JP3005870B2

JP3005870B2 - シュクロース代謝に関する酵素の遺伝子によって形質転換されたセルロース生産菌

Info

Publication number: JP3005870B2
Application number: JP7530194A
Authority: JP
Inventors: 尚人外内; 隆康土田; 文弘吉永; 末治堀之内; 輝彦別府; 英司簗瀬; 隆久林
Original assignee: 株式会社バイオポリマー・リサーチ
Priority date: 1994-05-19
Filing date: 1995-05-19
Publication date: 2000-02-07
Anticipated expiration: 2015-02-07

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、セルロース性物質を生産する能力を有する
微生物（この微生物を以後「セルロース生産菌」と称す
る。）にシュクロース代謝に関する遺伝子を導入するこ
とによって形質転換された菌及び該菌を用いるセルロー
ス性物質（以下、「バクテリアセルロース」又は「BC」
という。）の製造方法に関する。

背景技術 BCは可食性であり無味無臭である為、食品分野で利用
されるほか、水系分散性に優れているので食品、化粧品
又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、水分の
保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳化安定
化助剤としての産業上利用価値がある。

BCは木材パルプ等から製造されるセルロースに較べ、
フィブリルの断片幅が２桁程度も小さいことを特徴とす
る。

従って、BCの離解物はミクロフィブリルのかかる構造
的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補助剤
として各種の産業用用途がある。このようなセルロース
性離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張
弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的特徴に基づ
くすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材として
の応用がある。

従来より、アセトバクター属に属する微生物のような
セルロース生産菌を培養して、セルロースを生産する方
法は知られている。例えば、特開昭62−265990号公報、
特開昭63−202394号公報及び特公平６−43443号公報等
に、その記載がある。セルロース生産菌の培養を行なう
際に適当とされている栄養培地としては、炭素源、ペプ
トン、酵母エキス、燐酸ナトリウム及びクエン酸からな
るSchramm/Hestrin培地（Schrammら,J.General Biolog
y,11,pp.123〜129,1954）が知られている。しかしなが
ら、上記栄養培地で振盪もしくは通気攪拌培養を行なっ
た場合、特に安価な糖源であるシュクロースを用いた場
合に、得られるセルロース生産量は低く、生成速度も必
ずしも満足のいくものではなかった。

また、上記栄養培地の他に、コーンスチープリカー
（CSL）や麦芽エキス等を加えた培地が知られている
が、これら天然栄養素（ペプトン、酵母エキス、CSL、
麦芽エキスなど）に含まれる特定成分がセルロース生成
促進に関与していることは知られていない。

培地中の特定栄養素によるセルロース生成促進因子と
して、現在知られているものにはイノシトール、フィチ
ン酸及びピロロキノリンキノン（PQQ）（特公平５−171
8号公報；高井光男，紙パ技協誌，第42巻，第３号，第2
37〜244頁）等があるが、セルロース生成量はまだ不十
分であり、またこれらの振盪もしくは通気攪拌培養にお
ける効果も明確ではなかった。

また、本出願人は、カルボン酸又はその塩（特願平５
−191467号）、インベルターゼ（特願平５−331491
号）、メチオニン（特願平５−335764号）及びサポニン
（特願平６−214334号）を培地中に添加することによっ
て、セルロース性物質の生産性が向上することを見い出
している。更にPQQ非生成株（特願平６−127994号）、
サルファ剤耐性株（特願平６−151729号）、ピリミジン
アナログ耐性株（特願平６−158201号）及びDHO−DHase
等阻害剤耐性株（特願平６−167573号）を用いてセルロ
ース性物質の生産性が向上することも見い出されてい
る。又、特表平４−503456号公報には、セルロースシン
ターゼオペロン由来の少なくとも一種の遺伝子を酢酸菌
に導入してセルロース生産を高める方法が記載されてい
る。

本発明の目的は、セルロース生産菌を用いて、安価な
糖源であるシュクロースから経済的かつ高収率でセルロ
ース性物質を生産させる新たな方法を提供することにあ
る。

本発明者らは、上記の目的を達成するために種々の研
究を行なった。

その結果、驚くべきことに、シュクロース代謝に関す
る酵素の遺伝子をセルロース生産菌に導入して該菌を形
質転換することにより上記課題を達成することができた
のである。

従って、本発明は、かかる遺伝子によって形質転換さ
れたセルロース生産菌、該菌をシュクロースを含む培地
中で培養し、培地中にセルロース、セルロース性物質を
生成蓄積せしめ該物質を採取することから成るセルロー
ス性物質の製造方法及び該製造方法により得ることので
きるセルロース性物質に係わる。

即ち、本発明は、シュクロース代謝に関する酵素の遺
伝子によって形質転換されたセルロース生産菌に係わ
る。

更に、本発明は、シュクロース代謝に関する酵素の遺
伝子によって形質転換された酢酸菌に属するセルロース
生産菌に係わる。

更に、本発明は、シュクロース代謝に関する酵素の遺
伝子によって形質転換された酢酸菌のPQQ非生成株であ
るセルロース生産菌に係わる。

更に、本発明は、シュクロースホスホリラーゼ、レバ
ンシュクラーゼ変異酵素、シュクロースシンターゼ、又
はシュクロースホスホリラーゼとシュクロースパーミア
ーゼの組み合わせから選ばれた、シュクロース代謝に関
する酵素の遺伝子によって形質転換されたセルロース生
産菌に係わる。

又、本発明は、これらの形質転換されたセルロース生
産菌をシュクロースを含む培地中で培養し、培地中にセ
ルロース性物質を生成蓄積させ、該物質を回収すること
から成る該セルロース性物質の製造方法にも係わる。

又、本発明は、この方法によって得ることのできるセ
ルロース性物質にも係わる。

又、本発明は、シュクロース代謝に関する酵素の遺伝
子を用いてセルロース生産菌の形質転換することによ
る、セルロース性物質の生産性向上方法にも係わる。

上記本発明において形質転換に使用される菌株は、セ
ルロース生産菌、例えば、BPR2001株に代表されるアセ
トバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロ
ファーメンタンス（Acetobacter xylinum subsp.sucrof
ermentans）、アセトバクター・キシリナム（Acetobact
er xylinum）ATCC23768、アセトバクター・キシリナムA
TCC23769、アセトバクター・パスツリアヌス（A.pasteu
rianus）ATCC10245、アセトバクター・キシリナムATCC1
4851、アセトバクター・キシリナムATCC11142及びアセ
トバクター・キシリナムATCC10821等のアセトバクター
属酢酸菌、その他に、アグロバクテリウム属、リゾビウ
ム属、サルシナ属、シュードモナス属、アクロモバクタ
ー属、アルカリゲネス属、アエロバクター属、アゾトバ
クター属及びズーグレア属並びにそれらの菌株より各種
突然変異処理及び遺伝子組み換え技術などによって誘導
・育種して得られた菌株、更にそれらからNTG（ニトロ
ソグアニジン）等を用いる公知方法によって変異処理し
て創製される各種変異株である。

この中でも、BPR2001株と命名された株の分類学的性
質は、形態は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は
陰性、酸素に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽
性、オキシダーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成
は陽性、酢酸塩の酸化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性であ
り、本発明の形質転換菌の創製に好適でる。更に、かか
るBPR2001株から得られたPQQ非生成株を宿主細胞として
用いるとより好ましい。かかるPQQ非生成株の一例であ
るBPR3001c株は1994年５月２日付で通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄
託され、受託番号FERM Ｐ−14297を付され、その後199
5年５月12日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号FERM BP−51
00）に移管されている。

その他、前述した各種変異株、即ち、サルファ剤耐性
株（BPR3001D株；受託番号FERM Ｐ−14330,1994年５月
25日付）、ピリミジンアナログ耐性株（BPR3001I株；受
託番号FERM Ｐ−14362,1994年６月10日付）及びDHO−D
Hase等阻害剤耐性株（BPR3001N株；受託番号FERM Ｐ−
14361,1994年６月10日付）も、夫々、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに
寄託され、本発明に於いて、宿主細胞として用いること
ができる。

尚、BPR2001株は、平成５年２月24日に通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センタ
ーに寄託され（受託番号FERM Ｐ−13466）、その後199
4年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号FERM BP−45
45）に移管されている。

本明細書中、「シュクロース代謝に関する酵素」と
は、セルロース生産菌の培養糖源としてシュクロースを
用いた場合に、そのシュクロースに作用して該菌による
セルロース生合成に影響を与える酵素を意味する。その
例としては、例えば、シュクロースホスホリラーゼ、レ
バンシュクラーゼ、インベルターゼ、シュクロースパー
ミアーゼ、シュクロースシンターゼ及びシュクロースホ
スホトランスフェラーゼ等を挙げることができる。これ
ら酵素の由来は問わず、広く、微生物、植物及び動物に
求めることができる。

シュクロースホスホリラーゼ（EC2.4.1.7）は種々の
微生物に於いてその存在が知られており、例えば、リュ
ーコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mese
nteroides）（Kogad,B.O.,他,Biokhimiya,7.93−108（1
942））、シュードモナス・サッカロフィラ（Pseudomon
as saccharophila）（Doundaroff,M.,J.Biol.Chem.,15
1,351−361（1943））、及びシュードモナス・プトレフ
ァシエンス（P.putrefaciens）（Weimberg,R.他,J.Bact
eriol.,68,381−388（1954））等にこの酵素に関する記
載がある。

更に、リューコノストック・メセンテロイデス由来の
シュクロースホスホリラーゼ遺伝子についてはすでにク
ローニングもされ、その塩基配列も決定されている（Sa
toshi,K.,他,J.Ferment.Bioeng.,Vol.73,No.3,179−184
（1992））。

リューコノストック・メセンテロイデスはATCC12291
で寄託されており当業者には容易に入手可能である。従
って、この菌を出発材料として用いて、上記文献の記載
に従い、シュクロースホスホリラーゼ遺伝子を取得する
ことができる。

即ち、上記出発材料微生物からフェノール処理によっ
て染色体DNAを調製する。次に該染色体DNAを制限酵素
（例えばEcoR I又はSau3AI）で切断し、同様な制限酵素
で消化したプラスミド（例えばpBR322）に連結する。こ
のプラスミドを適当な大腸菌（例えばE.coliDH1）に形
質転換し、アンピシリン含有培地で培養する。

シュクロースホスホリラーゼのＮ末端の６つのアミノ
酸配列（Met−Glu−Ile−Gln−Asn−Lys）に基づいて適
当なオリゴヌクレオチドプローブを作成する。このプロ
ーブを例えば放射性標識し、前記培養したコロニーとハ
イブリダイゼーションさせ、サザン・ブロッティングを
行ない、イン−ビトロパッケージング、エンドヌクレア
ーゼによる消化及びジデオキシ鎖終結法等による塩基配
列の決定を行なうことができる。

また、J.Ferment.Bioeng.,Vol.73,No.3,179−184（19
92）には該遺伝子の塩基配列が記載されている訳である
から、この情報に基づいて当業者であれば、合成DNAを
作成し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR法）によって遺伝
子断片を増幅し取得したり、化学合成法によってシュク
ロースホスホリラーゼ遺伝子を得ることも容易である。

また、レバンシュクラーゼ（EC2.4.1.10）もシュクロ
ースを分解、代謝する酵素として知られている。該酵素
は、シュクロースをグルコースとフラクトースに分解
するシュクロース加水分解活性と、シュクロースから
グルコースとレバンとを生成するフルクトシル転移活性
の２種の活性を有している。このうち、二番目の活性は
レバンを副生する為に、BCの生産上あまり好ましくな
い。

通気嫌気性のグラム陰性桿菌であるZymomonas mobili
s由来のレバンシュクラーゼはすでに精製されその諸性
質も解明され、更に、その遺伝子配列も決定されている
（Yanase,H.,他,Biosci,Biotech,Biochem.,56,1335−13
37（1992）及び生物工学誌第71巻，第３号,179−191,19
93）。

また、亜硝酸等の化学剤処理又は部位特異的突然変異
によって、上記２種の活性が変化し、野性型酵素に比べ
て、糖転移活性が高くなった変異型酵素、加水分解
活性が高くなった変異型酵素、及び加水分解活性と糖
転移活性がともに低下した変異型酵素の各遺伝子も取得
されている（前掲）。

この中で、今回、発明者等はフルクトシル転移活性に
関与する領域に変異を有する変異型酵素であって、フル
クトシル転移活性を減少させるとともに、シュクロース
加水分解活性が著しく増大した変異型酵素を新たに創製
し、その遺伝子構造を明らかにした。

更に、シュクロースシンターゼ（EC2.4.1.13）及びシ
ュクロースパーミアーゼ遺伝子も、後述するように、そ
の存在及び塩基配列が知られており、本発明に有利に使
用することができる。

こうして得られるシュクロース代謝に関する酵素の遺
伝子類は、それらのうちの一種又は二種以上を組み合わ
せて、適当なベクターを用いるか、又は直接宿主染色体
中に組入れるかして、宿主細胞内に導入し、セルロース
生産菌を形質転換することができる。形質転換の手段と
しては、電気パルス法、リン酸カルシウム法等の従来公
知の如何なる方法も適宜使用することが出来る。

本発明の目的に使用することができるベクターの例と
しては、特開平１−199580号公報に記載されているアセ
トバクター・アセチ・サブスピーシーズ・キシリナム
IFO.3288株が保有する７つのベクターの他に、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA,Vol.87,pp.8130−8134（1990）及び特
表平４−503456号公報に記載されているものを挙げるこ
とができる。

更に、酢酸菌プラスミドの遺伝子組み換え操作を行な
う際に、酢酸菌内のみならず他の宿主細胞、例えば大腸
菌内でも複製可能なプラスミドベクター（以下、「シャ
トルベクター」という。）を使用することが出来れば大
変便利である。

このようなシャトルベクターの例として、前記特開平
１−199580号及びBIOTECHNOLOGY LETTERS,Vol.14,No.7
（July,1992）,pp.539−542に幾つか報告されている。
また前記特表平４−503456号公報第７頁右下欄第15行〜
第８頁左上欄第２行にも本発明で使用し得るシャトルベ
クターの例が記載されている。

その他にも、本発明者等が開発したシャトルベクター
pSA19（外内他,Bioscience,Biotechnology and Biochem
istry,58巻,1899頁（1994年））,pSA7及びpK5も、前記B
PR2001株が保有する内在性プラスミドpAH4とpUC18等の
大腸菌株由来のプラスミドから構築されたシャトルベク
ターとして本発明に好適に使用し得るものである（PCT/
JP94/00315）。なお、これらのプラスミドを保持する大
腸菌JM105株、即ち、pSA19、pSA7及びpK5も上記特許微
生物寄託センターに平成５年２月24日付で寄託されてお
り、その受託番号はそれぞれFERM Ｐ−13469、FERM
Ｐ−13468、FERM Ｐ−13467であり、これらはその後、
1994年２月７日付でブダペスト条約に基づく寄託に移管
され、夫々、受託番号、FERM BP−4548、FERM BP−45
47及びFERM BP−4546が付されている。

本発明の製造方法に用いる培地の組成物中、炭素源と
してはシュクロースを含み、グルコース、フラクトー
ス、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、マル
トース、エリスリット、グリセリン、エチレングリコー
ル及びエタノール等を併用して使用することもできる。
更にはこれらのものを含有する澱粉水解物、シトラスモ
ラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾
汁、柑橘類を始めとする果汁等をシュクロースに加えて
使用することもできる。

また、窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸
塩、尿素等有機或いは無機の窒素源を使用することがで
き、或いはBact−Peptone、Bact−Soytone、Yeast−Ext
ract、豆濃などの含窒素天然栄養源を使用してもよい。
有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、2,7,9−トリカルボキシ−1Hピロロ〔2,3−５〕−キ
ノリン−4,5−ジオンを添加してもよい。

生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用
する場合には、要求される栄養素を補添することが必要
である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、
カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト塩、モリブ
デン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用される。

更に、前述のセルロース生成促進因子を適宜培地中に
添加することもできる。培養のpHは３ないし７に、好ま
しくは５付近に制御する。培養温度は10〜40℃、好まし
くは25〜35℃の範囲で行う。培養槽に供給する酸素濃度
は１〜100％、望ましくは21〜80％であれば良い。これ
ら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する菌体の接
種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得るもので
ある。

本発明方法では、培養形式に制限を受けず、静置、振
盪もしくは通気攪拌培養のいずれでもよい。振盪もしく
は通気攪拌下での培養であってもセルロース生産性に影
響を及ぼさないことも本発明方法の特徴の１つである。
また、培養操作方法についても、いわゆる回分発酵法、
流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法のいず
れも使用することができる。更に、これら培養形式、培
養操作方法に適宜、修正又は変更を加えた方法も使用す
ることができる。

更に攪拌手段としては従来公知の手段、例えばインペ
ラー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循
環、及びこれら手段の組合せ等から任意に選択すること
ができる。

本発明の方法によって生成されるセルロース性物質は
そのまま回収してもよく、さらに本物質中に含まれる菌
体を始めとするセルロース性物質以外の物質を取り除く
処理をほどこしてもよい。

不純物を取り除くためには水洗、加圧脱水、希酸洗
浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素な
どの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵素
による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸な
どの界面活性剤による処理、常温から200℃の範囲の加
熱洗浄などを単独及び併用してほどこすことによりセル
ロース性物質から不純物を除去することができる。

このようにして得られた本発明でいうセルロース性物
質とは、セルロース及び、セルロースを主鎖としたヘテ
ロ多糖を含むもの及びβ−1,3、β−1,2等のグルカンを
含むものである。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の
構成成分はマンノース、フラクトース、ガラクトース、
キシロース、アラビノース、ラムノース、グルクロン酸
等の六炭糖、五炭糖及び有機酸等である。

なおこれ等の多糖が単一物質である場合もあるし２種
以上の多糖が水素結合等により混在してもよい。

図面の簡単な説明図１は、シュクロースホスホリラーゼ遺伝子を含む形
質転換用プラスミドの作成過程を示す。

発明を実施するための最良の形態以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明す
る。

実施例１シュクロースホスホリラーゼ遺伝子によって
形質転換されたセルロース生産性酢酸菌の創製導入プラスミドの作成公知のリューコノストック・メセンテロイデスATCC12
291株のシュクロースホスホリラーゼ遺伝子の塩基配列
をもとに、以下の合成DNA2種類を作成した。

１ GTACTGCAGATTATCGCAATCGTTACAG ２ CCGAAGCTTTTGAACAGTGAGT この合成DNAをプライマーとして用い、Murray,M.G.an
d Thompson,W.F.Nuol,Acids Res.8,4321−4325（1980）
の方法により調製した同株のDNAを鋳型として用い、通
常の条件でPCR法を行ったところ、シュクロースホスホ
リラーゼ遺伝子を含む約1.8KbのDNA断片が増幅した。こ
のDNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分離、回収
し、Pst I、Hind IIIで切断した後、pUC18プラスミド
（Yanisch−Perron,C.他,Gene 33,103−119（1985））
のPst I、Hind III切断物とライゲーションし、大腸菌J
M109株に形質転換して、シュクロースホスホリラーゼ遺
伝子を含む形質転換株を選択した。この株からプラスミ
ドを調製し、Hind III切断後、先に開発したシャトルベ
クターpSA19のHind III切断物とライゲーションし、大
腸菌JM109株に形質転換して、シュクロースホスホリラ
ーゼ遺伝子およびpAH4由来配列を含む形質転換株を選択
した。その株のプラスミドをpSASPと命名し、該株より
再度プラスミドを調製した。

以上の作成過程を図１に示した。

形質転換このプラスミドpSASPを用いて、以下の様にBPR2001株
を形質転換した。BPR2001株を0.1％セルラーゼを含むYP
D培地で培養し、遠心分離により集めた菌体を10％スク
ロース溶液で洗浄した後再度10％スクロース溶液に懸濁
し、プラスミドDNAと混合して島津細胞融合装置SSH−10
（島津製作所）を用いて、1400Vの電気パルスを20回印
加し、電気パルス法により形質転換を行った。その結
果、アンピシリン耐性株が得られた。こうして、得られ
た形質転換株菌体の破砕抽出物中のシュクロースホスホ
リラーゼ活性を（Kitao,S.他,J.Ferment.Bioeng.73,179
−184（1992））と同様に測定したところ、0.112U/mg蛋
白の活性が検出された。一方、対照としたBPR2001株の
菌体破砕抽出物中には、活性は検出されなかった。同様
に、pSASPを用いて、BPR3001c株の形質転換株も得た。

実施例２シュクロースホスホリラーゼ遺伝子によって
形質転換されたセルロース生産性酢酸菌によるセルロー
スの生産この創製した形質転換株を用いて、宿主株を対照とし
てセルロースの生産をフラスコ培養によっておこなっ
た。

フラスコ培養による培養条件は以下のとおりである。

・フラスコ培養グリセロールストックより培地100mlを仕込んだ750ml
容ルーフラスコに植菌し28℃で３日間静置培養した。培
養後ルーフラスコをよく振って菌体をセルロース膜より
はがした後、菌液12.5mlを112.5mlの培地を含む500ml縦
型バッフルフラスコに植菌し、28℃、180rpm、４日間培
養した。培地は、CSL−Sucを用いた。

CSL−Suc培地成分最終濃度（mM）（NH₄）₂SO₄ 25 KH₂PO₄ 7.3 MgSO₄ 1.0 FeSO₄ 0.013 CaCl₂ 0.10 Na₂MoO₄ 0.001 ZnSO₄ 0.006 MnSO₄ 0.006 CuSO₄ 0.0002 ビタミン混合物（下記） 10ml/ 炭素源適量 CSL 適量消泡剤 0.01v/v％最終pH＝5.0±0.2 （特に指定しない限り、シュクロース40g/、CSL 20m
l/）ビタミン混合物化合物 mg/L イノシトール 200 ナイアシン 40 ピリドキシンHCl 40 チアミンHCl 40 パントテン酸カルシウム 20 リボフラビン 20 ｐ−アミノ安息香酸 20 葉酸 0.2 ビオチン 0.2 その結果、BPR2001株においては、セルロース生産量
が1.8g/であったのに対し、シュクロースホスホリラ
ーゼ導入株では2.5g/であり、生産性向上が認められ
た。また、BPR3001c株においては、セルロース生産量が
5.0g/であったのに対し、シュクロースホスホリラー
ゼ導入株では6.5g/であり、生産性向上が認められる
とともに、非常に高いセルロース生産性が得られた。

尚、セルロース量（g/）は、培養終了後、フラスコ
内の固形物を集積し、水洗して培地成分を除去した後、
１％NaOH水溶液中で110℃、20分間処理して菌体を除去
した。さらに、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロ
ースを水洗した後、80℃で12時間真空乾燥して乾燥重量
を測定することで求めた。また収率（％）は以下のよう
にして求めた。

対消費糖収率（％）の計算対消費糖収率は、対消費糖収率として以下のように計
算した。

Y_BC＝BC/（RC_MF−RC_BF）＊100 Y_BC:対消費糖収率（％） BC:BC蓄積量（g/） RC_MF:培地の糖濃度（g/） RC_BF:培養後の培地の糖濃度（g/）実施例３部位特異的突然変異によるレバンシュクラー
ゼ変異酵素の創製 Zymomonas mobilis IFO13756（Z6）株の菌体外レバン
シュクラーゼ遺伝子と菌体外インベルターゼ遺伝子のア
ミノ酸配列を比較した結果、反応特異性を規定している
後半部分において、レバンシュクラーゼの297番目のヒ
スチジン残基に相当する箇所が、インベルターゼではア
スラギン酸であることを見いだした。そこで、そのレバ
ンシュクラーゼ遺伝子の発現プラスミドpUZE2d（平成４
年度日本生物工学大会、講演要旨集20頁）を、GGCATAAG
TCGAATCATGACTGATCGTAという配列を持つ合成オリゴヌク
レオチドをプライマーとして、通常のクンケルの方法
（Kunkel,et al.,Methods in Enzymology,154,367,（19
87））をもちいて部位特異的変異を誘導し、297番目の
ヒスチジン残基をアスパラギン酸残基に置換した変異酵
素遺伝子を含む発現プラスミドH297Dを取得した。

実施例４レバンシュクラーゼ変異酵素の酵素活性の測
定得られた変異酵素遺伝子及び野性型酵素遺伝子を夫々
有する発現プラスミドH297D及びpUZE2dで大腸菌株を従
来公知の方法で形質転換し、これを培養し、遠心により
菌体を集め、20mMリン酸緩衝液で洗浄し、粗酵素画分を
溶出した。

レバンシュクラーゼの活性を以下の方法で測定した。
すなわち、シュクロース加水分解活性は、10％シュクロ
ース、0.1M酢酸緩衝液（pH5.0）中で、30度で酵素反応
を行い、得られた還元糖をSomogy−Nelson法（Tanaka e
t al.,Agric.Biol.Chem.42,323−326（1978））で定量
した。活性の単位は、１分間に１μmolのグルコース相
当量を産生する酵素量と定義した。一方、フルクトシル
基転移活性は、シュクロースから得られたグルコースと
フルクトースを、グルコース−フルクトースＦキット
（Boehringer Manheim,GmBH）でおのおの定量すること
により測定した。

その結果、野生型酵素の場合は、シュクロース加水分
解活性が7.0U/mg pr.、転移活性が18.3％であったのに
対し、造成された変異型酵素の場合は、シュクロース加
水分解活性が57.6U/mg pr.、転移活性が7.4％であっ
た。

実施例５シュクロースシンターゼ遺伝子によって形質
転換されたセルロース生産性酢酸菌によるセルロースの
生産マング豆（Vigna radiata）をバーミキュライトに植
えて発芽させた幼苗の胚軸の組織よりmRNAを調製し、cD
NAを作成した。20gの胚軸を50mMトリス塩酸塩（pH8.5）
と１％SDSの100mlと、同量の90％フェノールとともに破
砕し、その遠心上層を再びフェノール／クロロホルム
（1:1）で洗浄し、pHを５にあわせた。RNAは0.6倍量の
イソプロパノールとともに−20℃で沈澱させ回収し、少
量の水に溶かして20分の１量の6M塩化リチウムと2.5倍
量のエタノールで再沈澱させ、２回繰り返した。得られ
た精製RNAをオリゴｄ（Ｔ）セルロースクロマトグラフ
ィーによりmRNAを調製した。cDNAはアマシャム社のcDNA
合成キットを用いて作成した。一方、既に報告されてい
るマング豆のシュクロースシンターゼcDNAの塩基配列
（Araiら,Plant Cell Physiology,33巻,503頁（1992
年））をもとに、以下の２種類のDNAオリゴマーを合成
した。

１、GAGGATCCGCCACCATGGCTACCGATCGTTTGACCCG ２、TCTCGGTCGACAAGCCGGTTCCTTCATTTCTTCATCC これらのDNAオリゴマーをプライマーとして用い、マ
ング豆より調製したcDNAからPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）によりシュクロースシンターゼ遺伝子を増幅した。
増幅されたDNAを制限酵素BamH IおよびSal Iで処理し
た。得られた断片を大腸菌とセルロース生産菌のシャト
ルベクターpSA19（Tonouchiら,Bioscience,Biotechnolo
gy,and Biochemistry,58巻,1899頁（1994年））のBamH
I、Sal I分解物と連結し、大腸菌JM109株を形質転換し
て目的のプラスミドを持つ形質転換株を選択した。

この株よりプラスミドを回収し、実施例１と同様の方
法でセルロース生産菌アセトバクター・キシリナム・サ
ブスピーシーズ・シュクロファーメンタンスBPR2001株
を形質転換した。その後、実施例２と同様に、セルロー
ス生産をフラスコ培養によって行った。その結果、シュ
クロースシンターゼ導入株では2.6g/であり、生産性
向上が認められた。同様にBPR3001c株について行ったと
ころ、遺伝子導入株では7.0g/であり、生産性向上が
認められるとともに、非常に高いセルロース生産性が得
られた。

実施例６シュクロースホスホリラーゼ遺伝子及びシュ
クロースパーミアーゼによって形質転換されたセルロー
ス生産性酢酸菌によるセルロースの生産大腸菌シュクロースパーミアーゼ遺伝子を含むプラス
ミドpJBLl36（J.Bockmannら,Mol.Gen.Genet.,235巻,22
頁（1992年））を制限酵素EcoR IとSph Iで処理し、T4D
NAポリメラーゼにより末端を平滑化、T4DNAリガーゼに
よりPst Iリンカーを連結後、Pst Iで処理した。アガロ
ースゲル電気泳動によりシュクロースパーミアーゼ遺伝
子を含むDNA断片を分離、回収し、この断片をシュクロ
ースホスホリラーゼ遺伝子を持つシャトルベクターpSAS
PのPst I切断物とT4DNAリガーゼを用いて連結し、大腸
菌JM109株を形質転換して、シュクロースホスホリラー
ゼ遺伝子およびシュクロースパーミアーゼ遺伝子を含む
形質転換株を選択した。この株のプラスミドをpSASPBと
命名し、該株より再度プラスミドを調製した。

このプラスミドを用いて実施例１と同様の方法でセル
ロース生産菌アセトバクター・キシリナム・サブスピー
シーズ・シュクロファーメンタンスBPR2001株を形質転
換した。その後、実施例２と同様に、セルロース生産を
フラスコ培養によって行った。その結果、プラスミド保
持株では2.7g/であり、生産性向上が認められた。同
様にBPR3001c株について行ったところ、遺伝子導入株は
7.4g/であり、生産性向上が認められるとともに、非
常に高いセルロース生産性が得られた。

産業上の利用可能性本発明によるセルロース性物質の製造方法に於いて、
シュクロース代謝に関する酵素の遺伝子によって形質転
換されたセルロース生産菌を用いることによって、従来
と比較してセルロース性物質の収率が約２ないし３割も
増加し、セルロース性物質の生産性が著しく向上する。
即ち、本発明によるセルロース性物質の製造方法によっ
て、セルロース性物質を効率よく経済的に製造すること
が可能となる。

フロントページの続き (72)発明者吉永文弘神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１号株式会社バイオポリマー・リサーチ内 (72)発明者堀之内末治東京都江東区越中島１丁目３番16号 403号 (72)発明者別府輝彦東京都杉並区堀ノ内１丁目５番21号 (72)発明者簗瀬英司鳥取県鳥取市南吉方３丁目361番地大同ハイツ405号 (72)発明者林隆久京都府宇治市五ヶ庄京大職員宿舎544 号 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】シュクロースホスホリラーゼ、シュクロー
スシンターゼ、又はシュクロースホスホリラーゼとシュ
クロースパーミアーゼの組み合わせから選択される酵素
の遺伝子によって形質転換されたアセトバクター属酢酸
菌。
【請求項２】PQQ非生成株である請求項１に記載のアセ
トバクター属酢酸菌。
【請求項３】請求項１又は２に記載されたアセトバクタ
ー属酢酸菌をシュクロースを含む培地中で培養し、培地
中にセルロース物質を生成蓄積させ、該物質を回収する
ことから成る、該セルロース物質の製造方法。