 또는 에티오닌인 내성균주.
제13항에 있어서, FERM BP-5818인 내성균주.
제13항에 있어서, FERM BP-5819인 내성균주.
제13항에 있어서, FERM BP-5820인 내성균주.
제1항 또는 3항에 기재된 셀룰로스 생산균의 레반슈크라제 결손균주.
제17항에 있어서, FERM BP-5789인 결손균주.
제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 기재된 셀룰로스 생산균을 배양함으로써 이루어지는 셀룰로스성 물질의 제조 방법.
제19항에 기재된 제조방법에 의해 얻을 수 있는 셀룰로스성 물질.