JPH0568239B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は５量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ
糖の製造方法に関する。 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖は臨床検査薬におけ
るリゾチームやβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼの測定基質として有用である。特にリゾチー
ムの基質としては、５量体以上のＮ−アセチルキ
トオリゴ糖が極めて有用であり、また最近では６
量体であるＮ−アセチルキトヘキサオークの免疫
機能増強作用、抗腫瘍効果などが報告され注目を
集めている。 しかしながら現在、５量体以上のＮ−アセチル
キトオリゴ糖は、大量生産することが非常に困難
である。例えば従来からの酸によるキチンの限定
加水分解では、２〜４量体は比較的高い収率で得
られるが５量体以上Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の
収率は非常に低いものである。そこで本発明者等
は、５量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖の大
量生産を目的に種々酵素を検索したところ、ノカ
ルデイア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
は、３量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖に作
用し、糖転移反応により効率良く５量体以上のＮ
−アセチルキトオリゴ糖を生産することを見い出
し本発明を完成した。従来、Ｎ−アセチルキトオ
リゴ糖のリゾチームによる糖転移反応によつて得
られるオリゴ糖についての報告はあるがキチナー
ゼについての糖転移反応による報告は未だ見当ら
ない。本発明によれば、Ｎ−アセチルキトオリゴ
糖に対して、リゾチームよりも強い糖転移反応性
を有しており、効率良く５量体以上のＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖が生産できる。すなわち本発明は
５量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖の製造法
を提供するものである。 本発明の方法に於いて用いられる酵素は、ノカ
ルデイア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
であつて次に示す如き理化学的性質を有する。 (a) 作用 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に作用し強い糖転
移反応を起こす。本酵素の酵素量に対し過剰の
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を作用させた場合、
糖転移反応により重合度の高いＮ−アセチルキ
トオリゴ糖を生成する。またキチンまたはＮ−
アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを加水分
解する。 (b) 至適PH コロイドキチンを基質として40℃で反応を行
つた場合、本酵素はPH5.5に至適PHを有する。 (c) PH安定性 本酵素は４℃で24時間の処理においてPH5.0
〜8.0で安定である。 (d) 至適温度 コロイドキチンを基質としてPH5.6で反応を
行なつた場合、本酵素は70℃付近に至適PHを有
する。 (e) 熱安定性 本酵素はPH5.6で30分間の処理において50℃
以下で安定である。 (f) 分子量 SDS−デイスク電気泳動法による本酵素の分
子量は約44000である。 (g) 等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動による本酵
素の等電点はPH9.1付近である。 上記の如き性質を有するキチナーゼは、次のよ
うにして製造することができる。 酵素生産に用いるノカルデイア属に属するキチ
ナーゼ生産菌としては、ノカルデイア属に属しキ
チナーゼを生産する菌であればいずれでも良い。
その例としてはたとえばノカルデイア・オリエン
タリス（Nocardia Orientalis）が挙げられ、具
体的にはノカルデイア・オリエンタリス
IFO12360、IFO12361、IFO12362、IFO12806、
JCM4235、JCM4600などが挙げられる。上記
IFO12360、IFO12361、IFO12362、IFO12806株
は、財団法人発酵研究所のリスト・オブ・カルチ
ユアーズ1984年第７版（Institute for Fermen−
tation、Osaka、List of Cultures、1984、7th
Edition）に掲載されている。上記JCM4235、
JCM4600株は、理化学研究所微生物系統保存施
設のカタログ・オブ・ストレインズ1984年第２版
（Japan Collection of Micro−organisms、
Catalogue of Stains、1984、2ndEdition）に掲
載されている。本発明に、用いられるキチナーゼ
はノカルデイア属に属するキチナーゼ生産菌を培
地に培養し、培養物中に生産せしめることにより
製造される。培養に用いられる培地は、上記微生
物が利用し得る栄養源を含むものであればいづれ
でも良いが、キチナーゼの生産能をより高めるに
は誘導基質であるキチンを添加することが好まし
い。例えばコロイドキチン0.5％、Ｎ−アセチル
グルコサミン0.5％、ペプトン0.2％、酵母エキス
0.01％、リン酸２水素カリウム0.03％、リン酸１
水素カリウム0.07％、硫酸マグネシウム・７水和
物0.05％を含有するもの（PH7.0に調整）が挙げ
られる。液体培地でも固体培地でも良いが、大量
に行う場合には液体培地が好ましい。培養の方法
は振盪培養が好ましい。培養の条件は培地の組
成、菌株の種類によつて異なるが、培養温度は20
〜35℃、さらに好ましくは25〜30℃、培養時間は
２〜７日、さらに好ましくは２〜５日である。目
的とするキチナーゼは通常菌体外に蓄積されるの
で周知の分離、精製手段により培養物から分離、
精製される。たとえば、培養物から遠心分離ある
いは濾過により菌体を除去した後、培養濾液に硫
酸アンモニウムを加え塩析を行なう。塩析により
析出した蛋白質を遠心分離により採取し、10ｍＭ
酢酸緩衝液（PH5.0）中で透析し、これを遠心分
離してその上清液を粗酵素溶液とする。粗酵素溶
液中には目的とするキチナーゼの他、キトビアー
ゼや他の理化学的性質を有するキチナーゼなどが
含まれている。粗酵素溶液から目的とするキチナ
ーゼの分離、精製はSP−セフアデツクスＣ−50
（フアルマシア社製）のイオン交換クロマトグラ
フイーおよびバイオゲルＰ−60（バイオラド社製）
への特異的吸着性を利用して行うことができる。 このようにして得られるキチナーゼの活性や糖
転移反応は次のようにして測定する。 (1) キチナーゼの活性 0.2％コロイドキチンを含む0.2M酢酸緩衝液
（PH5.6）2.0mlに酵素液を加えて40℃で10分間
反応させる。反応後シヤール試薬（0.5ｇのフ
エリシアン化カリウムを0.5M炭酸ナトリウム
溶液１に溶解）3.0mlを加え沸騰湯中で15分
間加熱する。水で冷却後遠心分離して不溶物を
除き上清液の420nｍにおける吸光度の減少を
測定する。還元糖の生成はＮ−アセチルグルコ
サミンを用いた標準曲線から求める。酵素活性
1Uは１分間に1μmoleのＮ−アセチルグルコサ
ミンを生成する酵素量とした。 (2) 糖転移反応 ５％のＮ−アセチルキトテトラオースを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH5.6）２mlに酵素溶液を
加えて40℃で48時間反応させる。一定時間ごと
に反応液を採取し沸騰湯中で10分間加熱し反応
を停止させる。これら溶液を高速液体クロマト
グラフイーに供し、反応生成物を確認した。 本発明の原料としては、キチン部分加水分解
物、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖等が用いられる。
このキチン部分加水分解は、キチンを濃塩酸で40
℃で２〜３時間加水分解しアルカリで中和した
後、活性炭に吸着させアルコールで溶出すること
によつて調製できる。キチン部分加水分解物は、
２〜８量体のＮ−アセチルキトオリゴ糖を含み、
それぞれのＮ−アセチルキトオリゴ糖は、上記ア
ルコール溶出時に、アルコール濃度勾配をかけて
溶出したり、あるいは、ゲル濾過や高速液体クロ
マトグラフイー等の手段により分離し調整するこ
とができる。 本発明で上記原料と上記キチナーゼを作用させ
るには、キチン部分加水分解物あるいはＮ−アセ
チルキトオリゴ糖を0.5〜30重量％を含むものを
基質とし、PH３〜７、温度30〜60℃で、酵素量は
基質１ｇ当たり50〜2000Uを用いて反応させると
良い。反応時間は、基質量、反応PH、温度、酵素
量等によつて大きく異なるが、通常30分〜48時間
である。かくして酵素反応を終了した反応混合物
は沸騰湯中で10分加熱し反応を停止させる。 上記酵素反応により５量体以上のＮ−アセチル
キトオリゴ糖を多く含む反応混合物が得られる。
このようにして得られる反応混合物からの５量体
以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖の分離、精製
は、周知の分離、精製手段により行なうことがで
きる。たとえば、活性炭に反応混合物を吸着さ
せ、アルコール濃度勾配法により分離溶出させる
方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフイー
等の手段により分離、精製することができる。 次に、本発明の参考例及び実施例について更に
具体的に説明するが、かかる説明によつて本発明
が何ら限定されるものでないことは勿論である。 参考例 １ キチナーゼの調製 グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス
0.5％、リン酸２水素カリウム0.03％、リン酸１
水素カリウム0.07％、硫酸マグネシウム・７水和
物0.05％（PH7.0に調整）の組成の前培養培地10
mlを含む100ml容フラスコに、ノカルデイア・オ
リエンタリスIFO12806の一白金耳を接種し、30
℃で１日間振盪培養した。 次にコロイドチキン0.5％、Ｎ−アセチルグル
コサミン0.5％、ペプトン0.2％、酵母エキス0.01
％、リン酸２水素カリウム0.03％、リン酸１水素
カリウム0.07％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.05％の組成の本培養培地150mlを含む1000ml容
フラスコに、前記前培養終了液を接種し30℃で３
日間振盪培養した。このような操作により得られ
た培養液450ml（150ml×３）を10000rpm、15分
間遠心分離して菌体を除き、上清液を75％飽和と
なるように固型硫安を加え４℃で塩析を行なつ
た。塩析により沈澱した蛋白質を４℃で
8000rpm、15分間遠心分離して採取し、これを少
量の水に溶解し10ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.0）に透
析した。透析液を４℃で10000rpm、15分間遠心
分離して上清液30mlを得、これを粗酵素液とし
た。 粗酵素液30mlを10ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.0）で
平衡化したSP−セフアデツクスＣ−50（フアルマ
シア社製）のカラム（2.5×40cm）に吸着させた。
溶出は０→0.5Mの食塩を含む同上緩衝液による
塩濃度勾配溶出法で行なつた。なお流速は60ml／
hrであつた。ここで得られた活性画分149mlに80
％飽和となるように固形硫安を加え４℃で塩析を
行なつた。塩析により沈澱した蛋白質を４℃で
8000rpm、15分間遠心分離して採取し、0.5M食
塩を含む50ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.6）に透析した。
透析液を４℃で10000rpm、15分間遠心分離して
上清液３mlを得た。上記で得られた上清液３mlを
0.5M食塩を含む50ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.6）で平
衡化したバイオゲルＰ−60（バイオラド社製）の
カラム（2.2×77cm）に供した。溶出は同上緩衝
液により行ない、バイオゲルＰ−60への特異的吸
着性により遅れて分離された活性画分100mlを得
た。なお流速は12.8ml／hrであつた。以上の精製
の要約を第１表に示す。このようにして得られた
キチナーゼは、SDS−デイスク電気泳動で均一で
あつた。

【表】 実施例 １ キチンの加水分解により得られたＮ−アセチル
キトテトラオース１ｇを40mlの0.1Mリン酸緩衝
液（PH5.6）に溶解し40℃に保つた後、参考例１
と同様の方法で調製したキチナーゼを400U添加
して、40℃で６時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物はイオン交換樹脂による脱塩を行な
い、さらに減圧濃縮後凍結乾燥することにより
0.95ｇの白色粉末となつた。この白色粉末の生成
物組成は、高速液体クロマトグラフイーによつて
確認したところ、Ｎ−アセチルキトヘキサオース
18％、Ｎ−アセチルキトテトラオース60％、Ｎ−
アセチルキトビオース20％であつた。 実施例 ２ キチンの加水分解により得られたＮ−アセチル
キトペンタオース１ｇを20mlの0.1Mリン酸緩衝
液（PH5.6）に溶解し40℃に保つた後、参考例１
と同様の方法で調製したキチナーゼを200U添加
して、40℃で15時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物はイオン交換樹脂による脱塩を行な
い、さらに減圧濃縮後凍結乾燥することにより
0.92ｇの白色粉末となつた。この白色粉末の生成
物組成は、高速液体クロマトグラフイーによつて
確認したところ、Ｎ−アセチルキトヘプタオース
５％、Ｎ−アセチルキトペンタオース33％、Ｎ−
アセチルキトテトラオース10％、Ｎ−アセチルキ
トトリオース31％、Ｎ−アセチルキトビオース20
％、Ｎ−アセチルグルコサミン１％であつた。 実施例 ３ キチンの加水分解により得られたＮ−アセチル
キトテトラオース10ｇを160mlの0.1Mリン酸緩衝
液（PH5.6）に溶解し40℃に保つた後、参考例１
と同様の方法で調製したキチナーゼを2300U添加
して、40℃で26時間反応させた。反応終了後、
100℃で10分間加熱し反応を停止させる。得られ
た反応混合物は、活炭カラム（4.4×100cm）に供
して生成したオリゴ糖を吸着させ、０→50％のエ
タノール濃度勾配法で、溶出液16を用いてオリ
ゴ糖を分離溶出した。次いで得られたそれぞれの
画分を減圧濃縮後、凍結乾燥して、Ｎ−アセチル
キトヘキサオース1.6ｇ、その他、Ｎ−アセチル
キトビオース2.5ｇ、Ｎ−アセチルキトテトラオ
ース5.5ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キチンの加水分解により得られた４〜５量体
   のＮ−アセチルキトオリゴ糖を基質とし、これ
   に、ノカルデイア属の生産するキチナーゼを作用
   させ、その糖転移反応により、重合度の高いＮ−
   アセチルキトオリゴ糖を得ることを特徴とする、
   酵素によるＮ−アセチルキトオリゴ糖の製造法。