KR0130938B1 - 고농도 갈락토올리고당의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 조성의 갈락토올리고당 혼합액의 제조방법에 관한 것으로서, β-갈락토시다제와 글루코스이소머라제를 유리효소의 형태로, 또는 물에 녹지 않는 담체에 함께 고정화한 효소의 형태로, pH5-8, 온도 30-70 ℃조건하에, 농도 30-65%(w/w)의 유당에 작용시켜 회분식 또는 연속식으로 반응시킴을 특징으로 하는 고농도 갈락토올리고당 혼합액의 제조방법을 제공한다.

Description

고농도 갈락토올리고당의 제조방법

본 발명은 β-갈락토시다제에 의한 갈락토올리고당으로의 전환반응에 글루코스이소머라제를 동시에 작용시킴으로써 고농도의 갈락토올리고당을 함유하는 새로운 조성의 갈락토올리고당 혼합액을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 유당(lactose)을 기질로하여 갈락토올리고당을 생성하는 β-갈락토시다제와 포도당(glucose)을 과당(fructose)으로 이성화하는 글루코스이소머라제를 유리효소로하여, 또는 물에 녹지 않는 담체에 고정화한 고정화 효소로하여 유당에 함께 적용시켜 회분식 또는 연속식으로 반응시킴을 특징으로 하는 고농도의 갈락토올리고당 혼합액을 생성하는 방법에 관한 것이다.

β-갈락토시다제는 바실러스(Bacillus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococus)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 싸카로마이세스(Saccharomyces)속, 크립토코커스(Cryptococus)속, 클로이베로마이세스(kluyveromyces)속 등의 미생물을 유당을 탄소원으로하여 배양할 경우 생성, 분비되는 세포내 또는 세포의 효소로서, 통상 유당에 작용하여 갈락토스를 1-3개 결합시켜 갈락토올리고당을 생성하고, 부수적을 포도당과 소량의 갈락토스를 생성한다. 이와 같이, β-갈락토시다제를 유당에 작용시켜 얻게 되는 반응 생성물에는 갈락토올리고당 외에도 부산물로 생성된 포도당 및 갈락토스 및 미반응 유당이 함유되어 있다.

β-갈락토시다제를 유당에 작용시켜 갈락토올리고당을 얻는 갈락토올리고당으로의 전환반응에서, β-갈락토시다제는 유당을 가수분해하여 얻게 되는 갈락토스를 수용체에 β-결합시키는 활성을 갖고 있다. 이 수용체가 물인 경우에는 유당이 포도당과 갈락토스로 단지 가수분해만 일어나게 되는 것이다. 수용체가 포도당인 경우에는 알로락토스(allolactose)또는 유당의 2당류가 재생성되고, 수용체가 2당류인 경우에는 3당류의 올리고당이 생성되고, 수용체가 3당류이면 4당류, 4당류이면 5당류의 올리고당이 생성된다[Biotech. Bioengn., vol 30, p1019, 1987]. 갈락토올리고당이 생성되는 효소반응에서 포도당의 농도가 증가하면 갈락토스의 수용체로 유당과 경쟁하게 되어 올리고당의 생성율이 감소하게 된다. 또한, 생성된 포도당은 β-갈락토시다제의 효소활성을 저해하여 반응속도를 지연시킨다[J. of Ferment. Bioengn., vol 70(5), p301, 1990].

상기한 바와 같이, 고정화 또는 유리 효소인 β-갈락토시다제를 이용하여 갈락토올리고당을 생성하는 반응은 포도당이 부산물로 고농도로 생성되며, 포도당의 농도가 어느 수준 이상이 되면 유당과 경쟁하여 올리고당 생성반응을 저해하고 반응속도를 지연시키기 때문에 반응의 전환율을 40%이상으로 하기 곤란하다. 이때 전환율이란 투입된 유당의 농도에 대한 생성된 올리고당 농도의 비율을 말한다. 반응액중의 올리고당 농도를 높게 하기 위하여 고농도의 유당에 β-갈락토시다제를 작용시켜 전환반응을 진해시키는 경우, 포도당도 그만큼 고농도로 생성되기 때문에 유당과 경쟁적으로 갈락토스 수용체로 작용하여 올리고당의 생성율을 떨어뜨리며, 따라서 β-갈락토시다제에 의한 갈락토올리고당의 생성 반응은 반응의 부산물인 포도당의 저해작용에 의해 고농도의 올리고당을 함유한 반응액을 얻기가 어렵다.

한편, 한국 특허 공개 제88-5255호 공보에는, 갈락토올리고당의 제조법으로, 반응온도를 높여 유당의 용해를 증가시킨 상태에서 β-갈락토시다제를 유당에 작용시켜 처리하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 방법에서는, 반응온도가 매우 높기 때문에 열에 안정한 β-갈락토시다제만 사용할 수 있어 전환반응에 이용할 수 있는 효소가 제한되는 문제점이 있다. 또, 유당 농도가 높은 반응에서도 상기한 바와같이 포도당이 그만큼 고농도로 생성되기 때문에 유당과 경쟁적으로 갈락토스 수용체로 작용하고, 효소활성을 저해하여 올리고당의 생성율을 30%이상으로 하기가 어렵다.

이에 본 발명자들은 종래 기술에서의 상기한 문제점을 해소하고 고농도의 갈락토올리고당 혼합액을 얻는 방법을 제공하기 위하여 예의 연구한 결과, 포도당에 작용하여 이를 과당으로 이성화하는 글루코스이소머라제를 β-갈락토시다제에 의한 갈락토올리고당으로의 전환반응에 함께 작용시키는 경우, 갈락토올리고당으로의 전환 반응에 부산물로 생성되는 포도당을 과당으로 전환시켜 제거함으로써 포도당에 의한 β-갈락토시다제의 활성에의 저해작용을 줄이고, 갈락토스의 수용체로 유당과의 경쟁적 작용을 감소시킬 수 있어, 고농도의 갈락토올리고당의 혼합액을 얻을 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 β-갈락토시다제에 의한 갈락토올리고당으로의 전환반응에 글루코스이소머라제를 동시에 작용시킴으로써 포도당에 의한 β-갈락토시다제의 활성에의 저해작용을 감소시켜 고농도의 갈락토올리고당 혼합액을 얻을 수 있는 제조방법을 제공하는 것이다.

글루코스이소머라제(자일로스이소머라제)는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 바실러스(Bacillus)속, 에어로박터(Aerobacter)속, 썰머스(Therums)속 등의 미생물이 생성하는 세포내 효소(미국특허 제4,610,965호)로서, 포도당을 과당으로 전환시키는 반응에 관여하며, 공업적으로는 불용성 담체에 고정화하여 과당의 생산에 이용되고 있다(일본특허 공개 소53-25029). 이때, 생성된 고당은 β-갈락토시다제의 효소활성에의 저해작용이 전혀 없으며, 갈락토스의 수용체로도 이용될 수 없으므로 갈락토올리고당의 생성에 영향을 주지 못한다.[J. of Ferment. Bioengen., vol 70(5), p301, 1990].

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

즉, 본 발명에 따르면, 유당을 기질로하여 갈락토올리고당을 생성하는 β-갈락토시다제와 포도당을 과당으로 이성화하는 글루코스이소머라제를 유리 효소로 하여 회분식 교반조에 함께 넣어 반응시키거나 또는 이들 두 효소를 물에 녹지 않는 담체에 함께 고정화시킨 고정화 효소로 하여 회분식 교반조에 넣어 반응시키거나 또는 이를 칼럼에 충전하여 연속적으로 고농도의 올리고당 혼합액을 생성하는 방법이 제공된다.

이때 사용되는 기질로는 30-65%(w/w)의 유당용액이며, pH5-8, 온도 30-70℃의 조건하에 반응을 진행시킨다.

이렇게하여 생성된 올리고당 용액은 종래의, 방법에 의해 얻은 제품보다 포도당의 농도가 낮고 올리고당의 농도가 높다.

이하, 상기한 두 효소를 함께 고정화한 효소의 제조법에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

글루코스이소머라제의 담체로는 키틴을 사용하는데, 키틴은 자연계에 널리 분포되어 있는 갑각류의 주성분으로 N-아세틸 글로코사민이 베타(1→4)로 결합된 바이오폴리머이다. 이것은 구조의 변형이 용이하고 흡착력이 강하여 중금 속의 흡착제로 사용되며 쉽게 구할 수 있으므로 고정화 효소의 담체로 많은 잇점이 있다.

미생물을 배양하여 얻은 글루코스이소머라제 효소 용액 또는 효소 냉동 건조제품을 0.05M의 인산 완충용액(pH6.5-7.5)에 1-2%로 현탁시킨 키틴 현탁액에 혼합하여 실온에서 1시간 교반하여 흡착 고정화하고, 4℃에서 12시간 정지시킨 후 증류수로 고정화 효소를 3회 세척하여 미흡착 효소를 제거한다. 글루타르알데하이드를 최종 농도 0.1-2%로 처리하여 효소와 담체를 공유결합으로 연결할 수도 있다. 키틴에 고정화된 글루코스이소머라제의 활성은 0.1M의 포도당 용액을 기질로하여 60℃에서 활성을 측정하여 1분간 1μM의 과당을 생성하는 효소량을 1단위로 정의한다. 일반적으로 상기의 방법으로 고정화된 글루코스이소머라제의 활성은 100-200단위/g-담체 정도이다. 또, 고정화 글루코스이소머라제의 반응 최적 pH도 산성쪽으로 0.5-1.0단위 이동되어 β-갈락토시다제의 반응 최적 pH와 거의 같게 되었다.

한편, β-갈락토시다제의 고정화 방법은 알지네이트를 이용한 포괄법을 많이 사용하고 있다.

β-갈락토시다제를 생성하는 균주를 유당을 함유하는 영양배지에서 통상적인 방법으로 배양하여 효소를 함유한 균체를 얻은 후 2-3%(w/v)의 알지네이트와 습균체의 농도가 최종적으로 10-40%(w/w)가 되도록 섞고, 여기에 키틴에 고정화한 글루코스이소머라제를 β-갈락토시다제 활성이 글루코스이소머라제의 활성에 대하여 1-2배, 바람직하게는 1.5-2.0배가 되는 양으로 첨가하여 충분히 혼합한 다음 시린지 게이지를 통하여 상온에서 교반중인 0.5-3.0M의 염화칼슘 수용액에 적하시키면 일정한 크기의 비드형태로 두 효소가 함께 고정화된다. 고정화한 세포를 실온에서 1-2시간 방치시킨 후, 4℃에서 24시간 동안 경화시킨다. 고정화한 β-갈락토시다제의 활성은 0.05M의 인산 완충용액(pH6.0)에 40%(w/w)로 용해한 유당을 기질로 50℃에서 측정하여 1분간 1μM의 포도당을 생성하는 효소량을 1단위로 한다.

세포외 β-갈락토시다제를 고정화하고자 하는 경우에는, 효소의 성질에 따라 이온교환수지를 이용할 수 있다. 세포외 β-갈락토시다제를 생성하는 균주를 유당을 함유한 영양배지에서 통상적인 방법으로 배양하여 균체를 제거하고, 효소는 함유한 반응액을 얻은 후, 20mg-단백질/g-담체가 되도록 다공성 음이온교환수지로 고정화하였다. 이하의 방법은 상기한 방법에서와 동일하다.

상기한 방법으로 함께 고정화한 두 효소의 β-갈락토시다제 활성측정 조건에서 기질만을 달리하여 측정한 활성비는 거의 동일하거나 β-갈락토시다제의 활성이 약간 우세하게 나타난다.

상기한 방법으로 함께 고정화한 두 효소의 β-갈락토시다제 활성측정 조건에서 기질만을 달리하여 측정한 활성비는 거의 동일하거나 β-갈락토시다제의 활성이 약간 우세하게 나타난다.

함께 고정화한 효소의 제법으로는 앞서 설명한 서로 다른 담체에 상이한 고정화 방법을 이용하거나 또는 하나의 담체에 두가지 효소를 같이 흡착시키는 것처럼 동일한 고정화방법을 이용할 수 있으며, 어느 한가지로 한정되지는 않는다.

상기한 바와 같이 제조한 고정화 효소를 유당에 작용하여 갈락토올리고당으로의 전환반응을 진행시키는 경우, β-갈락토시다제작용의 부산물로 생성되는 포도당은 글루코스이소머라제의 기질이 되어 과당으로 전환되므로, 고정화 효소에 의해 생성된 포도당은 효소 그 자체의 작용에 의해 제거된다. 즉 β-갈락토시다제의 반응 부산물에 의한 저해작용이 감소되어 전체적인 반응 속도가 빨라지고 효소의 수명도 연장된다. 또한 갈라토스 수용체인 포도당의 농도가 감소하므로 올리고당의 생성율이 높아진다. 최종적으로 종래의 제품과 비교하여 포도당과 유당의 농도가 낮아지고 갈락토올리고당과 과당의 농도가 높아진 새로운 조성의 갈락토올리고당 혼합액이 얻어진다.

즉, 함께 고정화된 효소를 회분식 또는 연속식으로 운전하게 되면 고농도의 갈락토올리고당을 함유한 새로운 조성의 갈락토올리고당의 혼합액을 용이하게 얻을 수 있다. 또한 유리효소를 이용한 두 효소의 반응으로도 같은 효과를 얻을 수 있다.

최종 반응 생성물은 그 자체로 사용되거나 또는 탈색, 정제, 농축, 건조 또는 기타 식품이나 음료수의 제형으로 하는데 요구되는 가공을 실시하여 비피도박테리움균 증식촉진작용이 있는 감미당 혼합물 또는 음식물로서 이용될 수 있다. 물론, 반응 생성물은 정제 올리고당의 제조용으로 이용될 수도 있다.

이하 실시예에 의거하여 본 발명은 보다 상세하게 설명한다.

[실시예 1]

키틴과 안지네이트에 함께 고정화한 β-갈락토시다제와 글루코스이소머라제를 칼럼에 충전하여 pH6-7, 40%(w/w)의 유당용액을 공산속도(space velocity)0.5로 통액하여 운전하였다(A). 또, 비교를 위하여 β-갈락토시다제를 종래의 방법대로 알지네이트에 고정화하여 동일하게 운전하였다(B). 두 경우의 반응 산물중 당조성비를 고속 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 그 결과는 하기의 표1과 같았다.

[실시예 2]

0.05M의 인산 완충용액 (pH6.5)에 그루코스이소머라제의 활성에 대하여 β-갈락토시다제의 활성이 1.5-2.0배가 되도록 효소용액을 만든 후, 다공성 음이온 교환수지를 20mg-단백질/g-담체에 해당하도록 투입하여 30℃에서 12시간 흡착시킨 후 수지를 탈이온수 500㎖로 세척하여 미흡착 단백질을 제거하여 고정화하였다. 이렇게하여 얻은 함께 고정화된 효소를 컬럼에 충전하여 pH6-7, 40%(w/w)의 유당용액을 공간속도 1.0으로 통액하여 운전하였다(A). 또, 비교를 위하여 β-갈락토시다제만을 상기의 방법대로 고정화하여 동일하게 운전하였다(B).

두 경우의 반응 산물중 당조성비를 고속 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 그 결과는 하기의 표 2와 같았다.

[실시예 3]

0.05M의 인산 완충용액(pH6.5)에 40%(w/w)의 유당용액을 만든 뒤, 여기에 글루코스이소머라제와 β-갈락토시다제를 각각 50단위/㎖-반응액을 넣어 50℃에서 15시간 반응하였다(A). 또 비교를 위해 β-갈락토시다제만을 상기의 방법대로 넣어 동일하게 반응하였다(B). 두 경우의 반응 산물 중 당조성비를 고속 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 그 결과 하기의 표 3과 같았다.

Claims (5)

1. 효소를 이용하여 기질인 유당으로부터 갈락토올리고당 혼합액을 제조하는 방법에 있어서, β-갈락토시다제와 글루코스이소머라제를 유리 효소의 형태로, 또는 물에 녹지 않는 담체에 함께 고정화한 효소의 형태로 유당에 작용시켜 회분식 또는 연속식으로 반응시킴을 특징으로 하는 고농도 갈락토올리고당 혼합액의 제조방법
2. 제1항에 있어서, 상기 고정화효소는 β-갈락토시다제와 글루코스이소머라제를 동일한 담체 또는 서로 다른 담체에 글루코스이소머라제의 활성에 대하여 β-갈락토시다제의 활성이 1-2배가 되도록 고정화하여 얻은 것임을 특징으로 하는 제조방법
3. 제1항에 있어서, 유당의 농도를 30-65%(w/w)로 함을 특징으로 하는 고농도 갈락토올리고당의 제조방법
4. 제1항에 있어서, 기질의 pH를 5-8로 함을 특징으로 하는 고농도 갈락토올리고당의 제조방법
5. 제1항에 있어서, 효소 반응온도를 30-70℃로 함을 특징으로 하는 고농도 갈락토올리고당의 제조방법