JP2688854B2 - 糖転移活性の強いα―ガラクトシダーゼの製造法 - Google Patents
糖転移活性の強いα―ガラクトシダーゼの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseu
domonas fluorescens）H-601株による糖転移活性の強
いα−ガラクトシダーゼの製造法に関するものである。
domonas fluorescens）H-601株による糖転移活性の強
いα−ガラクトシダーゼの製造法に関するものである。
［従来の技術］ 近年、各種オリゴ糖類がビフィズス因子など新たな機
能性をもつ物質として注目されている。このようなオリ
ゴ糖あるいは配糖体の合成法としては糖転移酵素または
加水分解酵素の糖転移作用を利用する方法や縮合反応を
利用する方法が開発されている。糖転移作用を利用する
方法は、縮合反応によるオリゴ糖あるいは配糖体の合成
とは違い特定の結合様式を持ったオリゴ糖あるいは配糖
体のみを特異的に合成できる。例えばβ−フラクトフラ
ノシダーゼによるフラクトオリゴ糖、β−ガラクトシダ
ーゼによるβ−ガラクトオリゴ糖の製造がある。一方、
α−ガラクトシダーゼは、動物組織、微生物、高等植物
の種子等に広く存在し、α−Ｄ−ガラクトシド結合を加
水分解してＤ−ガラクトースを遊離させる反応を触媒す
る酵素である。この酵素は、19世紀末にメリビオースを
加水分解する酵素（メリビアーゼ）として酵母から抽出
されて以来、種々の起源のものが単離され研究されてき
た。特に利用面では、甜菜糖からの蔗糖の分離精製工程
において、蔗糖の結晶化を妨げるラフィノースを蔗糖と
ガラクトースに効率的に加水分解することを目的として
利用されている。しかしながら、α−ガラクトシダーゼ
の糖転移作用については、基質となるα−ガラクトシル
基をもつ化合物の安価な供給源が知られていなかった為
にほとんど研究されていなかった。さらに、大豆オリゴ
糖を中心にα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖が強いビ
フィズス因子活性をもつ物質として注目されているにも
かかわらず、α−ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用
するオリゴ糖の工業的製造法は確立されていない。そこ
で、本発明者らは、このα−ガラクトシル基を含むオリ
ゴ糖の合成とその有効利用を目的に土壌から糖転移活性
の強いα−ガラクトシダーゼを生産する菌の分離を試み
た。
能性をもつ物質として注目されている。このようなオリ
ゴ糖あるいは配糖体の合成法としては糖転移酵素または
加水分解酵素の糖転移作用を利用する方法や縮合反応を
利用する方法が開発されている。糖転移作用を利用する
方法は、縮合反応によるオリゴ糖あるいは配糖体の合成
とは違い特定の結合様式を持ったオリゴ糖あるいは配糖
体のみを特異的に合成できる。例えばβ−フラクトフラ
ノシダーゼによるフラクトオリゴ糖、β−ガラクトシダ
ーゼによるβ−ガラクトオリゴ糖の製造がある。一方、
α−ガラクトシダーゼは、動物組織、微生物、高等植物
の種子等に広く存在し、α−Ｄ−ガラクトシド結合を加
水分解してＤ−ガラクトースを遊離させる反応を触媒す
る酵素である。この酵素は、19世紀末にメリビオースを
加水分解する酵素（メリビアーゼ）として酵母から抽出
されて以来、種々の起源のものが単離され研究されてき
た。特に利用面では、甜菜糖からの蔗糖の分離精製工程
において、蔗糖の結晶化を妨げるラフィノースを蔗糖と
ガラクトースに効率的に加水分解することを目的として
利用されている。しかしながら、α−ガラクトシダーゼ
の糖転移作用については、基質となるα−ガラクトシル
基をもつ化合物の安価な供給源が知られていなかった為
にほとんど研究されていなかった。さらに、大豆オリゴ
糖を中心にα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖が強いビ
フィズス因子活性をもつ物質として注目されているにも
かかわらず、α−ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用
するオリゴ糖の工業的製造法は確立されていない。そこ
で、本発明者らは、このα−ガラクトシル基を含むオリ
ゴ糖の合成とその有効利用を目的に土壌から糖転移活性
の強いα−ガラクトシダーゼを生産する菌の分離を試み
た。
［発明が解決しようとする問題点］ したがって本発明の目的は、糖転移活性の強いα−ガ
ラクトシダーゼを安価に且つ大量に生産し得る方法を提
供することにある。
ラクトシダーゼを安価に且つ大量に生産し得る方法を提
供することにある。
本発明者らは、先に広く自然界よりα−ガラクトシル
基の転移作用を持つα−ガラクトシダーゼを生産する微
生物を求めて検索したところ、シュードモナス属菌が転
移活性を有するα−ガラクトシダーゼを生産する能力を
有することを見出し、Ｈ−１と命名して研究発表［日本
農芸化学会1988年度大会講演要旨集 第296ベージ］し
た。しかしながら、このシュードモナス・フルオレッセ
ンスＨ−１が生産するα−ガラクトシダーゼは、基質と
してメリビオースを用いた場合、基質濃度が1M前後で生
じたガラクトースの60％程度しか転移できないという問
題点があった。
基の転移作用を持つα−ガラクトシダーゼを生産する微
生物を求めて検索したところ、シュードモナス属菌が転
移活性を有するα−ガラクトシダーゼを生産する能力を
有することを見出し、Ｈ−１と命名して研究発表［日本
農芸化学会1988年度大会講演要旨集 第296ベージ］し
た。しかしながら、このシュードモナス・フルオレッセ
ンスＨ−１が生産するα−ガラクトシダーゼは、基質と
してメリビオースを用いた場合、基質濃度が1M前後で生
じたガラクトースの60％程度しか転移できないという問
題点があった。
［問題点を解決する手段］ 本発明者らは、その後さらにα−ガラクトシル基の転
移作用のより強いシュードモナス属菌を求めて検索を続
けた結果、転移活性の極めて強い新規な菌株を見出し、
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas flu
orescens）Ｈ−601株と命名して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、糖転移活性の強いα−ガラクトシ
ダーゼを生産するシュードモナス・フルオレッセンスH-
601株を培養し、培養上清から糖転移活性の強いα−ガ
ラクトシダーゼを採取することを特徴とする糖転移活性
の強いα−ガラクトシダーゼの製造法に関するものであ
る。
移作用のより強いシュードモナス属菌を求めて検索を続
けた結果、転移活性の極めて強い新規な菌株を見出し、
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas flu
orescens）Ｈ−601株と命名して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、糖転移活性の強いα−ガラクトシ
ダーゼを生産するシュードモナス・フルオレッセンスH-
601株を培養し、培養上清から糖転移活性の強いα−ガ
ラクトシダーゼを採取することを特徴とする糖転移活性
の強いα−ガラクトシダーゼの製造法に関するものであ
る。
なお、本発明でいう糖転移活性の強いα−ガラクトシ
ダーゼとは、基質としてメリビオースを用いた場合、基
質濃度が1M前後でもほとんど基質阻害を受けず、生じた
ガラクトースの65％以上を転移することができる活性を
有するα−ガラクトシダーゼをいう。
ダーゼとは、基質としてメリビオースを用いた場合、基
質濃度が1M前後でもほとんど基質阻害を受けず、生じた
ガラクトースの65％以上を転移することができる活性を
有するα−ガラクトシダーゼをいう。
以下に本発明の内容を更に具体的に説明する。本発明
においては、その例示菌株としてシュードモナス・フル
オレッセンス（Pseudomonas fluorescens）H-601株が
有効に利用される。シュードモナス・フルオレッセンス
は、土壌・河川・食品等から分離され、蛍光性色素を生
成することがよく知られている。しかしながら、α−ガ
ラクトシダーゼを生産する能力を有するシュードモナス
・フルオレッセンスの菌株は本発明者らが見出した前記
２株以外は未だ報告されていない。
においては、その例示菌株としてシュードモナス・フル
オレッセンス（Pseudomonas fluorescens）H-601株が
有効に利用される。シュードモナス・フルオレッセンス
は、土壌・河川・食品等から分離され、蛍光性色素を生
成することがよく知られている。しかしながら、α−ガ
ラクトシダーゼを生産する能力を有するシュードモナス
・フルオレッセンスの菌株は本発明者らが見出した前記
２株以外は未だ報告されていない。
次に、本発明者らの見出した菌株の菌学的性質を示す
と、下記の通りである。
と、下記の通りである。
（ａ）形態学的性質 細胞の形 桿菌 グラム染色 陰性 胞子の有無 無し 運動性 有り （ｂ）培地での生育 寒天平面培地 円形、規則的、周囲は円滑 表面は滑
らか、偏平状 半透明で、淡黄色 （ｃ）生育の温度 37℃ 生育する 41℃ 生育せず （ｄ）生化学的性質 カタラーゼ ＋ オキシダーゼ（Kovacs） ＋ Ｏ−Ｆテスト Ｏ （ｅ）ラピッドテスト（API）の結果 ［30℃ 48時間培養］ 硝酸塩の還元 ＋ インドールの生成 − グルコースから酸の生成 − アルギニンデヒドラーゼ ＋ ウレアーゼ − エスクリンの加水分解 − ゼラチンの加水分解 − β−ガラクトシダーゼ − 糖の同化 グルコース ＋ アラビノース ＋ マンノース ＋ マンニトール ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ マルトース − グルコン酸塩 ＋ カプリン酸塩 ＋ アジピン酸塩 − リンゴ酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ 酢酸フェニルエステル − チトクロムオキシダーゼ ＋ ［30℃ ７日間培養］ ゼラチンの加水分解 ＋ ピオベルデインの生成 ＋ レバンの生成 − 硝酸塩の還元 − 亜硝酸塩の生成 − 残留窒素 − 以上の諸性状をバージェイのマニュアル・オブ・デタ
ーミネィティブ・バクテリオロジー 第８版（1974）の
記載と照合することにより、本菌がシュードモナス・フ
ルオレッセンスであることを確認しシュードモナス・フ
ルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）H-601と
命名した。なお、本菌株は、微工研菌寄第11027号（FER
M P-11027）として、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。
らか、偏平状 半透明で、淡黄色 （ｃ）生育の温度 37℃ 生育する 41℃ 生育せず （ｄ）生化学的性質 カタラーゼ ＋ オキシダーゼ（Kovacs） ＋ Ｏ−Ｆテスト Ｏ （ｅ）ラピッドテスト（API）の結果 ［30℃ 48時間培養］ 硝酸塩の還元 ＋ インドールの生成 − グルコースから酸の生成 − アルギニンデヒドラーゼ ＋ ウレアーゼ − エスクリンの加水分解 − ゼラチンの加水分解 − β−ガラクトシダーゼ − 糖の同化 グルコース ＋ アラビノース ＋ マンノース ＋ マンニトール ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ マルトース − グルコン酸塩 ＋ カプリン酸塩 ＋ アジピン酸塩 − リンゴ酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ 酢酸フェニルエステル − チトクロムオキシダーゼ ＋ ［30℃ ７日間培養］ ゼラチンの加水分解 ＋ ピオベルデインの生成 ＋ レバンの生成 − 硝酸塩の還元 − 亜硝酸塩の生成 − 残留窒素 − 以上の諸性状をバージェイのマニュアル・オブ・デタ
ーミネィティブ・バクテリオロジー 第８版（1974）の
記載と照合することにより、本菌がシュードモナス・フ
ルオレッセンスであることを確認しシュードモナス・フ
ルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）H-601と
命名した。なお、本菌株は、微工研菌寄第11027号（FER
M P-11027）として、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。
本発明のシュードモナス・フルオレッセンスH-601株
により糖転移活性の極めて強いα−ガラクトシダーゼを
生産するためには、通常、メリビオース、ラフィノー
ス、スタキオース、ガラクトマンナンやその分解物単
独、あるいは、蔗糖、粉飴、ラクトース、澱粉に誘導物
質としてメリビオース、ラフィノース、スタキオース、
ガラクトマンナンやその分解物を添加したものを炭素源
として用い、全脂あるいは脱脂大豆、コーンスティープ
リカー、ポリペプトン、ソイトン、あるいは、酵母エキ
スのような有機または無機の窒素源を含む液体培地を用
いて、20〜40℃で、２〜14日間程度、好気的に培養すれ
ばよい。糖転移活性の強いα−ガラクトシダーゼは菌体
外に生産される酵素である為、液体培地の場合、培養後
濾過、あるいは、遠心分離によって得た培養上清を粗酵
素液としてそのまま利用できる。粗酵素液は、そのまま
使用できるが、例えば硫安沈殿法や溶媒沈殿法または限
外濾過法等の公知の方法により、粗酵素濃縮液を得るこ
ともできる。このようにして得られた、本発明の糖転移
活性の強いα−ガラクトシダーゼ標品は次の様な諸性質
を有する。
により糖転移活性の極めて強いα−ガラクトシダーゼを
生産するためには、通常、メリビオース、ラフィノー
ス、スタキオース、ガラクトマンナンやその分解物単
独、あるいは、蔗糖、粉飴、ラクトース、澱粉に誘導物
質としてメリビオース、ラフィノース、スタキオース、
ガラクトマンナンやその分解物を添加したものを炭素源
として用い、全脂あるいは脱脂大豆、コーンスティープ
リカー、ポリペプトン、ソイトン、あるいは、酵母エキ
スのような有機または無機の窒素源を含む液体培地を用
いて、20〜40℃で、２〜14日間程度、好気的に培養すれ
ばよい。糖転移活性の強いα−ガラクトシダーゼは菌体
外に生産される酵素である為、液体培地の場合、培養後
濾過、あるいは、遠心分離によって得た培養上清を粗酵
素液としてそのまま利用できる。粗酵素液は、そのまま
使用できるが、例えば硫安沈殿法や溶媒沈殿法または限
外濾過法等の公知の方法により、粗酵素濃縮液を得るこ
ともできる。このようにして得られた、本発明の糖転移
活性の強いα−ガラクトシダーゼ標品は次の様な諸性質
を有する。
（１）作用 α−ガラクトシダーゼは、α−Ｄ−ガラクトシド結合
を加水分解してＤ−ガラクトースを遊離させる反応を触
媒する酵素である。本酵素は、終濃度4.4mMのα−ガラ
クトシル基を持つ化合物に、パラニトロフェニル−α−
ガラクトシド＞オルトニトロフェニル−α−ガラクトシ
ド＞メリビオース＞ラフィノース＞スタキオースの順で
よく作用した。
を加水分解してＤ−ガラクトースを遊離させる反応を触
媒する酵素である。本酵素は、終濃度4.4mMのα−ガラ
クトシル基を持つ化合物に、パラニトロフェニル−α−
ガラクトシド＞オルトニトロフェニル−α−ガラクトシ
ド＞メリビオース＞ラフィノース＞スタキオースの順で
よく作用した。
（２）最適作用pH範囲 本酵素の最適作用pH範囲は、約６〜７に認められた。
（３）安定pH範囲 McIlvaine緩衝液、Tris緩衝液、Glycine-NaOH緩衝液
の下で40℃２時間放置した場合の本酵素の安定性は、pH
6〜９であった。
の下で40℃２時間放置した場合の本酵素の安定性は、pH
6〜９であった。
（４）作用温度範囲及び最適作用温度 本酵素は、約60℃までの温度で良く作用するが、最適
作用温度は約45℃であった。
作用温度は約45℃であった。
（５）熱安定性 本酵素を0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）の下で各温度で
15分間加熱処理した結果、40℃までは90％以上の活性が
維持された。
15分間加熱処理した結果、40℃までは90％以上の活性が
維持された。
（６）糖転移活性 α−ガラクトシル基の供与体としては、本酵素が基質
とするα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖
体全てが利用できる。ここでは、基質としてメリビオー
スを用いて本酵素の糖転移活性を測定した。各種の濃度
のメリビオースに本酵素を作用させ、反応によって生じ
た遊離のグルコースとガラクトースをベーリンガー・マ
ンハイムのＦキット（商品名）を用いて定量した。第１
図に示したように本酵素は、基質濃度が50mM前後から基
質の切断によって生じたガラクトースを転移反応に利用
し始め、1M前後でも基質阻害を受けず生じたガラクトー
スの65％以上を転移するという強い転移活性を有してい
た。なお、第１図において、横軸は基質濃度を、縦軸は
生成物の量を示し、□はメリビオースの分解によって生
じたグルコース量を、＋はガラクトース量を示す。すな
わち、この差が糖転移作用に使われたガラクトース量を
示すものである。
とするα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖
体全てが利用できる。ここでは、基質としてメリビオー
スを用いて本酵素の糖転移活性を測定した。各種の濃度
のメリビオースに本酵素を作用させ、反応によって生じ
た遊離のグルコースとガラクトースをベーリンガー・マ
ンハイムのＦキット（商品名）を用いて定量した。第１
図に示したように本酵素は、基質濃度が50mM前後から基
質の切断によって生じたガラクトースを転移反応に利用
し始め、1M前後でも基質阻害を受けず生じたガラクトー
スの65％以上を転移するという強い転移活性を有してい
た。なお、第１図において、横軸は基質濃度を、縦軸は
生成物の量を示し、□はメリビオースの分解によって生
じたグルコース量を、＋はガラクトース量を示す。すな
わち、この差が糖転移作用に使われたガラクトース量を
示すものである。
（７）受容体特異性 基質として１％パラニトロフェニル−α−ガラクトシ
ド、受容体として４％のガラクトース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、シュークロース、グリセリン
に本酵素を作用させ反応生成物を薄層クロマトグラフィ
ーにより確認した。その結果、この受容体の全ての場合
に転移生成物が確認され、本酵素は広い受容体特異性を
持つことが確認された。
ド、受容体として４％のガラクトース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、シュークロース、グリセリン
に本酵素を作用させ反応生成物を薄層クロマトグラフィ
ーにより確認した。その結果、この受容体の全ての場合
に転移生成物が確認され、本酵素は広い受容体特異性を
持つことが確認された。
（８）α−ガラクトシダーゼの活性測定法 10mMパラニトロフェニル−α−ガラクトシド0.2mlと4
0mMリン酸緩衝液（pH6.5）0.2mlにα−ガラクトシダー
ゼ溶液0.05mlを加えて40℃10分間反応させる。反応後、
0.2M炭酸ナトリウム0.5mlを加えて反応を止め、遊離し
てくるパラニトロフェノール量を分光光度計にて400nm
の吸光度を計ることにより測定した。酵素活性１単位
は、この条件下で１分間に１μ moleのパラニトロフェ
ノールを生成する酵素量と定義した。
0mMリン酸緩衝液（pH6.5）0.2mlにα−ガラクトシダー
ゼ溶液0.05mlを加えて40℃10分間反応させる。反応後、
0.2M炭酸ナトリウム0.5mlを加えて反応を止め、遊離し
てくるパラニトロフェノール量を分光光度計にて400nm
の吸光度を計ることにより測定した。酵素活性１単位
は、この条件下で１分間に１μ moleのパラニトロフェ
ノールを生成する酵素量と定義した。
（９）精製法 遠心分離によって得た培養上清を0.2飽和硫安存在下
で疎水クロマトグラフィー（東ソー（株）製ブチルトヨ
パール 650M）、イオン交換クロマトグラフィー（東ソ
ー（株）製 DEAE−トヨパール 650M）、および、ゲル
クロマトグラフィー（東ソー（株）製トヨパール HW-5
5F）を行ない本酵素を精製した。この操作によりディス
クゲル電気泳動的に単一なα−ガラクトシダーゼの標品
を得ることができた。
で疎水クロマトグラフィー（東ソー（株）製ブチルトヨ
パール 650M）、イオン交換クロマトグラフィー（東ソ
ー（株）製 DEAE−トヨパール 650M）、および、ゲル
クロマトグラフィー（東ソー（株）製トヨパール HW-5
5F）を行ない本酵素を精製した。この操作によりディス
クゲル電気泳動的に単一なα−ガラクトシダーゼの標品
を得ることができた。
（10）分子量 本酵素について東ソー（株）製トヨパールHW-55F（商
品名）を用いたゲル濾過法により分子量を測定したとこ
ろ、分子量は3.9×104に相当した。
品名）を用いたゲル濾過法により分子量を測定したとこ
ろ、分子量は3.9×104に相当した。
（11）等電点 本酵素についてファルマシアPhastGel IEF3-9（商品
名）を用いた等電点電気泳動により等電点を測定したと
ころ6.3であった。
名）を用いた等電点電気泳動により等電点を測定したと
ころ6.3であった。
［発明の効果］ 以上のとおり、本発明の転移活性の強いα−ガラクト
シダーゼは基質濃度が1M前後でも基質阻害を受けず、基
質の切断によって生じたガラクトースの65％以上を転移
するという極めて強い転移活性をもっていた。また、受
容体特異性もガラクトース、グルコース、マンノース、
フラクトース、シュークロース、グリセリンと非常に広
くその酵素的性質がこれまで知られている酵素に較べて
優れていた。そして、このような本酵素の特徴は、α−
ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用したα−ガラクト
シル基を含むオリゴ糖あるいは配糖体の合成において著
しい技術進歩をもたらしたものである。また、本酵素は
加水分解酵素であるため当然の事ながら縮合反応を利用
したα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖体
の合成においても利用できる。
シダーゼは基質濃度が1M前後でも基質阻害を受けず、基
質の切断によって生じたガラクトースの65％以上を転移
するという極めて強い転移活性をもっていた。また、受
容体特異性もガラクトース、グルコース、マンノース、
フラクトース、シュークロース、グリセリンと非常に広
くその酵素的性質がこれまで知られている酵素に較べて
優れていた。そして、このような本酵素の特徴は、α−
ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用したα−ガラクト
シル基を含むオリゴ糖あるいは配糖体の合成において著
しい技術進歩をもたらしたものである。また、本酵素は
加水分解酵素であるため当然の事ながら縮合反応を利用
したα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖体
の合成においても利用できる。
［実施例］ 次に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。
らに限定されるものではない。
実施例１ １％メリビオース,1％ポリペプトン,0.05％ K2HPO4,
0.01％ MgSO4・7H2O,0.01％ KC1を含む液体培地（pH7.
0）100mlを500ml坂口フラスコに入れ、常法によるオー
トクレーブにより殺菌後シュードモナス・フルオレッセ
ンス（Pseudomonas fluorescens）H-601株を接種し、3
0℃で４日間振盪培養した。培養後、遠心分離により除
菌し、得られた培養上清についてα−ガラクトシダーゼ
活性を測定した。その結果、酵素活性は培養液1ml当り
0.75単位であった。
0.01％ MgSO4・7H2O,0.01％ KC1を含む液体培地（pH7.
0）100mlを500ml坂口フラスコに入れ、常法によるオー
トクレーブにより殺菌後シュードモナス・フルオレッセ
ンス（Pseudomonas fluorescens）H-601株を接種し、3
0℃で４日間振盪培養した。培養後、遠心分離により除
菌し、得られた培養上清についてα−ガラクトシダーゼ
活性を測定した。その結果、酵素活性は培養液1ml当り
0.75単位であった。
実施例２ 実施例１において、メリビオースに代えて、１％粉飴
に0.1％メリビオースを誘導源として添加した培地にシ
ュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluor
escens）H-601株を植菌し、30℃で４日間振盪培養し
た。培養後遠心分離によって得た培養上清についてα−
ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果、酵素活性
は培養液1ml当たり0.38単位であった。
に0.1％メリビオースを誘導源として添加した培地にシ
ュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluor
escens）H-601株を植菌し、30℃で４日間振盪培養し
た。培養後遠心分離によって得た培養上清についてα−
ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果、酵素活性
は培養液1ml当たり0.38単位であった。
実施例３ 実施例２で得たα−ガラクトシダーゼ760単位を含む
粗酵素標品2000mlを0.2飽和硫安存在下で疎水クロマト
グラフィー（東ソー（株）製 ブチルトヨパール650
M）、イオン交換クロマトグラフィー（東ソー（株）製
DEAE−トヨパール 650M）、および、ゲルクロマトグ
ラフィー（東ソー（株）製 トヨパール HW-55F）によ
り300単位の酵素標品10mlを得た。この酵素標品は、デ
ィスク電気泳動的に単一であった。この様な精製による
α−ガラクトシダーゼの収率は約40％であった。
粗酵素標品2000mlを0.2飽和硫安存在下で疎水クロマト
グラフィー（東ソー（株）製 ブチルトヨパール650
M）、イオン交換クロマトグラフィー（東ソー（株）製
DEAE−トヨパール 650M）、および、ゲルクロマトグ
ラフィー（東ソー（株）製 トヨパール HW-55F）によ
り300単位の酵素標品10mlを得た。この酵素標品は、デ
ィスク電気泳動的に単一であった。この様な精製による
α−ガラクトシダーゼの収率は約40％であった。
実施例４ 1gのメリビオースと1gのシュークロースを含むpH6.5
のリン酸緩衝液5mlに実施例３によって得られた精製酵
素標品５単位を添加し、40℃で50時間反応させた。反応
液を10分間煮沸加熱し酵素を失活させた後、反応液１μ
ｌを濾紙にスポットしｎ−ブタノール：ピリジン：水＝
6:4:3の組成の溶媒系で４重展開後、フロログルシン法
によるケトース呈色を行なうと、ラフィノースに相当す
る位置にスポットが検出された。この反応液を活性炭カ
ラムクロマトグラフィーにかけ、オリゴ糖類を吸着させ
た後、エチルアルコールの濃度勾配により溶出させた。
この３量体画分を集め、濃縮し凍結乾燥標品0.8gを得
た。本標品は、（ａ）α−ガラクトシダーゼで加水分解
するとガラクトースとシュークロースを等モル生成する
こと、（ｂ）β−フラクトシダーゼで加水分解すると、
等モルのメリビオースとフラクトースを生成すること、
（ｃ）α−ガラクトシダーゼとβ−フラクトシダーゼと
で加水分解するとガラクトース、グルコース、フラクト
ースを１モルずつ生成すること、（ｄ）ペーパークロマ
トグラフィーの移動度がラフィノースと一致すること、
以上のことからラフィノースであると同定した。
のリン酸緩衝液5mlに実施例３によって得られた精製酵
素標品５単位を添加し、40℃で50時間反応させた。反応
液を10分間煮沸加熱し酵素を失活させた後、反応液１μ
ｌを濾紙にスポットしｎ−ブタノール：ピリジン：水＝
6:4:3の組成の溶媒系で４重展開後、フロログルシン法
によるケトース呈色を行なうと、ラフィノースに相当す
る位置にスポットが検出された。この反応液を活性炭カ
ラムクロマトグラフィーにかけ、オリゴ糖類を吸着させ
た後、エチルアルコールの濃度勾配により溶出させた。
この３量体画分を集め、濃縮し凍結乾燥標品0.8gを得
た。本標品は、（ａ）α−ガラクトシダーゼで加水分解
するとガラクトースとシュークロースを等モル生成する
こと、（ｂ）β−フラクトシダーゼで加水分解すると、
等モルのメリビオースとフラクトースを生成すること、
（ｃ）α−ガラクトシダーゼとβ−フラクトシダーゼと
で加水分解するとガラクトース、グルコース、フラクト
ースを１モルずつ生成すること、（ｄ）ペーパークロマ
トグラフィーの移動度がラフィノースと一致すること、
以上のことからラフィノースであると同定した。
第１図は、基質にメリビオースを用いて本酵素の糖転移
作用に及ぼす基質濃度の影響を調べた結果を示した図で
ある。
作用に及ぼす基質濃度の影響を調べた結果を示した図で
ある。
Claims (2)
- 【請求項１】シュードモナス・フルオレッセンス（Pseu
domonas fluorescens）H-601株を培養することからなる
糖転移活性の強いα−ガラクトシダーゼの製造法。 - 【請求項２】α−ガラクトシダーゼがシュードモナス・
フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）H-601株
の培養上清液から採取することを特徴とする請求項第
（１）項記載の糖転移活性の強いα−ガラクトシダーゼ
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28046789A JP2688854B2 (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | 糖転移活性の強いα―ガラクトシダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28046789A JP2688854B2 (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | 糖転移活性の強いα―ガラクトシダーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03143393A JPH03143393A (ja) | 1991-06-18 |
| JP2688854B2 true JP2688854B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=17625475
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28046789A Expired - Lifetime JP2688854B2 (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | 糖転移活性の強いα―ガラクトシダーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2688854B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6083725A (en) | 1996-09-13 | 2000-07-04 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein |
| BRPI0309665B8 (pt) | 2002-04-25 | 2021-05-25 | Transkaryotic Therapies Inc | método para analisar uma preparação de alfagalactosidase a |
| CN101568643B (zh) * | 2006-12-26 | 2012-08-08 | 旭化成化学株式会社 | α-低聚半乳糖的制造方法 |
-
1989
- 1989-10-27 JP JP28046789A patent/JP2688854B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03143393A (ja) | 1991-06-18 |
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