JPH03198773A - 新規耐熱性レバンシュークラーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、シュークロースからレバンを生成する新規耐
熱性レバンシュークラーゼおよびその製造法に関する。

［従来の技術］ レバンはコレステロール吸収抑制、血圧抑制，整腸作用
、免疫増強などの効果が期待される。

また、加工食品分野においてはデンプンの老化抑制、増
粘材、安定材等として有用である。

レバンシュークラーゼはシュークロースやラフィノース
のβ−フラクトシル基をシュークロースやラフィノース
に転移させ、β−２，６結合のレバンを生成する酵素で
ある。

これまテＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｍｅｔ
ｈＪｊｎｚｙｍｏｌ、８．５００−５０５）　　、　Ａ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒ　Ｉｅｖａｎｉｃｕｍ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、＋１３．７９−８３
）　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ　（特公昭５８−４２３５号）や、Ｌｅｕｃｏｎｏｓ
ｔｏｃ属、　Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、　Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ属が生成することが知られている。

しかしながら、上記の微生物はレバンシュークラーゼを
培養液中に生成するため、同時に生成されるレバンとの
分離が困難となりしへンシュークラーゼのみを経済的に
得ることができないことや、酵素の耐熱性不足などの間
開セサがあった。

レバンシュークラーゼの別の用途としては、そのフラク
トシル基転移作用を利用することにより、キシロースや
ラクトースにフラグ）・シル基が転移したキシロシュー
クロースやラフｌ−シュークロースなどの有用オリゴ糖
の製造に使用することが挙げられ、キシロシュークロー
スやラクトシュークロースはビフィズス菌増殖物質や抗
う触性１１味料などとしての利用か期待されている。

現在、これら有用オリゴ糖の製造方法として、バチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｉｆｆｉ　菌起源のしへンシュー
クラーゼ（特開昭５９−３９２８７号）や、アエロバク
タ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌起源のレバンシュー
クラーゼ（特開昭５５−１１１１３８９号）を用いてラ
クトシュークロースを合成する方法、あるいはバチルス
ｅサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）
のレバンシュークラーゼ（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、９
０．５２＋５２Ｅｌ（１９８１））、（特開昭５５−１
１８３８８号〕を用いてシュークロースとキシロースを
合成する方法等が報告されているが、酵素の耐熱性、反
応効率の点から実用化されていない。

本発明は上記事実を考慮し、しへンの製造およびキシロ
シュークロースやラクトシュークロースなどのオリゴ糖
製造に適した耐熱性のレバンシュークラーゼを収率よ〈
生成する方法を提供することを目的とする。

［問題を解決するための手段」 本発明者らは、多くの微生物についてレバンシュークラ
ーゼ生産能の観点から微生物の検索を行ったところ、ロ
ーネラ属の微生物が耐熱性のレバンシュークラーゼを菌
体内に多く蓄積することを見いだし、木発明を完成する
に至った。

本発明のしへンシュークラーゼは後述Ｔる理化学的性質
を有する新規なレバンシュークラーゼであった。

特に受容体としてキシロースやラクトースの糖を用いた
場合、高温下で短時間にシュークロースのフラクトシル
基がこれらの糖に転移し、キシロシュークロースやラク
トシュークロースを生成する。

この新規耐熱性レバンシュークラーゼは、ローネラ属に
属する微生物を好気的に培養した菌体内より酵素を分離
、採取することにより生産される。

菌体からの酵素の分離手段としては公知の酵素精製方法
を用いることができる。

また、培養によって得られたローネラ争アクアティリス
の菌体および菌体処理物を粗酵素として用いることも可
能である。

木発明において使用されるローネラ属としてはローネラ
・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ　ａｑｕａｔｉｌ
　ｉｓ）　（ＪＣＭ−ＩＨ３）が挙げられる。

なお、ローネラ属の微生物のしへンシュークラーゼ生産
能については未だ知られていなかった。

以下に本発明について詳述する。

（Ｉ）木発明に用いる微生物 本発明に用いる微生物は、レバンシュークラーゼ生成能
を有するものであり、ローネラ属に属する菌種である。

その−例として理化学研究所微生物系統保存施設保存の
ローネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ　ａｑｕ
ａｔｉｌｉｓ）（ＪＣＭ−１８８３）が挙げられる。

ここで、本発明における使用微生物としてのローネラ・
アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ　ａｑｕａｔｉｌｉ
ｓ）（ＪＣＭ−１６８３）はその−例であり、その変異
株およびローネラ属に属する菌種でしへンシュークラー
ゼ生成能を有する微生物はすべて本発明方法において使
用することができる。

」二記微生物の培養は、通常用いられる固体培地、液体
培地のどちらをもちいてもよいが液体培地の方が好まし
い。

微生物の培養に使用される培地は、炭素源としては微生
物が利用できる炭素源を用いることが可能であるが、好
ましくはシュークロースまたはグルコースであり、また
窒素源としては、酵母エキス、カセイン、コーンスチー
ブリカー、ペプトン、肉エキスなどの天然窒素源や硫安
、塩安、尿素などの無機窒素化合物を用いることができ
る。

なお、炭素源の濃度は１〜２０％の範囲で、培養時間は
８〜１６時間程度が好適であり、培養は静置培養または
通気攪はん、振とう培養のいずれの方法でも行うことが
できる。

（ＩＩ　）しへンシュークラーゼ レへンシュークラーゼは上記微生物の菌体内で生産され
、菌体破砕物から分離、採取し、菌体からの分離手段と
しては公知の酸素精製方法を用いることができる。微生
物の培養物を粗酵素として用いてもよく、また、塩析法
、担体吸着法、ゲル濾過法、電気泳動法などの精製手段
を用いて精製酵素として使用することもできる。

ローネラ・アクアティリスのレバンシュークラーゼは以
下の理化学的性質を有する新規な酵素である。

■作用および基質特異性 シュークロースやラフィノースからβ フラクトシル基をシュークロースやラ フィノースなど受容体に転移させ、β ＝２，６結合のレバンを生成する。

受容体としてキシロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラ
ビノース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メ
リビオース、マルトテトラオースなど用いた場合、シュ
ークロースのβ−フラクトシル基が受容体に転移し、そ
れぞれに相当するフラクトシル基を有するオリゴ糖を生
成する。

■力価の測定法 １０％シュークロース（ｐＨｆｉ、ｏ、マツクルバイン
（ＭａｃＩｌｖａｉｎｅ）ｌｊＪ衝液）　０．９ｍｌ　
と酵素溶液０．１１Ｉｌｌを混合し、３０℃で３０分間
反応させた後、沸騰浴中で５分間加熱し、反応を停止さ
せた。生成したグルコース量をクルコースオキシターセ
法により測定し、基質シュークロースから１分間に１μ
モルのグルコースを生成する能力を１ユニツト（Ｕ）と
した。

■至適ｐＨおよび安定ｐ）Ｉ＠囲 シュークロースを基質として各ｐＨにおいて３０℃で３
０分間反応させた結果、第１図に示すように至適ｐＨは
ｐＨ５，５〜８．０であった。

また、各ｐＨにおいて３０℃で１２０分間インキュベー
トした後の残存活性を調べたところ、第２図に示すよう
にｐ）１５．０〜９．０の範囲で９０％以−１１の残存
活性を示した。

■作用適温および熱安定性 シュークロースを基質として各温度においてｐＨ５，５
で３０分間反応させた結果、第３図に示すように最適作
用温度は５０〜６０℃であった・ また、各温度においてｐｌ（５，５で１０分間インキュ
ベートした後の残存活性を調べたところ、第４図に示す
ように５０℃まで安定であった。

■阻害 １ｍＭの水銀イオン、銀イオンにより阻害を受け、また
、５０ｍＭのフラクトースによってＯ も阻害された。

■精製方法 前記微生物を超音波破砕機あるいはフレンチプレスを用
いて破砕し、粗酵素を得ることができる。この菌体破砕
物のＦ澄み液を除核酸、塩析を行った後、ＤＥＡｔｊ−
Ｔｏｙｏｐａｒｐａｋ　１３５０Ｍ　（商品名）　、Ｔ
ＳＫｇａｌ　Ｇ３０００ＳＷ（商品名）などを用いたカ
ラムクロマトクラフィーによって精製酵素を分離、採取
することができる。

■分子量 ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷを用いたゲル濾過法によ
る測定で測定した結果、分子量は約１２万であった。

実施例１　菌体の製造 ＫＨ２ＰＯ４２ｇ Ｎａ２ＨＰＯｎｉ２Ｈ２０８ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌｐＨ
７、０ １ ５００ｍ　ｌ容三角フラスコ５０木に上記組成の培地を
それぞれ＋００ｍ１をとり、あらかじめ同培地で前培養
しておいたローネ ラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ　ａｑｕａｔｉ
ｌｉｓＪＣＭ−１８８３）　（７）培養液１ｍｌを接種
し、３０’Ｃテ１６時間ロータリシェーカーで振とぅ培
養（１６０ｒｐｍ）を行った。培養終了後、５１の培養
液から遠心分＠　（８０００ｒｐｍ、１０分間）シテ閑
体を回収した。回収した菌体を蒸留水で４回洗浄後、３
０ＩＩＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）３００ｍｌに懸
濁し、００６６Ｇが２０の菌体懸濁液を得た。

実施例２　酵素の精製 実施例１の方法で得た菌体懸濁液３００ｍ１を低温下で
フレンチプレス菌体破砕機により破Ｒ−（１５００ｋｇ
ｆ／ｃｍ’　）　ｌ、た後、遠心分１１１！（１２００
０ｒｐｍ　１０分間）して上澄み液２９０ｍ　ｌを得た
。この上澄み液の総活性は２４０６ユニツトであった。

上澄み液２９０ｏ＋　１に５％硫酸ストレプトマイシン
３０ｍ１を加え除核酸を行った　２ 後、遠心分離（１２００Ｏｒｐｍ　、　１０分間）シテ
」ニ澄み液３１０ｍ１　を得た。これに９７ｇの硫安を
加え酵素を沈澱させ、沈澱した酵素を遠心分離（１２０
００ｒｐｍ　、　１０分間）後、適当Ｎの３ｈＭリン酸
緩衝液（ＰＨ１３，０）に溶解し、同緩衝液で一夜透析
した。透析後２５ｍ１の粗酵素液を得た。この粗酵素の
総活性は、２２７４ユニツトであった。

この粗酵素液をあらかじめ３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）
ＩＢ、０）で平衡化したＩＩＥＡＥ−Ｔｏｖｏｏａ　ｒ
　１ｐａｋ　６５０Ｍ（２２ｍｍφＸ　２００ｍｍ）カ
ラムに吸着させ、次いで同緩衝液（０〜１．ＯＭ　Ｎａ
１ｌのグラジエン）・）にて溶出し、３５０ｍ１の活性
画分を得た。透析、凍結乾燥、限外濾過を行い１０ｍ１
まで濃縮した。つぎに、あらかじめ３０ｍＭリン酸緩衝
Ｍ　（ｐＨ８，０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０
００ＳＷ（７，８ｍｍφＸ　３００ｍｍ）カラムでゲル
濾過を行い、８４１１１１の活性画分を得た。

さらにＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷで分画を行い、
透析、凍結乾燥後３７３ユニツトの精製酵素を　３ 得た。この酵素は、ＳＯ３電気泳動法で単一。

のバンドを示した。精製酵素の比活性は１２０７ユニツ
ト／ｍｇ　φタンパクで８４４倍まで精製された。精製
酵素のシュークロースに対するＫｍ値、Ｖｍａ　ｘはそ
れぞれ５０ｍＭ、７１４μｍｏｌ／ａ＋ｉｎ゛ｍｇであ
った・実施例３　レバンの生成 シュークロース１０ｇを３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨｅ
、ｏ）に溶解して１００ｍ１　とした。これに実施例２
で得られたローネラ・アクアティリスの精製レバンシュ
ークラーゼ１ｏユニツトを加えて３０　’Ｏで２４時間
反応させた。反応液に３００ｍ１のエタノールを加え白
色の粘質沈澱物を得た。これを８０°Ｃの温水に溶解し
た後、再度３倍量のエタノールを加え沈澱物を慢だ。こ
の沈殿物を４０℃で６時間乾燥し１．９ｇの固形物を得
た。この固形物はフラクトースの重合体であるレバンで
あった。

実施例４　ラクトシュークロースの生成　４ シュークロースｌＯｇとラクトースＩＯｇを３０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐｌ＋８．０）に溶解して１００ｍ１　と
した。これに実施例２で得られたローネラ争アクアティ
リスの精製レバンシュークラーセ１０ユニ７）を加えて
５０　℃で５時間反応させた。

高速液体クロマトクラフィーにより生成したラクトシュ
ークロースを測定したところ、６．８ｇのラクトシュー
クロースが生成した。

得られた反応液１００ｍ１を減圧濃縮した。

この濃縮液をカーボン争セライトカラム（ｉ　：　ｉ）
　ヘ通液し、水４１を７５０ｍ１／ｈｒの流速で流し単
糖を溶出、次ぎに２％エタノール４１でシュークロース
とラクトースを溶出させた後、１０％エタノール６１を
流し活性炭に吸着されているラフ］・シュークロースを
溶出させた。

ラクトシュークロースを含む溶出液を減圧濃縮した後、
凍結乾燥を行い白色の粉末　５ ラクトシュークロース５．８ｇを得た。

実施例５　キシロシュークロースノ生成シュークロース
１０ｇとキシロース１０ｇを３０ｍＭｊｌン酸緩衝液（
ｐＨ［１，０）に溶解して１００ｍ１　とした。これに
実施例２で得られたローネラ・アクアティリスの精製し
へンシュークラーセ１０ユニットを加えて５０°Ｃで５
時間反応させた。

高速液体クロマトグラフィーにより生成したラクトシュ
ークロースを測定したところ、８．６ｇのラクトシュー
クロースが生成した。

得られた反応液１００ｍ１を減圧濃縮した。

この濃縮液をカーホン・セライトカラム（１：ｌ）へ適
法し、水４１を７５０ｍ１／ｈｒの流速で流し単糖を溶
出、次ぎに５％エタノール４１でシュークロースを溶出
させた後、１０％エタノール８１を流し活性炭に吸着さ
れているキシロシュークロースを溶出させた。

　６ キシロシ、−クロースを含む溶出液を減圧濃縮した後、
凍結乾燥を行い白色の粉末キシロシュークロース７．２
ｇヲ得り。

実施例６　各種オリゴ糖の生成 シュークロース１０ｇとＤ−アラビノース。

Ｌ−アラビノース、マルトース、セロビオース、メリビ
オース、マルトテ］・ラオースなど各種糖質それぞれＬ
ｏｇを実施例４．５と同様に３０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ
ＨＢ、Ｏ）に溶解して１００１　とした。これらに実施
例２″ｃ−得られたローネラ・アクアティリスの精製し
へンシュークラーゼｌＯユニットを加えて５０℃で５時
間反応させた。

高速液体クロマトグラフィーにより生成した各種オリゴ
糖を確認した。オリゴ糖の生成量はセロビオース、マル
トースを受容体にしたばあいに多く、次いでマルトテＩ
・ラオース〉Ｌ−アラビノース〉Ｄ−アラビノース〉メ
リビオースの順であった。

［発明の効果］ ７ 以上説明したように、本発明のし／くンシュクラーゼは
新規な酵素であり、この酵素を用いれば、レバンやキシ
ロシュークロース、ラクトシュークロースなどを収率よ
く短時間に得ることができ、しかも、本酵素はｐＨ安定
性が高く、第１図乃至第４図はそれぞれレバンシューク
ラーゼの至適ｐＨ，ｐｉ安定性、至適温度、温度安定性
を示したグラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の（ａ）乃至（ｇ）の理化学的性質を有する
   耐熱性レバンシュークラーゼ。 （ａ）シュークロースまたはラフィノースからβ−フラ
   クトシル基がシュークロースやラフィノースなどの受容
   体に転移してβ−２，６結合のレバンを生成し、受容体
   がキシロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、
   ラクトース、マルトース、セロビオース、メリビオース
   、マルトテトラオースの時に、これら受容体にフラクト
   シル基が転移したオリゴ糖を生成する。 （ｂ）至適ｐＨ５．５〜６．０ （ｃ）安定ｐＨ３０℃、１２０分間処理の条件下で５．
   ０〜９．０ （ｄ）作用適温５０℃〜６０℃、 （ｅ）熱安定性ｐＨ５．５で１０分間処理の場合、５０
   ℃まで安定 （ｆ）阻害性水銀イオン、銀イオン、フラクトースによ
   り阻害される （ｇ）分子量ゲル濾過法による測定で約１２万
2. （２）ローネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属に属する上記耐
   熱性レバンシュークラーゼ生産菌を好気条件下で培養し
   、培養物から耐熱性レバンシュークラーゼを分離、採取
   することを特徴とする微生物による耐熱性レバンシュー
   クラーゼの製造方法。
3. （３）上記レバンシュークラーゼ生産菌がローネラ・ア
   クアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ　ａｑｕａｔｉｌｉｓ
   ）である特許請求の範囲第（２）項に記載の耐熱性レバ
   ンシュークラーゼ製造法。