KR940010307B1 - 고농도 프락토올리고당의 제조법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

고농도 프락토올리고당의 제조법

본 발명은 고농도의 프락토올리고당을 함유한 새로운 조성의 프락토올리고당 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는 물에 녹지않는 담체에 올리고당을 생성하는 프락토실트랜스퍼라제와 포도당을 과당으로 이성화하는 글루코스 이소머라제를 함께 고정화하여 회분식 교반조에 같이 넣어 반응시키거나 또는 이를 컬럼에 충전하여 연속적으로 고농도의 올리고당 혼합물을 생성하는 방법에 관한 것이다.

프락토실트랜스퍼라제는 오레오바시디움(Aureobasidium)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 푸사리움(Fusarium)속 그리고 글레오스포리움(Gloeosporium)속 등의 미생물을 설탕을 탄소원으로 하여 액체배양하였을 경우 생성, 분리되는 세포 내, 외 효소(미국특허 제4,356,262호)로서 통상 설탕에 작용하여 과당을 1-3개 결합시켜 프락토올리고당을 생성하고 부수적으로 미전환 혹은 미결합된 설탕, 과당 그리고 포도당을 생성한다(일본특허 출원공개소 56-154967호).

또 글루코스 이소머라제는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 바실러스(Bacillus)속 및 에어로박터(Aerobacter)속 등의 미생물이 생성되는 세포내 효소(미국특허 제4,610,965호)로 포도당을 과당으로 전환하는 반응에 관여하며, 공업적으로는 불용성담체에 고정화하여 과당의 생산에 이용되고 있다(일본특허 출원공개소 53-25029호).

한편 고정화 프락토실트랜스퍼라제를 이용하여 올리고당을 생산하는 반응은 부산물로 포도당이 고농도로 생성되며, 포도당의 농도가 어느 수준 이상이 되면 설탕의 전환 반응을 저해(Biotechnology Letter, 1989년, 491페이지)하여 효소반응 속도를 지연시키기 때문에 반응의 전환율은 60%이상으로 되기에 곤란하다. 전환액중 올리고당의 농도를 높게 하기 위하여 설탕농도를 높여 반응시키면 역시 포도당의 저해작용으로 고농도의 올리고당을 함유한 전환액을 얻기가 어려우므로 통상적으로 60%(w/v)의 설탕용액을 사용하는 것으로 되어 있다.

이러한 단점을 극복하여 효소반응 속도를 빠르게 하고 올리고당의 농도를 높이기 위하여 연구를 계속한 결과 본 발명자들은 프락토실트랜스퍼라제와 글루코스 이소머라제를 같이 고정화 시킨 새로운 고정화 효소와 이를 이용하여 회분식 혹은 연속식으로 반응시키는 시스템을 고안하게 되었다.

즉, 본 발명에 따르면 물에 녹지 않는 담체에 올리고당을 생성하는 프락토실트랜스퍼라제와 포도당을 과당으로 이성화는 글루코스 이소머라제를 함께 고정화하여 회분식 교반조에 같이 넣어 반응시키거나 또는 이를 컬럼에 충전하여 연속적으로 고농도의 올리고당 혼합물을 생성하는 방법이 제공된다.

이때 사용되는 기질은 설탕으로 50-90%(w/v)로, 바람직하게는 60-80%(w/v)로 용매하여 pH는 5-8로, 바람직하게는 6-7로 조정하여 사용하고 효소반응 온도가 50-60℃가 되도록 한다.

이렇게 하여 생성된 올리고당 용액은 기존의 방법에 의하여 얻은제품보다 포도당의 농도가 낮고 올리고당의 농도가 높아진 것으로 고농도의 프락토올리고당 혼합액을 쉽게 얻을 수 있다.

두 효소를 함께 고정화 한 효소의 제조법에 관하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

글루코스 이소머라제의 고정화 담체로는 키틴(chitin)을 사용하는데 키틴은 자연계에 널리 분포되어 있는 갑각류의 주성분으로 엔-아세칠 그루코사민이 베타(1→4)로 결합된 바이오폴리머이다. 이것은 구조의 변형이 용이하고 흡착력이 강하여 중금속의 흡착제로 사용되며 쉽게 구할 수 있으므로 고정화 효소의 담체로 많은 잇점이 있다.

미생물을 배양하여 얻은 글루코스 이소머라제 효소 용액 혹은 효소 냉동 건조 제품을 0.05M 인산완충 용액(pH 6.5-7.5)에 1-2%로 현탁시킨 키틴 현탁액에 혼합하여 실온에서 1시간 교반하여 혼합 고정화하고 4℃에서 12시간 정치시킨 후 증류수로 고정화 효소를 3회 세척하여 미흡착 효소를 제거한다. 글루타르알데히드롤 최종농도 0.1-2%로 처리하여 효소와 담체를 공유결합으로 연결시킬 수 있다. 키틴에 고정화된 글루코스 이소마라제의 활성은 0.1몰 포도당용액을 기질로 하여 60℃에서 활성을 측정하여 1분간 1마이크로몰의 프럭토스를 생성하는 효소량을 1단위로 정의한다. 일반적으로 상기의 방법으로 고정화 된 글루코스 이소머라제의 활성은 100-200단위/g 정도이다.

그리고 고정화된 글루코스 이소머라제의 반응 최적 pH도 산성쪽으로 0.5-1.0단위 이동되어 프락토실트랜스퍼라제의 최적 pH와의 차이도 줄일 수 있다.

한편 프락토실트랜스퍼라제의 고정화 방법은 알지네이트를 이용한 포괄법을 많이 사용하고 있다. 프락토실트랜스퍼라제를 생성하는 균주를 설탕을 함유하는 영양배지에서 통상적인 방법으로 배양하여 효소를 함유한 균체를 얻은 후 2-3%(w/v)의 알지네이트와 습균체의 농도가 최종적으로 10-40%(w/v)가 되도록 섞고, 여기에 키틴에 고정화한 글루코스이소머라제를 프락토실트랜스퍼라제 활성이 글루코스이소머라제의 활성에 비하여 1.5∼2.0배가 되는 양으로 첨가하여 충분히 혼합한 다음 시린지 게이지를 통하여 상온에서 교반중인 0.5-3.0몰의 염화칼슘 수용액에 적하시키면 일정한 크기의 비드형태로 두 효소가 함께 고정화 된다. 고정화한 세포를 실온에서 1-2시간 방치 후 4℃에서 24시간 동안 경화시킨다. 고정화한 프락토실트랜스퍼라제의 활성은 0.05몰 구연산 완충용액(pH 5.5)에 60%(w/v)로 용해한 설탕을 기질로 60%에서 측정하며 1분간 1마이크로몰의 포도당을 생성하는 효소량을 1단위라 한다. 상기의 방법으로 함께 고정화한 두 효소의 프락토실트랜스퍼라제 활성 측정 조건에서 기질만을 달리하여 측정한 활성비는 거의 동일하거나 프락토실트랜스퍼라제의 활성이 약간 우세하게 나타난다.

함께 고정화 하는 요소의 제법은 앞서 설명한 서로 다른 담체에 상이한 고정화 방법을 이용하거나 하나의 담체에 두가지 효소를 같이 흡착시키는 것처럼 동일한 고정화 방법을 이용하거나 어느 한가지로 한정되지는 않는다.

이상처럼 제조한 고정화 효소는 그 자체에서 프락토실트랜스퍼라제 작용의 부산물로 생성된 글루코스가 글루코스 이소머라제의 기질이 되어 프락토스로 전이되는 이 프락토스의 일부가 다시 프락토실트랜스퍼라제에 의하여 프락토올리고당으로 전이되면 연속반응을 거치게 되므로 글루코스의 농도가 낮게 되어, 즉 프락토실트랜스퍼라제의 반응 산물에 의한 저해(product inhibition)가 약해져서 전체적인 반응속도가 빨라지며 효소의 수명도 연장된다. 최종반응액은 기존의 제품과 비교하여 설탕의 포도당과 농도가 낮아지고 프락토올리고당과 프락토스의 농도가 높아진 새로운 조성의 프락토올리고당 혼합액으로 얻어진다. 즉, 함께 고정화 된 효소를 회분식으로 운전하게 되면 고농도의 프락토올리고당을 함유하는 새로운 조성의 프락토올리고당의 혼합액을 용이하게 만들 수 있다.

본 발명의 이하 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

키틴과 알지네이트에 함께 고정화한 프락토실트랜스퍼라제와 글루코스 이소머라제를 충전하여 pH 6-7, 80%(w/v)의 설탕용액을 공간속도(space velocity) 05로 통액하여 운전하였다.(A)

또, 비교를 위하여 프락토실트랜스퍼라제를 기존의 방법대로 알지네이트에 고정화하여 동일하게 운전하였다.(B) 두 경우의 반응 산물중 당의 조성비를 고속 액체크로마토그라피(HPLC)로 분석하였다. 그 결과는 아래의 표와 같다.

[ 실시예 2 ]

0.05M 인산완충용액(pH 6.5)에 글루코스 이소머라제의 활성에 대하여 프락토실트랜스퍼라제의 활성이 1.5배가 되도록 효소용액을 만든 후 다공형 음이온 교환수지를 1mg 효소 단백질에 대하여 5.0mg 당량에 해당하도록 투입하여 30℃에서 12시간 흡착시킨 후 수지를 탈이온수 500ml로 세척하여 미흡착단백질을 제거하여 고정화하였다. 이렇게 하여 얻은 함께 고정화된 효소를 컬럼에 충전하여 pH 6-7, 80(w/v)의 설탕용액을 공간속도를 1.0으로 통액하여 운전하였다.(A)

또, 비교를 위하여 프락토실트랜스퍼라제만을 상기의 방법대로 고정화하여 동일하게 운전하였다.(B)

두 경우의 반응산물 중 당의 조성비를 분석하였다.

[ 실시예 3 ]

본 발명에 따른 고정화 효소가 높은 활성을 나타낼 수 있는 기질의 최적 pH를 조사하였다.

기질로서 pH 5-9범위의 설탕용액을 제조하여, 함께 고정화한 효소를 사용하여 pH에 따른 전환률의 변화를 측정하였다.

Claims (2)

1. 효소를 이용하여 기질인 설탕으로부터 프락토올리고당 혼합액을 제조하는 방법에 있어서, 프락토실트랜스퍼라제와 글루코스이소머라제를 물에 녹지 않는 담체에 함께 고정화한 효소를, 농도 60∼80%(w/v)의 기질에, pH 5∼7, 온도 50∼60℃ 조건하에서 적용하여 회분식 또는 연속식으로 고함량의 프락토올리고당을 제조함을 특징으로 하는 고함량의 프락토올리고당 혼합액의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 고정화 효소는 글루코스이소머라제를 100∼200단위/g양으로 담체에 고정화하고, 프락토실트랜스퍼라제는 그의 활성이 전기 글루코스이소머라제 활성의 1.5∼2.0배가 되는 양으로 동일한 담체 또는 다른 담체에 고정화하여 얻은 것임을 특징으로 하는 제조방법.