JPH10262683A - 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物 - Google Patents
組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物Info
- Publication number
- JPH10262683A JPH10262683A JP9109996A JP10999697A JPH10262683A JP H10262683 A JPH10262683 A JP H10262683A JP 9109996 A JP9109996 A JP 9109996A JP 10999697 A JP10999697 A JP 10999697A JP H10262683 A JPH10262683 A JP H10262683A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- maltose
- recombinant
- dna
- phosphorylase
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組
換えベクター含む形質転換体、該形質転換体を培養して
組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを製造する方
法、及び該酵素の利用法を提供すること。 【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
る遣伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の内、塩基
番号１８２〜２４５５で表される塩基配列からなるＤＮ
Ａ。 （ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ組換え耐熱性マル
トースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ。
ードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組
換えベクター含む形質転換体、該形質転換体を培養して
組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを製造する方
法、及び該酵素の利用法を提供すること。 【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
る遣伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の内、塩基
番号１８２〜２４５５で表される塩基配列からなるＤＮ
Ａ。 （ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ組換え耐熱性マル
トースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性マルトース
ホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組
換えベクターとその形質転換体、該形質転換体を用いた
組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造方法、及
び該組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを用いたト
レハロース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造法に
関する。
ホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組
換えベクターとその形質転換体、該形質転換体を用いた
組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造方法、及
び該組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを用いたト
レハロース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】トレハロースは、酵母、かび、細菌、昆
虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定
なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３−５００
５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質で
ある。
虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定
なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３−５００
５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質で
ある。
【０００３】従来、トレハロースを調製する方法として
は、酵母からの抽出法（特開平５−２９２９８６）、細
菌による発酵法（特開平５−２１１８８２）等が知られ
ている。しかし、これらの方法で調製したトレハロース
は、大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除
去工程が複雑である等の理由から製造コストが高くな
り、非常に高価であるため食品用途には利用することが
できなかった。
は、酵母からの抽出法（特開平５−２９２９８６）、細
菌による発酵法（特開平５−２１１８８２）等が知られ
ている。しかし、これらの方法で調製したトレハロース
は、大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除
去工程が複雑である等の理由から製造コストが高くな
り、非常に高価であるため食品用途には利用することが
できなかった。
【０００４】一方、安価にトレハロースを調製する有効
な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、マ
ルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼ
を用いた同時反応法がある（特公昭６３−６０９９
８）。この方法は２種類のホスホリラーゼがそれぞれマ
ルトースとトレハロースに作用して可逆的に加リン酸分
解しグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生じる
反応を利用したもので、安価な原料であるマルトースに
両酵素を同時に作用させるとトレハロースが生成するも
のである。
な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、マ
ルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼ
を用いた同時反応法がある（特公昭６３−６０９９
８）。この方法は２種類のホスホリラーゼがそれぞれマ
ルトースとトレハロースに作用して可逆的に加リン酸分
解しグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生じる
反応を利用したもので、安価な原料であるマルトースに
両酵素を同時に作用させるとトレハロースが生成するも
のである。
【０００５】これまでに知られているマルトースホスホ
リラーゼとしては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ８２８
７（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７（１２），２８
１３〜２８１９，１９７３）、ラクトバチルス・サンフ
ランシスコ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒ
ａｎｃｉｓｃｏ）（特開平１−９１７７８）、ラクトバ
チルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒ
ｅｖｉｓ）ＤＭＳ２００５４、ＮＣＩＢ８８３６、８５
６１、８５６２、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＭＳ
２０１７４、微工研菌寄第４６２８号、ラクトバチルス
・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅ
ｒｉ）ＤＳＭ２００１６、ラクトバチルス・フエルメン
テユム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔ
ｕｍ）ＤＭＳ２００５２、ストレプトコッカスｓｐｅ
ｃ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）微工
研菌寄第４６２４号、微工研菌寄第４６２５号、微工研
菌寄第４６２６号、微工研菌寄第４６２７号（特公昭６
０−５４０３６）、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏ
ｎａｓ）ＳＨ−３５（日本農芸化学会誌，６９（臨時増
刊号），２８，１９９５）、プロピオニバクテリウム・
フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＫＹ４００２、エ
ンテロコッカス・フェシウデンライヒ（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＡＴＣＣ１０５４１（特
開平７−５９８４）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）ＩＦＯ３１８１
（日本農芸化学会誌，７０，７７３，１９９６）、ロイ
コノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ１２２９
１、ラクトコッカス・ラクチス・サブエスピー・ラクチ
ス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓ
ｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＩＦＯ１２７００７（特開平８−２
８０３８２）、アルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１１６
２４、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ９９６６、ブレビバクテ
リウム・ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．）ＡＪ３１２５、コリネバクテリウム・ゼロシス
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｘｅｒｏｓｉｓ）Ａ
ＴＣＣ３７３、フラボバクテリウム・ｓｐ．（Ｆｌａｖ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ２４６９、ミクロ
コッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔ
ｅｕｓ）ＡＴＣＣ２７２、セラチア・ｓｐ．（Ｓｅｒａ
ｔｉａ ｓｐ．）ＡＪ２４７８、ストレプトマイセス・
フラボビレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖ
ｏｖｉｒｅｎｓ）ＩＦＯ３１９７、キサントモナス・キ
ャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅ
ｓｔｒｉｓ）ＡＪ２７８４（特開平８−２８０３９５）
が生産するものが挙げられる。
リラーゼとしては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ８２８
７（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７（１２），２８
１３〜２８１９，１９７３）、ラクトバチルス・サンフ
ランシスコ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒ
ａｎｃｉｓｃｏ）（特開平１−９１７７８）、ラクトバ
チルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒ
ｅｖｉｓ）ＤＭＳ２００５４、ＮＣＩＢ８８３６、８５
６１、８５６２、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＭＳ
２０１７４、微工研菌寄第４６２８号、ラクトバチルス
・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅ
ｒｉ）ＤＳＭ２００１６、ラクトバチルス・フエルメン
テユム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔ
ｕｍ）ＤＭＳ２００５２、ストレプトコッカスｓｐｅ
ｃ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）微工
研菌寄第４６２４号、微工研菌寄第４６２５号、微工研
菌寄第４６２６号、微工研菌寄第４６２７号（特公昭６
０−５４０３６）、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏ
ｎａｓ）ＳＨ−３５（日本農芸化学会誌，６９（臨時増
刊号），２８，１９９５）、プロピオニバクテリウム・
フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＫＹ４００２、エ
ンテロコッカス・フェシウデンライヒ（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＡＴＣＣ１０５４１（特
開平７−５９８４）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）ＩＦＯ３１８１
（日本農芸化学会誌，７０，７７３，１９９６）、ロイ
コノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ１２２９
１、ラクトコッカス・ラクチス・サブエスピー・ラクチ
ス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓ
ｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＩＦＯ１２７００７（特開平８−２
８０３８２）、アルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１１６
２４、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ９９６６、ブレビバクテ
リウム・ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．）ＡＪ３１２５、コリネバクテリウム・ゼロシス
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｘｅｒｏｓｉｓ）Ａ
ＴＣＣ３７３、フラボバクテリウム・ｓｐ．（Ｆｌａｖ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ２４６９、ミクロ
コッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔ
ｅｕｓ）ＡＴＣＣ２７２、セラチア・ｓｐ．（Ｓｅｒａ
ｔｉａ ｓｐ．）ＡＪ２４７８、ストレプトマイセス・
フラボビレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖ
ｏｖｉｒｅｎｓ）ＩＦＯ３１９７、キサントモナス・キ
ャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅ
ｓｔｒｉｓ）ＡＪ２７８４（特開平８−２８０３９５）
が生産するものが挙げられる。
【０００６】これらのマルトースホスホリラーゼの内、
酵素化学的に酵素の特性が調べられているものは、ラク
トバチルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７（Ａｇｒ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７（１２），２８１３〜２８１９，
１９７３）、ラクトバチルス・サンフランシスコ（特開
平１−９１７７８）、プレシオモナスＳＨ−３５（日本
農芸化学会誌，６９（臨時増刊号），２８，１９９
５）、エンテロコッカス・ヒアーＩＦＯ３１８１（日本
農芸化学会誌，７０，７７３，１９９６）、プロピオニ
バクテリウム・フロイデンライビＫＹ４００２（Ｊ．Ｆ
ＥＲＭ．ＢＩＯＥＮＧ．，８２，１７１，１９９６）で
ある。これらの酵素の熱安定性は、高いものでも５０℃
以下と低く、工業的製造条件で利用するのは困難であ
る。
酵素化学的に酵素の特性が調べられているものは、ラク
トバチルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７（Ａｇｒ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７（１２），２８１３〜２８１９，
１９７３）、ラクトバチルス・サンフランシスコ（特開
平１−９１７７８）、プレシオモナスＳＨ−３５（日本
農芸化学会誌，６９（臨時増刊号），２８，１９９
５）、エンテロコッカス・ヒアーＩＦＯ３１８１（日本
農芸化学会誌，７０，７７３，１９９６）、プロピオニ
バクテリウム・フロイデンライビＫＹ４００２（Ｊ．Ｆ
ＥＲＭ．ＢＩＯＥＮＧ．，８２，１７１，１９９６）で
ある。これらの酵素の熱安定性は、高いものでも５０℃
以下と低く、工業的製造条件で利用するのは困難であ
る。
【０００７】一般に、工業的に酵素反応で生産を行う場
合、雑菌汚染の低減の目的から反応温度は５５℃以上の
高温が一般的に採られている。反応温度の高温化は基質
と生産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多
くすることができ、且つ、酵素反応速度が早くなり反応
時間の短縮化ができる等の利点があるので、コスト的に
も有利である。このようなことから工業的に使用される
酵素は、一般的には熱安定性の優れたものが選ばれる。
合、雑菌汚染の低減の目的から反応温度は５５℃以上の
高温が一般的に採られている。反応温度の高温化は基質
と生産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多
くすることができ、且つ、酵素反応速度が早くなり反応
時間の短縮化ができる等の利点があるので、コスト的に
も有利である。このようなことから工業的に使用される
酵素は、一般的には熱安定性の優れたものが選ばれる。
【０００８】また、工業的に使用される酵素は、生産コ
ストを下げるためにより安価であることも求められる。
つまり、酵素生産微生物は酵素生産性が高いことを要求
される。
ストを下げるためにより安価であることも求められる。
つまり、酵素生産微生物は酵素生産性が高いことを要求
される。
【０００９】この様な状況に鑑み、本発明者らは高温で
の酵素反応によるトレハロースの製造を行える高い熱安
定性を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼにつき鋭
意探索したところ、好熱性バチルス属細菌が生産するマ
ルトースホスホリラーゼが５５℃以上の温度で使用して
も失活しないことを見出した（特開平９−３７７８
０）。
の酵素反応によるトレハロースの製造を行える高い熱安
定性を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼにつき鋭
意探索したところ、好熱性バチルス属細菌が生産するマ
ルトースホスホリラーゼが５５℃以上の温度で使用して
も失活しないことを見出した（特開平９−３７７８
０）。
【００１０】しかしながら、これらの微生物は酵素の生
産能力が十分でなく、トレハロースやβ−グルコース−
１−リン酸を大量に生産しようとすると、微生物を大量
に培養しなければならないという問題があった。この問
題を解決するためには従来は、微生物の酵素生産能を改
善する煩雑な育種操作を行っていた。具体的には、野生
株を紫外線、エックス線、薬品（ＮＴＧ（Ｎ−メチル−
Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エ
チルメタンスルホネート）等）等を用い人工的変異手段
で変異処理し、酵素生産性の向上した変異株を作製する
といったものである。
産能力が十分でなく、トレハロースやβ−グルコース−
１−リン酸を大量に生産しようとすると、微生物を大量
に培養しなければならないという問題があった。この問
題を解決するためには従来は、微生物の酵素生産能を改
善する煩雑な育種操作を行っていた。具体的には、野生
株を紫外線、エックス線、薬品（ＮＴＧ（Ｎ−メチル−
Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エ
チルメタンスルホネート）等）等を用い人工的変異手段
で変異処理し、酵素生産性の向上した変異株を作製する
といったものである。
【００１１】また、マルトースホスホリラーゼを生産す
る微生物はマルトースホスホリラーゼと同時に少量のマ
ルターゼも生産する場合が多い。このため、マルトース
ホスホリラーゼをトレハロースホスホリラーゼと共にマ
ルトースに作用させてトレハロースを製造する場合や、
マルトースに作用させてβ−グルコース−１−リン酸を
製造する場合、マルトースホスホリラーゼ粗酵素中に混
入しているマルターゼがマルトースを加水分解すること
によってトレハロースやβ−グルコース−１−リン酸の
収量低下が起こる。この問題を解決する方法の一つとし
て、粗酵素を精製してマルターゼを除くことが考えられ
るが、この場合は、酵素生産コストが高くなる問題が生
じる。或いは、別の方法として、人工的に酵素の生産性
や活性を変異させることによって、マルターゼの遺伝子
の発現を抑制したり、マルトースホスホリラーゼ活性だ
けを上げて相対的にマルターゼ活性を抑えるなどの方法
が考えられる。
る微生物はマルトースホスホリラーゼと同時に少量のマ
ルターゼも生産する場合が多い。このため、マルトース
ホスホリラーゼをトレハロースホスホリラーゼと共にマ
ルトースに作用させてトレハロースを製造する場合や、
マルトースに作用させてβ−グルコース−１−リン酸を
製造する場合、マルトースホスホリラーゼ粗酵素中に混
入しているマルターゼがマルトースを加水分解すること
によってトレハロースやβ−グルコース−１−リン酸の
収量低下が起こる。この問題を解決する方法の一つとし
て、粗酵素を精製してマルターゼを除くことが考えられ
るが、この場合は、酵素生産コストが高くなる問題が生
じる。或いは、別の方法として、人工的に酵素の生産性
や活性を変異させることによって、マルターゼの遺伝子
の発現を抑制したり、マルトースホスホリラーゼ活性だ
けを上げて相対的にマルターゼ活性を抑えるなどの方法
が考えられる。
【００１２】そこで、本発明者らも、マルトースホスホ
リラーゼ活性を持つバチルス属の細菌に対して変異処理
を行ったが、思惑とは異なって、マルターゼ活性と共に
マルトースホスホリラーゼ活性も消失した変異株や、マ
ルトースホスホリラーゼ活性と共にマルターゼ活性も上
昇した変異株しか得ることができなかった。このこと
は、マルトースホスホリラーゼの遺伝子とマルターゼの
遺伝子とが、何らかの関連を持って連動している可能性
を示唆すると考えられた。この問題を解決するために
は、偶然に頼る変異処理法ではなく、遺伝子を単離して
塩基配列を解析する遺伝子工学的な方法を採る必要があ
ると考えられた。
リラーゼ活性を持つバチルス属の細菌に対して変異処理
を行ったが、思惑とは異なって、マルターゼ活性と共に
マルトースホスホリラーゼ活性も消失した変異株や、マ
ルトースホスホリラーゼ活性と共にマルターゼ活性も上
昇した変異株しか得ることができなかった。このこと
は、マルトースホスホリラーゼの遺伝子とマルターゼの
遺伝子とが、何らかの関連を持って連動している可能性
を示唆すると考えられた。この問題を解決するために
は、偶然に頼る変異処理法ではなく、遺伝子を単離して
塩基配列を解析する遺伝子工学的な方法を採る必要があ
ると考えられた。
【００１３】一方、現在は、全アミノ酸配列が解明され
ていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単
離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコード
するＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物
や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養す
ることにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できる
ようになった。
ていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単
離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコード
するＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物
や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養す
ることにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できる
ようになった。
【００１４】そこで、かかる状況に鑑み、上記耐熱性酵
素をコードする遺伝子を突き止めてその遺伝子配列を解
析すること、遺伝子を組み込んだ形質転換体により酵素
の生産性や活性を改善することは重要な技術的課題であ
る。
素をコードする遺伝子を突き止めてその遺伝子配列を解
析すること、遺伝子を組み込んだ形質転換体により酵素
の生産性や活性を改善することは重要な技術的課題であ
る。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、組換え耐熱
性マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺
伝子を含む組換えベクター、該組換えベクター含む形質
転換体、該形質転換体を培養して組換え耐熱性マルトー
スホスホリラーゼを製造する方法、及び該酵素の利用法
を提供することを目的とする。
性マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺
伝子を含む組換えベクター、該組換えベクター含む形質
転換体、該形質転換体を培養して組換え耐熱性マルトー
スホスホリラーゼを製造する方法、及び該酵素の利用法
を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、高い熱安
定性を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼを自然界
より探索した結果、目的とする新規な耐熱性マルトース
ホスホリラーゼを好熱性バチルス属細菌が産生すること
を見出し（特開平９−３７７８０号公報）、特に茨城県
の土壌から分離したバチルスｓｐ．ＲＫ−１が強い耐熱
性マルトースホスホリラーゼ産生能を示したことを発見
し、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微
生物寄託センターへ寄託している（ＦＥＲＭ Ｐ−１５
０４４）。
定性を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼを自然界
より探索した結果、目的とする新規な耐熱性マルトース
ホスホリラーゼを好熱性バチルス属細菌が産生すること
を見出し（特開平９−３７７８０号公報）、特に茨城県
の土壌から分離したバチルスｓｐ．ＲＫ−１が強い耐熱
性マルトースホスホリラーゼ産生能を示したことを発見
し、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微
生物寄託センターへ寄託している（ＦＥＲＭ Ｐ−１５
０４４）。
【００１７】そして、更に研究を重ねた結果、本菌株の
耐熱性マルトースホスホリラーゼ遺伝子を単離し、該遺
伝子から構造遺伝子を見つけ、遺伝子工学を利用して、
組換え微生物を作製することによって酵素の生産性が飛
躍的に上昇し、不純物の少ない、高純度の組換え耐熱性
マルトースホスホリラーゼが効率よく調製できることを
見出し、本発明を完成した。
耐熱性マルトースホスホリラーゼ遺伝子を単離し、該遺
伝子から構造遺伝子を見つけ、遺伝子工学を利用して、
組換え微生物を作製することによって酵素の生産性が飛
躍的に上昇し、不純物の少ない、高純度の組換え耐熱性
マルトースホスホリラーゼが効率よく調製できることを
見出し、本発明を完成した。
【００１８】次に、この組換え微生物を培養することに
より、高純度の組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼ
を生産させ、これを利用してトレハロースを製造するこ
とができることを見出した。
より、高純度の組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼ
を生産させ、これを利用してトレハロースを製造するこ
とができることを見出した。
【００１９】すなわち、本発明は、以下のとおりであ
る。
る。
【００２０】１） 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡか
らなる遺伝子。
らなる遺伝子。
【００２１】（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配
列の内、塩基番号１８２〜２４５５で表される塩基配列
からなるＤＮＡ。
列の内、塩基番号１８２〜２４５５で表される塩基配列
からなるＤＮＡ。
【００２２】（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ下記
の酵素化学的性質を有する組換え耐熱性マルトースホス
ホリラーゼをコードするＤＮＡ。
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ下記
の酵素化学的性質を有する組換え耐熱性マルトースホス
ホリラーゼをコードするＤＮＡ。
【００２３】（１）作用 マルトースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リ
ン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグル
コースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコ
ースとグルコース−１−リン酸に作用させると等モルの
マルトースとリン酸を生成する。
ン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグル
コースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコ
ースとグルコース−１−リン酸に作用させると等モルの
マルトースとリン酸を生成する。
【００２４】（２）基質特異性 マルトースに特異的に作用する。
【００２５】（３）至適温度 マルトース加リン酸分解反応の至適温度は６０℃〜７０
℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５０％
以上を示す。
℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５０％
以上を示す。
【００２６】（４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６０℃、１５
分間処理後８０％以上の活性を有する。 （５）至適ｐＨ ６．０〜７．０。
分間処理後８０％以上の活性を有する。 （５）至適ｐＨ ６．０〜７．０。
【００２７】（６）ｐＨ安定性 ｐＨ５．５〜８．０で安定。
【００２８】（７）失活 １００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
【００２９】（８）分子量 ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した値は１５万
〜１９万。
〜１９万。
【００３０】（９）等電点 ４．７〜５．１。
【００３１】（１０）阻害剤 ＨｇＣｌ２で著しく活性が阻害される。
【００３２】なお、上記のＤＮＡとして、遺伝子コード
の縮重に基づき、配列表における配列番号１に示すアミ
ノ酸配列を変えることなく、配列表の配列番号１に示す
該当する塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他
の塩基で置き換えしたものは、当然、本発明に包含され
る。
の縮重に基づき、配列表における配列番号１に示すアミ
ノ酸配列を変えることなく、配列表の配列番号１に示す
該当する塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他
の塩基で置き換えしたものは、当然、本発明に包含され
る。
【００３３】２） （ａ）配列表の配列番号１に記載の
塩基配列の内、塩基番号１８２〜２４５５で表される塩
基配列からなるＤＮＡが好熱性バチルス属細菌由来のも
のである上記１記載の遺伝子。
塩基配列の内、塩基番号１８２〜２４５５で表される塩
基配列からなるＤＮＡが好熱性バチルス属細菌由来のも
のである上記１記載の遺伝子。
【００３４】３） 好熱性バチルス属細菌由来のものが
バチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭＰ−１５０４４）で
ある上記１又は２に記載の遺伝子。
バチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭＰ−１５０４４）で
ある上記１又は２に記載の遺伝子。
【００３５】４） 上記１、２又は３に記載の遺伝子を
含む組換えベクター。
含む組換えベクター。
【００３６】５） 遺伝子がバチルスｓｐ．ＲＫ−１
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）の染色体を制限酵素Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩで切断して得た２，６５５塩基対のＤＮＡ
断片である上記４記載の組換えベクター。
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）の染色体を制限酵素Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩで切断して得た２，６５５塩基対のＤＮＡ
断片である上記４記載の組換えベクター。
【００３７】６） 遺伝子がバチルスｓｐ．ＲＫ−１
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）の耐熱性マルトースホス
ホリラーゼをコードする遺伝子部分である２，２７４塩
基対のＤＮＡ断片である上記４記載の組換えベクター。
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）の耐熱性マルトースホス
ホリラーゼをコードする遺伝子部分である２，２７４塩
基対のＤＮＡ断片である上記４記載の組換えベクター。
【００３８】７） ベクターがプラスミドベクターｐＲ
ＭＰ１由来のものである上記４、５又は６記載の組換え
ベクター。
ＭＰ１由来のものである上記４、５又は６記載の組換え
ベクター。
【００３９】８） 上記４、５、６又は７に記載の組換
えベクターを含む形質転換体。
えベクターを含む形質転換体。
【００４０】９） 形質転換体が大腸菌である上記８記
載の形質転換体。
載の形質転換体。
【００４１】１０） 上記８又は９に記載の組換え形質
転換体を培養して、組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼを製造する方法。
転換体を培養して、組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼを製造する方法。
【００４２】１１） 上記１０に記載の耐熱性マルトー
スホスホリラーゼ及び耐熱性トレハロースホスホリラー
ゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩と
を、水性媒体中で、反応させることを特徴とするトレハ
ロース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。
スホスホリラーゼ及び耐熱性トレハロースホスホリラー
ゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩と
を、水性媒体中で、反応させることを特徴とするトレハ
ロース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。
【００４３】１２） 上記１１の反応が５５〜７０℃、
ｐＨ４．５〜８．０で行われる上記１１記載のトレハロ
ース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。
ｐＨ４．５〜８．０で行われる上記１１記載のトレハロ
ース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。
【００４４】本発明でいう「ストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする」とは、実施例２−３に示されたサ
ザンハイブリダイゼーションの処理条件よりも強い条件
によりハイブリダイズすることを指す。具体的には、実
施例２−３におけるハイブリダイズ溶液よりも構成成分
の濃度が高いか、ハイブリダイゼーション温度が高い
か、洗浄液の構成成分の濃度が高いか、洗浄液の温度が
高いかの場合をいう。
ハイブリダイズする」とは、実施例２−３に示されたサ
ザンハイブリダイゼーションの処理条件よりも強い条件
によりハイブリダイズすることを指す。具体的には、実
施例２−３におけるハイブリダイズ溶液よりも構成成分
の濃度が高いか、ハイブリダイゼーション温度が高い
か、洗浄液の構成成分の濃度が高いか、洗浄液の温度が
高いかの場合をいう。
【００４５】本発明の組換え耐熱性マルトースホスホリ
ラーゼをコードする遺伝子は、耐熱性マルトースホスホ
リラーゼ産生能を有する微生物から、遺伝子工学的手法
により取得する。
ラーゼをコードする遺伝子は、耐熱性マルトースホスホ
リラーゼ産生能を有する微生物から、遺伝子工学的手法
により取得する。
【００４６】一般に、二本鎖のＤＮＡは、熱やアルカリ
の処理により水素結合が解離して一本鎖となる（変
性）、また、変性したＤＮＡは徐々に温度を下げること
により、しだいにもとの二本鎖に復帰する（再生）。こ
の変性と再生は、ＤＮＡ二本鎖の塩基配列の相同性が高
いほど、変性が起こりにくく（高い温度が必要）、再生
し易い。
の処理により水素結合が解離して一本鎖となる（変
性）、また、変性したＤＮＡは徐々に温度を下げること
により、しだいにもとの二本鎖に復帰する（再生）。こ
の変性と再生は、ＤＮＡ二本鎖の塩基配列の相同性が高
いほど、変性が起こりにくく（高い温度が必要）、再生
し易い。
【００４７】そこで、今、異なる２種類の二本鎖ＤＮＡ
が試験管内に存在するとき、変性を行い、その後再生を
行うことにより、異種のＤＮＡ同士は、相同的配列に依
存して異種間の二本鎖を形成していく。
が試験管内に存在するとき、変性を行い、その後再生を
行うことにより、異種のＤＮＡ同士は、相同的配列に依
存して異種間の二本鎖を形成していく。
【００４８】このような２種のＤＮＡの間の二本鎖の会
合を、ハイブリッド形成といい、この方法により異なる
ＤＮＡの間の相同性を調べることをハイブリダイゼーシ
ョン法と呼んでいる。
合を、ハイブリッド形成といい、この方法により異なる
ＤＮＡの間の相同性を調べることをハイブリダイゼーシ
ョン法と呼んでいる。
【００４９】本発明は、このようなハイブリダイゼーシ
ョン法により、ＤＮＡの検索や同定等を行なうものであ
る。
ョン法により、ＤＮＡの検索や同定等を行なうものであ
る。
【００５０】ところで、本発明のＤＮＡは、塩基配列
（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするという特性を有するものである。
（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするという特性を有するものである。
【００５１】このことは、本発明において、ハイブリダ
イゼーション法により、ＤＮＡの検索や同定等を行なう
場合、ストリンジェントな条件下で行なえば、耐熱性マ
ルトースホスホリラーゼの構造遺伝子と相同性の高いＤ
ＮＡはハイブリダイズするが、逆に、相同性の低いもの
はハイブリダイズしないので、その結果、純度が極めて
高い、該酵素由来のＤＮＡが効率よく得ることが可能と
なる。
イゼーション法により、ＤＮＡの検索や同定等を行なう
場合、ストリンジェントな条件下で行なえば、耐熱性マ
ルトースホスホリラーゼの構造遺伝子と相同性の高いＤ
ＮＡはハイブリダイズするが、逆に、相同性の低いもの
はハイブリダイズしないので、その結果、純度が極めて
高い、該酵素由来のＤＮＡが効率よく得ることが可能と
なる。
【００５２】したがって、本発明は、ハイブリダイゼー
ション法の操作条件の設定を工夫することにより、耐熱
性マルトースホスホリラーゼから、高純度の組換え耐熱
性マルトースホスホリラーゼのＤＮＡを効率よく得るこ
とができる。
ション法の操作条件の設定を工夫することにより、耐熱
性マルトースホスホリラーゼから、高純度の組換え耐熱
性マルトースホスホリラーゼのＤＮＡを効率よく得るこ
とができる。
【００５３】本発明のＤＮＡが、ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするという特性を有する原因につ
いては、学問的には解明していないが、多分、前記の耐
熱性マルトースホスホリラーゼの（１）〜（１０）の酵
素化学的性質の内、特に（３）の「至適温度」及び
（４）の「熱安定性」という性質から来ているものと推
察される。
件下でハイブリダイズするという特性を有する原因につ
いては、学問的には解明していないが、多分、前記の耐
熱性マルトースホスホリラーゼの（１）〜（１０）の酵
素化学的性質の内、特に（３）の「至適温度」及び
（４）の「熱安定性」という性質から来ているものと推
察される。
【００５４】本発明のＤＮＡを入手する微生物として
は、バチルス属に属し、耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ産生能を有する微生物であればいずれの微生物でもよ
い。特に、本発明者らが茨城県の土壌より分離したバチ
ルス・ｓｐ．ＲＫ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）
もしくはその突然変異体が好ましい。
は、バチルス属に属し、耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ産生能を有する微生物であればいずれの微生物でもよ
い。特に、本発明者らが茨城県の土壌より分離したバチ
ルス・ｓｐ．ＲＫ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）
もしくはその突然変異体が好ましい。
【００５５】本発明は、耐熱性マルトースホスホリラー
ゼをコードする遺伝子を自律複製可能なベクターに組み
込んだ、複製可能な組換えベクター及び該組換えベクタ
ーを宿主に導入してなる形質転換体を包含する。
ゼをコードする遺伝子を自律複製可能なベクターに組み
込んだ、複製可能な組換えベクター及び該組換えベクタ
ーを宿主に導入してなる形質転換体を包含する。
【００５６】自立複製可能なベクターとしては、ｐＢＲ
３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＵＣ
１８、ｐＣＲ２．１、ｐＬＥＸ、ｐＪＬ３、ｐＳＷ１、
ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ４２０、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の
プラスミドベクターやλｇｔ１１、λＺＡＰ等のファー
ジベクターが挙げられるが、大腸菌で発現させるには、
ｐＢＲ３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ
（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−３、及びｐＣＲ
２．１が好適であり、枯草菌で発現させるには、ｐＨＹ
３００ＰＬＫが好適である。
３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＵＣ
１８、ｐＣＲ２．１、ｐＬＥＸ、ｐＪＬ３、ｐＳＷ１、
ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ４２０、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の
プラスミドベクターやλｇｔ１１、λＺＡＰ等のファー
ジベクターが挙げられるが、大腸菌で発現させるには、
ｐＢＲ３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ
（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−３、及びｐＣＲ
２．１が好適であり、枯草菌で発現させるには、ｐＨＹ
３００ＰＬＫが好適である。
【００５７】宿主としては、大腸菌、枯草菌、放線菌、
酵母等が挙げられ、組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼ生産における形質転換体の培養条件で、マルターゼ
を産生しないものであればよい。
酵母等が挙げられ、組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼ生産における形質転換体の培養条件で、マルターゼ
を産生しないものであればよい。
【００５８】また、本発明は、組換え耐熱性マルトース
ホスホリラーゼをコードする遺伝子を含む組換えベクタ
ーを宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物か
ら組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取してな
る、組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造方法
を包含する。
ホスホリラーゼをコードする遺伝子を含む組換えベクタ
ーを宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物か
ら組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取してな
る、組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造方法
を包含する。
【００５９】本発明の形質転換体の培養に用いる栄養培
地としては、炭素源、窒素源、無機物、及び必要に応じ
使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するもの
であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
地としては、炭素源、窒素源、無機物、及び必要に応じ
使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するもの
であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００６０】炭素源としてはマルトース、スクロース、
グルコース、フラクトース、デンプン、デキストリン、
グリセリン等の炭化水素が用いられる。
グルコース、フラクトース、デンプン、デキストリン、
グリセリン等の炭化水素が用いられる。
【００６１】窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿素等の無機有機窒
素化合物が用いられる。窒素源としてはペプトン、ポリ
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カ、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブ
ルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も使用でき
る。
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿素等の無機有機窒
素化合物が用いられる。窒素源としてはペプトン、ポリ
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カ、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブ
ルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も使用でき
る。
【００６２】無機物としてはリン酸二水素カリウム、リ
ン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、
硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム等が用いられる。その他にビオチ
ン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じて使用する。
ン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、
硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム等が用いられる。その他にビオチ
ン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じて使用する。
【００６３】培養法としては液体培養法（振とう培養法
もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌
培養法が最も適している。培養温度とｐＨは、使用する
形質転換体の増殖に最も適した条件を選べばよい。培養
時間は培養条件によって変わってくるが、通常１５〜４
８時間程度であり、組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼの生成が確認されたとき、好ましくは生成が最大に
達したときに培養を停止する。
もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌
培養法が最も適している。培養温度とｐＨは、使用する
形質転換体の増殖に最も適した条件を選べばよい。培養
時間は培養条件によって変わってくるが、通常１５〜４
８時間程度であり、組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼの生成が確認されたとき、好ましくは生成が最大に
達したときに培養を停止する。
【００６４】この様にして得られた培養物から本発明の
組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取するに
は、まず、培養液中の菌体を物理的な手法で破砕する
か、有機溶剤やリゾチームのような酵素によって溶解し
た後、残渣を遠心分離法や濾過法等により除去する。こ
れを限外濾過、塩析、透析、溶剤沈澱等の処理を単独或
いは組み合わせに付すことにより工業用途の濃縮酵素液
が調製できる。
組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取するに
は、まず、培養液中の菌体を物理的な手法で破砕する
か、有機溶剤やリゾチームのような酵素によって溶解し
た後、残渣を遠心分離法や濾過法等により除去する。こ
れを限外濾過、塩析、透析、溶剤沈澱等の処理を単独或
いは組み合わせに付すことにより工業用途の濃縮酵素液
が調製できる。
【００６５】更に、この濃縮酵素液をイオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点ク
ロマトグラフィー等の周知の単離・精製法の組合せに付
すことにより、精製標品を得ることができる。
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点ク
ロマトグラフィー等の周知の単離・精製法の組合せに付
すことにより、精製標品を得ることができる。
【００６６】次に、本発明は、組換え耐熱性マルトース
ホスホリラーゼと耐熱性トレハロースホスホリラーゼの
存在下にマルトースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水
溶媒中で反応させることにより、トレハロース又はβ−
グルコース−１−リン酸を製造する方法を包含する。
ホスホリラーゼと耐熱性トレハロースホスホリラーゼの
存在下にマルトースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水
溶媒中で反応させることにより、トレハロース又はβ−
グルコース−１−リン酸を製造する方法を包含する。
【００６７】このように、本発明は、新規な好熱性バチ
ルス属細菌、特にバチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５０４４）由来の耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ遺伝子を基に、遺伝子工学的手法により、組換え耐熱
性マルトースホスホリラーゼを得、これを用いて組換え
微生物を作製したものであって、これを培養すれば、酵
素の生産性が飛躍的に上昇し、不純物の少ない、高純度
の組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼが調製できる
点で極めて優れていると言える。
ルス属細菌、特にバチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５０４４）由来の耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ遺伝子を基に、遺伝子工学的手法により、組換え耐熱
性マルトースホスホリラーゼを得、これを用いて組換え
微生物を作製したものであって、これを培養すれば、酵
素の生産性が飛躍的に上昇し、不純物の少ない、高純度
の組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼが調製できる
点で極めて優れていると言える。
【００６８】また、組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼが工業的規模で大量に、効率よく生産できるように
なった結果、これを利用することにより、有用なトレハ
ロースの製造が飛躍的に効率よく製造することができる
点においても、非常に価値がある。
ーゼが工業的規模で大量に、効率よく生産できるように
なった結果、これを利用することにより、有用なトレハ
ロースの製造が飛躍的に効率よく製造することができる
点においても、非常に価値がある。
【００６９】以上、本発明は、本発明者らが先に見出し
た耐熱性マルトースホスホリラーゼについて遺伝子学的
解明を行い、この解明を基に、そのＤＮＡの遺伝子学的
な特性を見つけ、遺伝子工学的な手法によって、高純度
でしかも耐熱性という極めて有用な特性を有する組換え
耐熱性マルトースホスホリラーゼを効率よく製造できる
ＤＮＡを得た点に、格別の意義があることが分かるであ
ろう。
た耐熱性マルトースホスホリラーゼについて遺伝子学的
解明を行い、この解明を基に、そのＤＮＡの遺伝子学的
な特性を見つけ、遺伝子工学的な手法によって、高純度
でしかも耐熱性という極めて有用な特性を有する組換え
耐熱性マルトースホスホリラーゼを効率よく製造できる
ＤＮＡを得た点に、格別の意義があることが分かるであ
ろう。
【００７０】以下、本発明について詳細に説明する。
【００７１】［１］ 耐熱性マルトースホスホリラーゼ
の酵素化学的性質：本発明は、本発明者らによる、耐熱
性マルトースホスホリラーゼの発見に基づくものである
が、この酵素は、好熱性バチルス属細菌、バチルス・ｓ
ｐ．ＲＫ−１株から産生されたものであり、その酵素化
学的特性を調べた結果（実施例１）、その酵素化学的性
質は、以下のとおりであった。
の酵素化学的性質：本発明は、本発明者らによる、耐熱
性マルトースホスホリラーゼの発見に基づくものである
が、この酵素は、好熱性バチルス属細菌、バチルス・ｓ
ｐ．ＲＫ−１株から産生されたものであり、その酵素化
学的特性を調べた結果（実施例１）、その酵素化学的性
質は、以下のとおりであった。
【００７２】なお、マルトースホスホリラーゼ活性は、
以下のように測定した。
以下のように測定した。
【００７３】酵素溶液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸クエ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２Ｗ／Ｖ％マ
ルトース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６
０℃、１５分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止
させた。次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取
し、グルコース検査試薬（グルコースＣＩＩ−テストワ
コー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０
分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計
を用いて反応液中のグルコース量を測定した。遊離した
グルコースの量から１分間に１μｍｏｌのマルトースを
加リン酸分解した酵素量を１単位とした。
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２Ｗ／Ｖ％マ
ルトース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６
０℃、１５分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止
させた。次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取
し、グルコース検査試薬（グルコースＣＩＩ−テストワ
コー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０
分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計
を用いて反応液中のグルコース量を測定した。遊離した
グルコースの量から１分間に１μｍｏｌのマルトースを
加リン酸分解した酵素量を１単位とした。
【００７４】また、ホスホリラーゼであることを確認す
るために、陰イオン交換カラムを分離手段として示差屈
折計を検出手段とする高速液体クロマトグラフィーによ
り、反応終了後の反応液に存在するβ−グルコース−１
−リン酸を定量した。
るために、陰イオン交換カラムを分離手段として示差屈
折計を検出手段とする高速液体クロマトグラフィーによ
り、反応終了後の反応液に存在するβ−グルコース−１
−リン酸を定量した。
【００７５】（１）作用 以下の式１で示すように、マルトースを可逆的に加リン
酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作
用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１
−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−
リン酸に作用させると等モルのマルトースとリン酸を生
成する。
酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作
用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１
−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−
リン酸に作用させると等モルのマルトースとリン酸を生
成する。
【化１】 （２）基質特異性 トレハロース、ネオトレハロース、マルトース、イソマ
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロ
フェノール−α−グルコシド、ｐ−ニトロフェノール−
β−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行った
ところ、マルトース以外にはグルコースの生成がほとん
ど認められなかった（表１）。
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロ
フェノール−α−グルコシド、ｐ−ニトロフェノール−
β−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行った
ところ、マルトース以外にはグルコースの生成がほとん
ど認められなかった（表１）。
【表１】 （３）至適温度 ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたとこ
ろ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は６０℃〜
７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５
０％以上を示した（図１）。
０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたとこ
ろ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は６０℃〜
７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５
０％以上を示した（図１）。
【００７６】（４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にてインキュベー
トし、残存活性を測定したところ、６０℃で１５分間処
理で、無処理の８０％以上の活性を示した（図２）。
トし、残存活性を測定したところ、６０℃で１５分間処
理で、無処理の８０％以上の活性を示した（図２）。
【００７７】（５）至適ｐＨ ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０
〜８．０）と２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜
９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．
０〜７．０であった（図３）。
〜８．０）と２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜
９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．
０〜７．０であった（図３）。
【００７８】（６）ｐＨ安定性 １００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
０〜８．０）と１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５
〜８．０で安定であった（図４）。
０〜８．０）と１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５
〜８．０で安定であった（図４）。
【００７９】（７）失活 １００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
【００８０】（８）分子量 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテ
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量の比較から分
子量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万で
あった。
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量の比較から分
子量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万で
あった。
【００８１】また、ＳＤＳゲル電気泳動により、各種標
準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は
７．５万〜９．５万であった。
準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は
７．５万〜９．５万であった。
【００８２】（９）等電点 等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移
動度から等電点は４．７〜５．１であった。
動度から等電点は４．７〜５．１であった。
【００８３】（１０）阻害剤 １ｍＭのＨｇＣｌ２で９９％、ＺｎＳＯ４で３７％の活
性阻害が見られた（表２）。
性阻害が見られた（表２）。
【表２】 （１１）Ｎ末端アミノ酸配列 常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロ
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、この酵素は、Ｎ末端に配列番号２に示すア
ミノ酸配列を有していた。
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、この酵素は、Ｎ末端に配列番号２に示すア
ミノ酸配列を有していた。
【００８４】［２］ 耐熱性マルトースホスホリラーゼ
のＤＮＡの配列解析 本発明者らは、上記の（１１）のＮ末端アミノ酸配列に
基づき、バチルス・ｓｐ．ＲＫ−１株の染色体ＤＮＡか
ら耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ
を取得し、その配列の解析を行った（配列番号３）。
のＤＮＡの配列解析 本発明者らは、上記の（１１）のＮ末端アミノ酸配列に
基づき、バチルス・ｓｐ．ＲＫ−１株の染色体ＤＮＡか
ら耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ
を取得し、その配列の解析を行った（配列番号３）。
【００８５】まず、バチルスｓｐ．ＲＫ−１株の菌体よ
りリゾチームとＳＤＳを用いた凍結融解法により染色体
ＤＮＡを調製し、この染色体ＤＮＡをテンプレートと
し、配列番号２に示すマルトースホスホリラーゼのＮ末
端の１から８番目のアミノ酸配列に基づき、５´−ＡＴ
ＧＴＡＹＴＡＹＡＡＹＣＧＩＣＴＩＴＴＹＧＡ−３´及
び５´−ＡＴＧＴＡＹＴＡＹＡＡＹＡＧＲＴＴＲＴＴＹ
ＧＡ−３´で表される配列のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして、ＰＣＲを行った。生成した約４００塩基
対のＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１８に挿入
し、クローニングした後、蛍光ラベルを用いたダイプラ
イマー法で塩基配列を決定し、マルトースホスホリラー
ゼのＮ末端から５番目のＡｒｇ以降をコードする３８１
塩基対のＤＮＡ断片を単離した。
りリゾチームとＳＤＳを用いた凍結融解法により染色体
ＤＮＡを調製し、この染色体ＤＮＡをテンプレートと
し、配列番号２に示すマルトースホスホリラーゼのＮ末
端の１から８番目のアミノ酸配列に基づき、５´−ＡＴ
ＧＴＡＹＴＡＹＡＡＹＣＧＩＣＴＩＴＴＹＧＡ−３´及
び５´−ＡＴＧＴＡＹＴＡＹＡＡＹＡＧＲＴＴＲＴＴＹ
ＧＡ−３´で表される配列のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして、ＰＣＲを行った。生成した約４００塩基
対のＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１８に挿入
し、クローニングした後、蛍光ラベルを用いたダイプラ
イマー法で塩基配列を決定し、マルトースホスホリラー
ゼのＮ末端から５番目のＡｒｇ以降をコードする３８１
塩基対のＤＮＡ断片を単離した。
【００８６】そこで、次に、このＤＮＡ断片をプローブ
として、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＢａｍＨ Ｉ、ＰｓｔＩ、
Ｓａｌ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ等の各種制限酵素で切断した
染色体ＤＮＡとサザンハイブリダイゼーションを行った
ところ、約２，５００塩基対のＨｉｎｄ ＩＩＩ切断Ｄ
ＮＡ断片が相同性を示したので、この断片の塩基配列を
インバースＰＣＲ法によって解析した。この解析した塩
基配列の３´側に制限酵素ＢｓｔＰ Ｉ認識配列が検出
されたことから、次に、染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂｓｔ
Ｐ Ｉで切断後、上記のＨｉｎｄ ＩＩＩ切断ＤＮＡ断
片と同様に、インバースＰＣＲ法によって、約４，００
０塩基対のＢｓｔＰ Ｉ切断断片の塩基配列の解析を行
った。３種類のＤＮＡ断片の塩基配列解析結果より、耐
熱性マルトースホスホリラーゼをコードする全塩基配列
を決定することができた。その配列を配列番号３に示
す。
として、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＢａｍＨ Ｉ、ＰｓｔＩ、
Ｓａｌ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ等の各種制限酵素で切断した
染色体ＤＮＡとサザンハイブリダイゼーションを行った
ところ、約２，５００塩基対のＨｉｎｄ ＩＩＩ切断Ｄ
ＮＡ断片が相同性を示したので、この断片の塩基配列を
インバースＰＣＲ法によって解析した。この解析した塩
基配列の３´側に制限酵素ＢｓｔＰ Ｉ認識配列が検出
されたことから、次に、染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂｓｔ
Ｐ Ｉで切断後、上記のＨｉｎｄ ＩＩＩ切断ＤＮＡ断
片と同様に、インバースＰＣＲ法によって、約４，００
０塩基対のＢｓｔＰ Ｉ切断断片の塩基配列の解析を行
った。３種類のＤＮＡ断片の塩基配列解析結果より、耐
熱性マルトースホスホリラーゼをコードする全塩基配列
を決定することができた。その配列を配列番号３に示
す。
【００８７】［３］ 組換え耐熱性マルトースホスホリ
ラーゼのＤＮＡの単離・同定とその製造：耐熱性マルト
ースホスホリラーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩
基配列が決定できたことから、該マルトースホスホリラ
ーゼをコードするＤＮＡ配列の開始コドン上流１６９塩
基目からの配列５´−ＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＣ
ＣＴＴＣＡ−３´で表されるオリゴヌクレオチドと、終
止コドン下流１８０塩基目からの配列のアンチセンス配
列５´−ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＡＴＧＴＣＡＴＡ
ＡＣＣＡＴＴＧＴ−３´で表されるオリゴヌクレオチド
をプライマーとして、前記の染色体ＤＮＡをテンプレー
トとしたＰＣＲを行い、耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ構造遺伝子を含む約２，７００塩基対のＤＮＡ断片を
調製した。これをプラスミドベクターｐＣＲ２．１にラ
イゲーションして、組換えプラスミドｐＲＭＰ１を作製
し、大腸菌ＩＮＶαＦ´（ｅｎｄＡｌ，ｒｅｃＡｌ，ｈ
ｓｄＲ１７（ｒ−Ｋ，ｍ＋Ｋ），ｓｕｐＥ４４，λ−，
ｔｈｉ−１，ｇｙｒＡ，ｒｅｌＡｌ，φ８０ ｌａｃＺ
△Ｍ１５△（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ），ｄｅｏＲ＋，
Ｆ´）株へ導入を行い、形質転換された大腸菌ＲＭＰ１
を得た。
ラーゼのＤＮＡの単離・同定とその製造：耐熱性マルト
ースホスホリラーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩
基配列が決定できたことから、該マルトースホスホリラ
ーゼをコードするＤＮＡ配列の開始コドン上流１６９塩
基目からの配列５´−ＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＣ
ＣＴＴＣＡ−３´で表されるオリゴヌクレオチドと、終
止コドン下流１８０塩基目からの配列のアンチセンス配
列５´−ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＡＴＧＴＣＡＴＡ
ＡＣＣＡＴＴＧＴ−３´で表されるオリゴヌクレオチド
をプライマーとして、前記の染色体ＤＮＡをテンプレー
トとしたＰＣＲを行い、耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ構造遺伝子を含む約２，７００塩基対のＤＮＡ断片を
調製した。これをプラスミドベクターｐＣＲ２．１にラ
イゲーションして、組換えプラスミドｐＲＭＰ１を作製
し、大腸菌ＩＮＶαＦ´（ｅｎｄＡｌ，ｒｅｃＡｌ，ｈ
ｓｄＲ１７（ｒ−Ｋ，ｍ＋Ｋ），ｓｕｐＥ４４，λ−，
ｔｈｉ−１，ｇｙｒＡ，ｒｅｌＡｌ，φ８０ ｌａｃＺ
△Ｍ１５△（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ），ｄｅｏＲ＋，
Ｆ´）株へ導入を行い、形質転換された大腸菌ＲＭＰ１
を得た。
【００８８】そして、上記の形質転換体中の組換えプラ
スミドｐＲＭＰ１に挿入されている約２，７００塩基対
のＤＮＡ断片の塩基配列の解析を行った。その結果は、
配列番号１に示す通りであり、前記の耐熱性マルトース
ホスホリラーゼのＤＮＡ配列の配列番号３の１５０６〜
４１５５と一致することが確認された。
スミドｐＲＭＰ１に挿入されている約２，７００塩基対
のＤＮＡ断片の塩基配列の解析を行った。その結果は、
配列番号１に示す通りであり、前記の耐熱性マルトース
ホスホリラーゼのＤＮＡ配列の配列番号３の１５０６〜
４１５５と一致することが確認された。
【００８９】そこで、形質転換大腸菌ＲＰＭＩをジャー
培養し、組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼ粗酵素
の調製を行った。培養は、容量５１のファーメンターに
ポリペプトン２％、酵母エキス１％、グルコース０．５
％、ＮａＣｌ０．５％、ＭｇＳＯ４０．０５％を含有す
る培地（ｐＨ７．０）約３１を入れて滅菌後、予め濾過
滅菌したアンピシリン水溶液を１００ｍｇ／ｌになるよ
うに添加し、温度を３５℃とした後、種培養液２Ｖ／Ｖ
％を接種して、３５℃、ｐＨ６．５〜７．５に保持しな
がら２４時間通気攪拌培養した。
培養し、組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼ粗酵素
の調製を行った。培養は、容量５１のファーメンターに
ポリペプトン２％、酵母エキス１％、グルコース０．５
％、ＮａＣｌ０．５％、ＭｇＳＯ４０．０５％を含有す
る培地（ｐＨ７．０）約３１を入れて滅菌後、予め濾過
滅菌したアンピシリン水溶液を１００ｍｇ／ｌになるよ
うに添加し、温度を３５℃とした後、種培養液２Ｖ／Ｖ
％を接種して、３５℃、ｐＨ６．５〜７．５に保持しな
がら２４時間通気攪拌培養した。
【００９０】培養終了後、培養液中の菌体破壊を行い、
これを除去した粗酵素液を調製した。粗酵素液のマルト
ースホスホリラーゼ活性は２，１００単位／ｍｌで、マ
ルターゼ活性は検出されなかった。
これを除去した粗酵素液を調製した。粗酵素液のマルト
ースホスホリラーゼ活性は２，１００単位／ｍｌで、マ
ルターゼ活性は検出されなかった。
【００９１】更に、実施例３に示すとおり、この粗酵素
を精製し、組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼの精
製標品を得た。
を精製し、組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼの精
製標品を得た。
【００９２】本発明の組換え型耐熱性マルトースホスホ
リラーゼの性質は、以下の通りである。
リラーゼの性質は、以下の通りである。
【００９３】（１）作用 前記の式１で示すように、マルトースを可逆的に加リン
酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作
用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１
−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−
リン酸に作用させると等モルのマルトースとリン酸を生
成する。
酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作
用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１
−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−
リン酸に作用させると等モルのマルトースとリン酸を生
成する。
【００９４】（２）基質特異性 トレハロース、ネオトレハロース、マルトース、イソマ
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロ
フェノールーα−グルコシド、ｐ−ニトロフェノール−
β−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行った
ところ、マルトース以外にはグルコースの生成がほとん
ど認められなかった。
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロ
フェノールーα−グルコシド、ｐ−ニトロフェノール−
β−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行った
ところ、マルトース以外にはグルコースの生成がほとん
ど認められなかった。
【００９５】（３）至適温度 ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたとこ
ろ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は６０℃〜
７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５
０％以上を示した。
０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたとこ
ろ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は６０℃〜
７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５
０％以上を示した。
【００９６】（４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にてインキュベー
トし、残存活性を測定したところ、６０℃で１５分間処
理で、無処理の８０％以上の活性を示した。
トし、残存活性を測定したところ、６０℃で１５分間処
理で、無処理の８０％以上の活性を示した。
【００９７】（５）至適ｐＨ ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０
〜８．０）と２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜
９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．
０〜７．０であった。
〜８．０）と２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜
９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．
０〜７．０であった。
【００９８】（６）ｐＨ安定性 １００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
０〜８．０）と１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５
〜８．０で安定であった。
０〜８．０）と１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５
〜８．０で安定であった。
【００９９】（７）失活 １００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
【０１００】（８）分子量 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテ
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量の比較から分
子量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万で
あった。
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量の比較から分
子量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万で
あった。
【０１０１】また、ＳＤＳゲル電気泳動により、各種標
準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は
７．５万〜９．５万であった。
準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は
７．５万〜９．５万であった。
【０１０２】（９）等電点 等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移
動度から等電点は４．７〜５．１であった。
動度から等電点は４．７〜５．１であった。
【０１０３】（１０）阻害剤 １ｍＭのＨｇＣｌ２で９９％、ＺｎＳＯ４で３７％の活
性阻害が見られた。
性阻害が見られた。
【０１０４】（１１）Ｎ末端アミノ酸配列 常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロ
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列番号２に示すアミ
ノ酸配列を有していた。
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列番号２に示すアミ
ノ酸配列を有していた。
【０１０５】この組換え型耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼの酵素化学的特性は、バチルス・ｓｐ．ＲＫ−１の
由来の耐熱性マルトースホスホリラーゼの酵素学的性質
とほぼ一致するものであった。
ーゼの酵素化学的特性は、バチルス・ｓｐ．ＲＫ−１の
由来の耐熱性マルトースホスホリラーゼの酵素学的性質
とほぼ一致するものであった。
【０１０６】従って、前述の組換え型耐熱性マルトース
ホスホリラーゼをコードするＤＮΛは、バチルス・ｓ
ｐ．ＲＫ−１の由来のものであると判断した。
ホスホリラーゼをコードするＤＮΛは、バチルス・ｓ
ｐ．ＲＫ−１の由来のものであると判断した。
【０１０７】［４］ トレハロース又はβ−グルコース
−１−リン酸の製造 組換え型耐熱性マルトースホスホリラーゼ及び耐熱性ト
レハロースホスホリラーゼの存在下に、マルトースとリ
ン酸もしくはリン酸塩とを、水性媒体中で、反応させ
て、トレハロース又はβ−グルコース−１−リン酸を製
造する方法について、以下述べる。
−１−リン酸の製造 組換え型耐熱性マルトースホスホリラーゼ及び耐熱性ト
レハロースホスホリラーゼの存在下に、マルトースとリ
ン酸もしくはリン酸塩とを、水性媒体中で、反応させ
て、トレハロース又はβ−グルコース−１−リン酸を製
造する方法について、以下述べる。
【０１０８】この反応に用いられる組換え耐熱性マルト
ースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６．０の緩衝液、例
えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）中で、５０〜６５℃のいずれかの温度で、好ま
しくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、特に６０℃で
１５分処理後に無処理の８０％以上の活性を有するもの
が好適に用いられる。これらの酵素は、精製酵素であっ
ても、マルターゼ等のトレハロースの製造に悪影響を及
ぼす酵素を含まない粗酵素であってもよい。また、さら
にこれを酵素の常法により担体に固定した固定化酵素を
用いることも可能である。
ースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６．０の緩衝液、例
えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）中で、５０〜６５℃のいずれかの温度で、好ま
しくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、特に６０℃で
１５分処理後に無処理の８０％以上の活性を有するもの
が好適に用いられる。これらの酵素は、精製酵素であっ
ても、マルターゼ等のトレハロースの製造に悪影響を及
ぼす酵素を含まない粗酵素であってもよい。また、さら
にこれを酵素の常法により担体に固定した固定化酵素を
用いることも可能である。
【０１０９】また、この反応に用いる耐熱性トレハロー
スホスホリラーゼとしては、上記反応温度のいずれか
で、及び上記ｐＨ範囲のいずれかで、組換え型耐熱性マ
ルトースホスホリラーゼの助力の下に、マルトースとリ
ン酸もしくはリン酸塩からトレハロースを生産し得るも
のであればよい。
スホスホリラーゼとしては、上記反応温度のいずれか
で、及び上記ｐＨ範囲のいずれかで、組換え型耐熱性マ
ルトースホスホリラーゼの助力の下に、マルトースとリ
ン酸もしくはリン酸塩からトレハロースを生産し得るも
のであればよい。
【０１１０】しかしながら、好適にはｐＨ６．０の緩衝
液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）中で、５０〜６５℃のいずれかの温度
で、好ましくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、特に
６０℃で１５分処理後に無処理の８０％以上の活性を有
する耐熱性トレハロースホスホリラーゼを用いることが
できる。かかる性質を有する耐熱性トレハロースホスホ
リラーゼの例として、本発明者らによって見出されたバ
チルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５６７）が産生する耐熱性トレハロースホスホ
リラーゼを挙げることができる。
液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）中で、５０〜６５℃のいずれかの温度
で、好ましくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、特に
６０℃で１５分処理後に無処理の８０％以上の活性を有
する耐熱性トレハロースホスホリラーゼを用いることが
できる。かかる性質を有する耐熱性トレハロースホスホ
リラーゼの例として、本発明者らによって見出されたバ
チルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５６７）が産生する耐熱性トレハロースホスホ
リラーゼを挙げることができる。
【０１１１】耐熱性トレハロースホスホリラーゼは組換
え型耐熱性マルトースホスホリラーゼと同様、精製酵素
であっても粗酵素であってもよい。
え型耐熱性マルトースホスホリラーゼと同様、精製酵素
であっても粗酵素であってもよい。
【０１１２】マルトースとしてはマルトースまたはマル
トース含有物（例えばマルトース高含有糖液）を用いる
ことができる。リン酸塩としてはリン酸三カリウム（も
しくはナトリウム）、リン酸水素二カリウム（もしくは
ナトリウム）、リン酸二水素カリウム（もしくはナトリ
ウム）等の水溶性リン酸塩を用いることができる。水性
媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液として
は酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク
酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を用いることができ
る。
トース含有物（例えばマルトース高含有糖液）を用いる
ことができる。リン酸塩としてはリン酸三カリウム（も
しくはナトリウム）、リン酸水素二カリウム（もしくは
ナトリウム）、リン酸二水素カリウム（もしくはナトリ
ウム）等の水溶性リン酸塩を用いることができる。水性
媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液として
は酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク
酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を用いることができ
る。
【０１１３】酵素の使用量については特に制限はない
が、マルトース１ｇに対して各酵素とも、０．１〜５０
単位、好ましくは１〜２０単位使用するのが好適であ
る。また、組換え型耐熱性マルトースホスホリラーゼと
耐熱性トレハロースホスホラリーゼとの使用比率は特に
制限ないが、単位の比で前者：後者＝１：５〜５：１、
好ましくは１：２〜２：１が適当である。
が、マルトース１ｇに対して各酵素とも、０．１〜５０
単位、好ましくは１〜２０単位使用するのが好適であ
る。また、組換え型耐熱性マルトースホスホリラーゼと
耐熱性トレハロースホスホラリーゼとの使用比率は特に
制限ないが、単位の比で前者：後者＝１：５〜５：１、
好ましくは１：２〜２：１が適当である。
【０１１４】リン酸及び／またはリン酸塩はマルトース
に対して、特に制限はないが、０．００１〜１倍モル、
好ましくは０．００５〜０．５倍モル使用するのが適当
である。尚、緩衝液がリン酸（塩）を含有する場合は系
中のリン酸及びリン酸塩の総量が上記範囲であればよ
い。
に対して、特に制限はないが、０．００１〜１倍モル、
好ましくは０．００５〜０．５倍モル使用するのが適当
である。尚、緩衝液がリン酸（塩）を含有する場合は系
中のリン酸及びリン酸塩の総量が上記範囲であればよ
い。
【０１１５】上記反応は温度、雑菌汚染をさらに避ける
とともに収率を挙げるため、好ましくは５５〜７０℃、
好ましくは５５〜６５℃、更に好ましくは６０〜６５℃
で行う。ｐＨは一般に４．５〜８．０、好ましくは５．
０〜６．０で行うのが適当である。上記条件で十分なト
レハロース生成が見られた時点で反応を終了するが、反
応は通常１〜１４４時間で終了する。
とともに収率を挙げるため、好ましくは５５〜７０℃、
好ましくは５５〜６５℃、更に好ましくは６０〜６５℃
で行う。ｐＨは一般に４．５〜８．０、好ましくは５．
０〜６．０で行うのが適当である。上記条件で十分なト
レハロース生成が見られた時点で反応を終了するが、反
応は通常１〜１４４時間で終了する。
【０１１６】反応終了後、反応液の加熱による酵素の失
活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活
等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理、エタノール晶出処理等の単離・精製手段
を適宜組み合わせてトレハロースを得ることができる。
活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活
等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理、エタノール晶出処理等の単離・精製手段
を適宜組み合わせてトレハロースを得ることができる。
【０１１７】また、本発明は、組換え型耐熱性マルトー
スホスホリラーゼの存在下にマルトースとリン酸もしく
はリン酸塩とを、水溶媒中で反応させせて、β−グルコ
ース−１−リン酸を製造することもできる。
スホスホリラーゼの存在下にマルトースとリン酸もしく
はリン酸塩とを、水溶媒中で反応させせて、β−グルコ
ース−１−リン酸を製造することもできる。
【０１１８】その場合、この反応に用いられる組換え型
耐熱性マルトースホスホリラーゼ、マルトース、水溶媒
は、トレハロース製造の場合と同様にして行うことがで
きる。酵素はマルトース１ｇに対して０．１〜５０単
位、好ましくは１〜２０単位が好適である。
耐熱性マルトースホスホリラーゼ、マルトース、水溶媒
は、トレハロース製造の場合と同様にして行うことがで
きる。酵素はマルトース１ｇに対して０．１〜５０単
位、好ましくは１〜２０単位が好適である。
【０１１９】反応温度、反応ｐＨ、反応時間はトレハロ
ース製造の場合と同様にして行うことができる。反応終
了後、イオン交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組
み合わせてβ−グルコース−１−リン酸を得ることがで
きる。
ース製造の場合と同様にして行うことができる。反応終
了後、イオン交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組
み合わせてβ−グルコース−１−リン酸を得ることがで
きる。
【０１２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を実施
例により詳細に説明する。
例により詳細に説明する。
【０１２１】マルトースホスホリラーゼ活性は、以下の
ように測定した。
ように測定した。
【０１２２】適宜希釈した酵素溶液０．４ｍｌと０．５
Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、
２Ｗ／Ｖ％マルトース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌ
を混合し、６０℃、１５分反応後１０分間の煮沸によっ
て反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．０
２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬グルコースＣＩＩ
−テストワコー（和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、
室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を
分光光度計を用いて測定し、反応液中のグルコース量を
定量した。生成したグルコースの量から１分間に１μｍ
ｏｌのマルトースを加リン酸分解した酵素量を１単位と
した。
Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、
２Ｗ／Ｖ％マルトース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌ
を混合し、６０℃、１５分反応後１０分間の煮沸によっ
て反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．０
２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬グルコースＣＩＩ
−テストワコー（和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、
室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を
分光光度計を用いて測定し、反応液中のグルコース量を
定量した。生成したグルコースの量から１分間に１μｍ
ｏｌのマルトースを加リン酸分解した酵素量を１単位と
した。
【０１２３】
【実施例１】 精製マルトースホスホリラーゼの酵素化
学的特性 ［実施例１−１］ 精製酵素の調製 バチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）
による耐熱性マルトースホスホリラーゼの精製は以下の
ようにして行った。
学的特性 ［実施例１−１］ 精製酵素の調製 バチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）
による耐熱性マルトースホスホリラーゼの精製は以下の
ようにして行った。
【０１２４】（培養）酵母エキス１％、ポリペプトン２
％、マルトース１％を含有する培地（ｐＨ７．０）１０
０ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入
れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したもの
に、バチルスｓｐ．ＲＫ−１を１白金耳植菌し、５５℃
にて１６時間振とう培養したものを種培養液とした。
％、マルトース１％を含有する培地（ｐＨ７．０）１０
０ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入
れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したもの
に、バチルスｓｐ．ＲＫ−１を１白金耳植菌し、５５℃
にて１６時間振とう培養したものを種培養液とした。
【０１２５】容量５１のファーメンターに種培養の場合
と同組成の培地約３１を入れて滅菌し、温度を５５℃と
した後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種し、５５℃、ｐＨ
６．０〜７．０に保持しながら１８時間通気攪拌培養し
た。
と同組成の培地約３１を入れて滅菌し、温度を５５℃と
した後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種し、５５℃、ｐＨ
６．０〜７．０に保持しながら１８時間通気攪拌培養し
た。
【０１２６】（粗酵素調製）分離した培養液に硫安を４
０〜６０％の飽和溶液になるよう溶解し、生じたタンパ
ク質の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透
析を行い、濃縮後マルトースホスホリラーゼ活性２８５
単位／ｍｌ、マルターゼ活性６５単位／ｍｌの粗酵素液
を１０ｍｌ得た。尚、マルターゼ活性の単位はマルトー
スを基質として反応を行い、１分間に遊離したグルコー
スのμｍｏｌ数とした。
０〜６０％の飽和溶液になるよう溶解し、生じたタンパ
ク質の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透
析を行い、濃縮後マルトースホスホリラーゼ活性２８５
単位／ｍｌ、マルターゼ活性６５単位／ｍｌの粗酵素液
を１０ｍｌ得た。尚、マルターゼ活性の単位はマルトー
スを基質として反応を行い、１分間に遊離したグルコー
スのμｍｏｌ数とした。
【０１２７】（イオン交換クロマトグラフィー）１０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化したＴＳＫ
ｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー
（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、０〜
０．５ＭＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、分画
分取した。活性のある画分は合わせて濃縮、脱塩後、更
に、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を
上げた。
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化したＴＳＫ
ｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー
（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、０〜
０．５ＭＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、分画
分取した。活性のある画分は合わせて濃縮、脱塩後、更
に、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を
上げた。
【０１２８】（ゲル濾過クロマトグラフィー）０．２Ｍ
ＮａＣｌを溶解した１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）
によって平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラ
ム（ファルマシア バイオテク（株））に、上記部分精
製酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、分画分取し
た。活性のある画分は濃縮、脱塩を行った。
ＮａＣｌを溶解した１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）
によって平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラ
ム（ファルマシア バイオテク（株））に、上記部分精
製酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、分画分取し
た。活性のある画分は濃縮、脱塩を行った。
【０１２９】（等電点クロマトグラフィー）２５ｍＭビ
ス・トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）によって平衡化し
た、Ｍｏｎｏ Ｐ ＨＲ５／２０カラム（ファルマシア
バイオテク（株））に上記部分精製酵素液を添加し、
ｐＨ４．０に調製した展開緩衝液Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ
（ファルマシア バイオテク（株））で溶出し、分画分
取した。活性のある画分は濃縮、脱塩を行った。
ス・トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）によって平衡化し
た、Ｍｏｎｏ Ｐ ＨＲ５／２０カラム（ファルマシア
バイオテク（株））に上記部分精製酵素液を添加し、
ｐＨ４．０に調製した展開緩衝液Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ
（ファルマシア バイオテク（株））で溶出し、分画分
取した。活性のある画分は濃縮、脱塩を行った。
【０１３０】（ネイティブポリアクリルアミドゲル電気
泳動）上記精製酵素をネイティブポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバン
ドを調べたところ一本のバンドしか検出されず、単一タ
ンパク質であることが確認できたので精製マルトースホ
スホリラーゼ酵素液とした。
泳動）上記精製酵素をネイティブポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバン
ドを調べたところ一本のバンドしか検出されず、単一タ
ンパク質であることが確認できたので精製マルトースホ
スホリラーゼ酵素液とした。
【０１３１】［実施例１−２］ 精製酵素の酵素化学的
特性 実施例１−１で調製した精製マルトースホスホリラーゼ
液を用い、以下の酵素化学的特性を調べた。
特性 実施例１−１で調製した精製マルトースホスホリラーゼ
液を用い、以下の酵素化学的特性を調べた。
【０１３２】（１）作用 実施例１−１で調製した精製酵素液０．４ｍｌと０．５
Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、
２Ｗ／Ｖ％マルトース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌ
を混合し、６０℃、６０分間マルトース分解反応を行っ
た。反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させ、こ
の反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検
査試薬グルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業
（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、
５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、反
応液中のグルコース量を定量した。一方、陰イオン交換
カラムと示唆屈折計を用いた高速液体クロマトグラフィ
ーにより、反応液中のβ−グルコース−１−リン酸を定
量した。その結果、反応停止液中のグルコース含量とβ
−グルコース−１−リン酸含量は等しかった。
Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、
２Ｗ／Ｖ％マルトース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌ
を混合し、６０℃、６０分間マルトース分解反応を行っ
た。反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させ、こ
の反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検
査試薬グルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業
（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、
５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、反
応液中のグルコース量を定量した。一方、陰イオン交換
カラムと示唆屈折計を用いた高速液体クロマトグラフィ
ーにより、反応液中のβ−グルコース−１−リン酸を定
量した。その結果、反応停止液中のグルコース含量とβ
−グルコース−１−リン酸含量は等しかった。
【０１３３】また、精製酵素液０．４ｍｌと０．５Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１２ｍｌ、０．５Ｍβ−グ
ルコース−１−リン酸・Ｎａ水溶液０．１２ｍｌ、０．
５Ｍグルコース水溶液０．１２ｍｌ、蒸留水０．４４ｍ
ｌを混合し、６０℃、６０分反応後１０分間の煮沸によ
って反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．
０２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬グルコースＣＩ
Ｉ−テストワコー（和光純薬工業（株））を３ｍｌ加
え、室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光
度を分光光度計を用いて測定し、反応液中のグルコース
量を定量した。一方、反応停止液をＴＳＫｇｅｌ Ａｍ
ｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））を用いた高速液体ク
ロマトグラフィーで分離後、示差屈折計で反応液のマル
トースを検出し定量した。
酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１２ｍｌ、０．５Ｍβ−グ
ルコース−１−リン酸・Ｎａ水溶液０．１２ｍｌ、０．
５Ｍグルコース水溶液０．１２ｍｌ、蒸留水０．４４ｍ
ｌを混合し、６０℃、６０分反応後１０分間の煮沸によ
って反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．
０２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬グルコースＣＩ
Ｉ−テストワコー（和光純薬工業（株））を３ｍｌ加
え、室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光
度を分光光度計を用いて測定し、反応液中のグルコース
量を定量した。一方、反応停止液をＴＳＫｇｅｌ Ａｍ
ｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））を用いた高速液体ク
ロマトグラフィーで分離後、示差屈折計で反応液のマル
トースを検出し定量した。
【０１３４】その結果、反応停止液中の消費グルコース
量と生成マルトース量は等しかった。従って、精製酵素
の作用は、式（１）で示すように、マルトースを可逆的
に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルト
ースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコ
ース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコー
ス−１−リン酸に作用させると等モルのマルトースとリ
ン酸を生成すると結論した。
量と生成マルトース量は等しかった。従って、精製酵素
の作用は、式（１）で示すように、マルトースを可逆的
に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルト
ースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコ
ース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコー
ス−１−リン酸に作用させると等モルのマルトースとリ
ン酸を生成すると結論した。
【０１３５】（２）基質特異性 （１）のマルトース分解反応の基質を以下のものに置き
換えて加リン酸分解反応を行ったところ、トレハロー
ス、ネオトレハロース、イソマルトース、セロビオー
ス、シュークロース、ｐ−ニトロフェノール−α−グル
コシド、ｐ−ニトロフェノール−β−グルコシドを基質
として加リン酸分解反応を行ったところ、いずれもグル
コースの生成が認められなかった（表１）。
換えて加リン酸分解反応を行ったところ、トレハロー
ス、ネオトレハロース、イソマルトース、セロビオー
ス、シュークロース、ｐ−ニトロフェノール−α−グル
コシド、ｐ−ニトロフェノール−β−グルコシドを基質
として加リン酸分解反応を行ったところ、いずれもグル
コースの生成が認められなかった（表１）。
【０１３６】（３）至適温度 精製マルトースホスホリラーゼ活性を各種温度（４０〜
８５℃）で行ったところ、マルトース加リン酸分解反応
の至適温度は６０℃〜７０℃付近で、５０℃〜７０℃の
範囲で最高活性の約５０％以上を示した（図１）。
８５℃）で行ったところ、マルトース加リン酸分解反応
の至適温度は６０℃〜７０℃付近で、５０℃〜７０℃の
範囲で最高活性の約５０％以上を示した（図１）。
【０１３７】（４）熱安定性 精製酵素液を各種温度（４０〜７５℃）に１５分間イン
キュベートした後、マルトースホスホリラーゼ活性を測
定したところ、６０℃処理で、無処理の８０％以上の活
性を示した（図２）。
キュベートした後、マルトースホスホリラーゼ活性を測
定したところ、６０℃処理で、無処理の８０％以上の活
性を示した（図２）。
【０１３８】（５）至適ｐＨ マルトースホスホリラーゼ活性測定に用いる０．５Ｍリ
ン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の代わりに、０．５
Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．
０）もしくは０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜
９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．
０〜７．０であった（図３）。
ン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の代わりに、０．５
Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．
０）もしくは０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜
９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．
０〜７．０であった（図３）。
【０１３９】（６）ｐＨ安定性 精製マルトースホスホリラーゼ酵素液を１００ｍＭリン
酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．０）と
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）と
混合し、４℃で２４時間インキュベートした後、各ｐＨ
での残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５〜８．０で
安定であった（図４）。
酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．０）と
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）と
混合し、４℃で２４時間インキュベートした後、各ｐＨ
での残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５〜８．０で
安定であった（図４）。
【０１４０】（７）失活 精製マルトースホスホリラーゼ酵素液を１００℃、１０
分間加熱した後、残存活性を測定したところ、活性は１
００％失活していた。
分間加熱した後、残存活性を測定したところ、活性は１
００％失活していた。
【０１４１】（８）分子量 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテ
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量の比較から分
子量を求めた結果、精製酵素の分予量は１５万〜１９万
であった。
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量の比較から分
子量を求めた結果、精製酵素の分予量は１５万〜１９万
であった。
【０１４２】また、ＳＤＳゲル電気泳動により、各種標
準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は
７．５万〜９．５万であった。
準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は
７．５万〜９．５万であった。
【０１４３】（９）等電点 等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移
動度から等電点は４．７〜５．１であった。
動度から等電点は４．７〜５．１であった。
【０１４４】（１０）阻害剤 精製マルトースホスホリラーゼ酵素液に終濃度１ｍＭに
なるように阻害剤を添加した後、残存活性を測定したと
ころ、ＨｇＣｌ２で９９％、ＺｎＳＯ４で３７％の活性
阻害が見られた（表２）。
なるように阻害剤を添加した後、残存活性を測定したと
ころ、ＨｇＣｌ２で９９％、ＺｎＳＯ４で３７％の活性
阻害が見られた（表２）。
【０１４５】（１１）Ｎ末端アミノ酸配列 常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロ
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番
号２に示すアミノ酸配列を有していた。
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番
号２に示すアミノ酸配列を有していた。
【０１４６】
【実施例２】 耐熱性マルトースホスホリラーゼをコー
ドするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ及び組換えＤＮＡ形質
転換大腸菌の調製 ［実施例２−１］ 染色体ＤＮＡの調製 ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．
５％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００
ｍｌバッフル付フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オ
ートクレーブ殺菌したものにバチルスｓｐ．ＲＫ−１株
を植菌し、５５℃で１４時間回転振とう培養した。遠心
分離により培養液から菌体を分離し、０．１ＭＥＤＴＡ
を含む０．１５ＭＮａＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し
た。これにリゾチームを２ｍｇ／ｍｌとなるように加
え、３７℃で３０分間穏やかに振とうした後、−８０℃
で３０分間凍結した。解凍後、１％ＳＤＳと０．１ＭＮ
ａＣｌを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．
０）を加えて６０℃に加温した。冷却後、１ｍＭＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
（ＴＥ緩衝液）で飽和したフェノール溶液を加えて除蛋
白処理を行った。その後、冷エタノールを加え、生成し
た粗染色体ＤＮＡを採取し、これを７０％、８０％、９
０％エタノールにそれぞれ５分間ずつ浸した後、ＴＥ緩
衝液に溶解した。これにＲＮａｓｅＡ（シグマ）を２０
μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間反応さ
せた。反応液を再度フェノール溶液による除蛋白処理を
行い、冷エタノールを加えて生成した染色体ＤＮＡを採
取し、７０％、８０％、９０％エタノールにそれぞれ５
分間ずつ浸した後、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＥ緩衝
液に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。
ドするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ及び組換えＤＮＡ形質
転換大腸菌の調製 ［実施例２−１］ 染色体ＤＮＡの調製 ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．
５％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００
ｍｌバッフル付フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オ
ートクレーブ殺菌したものにバチルスｓｐ．ＲＫ−１株
を植菌し、５５℃で１４時間回転振とう培養した。遠心
分離により培養液から菌体を分離し、０．１ＭＥＤＴＡ
を含む０．１５ＭＮａＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し
た。これにリゾチームを２ｍｇ／ｍｌとなるように加
え、３７℃で３０分間穏やかに振とうした後、−８０℃
で３０分間凍結した。解凍後、１％ＳＤＳと０．１ＭＮ
ａＣｌを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．
０）を加えて６０℃に加温した。冷却後、１ｍＭＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
（ＴＥ緩衝液）で飽和したフェノール溶液を加えて除蛋
白処理を行った。その後、冷エタノールを加え、生成し
た粗染色体ＤＮＡを採取し、これを７０％、８０％、９
０％エタノールにそれぞれ５分間ずつ浸した後、ＴＥ緩
衝液に溶解した。これにＲＮａｓｅＡ（シグマ）を２０
μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間反応さ
せた。反応液を再度フェノール溶液による除蛋白処理を
行い、冷エタノールを加えて生成した染色体ＤＮＡを採
取し、７０％、８０％、９０％エタノールにそれぞれ５
分間ずつ浸した後、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＥ緩衝
液に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【０１４７】［実施例２−２］ マルトースホスホリラ
ーゼをコードするＤＮＡの５´端ＤＮＡ断片の取得 配列表における配列番号２に示すマルトースホスホリラ
ーゼのＮ末端の１から８番目のアミノ酸配列のＭｅｔ−
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｐで表される配列に基づき、５´−ＡＴＧＴＡＹＴＡ
ＹＡＡＹＣＧＮＣＴＮＴＴＹＧＡ−３´及び５´−ＡＴ
ＧＴＡＹＴＡＹＡＡＹＡＧＲＴＴＲＴＴＹＧΛ−３´で
表される配列のオリゴヌクレオチドを化学合成した。こ
れらのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、実施例２
−１で得られた染色体ＤＮΛをテンプレートとしてＧｅ
ｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔ
ｈＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造（株））を用いてＰＣＲを行った。反応条件
は、９３℃で２分間加熱した後、９５℃で１分、５５℃
で１分３０秒、７２℃で３分のサイクルを３０回繰り返
してから、最後に７２℃で１５分保温した。
ーゼをコードするＤＮＡの５´端ＤＮＡ断片の取得 配列表における配列番号２に示すマルトースホスホリラ
ーゼのＮ末端の１から８番目のアミノ酸配列のＭｅｔ−
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｐで表される配列に基づき、５´−ＡＴＧＴＡＹＴＡ
ＹＡＡＹＣＧＮＣＴＮＴＴＹＧＡ−３´及び５´−ＡＴ
ＧＴＡＹＴＡＹＡＡＹＡＧＲＴＴＲＴＴＹＧΛ−３´で
表される配列のオリゴヌクレオチドを化学合成した。こ
れらのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、実施例２
−１で得られた染色体ＤＮΛをテンプレートとしてＧｅ
ｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔ
ｈＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造（株））を用いてＰＣＲを行った。反応条件
は、９３℃で２分間加熱した後、９５℃で１分、５５℃
で１分３０秒、７２℃で３分のサイクルを３０回繰り返
してから、最後に７２℃で１５分保温した。
【０１４８】アガロースゲル電気泳動で調べたところ、
約４００塩基対のＤＮＡ断片が生成していることが判明
した。この断片をＤＥ８１ペーパー（ワットマン）を用
いてアガロースゲルから回収し、Ｔ４ポリメラーゼ及び
クレノウフラグメントを作用させて断片の末端を平滑化
した。このＤＮＡ断片をＲＴＧｐＵＣ１８ ＳｍａＩ／
ＢＡＰ＋Ｌｉｇａｓｅ（ファルマシア）を用いてプラス
ミドベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位に挿入した。そ
して、この組換えプラスミドをコンピテントセルＥ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９（宝酒造（株））１００μｌに加
え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃で４５秒間加温
し、ＳＯＣ培地を加えて３７℃で１時間振とう培養する
ことにより、組換えプラスミドを導入した形質転換大腸
菌を得た。
約４００塩基対のＤＮＡ断片が生成していることが判明
した。この断片をＤＥ８１ペーパー（ワットマン）を用
いてアガロースゲルから回収し、Ｔ４ポリメラーゼ及び
クレノウフラグメントを作用させて断片の末端を平滑化
した。このＤＮＡ断片をＲＴＧｐＵＣ１８ ＳｍａＩ／
ＢＡＰ＋Ｌｉｇａｓｅ（ファルマシア）を用いてプラス
ミドベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位に挿入した。そ
して、この組換えプラスミドをコンピテントセルＥ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９（宝酒造（株））１００μｌに加
え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃で４５秒間加温
し、ＳＯＣ培地を加えて３７℃で１時間振とう培養する
ことにより、組換えプラスミドを導入した形質転換大腸
菌を得た。
【０１４９】得られた大腸菌から組換えプラスミド抽出
し、このプラスミドをテンプレートそして、プラスミド
ベクターｐＵＣ１８のＤＮＡを基に化学合成により作製
した、２種類の合成オリゴヌクレオチドＦＰ（５´−Ｇ
ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧ−３´）及びＲＰ
（５´−ＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ−３
´）をプライマーとして、前述の反応条件でＰＣＲを行
い、ｐＵＣ１８に挿入したＤＮＡ断片の増幅行った。反
応液９０μｌにＰＥＧ溶液（２０％ポリエチレングリコ
ール、２．５ＭＮａＣｌ）を６０μｌ加えて混合し、氷
中に１５分間静置した。遠心分離により沈殿したＤＮＡ
断片を分離し、７０％エタノールで洗浄後、真空乾燥し
た。これを適量の蒸留水に溶解し、塩基配列決定用ＤＮ
Ａを調製した。このＤＮＡをテンプレートとし、ＰＲＩ
ＳＭ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（パーキンエルマー）を用いたジデオキシ・チェーン・
ターミネーター法によりＤＮＡ断片の蛍光ラベルを行
い、ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析して塩基配列を決定し
た。結果、マルトースホスホリラーゼのＮ末端から５番
目のＡｒｇ以降をコードする３８１塩基対のＤＮＡ断片
であることが判明した。
し、このプラスミドをテンプレートそして、プラスミド
ベクターｐＵＣ１８のＤＮＡを基に化学合成により作製
した、２種類の合成オリゴヌクレオチドＦＰ（５´−Ｇ
ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧ−３´）及びＲＰ
（５´−ＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ−３
´）をプライマーとして、前述の反応条件でＰＣＲを行
い、ｐＵＣ１８に挿入したＤＮＡ断片の増幅行った。反
応液９０μｌにＰＥＧ溶液（２０％ポリエチレングリコ
ール、２．５ＭＮａＣｌ）を６０μｌ加えて混合し、氷
中に１５分間静置した。遠心分離により沈殿したＤＮＡ
断片を分離し、７０％エタノールで洗浄後、真空乾燥し
た。これを適量の蒸留水に溶解し、塩基配列決定用ＤＮ
Ａを調製した。このＤＮＡをテンプレートとし、ＰＲＩ
ＳＭ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（パーキンエルマー）を用いたジデオキシ・チェーン・
ターミネーター法によりＤＮＡ断片の蛍光ラベルを行
い、ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析して塩基配列を決定し
た。結果、マルトースホスホリラーゼのＮ末端から５番
目のＡｒｇ以降をコードする３８１塩基対のＤＮＡ断片
であることが判明した。
【０１５０】［実施例２−３］ 耐熱性マルトースホス
ホリラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の
取得とその塩基配列の決定 実施例２−１で調製した染色体ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、ＥｃｏＲ
Ｉ等の各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動
を行った。分離したＤＮＡ断片を常法によりナイロン膜
Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（デ
ュポン）に固定した。実施例２−２で得た３８１塩基対
のＤＮＡ断片をＲａｎｄａｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ
Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株））を用いたラ
ンダムプライマーＤＮＡラベリング法により放射性同位
体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定したＤＮＡ
断片とＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．らの方法（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３−５１７，１９７５）に
従ってサザンハイブリダイズさせた。条件は、５ＸＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．５ｍｇ
／ｍｌサケ変性ＤＮＡからなる溶液中において、６５℃
で１６〜２０時間ハイブリダイズを行い、その後２ＸＳ
ＳＣ、１％ＳＤＳからなる溶液中にて６５℃で３０分間
のサイクルで３回ナイロン膜を洗浄した。
ホリラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の
取得とその塩基配列の決定 実施例２−１で調製した染色体ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、ＥｃｏＲ
Ｉ等の各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動
を行った。分離したＤＮＡ断片を常法によりナイロン膜
Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（デ
ュポン）に固定した。実施例２−２で得た３８１塩基対
のＤＮＡ断片をＲａｎｄａｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ
Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株））を用いたラ
ンダムプライマーＤＮＡラベリング法により放射性同位
体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定したＤＮＡ
断片とＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．らの方法（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３−５１７，１９７５）に
従ってサザンハイブリダイズさせた。条件は、５ＸＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．５ｍｇ
／ｍｌサケ変性ＤＮＡからなる溶液中において、６５℃
で１６〜２０時間ハイブリダイズを行い、その後２ＸＳ
ＳＣ、１％ＳＤＳからなる溶液中にて６５℃で３０分間
のサイクルで３回ナイロン膜を洗浄した。
【０１５１】その結果、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断
して生成した約２，５００塩基対のＤＮＡ断片がハイブ
リダイズした。
して生成した約２，５００塩基対のＤＮＡ断片がハイブ
リダイズした。
【０１５２】そこで、実施例２−２で得た３８１塩基対
のＤＮＡ断片の塩基配列を基に、５´−ＧＡＴＧＧＴＣ
ＡＣＣＧＧＡＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＴＣ−３´及び５´
−ＧＡＴＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧ
Ａ−３´で表されるオリゴヌクレオチドＭＬ及びＭＲを
化学合成した。一方、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩ
で切断後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造
（株））を用いてライゲーションを行ったＤＮＡをテン
プレート、ＭＬ及びＭＲをプライマーとしてＧｅｎｅＡ
ｍｐ ＸＬ ＰＣＲ Ｋｉｔ（パーキンエルマー）を用
いてＰＣＲを行った。反応条件は、９５℃で３分間加熱
後、９５℃で３０秒間、６５℃で８分間のサイクルを３
２回繰り返してから、最後に７２℃で１２分間保温し
た。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約
２，５００塩基対のＤＮＡ断片が検出されたので、アガ
ロースゲルよりこのＤＮＡ断片をＤＥ８１ペーパ（ワッ
トマン）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片は超音
波処理によって５００〜１０００塩基対の大きさに小断
片化した後、ＲＴＧｐＵＣ１８ＳｍａＩ／ＢＡＰ＋Ｌｉ
ｇａｓｅ（ファルマシア）を用いてプラスミドベクター
ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位に挿入した。そして、この組
換えプラスミドをコンピテントセルＥｃｏｌｉＪＭ１０
９（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。
のＤＮＡ断片の塩基配列を基に、５´−ＧＡＴＧＧＴＣ
ＡＣＣＧＧＡＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＴＣ−３´及び５´
−ＧＡＴＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧ
Ａ−３´で表されるオリゴヌクレオチドＭＬ及びＭＲを
化学合成した。一方、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩ
で切断後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造
（株））を用いてライゲーションを行ったＤＮＡをテン
プレート、ＭＬ及びＭＲをプライマーとしてＧｅｎｅＡ
ｍｐ ＸＬ ＰＣＲ Ｋｉｔ（パーキンエルマー）を用
いてＰＣＲを行った。反応条件は、９５℃で３分間加熱
後、９５℃で３０秒間、６５℃で８分間のサイクルを３
２回繰り返してから、最後に７２℃で１２分間保温し
た。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約
２，５００塩基対のＤＮＡ断片が検出されたので、アガ
ロースゲルよりこのＤＮＡ断片をＤＥ８１ペーパ（ワッ
トマン）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片は超音
波処理によって５００〜１０００塩基対の大きさに小断
片化した後、ＲＴＧｐＵＣ１８ＳｍａＩ／ＢＡＰ＋Ｌｉ
ｇａｓｅ（ファルマシア）を用いてプラスミドベクター
ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位に挿入した。そして、この組
換えプラスミドをコンピテントセルＥｃｏｌｉＪＭ１０
９（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。
【０１５３】得られた形質転換大腸菌から組換えプラス
ミドを抽出し、このプラスミドをテンプレート、オリゴ
ヌクレオトドＦＰ及びＲＰをプライマーとして実施例２
−２と同じ反応条件でＰＣＲを行った。反応液から増幅
したＤＮＡ断片を精製し、塩基配列決定用ＤＮＡを調製
した。そして、このＤＮＡ断片をテンプレートとしてＰ
ＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ（パーキンエルマー）を用いた蛍光ラベル反応を行
い、ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析して塩基配列を決定し
た。決定した全ての塩基配列をコンピューターソフトＧ
ＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエアー開発（株））を
用いて解析し、約２，５００塩基対のＤＮＡ断片の塩基
配列を決定した。
ミドを抽出し、このプラスミドをテンプレート、オリゴ
ヌクレオトドＦＰ及びＲＰをプライマーとして実施例２
−２と同じ反応条件でＰＣＲを行った。反応液から増幅
したＤＮＡ断片を精製し、塩基配列決定用ＤＮＡを調製
した。そして、このＤＮＡ断片をテンプレートとしてＰ
ＲＩＳＭＴＭ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ（パーキンエルマー）を用いた蛍光ラベル反応を行
い、ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析して塩基配列を決定し
た。決定した全ての塩基配列をコンピューターソフトＧ
ＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエアー開発（株））を
用いて解析し、約２，５００塩基対のＤＮＡ断片の塩基
配列を決定した。
【０１５４】次に、この決定した配列の３´側に見られ
る制限酵素ＢｓｔｐＩ認識配列以降の塩基配列を基に、
５´−ＧＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡ
ＣＡＧ−３´及び５´−ＡＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＡ
ＣＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧ−３´で表されるオリゴヌクレ
オチドＭＬ２及びＭＲ２を化学合成した。一方、染色体
ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔｐＩで切断した後、上述と同様
にライゲーションしたＤＮＡをテンプレート、ＭＬ２及
びＭＲ２をプライマーとして実施例２−２と同じ反応条
件でＰＣＲを行った。反応液をアガロースゲル電気泳動
したところ約４，０００塩基対のＤＮＡ断片が検出され
た。そこで、この約４，０００塩基対のＤＮＡ断片の塩
基配列の決定を行った。その結果、先に決定したマルト
ースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ断片の３´端以
降の配列が決定できた。両配列より決定した耐熱性マル
トースホスホリラーゼをコードする塩基配列を配列表に
おける配列番号３に示す。
る制限酵素ＢｓｔｐＩ認識配列以降の塩基配列を基に、
５´−ＧＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡ
ＣＡＧ−３´及び５´−ＡＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＡ
ＣＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧ−３´で表されるオリゴヌクレ
オチドＭＬ２及びＭＲ２を化学合成した。一方、染色体
ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔｐＩで切断した後、上述と同様
にライゲーションしたＤＮＡをテンプレート、ＭＬ２及
びＭＲ２をプライマーとして実施例２−２と同じ反応条
件でＰＣＲを行った。反応液をアガロースゲル電気泳動
したところ約４，０００塩基対のＤＮＡ断片が検出され
た。そこで、この約４，０００塩基対のＤＮＡ断片の塩
基配列の決定を行った。その結果、先に決定したマルト
ースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ断片の３´端以
降の配列が決定できた。両配列より決定した耐熱性マル
トースホスホリラーゼをコードする塩基配列を配列表に
おける配列番号３に示す。
【０１５５】［実施例２−４］ 組換えプラスミドｐＲ
ＭＰ１と形質転換大腸菌ＲＭＰ１の調製 実施例２−３で決定した塩基配列より、マルトースホス
ホリラーゼをコードするＤＮＡ配列の開始コドン上流１
６９塩基目からの配列５´−ＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴ
ＧＣＣＣＴＴＣＡ−３´で表されるオリゴヌクレオチド
５ＭＰと、終止コドン下流１８０塩基目からの配列のア
ンチセンス配列５´−ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＡＴ
ＧＴＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＧＴ−３´で表されるオリゴ
ヌクレオチド３ＭＰを化学合成した。実施例２−１で調
製した染色体ＤＮＡをテンプレートとし、５ＭＰと３Ｍ
Ｐをプライマーとして実施例２−２と同じ反応条件でＰ
ＣＲを行い、２，６５５塩基対のＤＮＡ断片を得た。
ＭＰ１と形質転換大腸菌ＲＭＰ１の調製 実施例２−３で決定した塩基配列より、マルトースホス
ホリラーゼをコードするＤＮＡ配列の開始コドン上流１
６９塩基目からの配列５´−ＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴ
ＧＣＣＣＴＴＣＡ−３´で表されるオリゴヌクレオチド
５ＭＰと、終止コドン下流１８０塩基目からの配列のア
ンチセンス配列５´−ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＡＴ
ＧＴＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＧＴ−３´で表されるオリゴ
ヌクレオチド３ＭＰを化学合成した。実施例２−１で調
製した染色体ＤＮＡをテンプレートとし、５ＭＰと３Ｍ
Ｐをプライマーとして実施例２−２と同じ反応条件でＰ
ＣＲを行い、２，６５５塩基対のＤＮＡ断片を得た。
【０１５６】この２，６５５塩基対のＤＮＡ断片を、Ｏ
ｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１にライゲー
ション後、大腸菌ＩＮＶａＦ’（ｅｎｄＡｌ，ｒｅｃＡ
１，ｈｓｄＲ１７（ｒ−ｋ，ｍ＋ｋ），ｓｕｐＥ４４，
λ−，ｔｈｉ−１，ｇｙｒＡ，ｒｅｌＡｌ，φ８０ｌａ
ｃＺ△Ｍ１５△（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ），ｄｅｏＲ
＋，Ｆ’）株への導入を行い、２，６５５塩基対のＤＮ
Ａ断片が組み込まれた組換えプラスミドｐＲＭＰ１（図
５）を有する形質転換大腸菌ＲＭＰ１を得た。
ｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１にライゲー
ション後、大腸菌ＩＮＶａＦ’（ｅｎｄＡｌ，ｒｅｃＡ
１，ｈｓｄＲ１７（ｒ−ｋ，ｍ＋ｋ），ｓｕｐＥ４４，
λ−，ｔｈｉ−１，ｇｙｒＡ，ｒｅｌＡｌ，φ８０ｌａ
ｃＺ△Ｍ１５△（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ），ｄｅｏＲ
＋，Ｆ’）株への導入を行い、２，６５５塩基対のＤＮ
Ａ断片が組み込まれた組換えプラスミドｐＲＭＰ１（図
５）を有する形質転換大腸菌ＲＭＰ１を得た。
【０１５７】上記の形質転換大腸菌ＲＭＰ１をＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＭＰ１と命名し（受託番
号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６１３２）、工業技術院生命工学
工業技術試験所に平成９年３月１２日に寄託した。
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＭＰ１と命名し（受託番
号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６１３２）、工業技術院生命工学
工業技術試験所に平成９年３月１２日に寄託した。
【０１５８】そして、形質転換大腸菌ＲＭＰ１を培養
し、培養液から組換えプラスミドｐＲＭＰ１を抽出し、
導入した２，６５５塩基対のＤＮＡ断片の塩基配列の解
析を行った。その塩基配列を、配列表の配列番号１に示
す。
し、培養液から組換えプラスミドｐＲＭＰ１を抽出し、
導入した２，６５５塩基対のＤＮＡ断片の塩基配列の解
析を行った。その塩基配列を、配列表の配列番号１に示
す。
【０１５９】この配列より、組み込んだ２，６５５塩基
対のＤＮＡ断片の塩基配列は、実施例２−３で決定した
耐熱性マルトースホスホリラーゼのＤＮＡ配列の配列番
号３の１５０６〜４１６０と一致することが判明し、組
換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードしている
ことが確認できた。
対のＤＮＡ断片の塩基配列は、実施例２−３で決定した
耐熱性マルトースホスホリラーゼのＤＮＡ配列の配列番
号３の１５０６〜４１６０と一致することが判明し、組
換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードしている
ことが確認できた。
【０１６０】
【実施例３】 形質転換大腸菌ＲＰＭ１が生産する組換
え耐熱性マルトースホスホリラーゼの酵素化学的特性 ［実施例３−１］ 組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼの精製 バクトトリプトン１．６％、酵母エキス１．０％、Ｎａ
Ｃ１０．５％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌ
を５００ｍｌ三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間
オートクレーブ殺菌した後、濾過滅菌した１０ｍｇ／ｍ
ｌアンピシリン水溶液０．５ｍｌを添加したものに、実
施例２で得られた形質転換大腸菌ＲＭＰ１を１白金耳植
菌し、３７℃で１６時間回転振とう培養したものを種培
養液とした。
え耐熱性マルトースホスホリラーゼの酵素化学的特性 ［実施例３−１］ 組換え耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼの精製 バクトトリプトン１．６％、酵母エキス１．０％、Ｎａ
Ｃ１０．５％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌ
を５００ｍｌ三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間
オートクレーブ殺菌した後、濾過滅菌した１０ｍｇ／ｍ
ｌアンピシリン水溶液０．５ｍｌを添加したものに、実
施例２で得られた形質転換大腸菌ＲＭＰ１を１白金耳植
菌し、３７℃で１６時間回転振とう培養したものを種培
養液とした。
【０１６１】容量５１のファーメンターにポリペプトン
２％、酵母エキス１％、グルコース０．５％、ＮａＣ１
０．５％、ＭｇＳＯ４０．０５％を含有する培地（ｐＨ
７．０）約３１を入れて滅菌後、予め濾過滅菌したアン
ピシリン水溶液を１００ｍｇ／ｌになるように添加し、
温度を３５℃とした後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種し
て、３５℃、ｐＨ６．５〜７．５に保持しながら２４時
間通気攪拌培養した。
２％、酵母エキス１％、グルコース０．５％、ＮａＣ１
０．５％、ＭｇＳＯ４０．０５％を含有する培地（ｐＨ
７．０）約３１を入れて滅菌後、予め濾過滅菌したアン
ピシリン水溶液を１００ｍｇ／ｌになるように添加し、
温度を３５℃とした後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種し
て、３５℃、ｐＨ６．５〜７．５に保持しながら２４時
間通気攪拌培養した。
【０１６２】培養終了後、培養液を連続的に超音波処理
して菌体の破壊を行った。これを遠心分離し菌体残渣を
除去した培養液上清を得た。この上清を限外濾過によっ
て約１００ｍｌまで濃縮した後、１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）を３１加えて、再度１００ｍｌまで濃縮
し、粗酵素液を得た。粗酵素液のマルトースホスホリラ
ーゼ活性は２，１００単位／ｍｌで、マルターゼ活性は
検出されなかった。
して菌体の破壊を行った。これを遠心分離し菌体残渣を
除去した培養液上清を得た。この上清を限外濾過によっ
て約１００ｍｌまで濃縮した後、１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）を３１加えて、再度１００ｍｌまで濃縮
し、粗酵素液を得た。粗酵素液のマルトースホスホリラ
ーゼ活性は２，１００単位／ｍｌで、マルターゼ活性は
検出されなかった。
【０１６３】そこで、この粗酵素液を実施例１−１と同
様にして精製を行い、ネイティブポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で単一タンパク質であることを確認した。
様にして精製を行い、ネイティブポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で単一タンパク質であることを確認した。
【０１６４】［実施例３−２］ 組換え耐熱性マルトー
スホスホリラーゼの酵素化学的特性 実施例３−１の精製した組換え耐熱性マルトースホスホ
リラーゼの酵素化学的特性は実施例１−２と同様にして
調べた。以下に結果を示す。
スホスホリラーゼの酵素化学的特性 実施例３−１の精製した組換え耐熱性マルトースホスホ
リラーゼの酵素化学的特性は実施例１−２と同様にして
調べた。以下に結果を示す。
【０１６５】（１）作用 マルトースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リ
ン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグル
コースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコ
ースとグルコース−１−リン酸に作用させると等モルの
マルトースとリン酸を生成する。
ン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグル
コースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコ
ースとグルコース−１−リン酸に作用させると等モルの
マルトースとリン酸を生成する。
【０１６６】（２）基質特異性 トレハロース、ネオトレハロース、マルトース、イソマ
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐ−トロフ
ェノール−α−グルコシド、ｐ−ニトロフェノール−β
−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行ったと
ころ、マルトース以外にはグルコースの生成が認められ
なかった。
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐ−トロフ
ェノール−α−グルコシド、ｐ−ニトロフェノール−β
−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行ったと
ころ、マルトース以外にはグルコースの生成が認められ
なかった。
【０１６７】（３）至適温度 ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたとこ
ろ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は６０℃〜
７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５
０％以上を示した。
０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたとこ
ろ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は６０℃〜
７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５
０％以上を示した。
【０１６８】（４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にてインキュベー
トし、残存活性を測定したところ、６０℃で１５分間処
理で、無処理の８０％以上の活性を示した。
トし、残存活性を測定したところ、６０℃で１５分間処
理で、無処理の８０％以上の活性を示した。
【０１６９】（５）至適ｐＨ ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０
〜８．０）と２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜
９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．
０〜７．０であった。
〜８．０）と２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜
９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．
０〜７．０であった。
【０１７０】（６）ｐＨ安定性 １００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
０〜８．０）と１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５
〜８．０で安定であった。
０〜８．０）と１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ５．５
〜８．０で安定であった。
【０１７１】（７）失活 １００℃、１０分間の加熱で１００％失活した。
【０１７２】（８）分子量 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテ
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量の比較から分
子量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万で
あった。
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量の比較から分
子量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万で
あった。
【０１７３】また、ＳＤＳゲル電気泳動により、各種標
準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は
７．５万〜９．５万であった。
準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は
７．５万〜９．５万であった。
【０１７４】（９）等電点 等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移
動度から等電点は４．７〜５．１であった。
動度から等電点は４．７〜５．１であった。
【０１７５】（１０）阻害剤 １ｍＭのＨｇＣｌ２で９９％、ＺｎＳＯ４で３５％の活
性阻害が見られた。
性阻害が見られた。
【０１７６】（１１）Ｎ末端アミノ酸配列 常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロ
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番
号２に示すアミノ酸配列を有していた。
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番
号２に示すアミノ酸配列を有していた。
【０１７７】この結果から、組換え耐熱性マルトースホ
スホリラーゼは、耐熱性マルトースホスホリラーゼと同
じ酵素化学的性質を有することが確認された。
スホリラーゼは、耐熱性マルトースホスホリラーゼと同
じ酵素化学的性質を有することが確認された。
【０１７８】
【実施例４】 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼ
を用いたトレハロースの製造 ［実施例４−１］ 耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
の調製 肉エキス０．１２％、ポリペプトン０．４％、ＮａＣ１
０．２を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５０
０ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入れ、１２１
℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、バチルス
・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１
４５６７）を１白金耳植菌し、５５℃にて１６時間振と
う培養したものを種培養液とした。
を用いたトレハロースの製造 ［実施例４−１］ 耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
の調製 肉エキス０．１２％、ポリペプトン０．４％、ＮａＣ１
０．２を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５０
０ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入れ、１２１
℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、バチルス
・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１
４５６７）を１白金耳植菌し、５５℃にて１６時間振と
う培養したものを種培養液とした。
【０１７９】容量５１のファーメンターに酵母エキス１
％、ポリペプトン２％、トレハロース１％を含有する培
地（ｐＨ７．０）約３１を入れて滅菌し、温度を５５℃
とした後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種し、５５℃、ｐＨ
６．０〜７．０に保持しながら４０時間通気攪拌培養し
た。
％、ポリペプトン２％、トレハロース１％を含有する培
地（ｐＨ７．０）約３１を入れて滅菌し、温度を５５℃
とした後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種し、５５℃、ｐＨ
６．０〜７．０に保持しながら４０時間通気攪拌培養し
た。
【０１８０】培養終了後、培養物を遠心分離により菌体
を分離し、上清に硫安を８０％飽和に溶解し、析出した
タンパク質を遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対し
て透析を行い、濃縮後約２２０単位／ｍｌ粗酵素液を２
０ｍｌ得た。
を分離し、上清に硫安を８０％飽和に溶解し、析出した
タンパク質を遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対し
て透析を行い、濃縮後約２２０単位／ｍｌ粗酵素液を２
０ｍｌ得た。
【０１８１】［実施例４−２］ マルトースからトレハ
ロースの生成反応 実施例４−１で調製した耐熱性トレハロースホスホリラ
ーゼ粗酵素液と実施例３−１で調製した組換え型マルト
ースホスホリラーゼ粗酵素液を用いて、基質のマルトー
スに作用させトレハロースヘ変換させた。
ロースの生成反応 実施例４−１で調製した耐熱性トレハロースホスホリラ
ーゼ粗酵素液と実施例３−１で調製した組換え型マルト
ースホスホリラーゼ粗酵素液を用いて、基質のマルトー
スに作用させトレハロースヘ変換させた。
【０１８２】反応液はマルトース濃度３０Ｗ／Ｗ％、リ
ン酸濃度１０ｍＭ、粗酵素各１０単位／ｇとなるように
添加し、酢酸緩衝液でｐＨ５．０に調製した。反応は６
０℃で４８時間行った。反応の停止は１０分間１００℃
に加熱して行った。反応終了後、各反応液をＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））、溶離液ア
セトニトリル／水（７６／２４）、流速０．８ｍｌ／ｍ
ｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折計Ｓｈｏｄｅｘ（昭
和電工（株））を検出手段とする高速液体クロマトグラ
フィーにより反応液の糖組成を定量した。また、β−グ
ルコース−１−リン酸は反応液を陰イオン交換カラムと
示差屈析計を用いた高速液体クロマトグラフィーにより
定量した。結果、基質マルトースの６５％がトレハロー
スに変換された。
ン酸濃度１０ｍＭ、粗酵素各１０単位／ｇとなるように
添加し、酢酸緩衝液でｐＨ５．０に調製した。反応は６
０℃で４８時間行った。反応の停止は１０分間１００℃
に加熱して行った。反応終了後、各反応液をＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））、溶離液ア
セトニトリル／水（７６／２４）、流速０．８ｍｌ／ｍ
ｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折計Ｓｈｏｄｅｘ（昭
和電工（株））を検出手段とする高速液体クロマトグラ
フィーにより反応液の糖組成を定量した。また、β−グ
ルコース−１−リン酸は反応液を陰イオン交換カラムと
示差屈析計を用いた高速液体クロマトグラフィーにより
定量した。結果、基質マルトースの６５％がトレハロー
スに変換された。
【０１８３】
【実施例５】 トレハロース含有糖液、及びその粉末の
製造 コーンスターチにα−アミラーゼを作用させた澱粉液化
液に枝切り酵素プロモザイム（ノボノルディクスバイオ
インダストリー）とβ−アミラーゼ（長瀬産業（株））
を作用させて調製したマルトース高含有糖液（固形分３
０Ｗ／Ｗ％、固形分当たりのマルトース純度８０％）
に、実施例４−１で調製した組換え型マルトースホスホ
リラーゼ粗酵素液と実施例４−２で調製したバチルス・
ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
５６７）の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液
をそれぞれ固形分１ｇ当たり１０単位になるように加
え、さらに、リン酸濃度１０ｍＭになるようにリン酸カ
リウムを加えて、６０℃、ｐＨ５．０で４８時間反応さ
せ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ
た。
製造 コーンスターチにα−アミラーゼを作用させた澱粉液化
液に枝切り酵素プロモザイム（ノボノルディクスバイオ
インダストリー）とβ−アミラーゼ（長瀬産業（株））
を作用させて調製したマルトース高含有糖液（固形分３
０Ｗ／Ｗ％、固形分当たりのマルトース純度８０％）
に、実施例４−１で調製した組換え型マルトースホスホ
リラーゼ粗酵素液と実施例４−２で調製したバチルス・
ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
５６７）の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液
をそれぞれ固形分１ｇ当たり１０単位になるように加
え、さらに、リン酸濃度１０ｍＭになるようにリン酸カ
リウムを加えて、６０℃、ｐＨ５．０で４８時間反応さ
せ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ
た。
【０１８４】この反応液を活性炭で脱色し、イオン交換
樹脂で脱塩した後、濃度約７５％まで濃縮し、トレハロ
ース含有糖液を得た。この糖液を実施例４−３と同様に
高速液体クロマトグラフィーによって分析した結果、固
形分当たりの割合はグルコース２．８％、トレハロース
６３．２％、マルトース２０．５％、マルトトリオース
５．１％、その他マルトオリゴ糖８．４％であった。
樹脂で脱塩した後、濃度約７５％まで濃縮し、トレハロ
ース含有糖液を得た。この糖液を実施例４−３と同様に
高速液体クロマトグラフィーによって分析した結果、固
形分当たりの割合はグルコース２．８％、トレハロース
６３．２％、マルトース２０．５％、マルトトリオース
５．１％、その他マルトオリゴ糖８．４％であった。
【０１８５】また、前記反応液に固形分１ｇ当たり１単
位になるようにグルコアミラーゼ（生化学工業（株））
を加え、５５℃で８時間反応させ、次いで１００℃で１
０分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を活性炭
で脱色し、イオン交換樹脂で脱塩した後、濃度約５０％
まで濃縮し、ナトリウム型イオン交換カラムで分離を行
い、トレハロース画分を分取した。この分取した糖液を
濃縮し、固形分７５％で固形分当たり９５％のトレハロ
ースを含有するトレハロース高含有糖液を得た。
位になるようにグルコアミラーゼ（生化学工業（株））
を加え、５５℃で８時間反応させ、次いで１００℃で１
０分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を活性炭
で脱色し、イオン交換樹脂で脱塩した後、濃度約５０％
まで濃縮し、ナトリウム型イオン交換カラムで分離を行
い、トレハロース画分を分取した。この分取した糖液を
濃縮し、固形分７５％で固形分当たり９５％のトレハロ
ースを含有するトレハロース高含有糖液を得た。
【０１８６】さらに、このトレハロース高含有糖液を濃
縮後乾燥することにより粉末トレハロースを得た。
縮後乾燥することにより粉末トレハロースを得た。
【０１８７】以上の結果から、組換え耐熱性マルトース
ホスホリラーゼを利用して、トレハロースを製造するこ
とが出来ることが確認された。
ホスホリラーゼを利用して、トレハロースを製造するこ
とが出来ることが確認された。
【０１８８】
【発明の効果】本発明は、本発明者らが見出した、好熱
性バチルス属細菌、特にバチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５０４４）由来の耐熱性マルトースホスホ
リラーゼ遺伝子を基に、遺伝子工学的手法により、組換
え耐熱性マルトースホスホリラーゼを得、これを用いて
組換え微生物を作製したものであって、これを培養すれ
ば、酵素の生産性が飛躍的に上昇し、不純物の少ない、
高純度組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを効率よ
く製造できるＤＮＡを得た点で極めて優れている。
性バチルス属細菌、特にバチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５０４４）由来の耐熱性マルトースホスホ
リラーゼ遺伝子を基に、遺伝子工学的手法により、組換
え耐熱性マルトースホスホリラーゼを得、これを用いて
組換え微生物を作製したものであって、これを培養すれ
ば、酵素の生産性が飛躍的に上昇し、不純物の少ない、
高純度組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを効率よ
く製造できるＤＮＡを得た点で極めて優れている。
【０１８９】また、このように、組換え耐熱性マルトー
スホスホリラーゼが工業的規模で大量に、効率よく生産
できるようになった結果、これを利用することにより、
有用なトレハロースの製造が飛躍的に効率よく製造する
ことができる点においても、非常に価値がある。
スホスホリラーゼが工業的規模で大量に、効率よく生産
できるようになった結果、これを利用することにより、
有用なトレハロースの製造が飛躍的に効率よく製造する
ことができる点においても、非常に価値がある。
配列番号：１ 配列の長さ：２６５５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチルスｓｐ 株名：ＲＫ−１ 配列の特徴 特徴を示す記号：５’ＵＴＲ 存在位置：１．．１８１ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１８２．．２４５５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を示す記号：３’ＵＴＲ 存在位置：２４５５．．２６５５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列番号２ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの型：Ｎ末端フラグメント 配列番号３ 配列の長さ：５９８７ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチルスｓｐ 株名：ＲＫ−１
【図１】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼの至
適温度
適温度
【図２】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼの熱
安定性
安定性
【図３】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼの至
適ｐＨ
適ｐＨ
【図４】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼのｐ
Ｈ安定性
Ｈ安定性
【図５】本発明のプラスミドベクターｐＲＭＰ１の構造
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 19/12 Ｃ１２Ｐ 19/12 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 大島 良恵 千葉県船橋市日の出２−20−２ 昭和産業 株式会社総合研究所内 (72)発明者 山根 國男 茨城県土浦市常名4016−44
Claims (12)
- 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
る遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の内、塩基
番号１８２〜２４５５で表される塩基配列からなるＤＮ
Ａ。 （ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ下記の酵素化学的
性質を有する組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼを
コードするＤＮＡ。 （１）作用 マルトースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リ
ン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグル
コースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコ
ースとグルコース−１−リン酸に作用させると等モルの
マルトースとリン酸を生成する。 （２）基質特異性 マルトースに特異的に作用する。 （３）至適温度 マルトース加リン酸分解反応の至適温度は６０℃〜７０
℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５０％
以上を示す。 （４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６０℃、１５
分間処理後８０％以上の活性を有する。 （５）至適ｐＨ ６．０〜７．０。 （６）ｐＨ安定性 ｐＨ５．５〜８．０で安定。 （７）失活 １００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。 （８）分子量 ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した値は１５万
〜１９万。 （９）等電点 ４．７〜５．１。 （１０）阻害剤 ＨｇＣｌ２で著しく活性が阻害される。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列の
内、塩基番号１８２〜２４５５で表される塩基配列から
なるＤＮＡが好熱性バチルス属細菌由来のものである請
求項１記載の遺伝子。 - 【請求項３】 好熱性バチルス属細菌由来のものがバチ
ルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）であ
る請求項１又は請求項２に記載の遺伝子。 - 【請求項４】 請求項１、２又は３に記載の遺伝子を含
む組換えベクター。 - 【請求項５】 遺伝子がバチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５０４４）の染色体由来の２，６５５塩基
対のＤＮＡ断片である請求項４記載の組換えベクター。 - 【請求項６】 遺伝子がバチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５０４４）の耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼをコードする遺伝子部分である２，２７４塩基対の
ＤＮＡ断片である請求項４記載の組換えベクター。 - 【請求項７】 ベクターがプラスミドベクターｐＲＭＰ
１由来のものである請求項４、５又は６記載の組換えベ
クター。 - 【請求項８】 請求項４、５、６又は７に記載の組換え
ベクターを含む形質転換体。 - 【請求項９】 形質転換体が大腸菌である請求項８記載
の形質転換体。 - 【請求項１０】 請求項８又は請求項９に記載の組換え
形質転換体を培養して、組換え耐熱性マルトースホスホ
リラーゼを製造する方法。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の組換え耐熱性マル
トースホスホリラーゼ及び耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸
塩とを、水性媒体中で、反応させることを特徴とするト
レハロース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方
法。 - 【請求項１２】 請求項１１の反応が５５〜７０℃、ｐ
Ｈ４．５〜８．０で行われる請求項１１記載のトレハロ
ース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9109996A JPH10262683A (ja) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9109996A JPH10262683A (ja) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10262683A true JPH10262683A (ja) | 1998-10-06 |
Family
ID=14524460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9109996A Pending JPH10262683A (ja) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10262683A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10327887A (ja) * | 1997-03-31 | 1998-12-15 | Showa Sangyo Co Ltd | 組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体とその産生物 |
| US6770475B1 (en) | 1999-03-08 | 2004-08-03 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Promoters |
| WO2005003343A1 (ja) * | 2003-07-04 | 2005-01-13 | Independent Administrative Institution, Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | 新規微生物、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ並びにその製造方法 |
| JP2008301720A (ja) * | 2007-06-05 | 2008-12-18 | Japan Agengy For Marine-Earth Science & Technology | 新規なマルトースホスホリラーゼ、その製造方法、およびその利用方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08131166A (ja) * | 1994-11-04 | 1996-05-28 | Showa Sangyo Co Ltd | 耐熱性トレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、及び該酵素を用いるトレハロースの製造方法 |
| JPH0937780A (ja) * | 1995-07-31 | 1997-02-10 | Showa Sangyo Co Ltd | 耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法 |
-
1997
- 1997-03-25 JP JP9109996A patent/JPH10262683A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08131166A (ja) * | 1994-11-04 | 1996-05-28 | Showa Sangyo Co Ltd | 耐熱性トレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、及び該酵素を用いるトレハロースの製造方法 |
| JPH0937780A (ja) * | 1995-07-31 | 1997-02-10 | Showa Sangyo Co Ltd | 耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| EUR. J. BIOCHEM., vol. 191, no. 3, JPN4006012084, pages 715 - 720, ISSN: 0000756905 * |
| EUR. J. BIOCHEM., vol. 191, no. 3, JPNX006057220, pages 715 - 720, ISSN: 0000794187 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10327887A (ja) * | 1997-03-31 | 1998-12-15 | Showa Sangyo Co Ltd | 組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体とその産生物 |
| US6770475B1 (en) | 1999-03-08 | 2004-08-03 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Promoters |
| WO2005003343A1 (ja) * | 2003-07-04 | 2005-01-13 | Independent Administrative Institution, Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | 新規微生物、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ並びにその製造方法 |
| JP2008301720A (ja) * | 2007-06-05 | 2008-12-18 | Japan Agengy For Marine-Earth Science & Technology | 新規なマルトースホスホリラーゼ、その製造方法、およびその利用方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4915917B2 (ja) | ラクト−ｎ−ビオースｉ及びガラクト−ｎ−ビオースの製造方法 | |
| JP3557289B2 (ja) | 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素 | |
| HU195533B (en) | Process for producing microorganisms modificated with genetical engineering for producing amilase | |
| CN101636491A (zh) | 由gras表达的食品级嗜热性阿拉伯糖异构酶以及使用其制备塔格糖的方法 | |
| EP0671470B1 (en) | Trehalose releasing enzyme, DNA encoding therefor, their preparation and uses | |
| JP3810457B2 (ja) | マルトースをトレハロースに変換する組換え型耐熱性酵素 | |
| JP3557288B2 (ja) | 還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素 | |
| EP0674005B1 (en) | Non-reducing saccharide-forming enzyme, DNA encoding it, and their preparations and uses | |
| JP2003523203A (ja) | Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌単離体およびそれから単離されたイソマルツロース・シンターゼ遺伝子 | |
| JP3559609B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| JP3557272B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| JPH10262683A (ja) | 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物 | |
| EP0695804B1 (en) | DNA encoding for a recombinant enzyme for converting maltose into trehalose | |
| CA2179439A1 (en) | Sucrose metabolism mutants | |
| IE920659A1 (en) | Method of producing d-ribose | |
| JP3691875B2 (ja) | 耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法 | |
| JPH10327887A (ja) | 組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体とその産生物 | |
| EP1233072B1 (en) | Novel use of uridine diphosphate glucose 4-epimerase | |
| JP3557276B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| JP2838798B2 (ja) | イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途 | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| JPH04200386A (ja) | β―フラクトフラノシダーゼ及びその製造方法 | |
| US5763228A (en) | Recombinant enzyme for converting maltose into trehalose from pimelobacter sp. | |
| JP3005870B2 (ja) | シュクロース代謝に関する酵素の遺伝子によって形質転換されたセルロース生産菌 | |
| JPH03198773A (ja) | 新規耐熱性レバンシュークラーゼおよびその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040324 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060725 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061205 |