JPS61268190A - 糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 何）産業上の利用分野 本発明は難う触性甘味料、低カロリー甘味料及び腸内ビ
フィズス菌の選択的増殖因子として食品分野に使用され
ているフラクトオリゴ糖を主成分とする糖の新規な効率
的製造法を提供するものである。

（ロ）従来の技術及び発明が解決しようとする問題点シ
ュークローズに７ラクト一ス転移作用を有する酵素を作
用させると７ラクト一ス転移反応の結果、副生じたグル
コース、転移反応によりシュークローズにフラクトース
が１〜４分子分子上た３糖類（ＧＦａ　）　ｔ　　４糖
類（ＧＦａ　）　ｐ　　５糖類（ＧＦ４）。

６１１類（ＧＦ、　＞を含む７ラクトオリゴ糖および未
反応のシュークローズを少量含有する甘味組成物が生成
し、このフラクトオリゴ糖はう蝕原因菌であるストレプ
トコッカス・ムタンスの生産するデキストランシューク
ラーゼの基質とはならないので、フラクトース転移作用
を有する酵素をシュークローズに作用させることＫより
シュークローズから難う触性甘味料を製造できることが
知られている（特開昭５６−１５４９６７　）。また、
７ラクトオリゴ糖が生体内で消化吸収されない低力口Ｉ
Ｊ　−甘味料であること（特開昭５８−４００６５）に
加えて、腸内細菌のビフィズス菌により選択的に資化さ
れることから、腸内ビフィズス菌の選択的増殖因子とも
なり得ること（特公昭５９−５３８３４）も知られてい
る。

上記の７ラクトオリゴ糖製造に用いられるフラクトース
転移作用を有する酵素としては、アスペルギルス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）属、例えばアスヘルキにスーニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕａ　ｎｉｇｏｒ　ＦＥＲＭ
−Ｐ　５８８６　）。

ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　）属（ペニシ
リウム。

ニゲリカンｘ　（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎｉｇｒｉ
ｃａｎａ　）等）。

７ザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　）属（フザリウム・す
二（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　１ｉｎｉ　ＩＡＭ　５００８　
）等）、グレオスボリバシテウム・プルランス・パル・
メラニクナム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌ
ｕｌａｎｓ　ｖａｒ、　ｍｅｌａｎｉｇｅｎｕｍＡ−８
、ＡＴＯＣ２Ｑ６１２　）等）などのカビ、サツカロミ
セス（８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅａ　）属（サツカロミ
セス−セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｌｓｉａｅ　）等）を等）、ハンセヌラ（Ｈａｎ
ａｅｎｕｌａ　）属（ハンゼヌラーミソ（Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ　ｍ１ｓｏ　）等）、キャンディダ（０ａｎｄｉ
ｄａ　）属（キャンデイダ・トロピカリス（（ｌａｎｄ
ｉｄａ　１ｒｏｐｉｃａｌｉｆｌ　）等）などの酵母等
の微生物起源の酵素やアスパラガス、キクイモ等の植物
起源の酵素を用いることが既に知られている（特開昭５
６−１５４９６７、特公昭５９−５３８３４）。

上記の酵素を用いたフラクトオリゴ糖の工業的製造法と
しては、シュークローズ濃度５〜７０％。

）１ｔ［４，０〜７．Ｏ１温度２５〜６５℃で酵素使用
量をシュークローズ１ｇ当り０、０８〜３．３単位とし
て反応させる方法があり、この方法により得られる組成
物中の７ラクトオリゴ糖の含有量が３０〜５８％である
ことが知られている（特開昭５６−１５４９６７　）。

しかし、この方法によると、未反応の原料シュークロー
ズカ多量（１０〜３６％）に残存したり、グルコースの
副生（２５〜３８％）やフラクトースの副生（１〜９％
）がみられるために、生成フラクトオリゴ糖は６０％未
満に留まっている。

このように、未反応の原料シュークローズの残存を極力
少なくし、また副生ずるグルコース、フラクトースの生
成量を極力押えてシュークローズから７ラクトオリゴ糖
を高濃度に含有する糖組成物を有効に、かつ工業的に得
るために使用する酵素の特性把握と、それに伴なう反応
条件の設定は未だ十分でないのが現状である。

（ハ）問題点を解決するための手段 この発明は本発明者らによる前記特開昭５６−１５４９
６７号の発明をさらに発展させたもので、アスペルギル
ス・ニガーに属する菌の生産する強力なフラクトース転
移作用を有する酵素の特性を詳細に解明した結果、従来
技術に比べて酵素を高単位で、しかも短時間シュークロ
ーズに作用させることによりフラクトオリゴ糖の含有量
が大幅に上昇した転移生成物を得ることを見い出し、本
発明を完成するに至った。

本発明によれば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）起源の、シュークローズ
に作用してそのβ−Ｄ−フラクトフラノシド結合を切断
し、生成したフラクトシル基を糖類の１級水酸基に転移
させる作用（フラクトース転移作用）を有する酵素をシ
ュークローズに作用させることを特徴とするフラクトオ
リゴ糖を主成分とする糖の製造法が提供される。

本発明で用いるフラクトース転移作用を有する酵素は、
アスペルギルス・ニガーに属する菌を培養することによ
り得ることができる。酵素は適当な培地で培養した培養
液より得、目的に応じて所望の形態にすることができる
。その１例を示すと、アスペルギルス・ニガーＦＥＲＭ
−Ｐ　５８８６　ヲシュークローズを含む適当な培地、
例えばシュークローズ５．０％、酵母エキス３．６％、
カルボキシメチルセルロース（ＯＭＯ）　０、５％を含
有する培地で、２５〜３０℃、２４〜９６時間培養し、
培養終了後、培養液から一過、遠心分離等の手段で分離
して得られる菌体またはこの菌体より酵素抽出に関する
方法で得た酵素抽出液、さらには該抽出液より限外ｐ適
法、硫安塩析法、溶剤沈殿法、ゲル一過性アイオン交換
クロマト法等の酵素精製手段によって精製した酵素を用
いることができる。

次に、アスペルギルス・ニガーＦＥＲＭ−Ｐ　５８８６
菌の培養菌体より７ラクト一ス転移作用を有する酵素を
精製する方法の１例を示す。

培養菌体３６０ｇに１０　ｍＭ燐酸緩衝液（Ｐ４（５，
０）３．６１を加えて洗浄した菌体を一２０℃で凍結し
た後、２５℃で融解する操作を３回繰返し実施した。凍
結融解菌体を２０Ｋ）ｌｚｐｓ分間の超音波処理を行〜
・、更に２７℃、２４時間放置して菌体を自己消化させ
た後、遠心分離を行って沈殿部を除いて酵素抽出液３．
４１を得た。この抽出液に酢酸カルシウムを６％（Ｗ／
ｖ　）になるように加え、５℃で４時間放置後、遠心分
離を行って上清３．４１を得た。この上清を限外ｐ適法
（アミコン社製。

フォローファイバー、　　ＨＩＰ　１０使用）により９
２０Ｍまで濃縮した後、硫安を７５％（”／ｖ　）にな
るよ５に加えて生じた沈殿物を除去した。その上清を再
び限外−過去により８３ｍまで濃縮した。

次いで、２０　ｍＭ燐酸緩衝液（…６．０）で平衡化し
たＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　−５０６９０Ｋｌ
を充てんしたカラムにこの濃縮液をチャージし、２０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液、０、１ＭのＮａＣｌを含む２０　ｍＭ燐
酸緩衝液。

０、２Ｍ、　　０、３Ｍ、　０、５Ｍおよび１．０Ｍの
Ｎａ１ｌを含む２０　ｍＭ燐酸緩衝液で順次溶出すると
、活性は０、３ＭのＭａｉｌを含む２０　ｍＭ燐酸緩衝
液の分画に溶出された。次に、この活性分画を限外渥過
去で濃縮して８ｄとした後、０、１ＭのＭａｉｌを含む
２０式燐酸緩衝液（ＰＨ６，０）で平衡化したＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ６Ｂカラムに充てんして０、１　ＭのＭａｉ
ｌを含む２０ｍＭ燐酸緩衝液で溶出し、活性分画を集め
、この活性分画を限外濾過法で濃縮して５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　６　Ｂカラムでリクロマトグラフを行い、ディス
ク電気泳動（ゲル濃度７．５％、ｐＨ９，４）で単一な
酵素標品１３．７ｍ７を得た。本酵素の比活性は２８０
０単位／η蛋白であり、活性収率は１０％であった。

このよ５ＫＬ、て得た精製酵素の理化学的性質について
述べる〇 ■作用：シュークローズ、１−ケストース、ラフィノー
ス等のβ−Ｄ−フラクトフラノシド結合を有する糖類の
β−Ｄ−７ラクト７２ノシド結合を切断し、生成したフ
ラクトシル基を糖類の末端フラクトシル基のＣ−１（水
酸基）位に特異的に転移させる。シュークローズから多
糖類を合成しない。

■基質特異性ニジニークロース、１−ケストース。

ニストース、ラフィノースによく作用するが、ツラノー
ス、マルトース、メレチトースには作用しない。

■至適用および安定用範囲：至適ｐＨは５．０〜６．０
であり、４０８Ｃ２３０分間の加温条件下ではＰＩ（４
，５〜１０、０で９０％以上の活性を保つ。

■力価の測定法二基質濃度を１０％として、田５．０、
４０℃の条件下で１分間に１マイクロモルのフラクトー
スの転移作用を起す酵素力を１単位とした時の酵素力価
は２５００〜３０００単位／〜蛋白である。

■作用適温の範囲：５５℃付近に至適作用範囲がある。

■…、温度による失活の条件：４０℃、３０分の処理条
件では田２．０で完全に失活する。田５．０、３０分間
では８０℃で完全に失活する。

■阻害剤：塩化第二水銀では失活するが、硝酸銀。

酢酸鉛、硫酸マグネシウム、硫酸鋼、塩化第二鉄、硫酸
亜鉛、硫酸マンガン、塩化コバル）、　　ＦｉＤＴＡで
は失活しない。

■分子量：３４ｏ、ｏｏｏ（ゲルｐ過去〕。

■ディスク電気泳動：　Ｆ４（９，４、ゲル濃度７．５
％のアクリルアミド電気泳動法で蛋白的に単一であるこ
とが判明した。

上記の理化学的性質と一致する酵素は未だ知られておら
ず、本発明者らが見い出したオーレオバシデイクＡ−プ
ルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕ−
１ａｎａ　）属の酵素（特開昭５６−５１７５８）とも
アスパラガス等の植物起源の塩尻らにより報告されたフ
ラクトシルトランスフェラーゼ（Ａｇｒｉｃ、　１ｌｉ
ｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　４４　（３）、　６０３（１９８０）　
〕とも本酵素が異なることはその性質の比較より明らか
である。これらの酵素の主な相違点を表１に示す。

このようにして得られるフラクトース転移活性を有する
菌体酵素または精製酵素はシュークローズに作用してフ
ラクトオリゴ環を高濃度に含有する糖組成物を生成する
作用特性を有する。本発明者らはこの酵素の有する特性
を詳細に解明した結果、この作用特性を有効に生かす条
件で本酵素を使用することによりシュークローズから７
ラクトオリゴ糖を主成分とする糖組成物を従来技術より
も効率的、かつ工業的方法で製造することが可能となっ
た。

以下に本酵素の有する特性について説明する。

はじめに、シューク日−スからフラクトオリゴ環が生成
する酵素反応について詳細に述べる。７ラクト一ス転移
作用を有する酵素はシュークローズをフラクトシル基供
与体及び受容体とするので、２モルのシュークローズか
ら１モルのグルコースと１モルの３糖類左とえば１−ケ
ストースを生成する反応を触媒し、生成した３糖類に更
にフラクトシル基が転移すると４糖類、たとえばニス）
−スが生成する。一方、フラクトース転移作用を示す微
生物起源の酵素は一般にβ−７ラクト７ラノシダーゼの
性質をもつのでシュークローズの加水分解反応も触媒す
る。従って、シュークローズを基質とした時の反応初期
の基本反応式は次の（１）。

（匂式 転移反応　２ＯＦ−一〇＋Ｇア雪　　（１）酵素 加水分解反応　　　ＧＦ　　−−→Ｇ＋１Ｆ　　　　　
　（２）（式中、ＧＦはシュークローズを、Ｇはグルコ
ースを、ＧＦ、はシュークローズにフラクトースが１分
子結合した３糖類な、！はフラクトースを表わす）。

で示される。しかし、酵素反応を継続すると、生成した
３糖類（Ｇ１’Ｑ）もフラクトース転移の受容体となり
４糖類（ＧＦａ　）を生成し、更ＫＧＦ、も同様に７ラ
クト一ス受容体となり５糖類（ＧＦ４）を生成する複雑
な転移反応となり、７ラクトオリゴ糖生成反応は（３）
式で表わされる。

ＧＦ ↓酵素　　　　　　　　　　　（３） Ｇ（ａ％）　＋　Ｆ（ｂ％）　＋　ＧＦ（ａ％）＋ＧＦ
＊（ｄ％）　十〇Ｆ、（ａ％）＋ＧＦ４（ｆ％）　＋　
ＧＦｇ（ｇ％）（式中、Ｇ　ｐ　　Ｆ　ｐ　ＧＦ　ｙ　
ＧＦｓは前記と同じであり、ＧＦａ　ｒ　　ＧＦ４およ
びＧＦ、はシュークローズにフラグドーズが２，３およ
び４分子結合した４糖、５糖および６糖を示し、ａ、　
ｂ、　ｃ、　ｄ、　ｅ、　ｆ、　ｇは生成する糖組成を
重量パーセントで示す数字を表わす）。

従って、この（３）式を分析すると、シュークローズよ
りフラクトオリゴ環を効率的に製造するためには、■シ
ュークローズの損失に一つながる加水分解反応を極力押
えること、■転移反応で生成するフラクトオリゴ環の構
成糖中のＧＦ、生成量を多くしてグルコースの副生量を
少なくすること、■原料シュークローズの残存率を少な
くすることが重要であることがわかる。すなわち、加水
分解反応が全く起こらず転移反応によりＧＦ、のみが生
成し、かつシュークローズが完全に消費されたと仮定す
ると、シュークローズより得られる糖組成物中の７ラク
トオリゴ糖の含有率を理論上７５％まで高めることがで
きる。

従って、シュークローズから７ラクトオリコ糖を酵素反
応により効率的に製造する際には、使用する酵素の特性
及びその特性を生かす反応条件の設定が最も重要となる
。その酵素の最も重要な特性としては次の４項目が挙げ
られるが、過去にはこのような特性を総合的に比較した
例は未だない。

本発明者らはフラクトオリゴ環の効率的な製造法におい
て優れた特性を有する酵素を開発することを目的として
（１）培養においてより高いフラグドーズ転移活性の酵
素生産性をもつ菌株、（２）シュークローズを基質とし
た時より高いフラクトース転移比活性を有する酵素、（
３）シュークローズを基質とした時加水分解作用を示さ
ない酵素、（（１）高濃度シュークローズを基質として
有効に作用する酵素の４項目について詳細に比較検討し
たところ、アスペルギルス・ニガーに属する菌、好まし
くはアスペルギルス・ニガーＦ］ｉｆＲＭ−Ｐ　５８８
６菌の生産する酵素が上記のすべての項目で最も優れて
いることを見い出した。

以下にそれぞれの特性について説明するが、その特性の
指標となる酵素活性の強さは次のようにして測定した。

シュークローズを基質とした時の反応初期の酵素反応式
は前記の＋１）ｔ　（２１式で示されるので、酵素反応
が前記の（ｔ）　、　（２１式の範囲内、すなわちシュ
ークローズのみを基質として酵素と作用させてＧＦｓを
検出しない初期反応で生成するＧア９を定量することＫ
より、酵素の転移活性（Ｕ）を測定することができる。

一方、同様にして生成するフラグドーズ量を定量するこ
とにより酵素の加水分解活性（ＵＨ）を測定することが
できるし、シュークローズの減少量を定量することＫよ
り７ラクト一ス転移作用と加水分解作用とに関与する酵
素量をβ−フラクトフクノシダーゼ活性（Ｕ１Ｆ　）と
して測定することもできる。すなわち、酵素液０、５ゴ
、　ＭｃＩｌｖａｉｎ　緩衝液ｃｐＨｓ、ｏ　）　１．
０＋７．　２５％（Ｗ／ｖ　）シュークローズ溶液１．
０ｄをそれぞれ混合して４０℃で３０分反応させた後、
工５分間沸とう水中で処理して酵素を失活させる。しか
る後、生成するＧＦ、Ｉ量。

フラクトース量あるいは減少するシュークローズ量を高
速液体クロマトグラフィーで定量し、１分間に１μｍｏ
ｌｅのＱＦ、を生成させる酵素量を転移活性１単位、１
分間Ｋ１μｍｏｌｅのフラグドーズを生成させる酵素量
を加水分解活性１単位、１分間に１μｍｏｌｅのシュー
クローズを減少させる酵素量をβ−フラクトフラノシダ
ーゼ活性１単位とする。

尚、使用した高速液体クロマト装置は島津製作所製、Ｌ
Ｏ−５ム、使用カラムはＳｈｉｍａｚｕ　ＰＮＨ鵞　　
である。

シュークローズを炭素源とした培地で培養した微生物が
生産する酵素のフラクトース転移活性及び加水分解活性
について本発明者らが広く検索比較を行った結果の代表
例を菌体内及び菌体外酵素活性に分けて表２に示しであ
る。

また、基質濃度を変化させてアスペルギルス・ニガーＦ
ＥＲＭ−Ｐ　５８８６菌体酵素をシュークローズに作用
させた時の７ラクトオリゴ糖の生成量の変化を表３に示
す。

表２，３を用いてフラクトオリゴ糖を有効に生産スルア
スペルギルス・ニガーＦＥＲＭ−Ｐ　５８８６　酵素の
特性について詳細に説明する。表２より、フラグドーズ
転移活性の酵素生産性、転移作用の比活性及び副反応の
加水分解作用の程度が示される。

すなわち、＋１）フラクトース転移活性の酵素生産性に
ついては、培養液中の転移活性の測定値よりアスペルギ
ルス・ニガーに属する菌が一般に高く、その中でもアス
ペルギルス・ニガ−ＦＥＲＮ−Ｐ　５８８６が抜群に高
い酵素生産性を示しており、しかもその転移活性の大部
分が菌体内に蓄積されていることが明らかである。（２
）７ラクト一ス転移作用の比活性については、湿菌体１
ｇ当りの転移活性の測定［！’）７スペルギルス・ニガ
−Ｆ’ＥＲＭ−Ｐ　５８８６由来の酵素が最も高い比活
性を有している。（３）基質シェークロースの有効利用
の指標となる（転移活性／加水分解活性）については、
微生物起源の酵！では大きくばらついているが、アスペ
ルギルス・ニガーＦＥＲＮ−Ｐ　５８８６の酵素が最も
大きな値を示しており、フラクトオリゴ糖製造のために
はシュークローズに最も有効に作用していることが示さ
れている。しかも、オーレオバシデウム（Ａｕｒｅｏ−
ｂａｓｉｄｉｕｍ　）属等の酵素についての値が培養日
数により大巾に減少しているにもかかわらず、アスペル
ギルス・ニガーＦＥＲＭ−Ｐ　５８８６酵素は高い値を
保っていることは酵素の特性が培養時間によって変化し
ないことを示すものであり、酵素製造の際の大きな利点
となることも明らかとなった。

更に、表３より、高濃度シュークローズ溶液下でも本酵
素は有効に作用することが示される。すなわち、（４）
シュークローズ濃度と７ラクトオリゴ糖の含有率につい
ては５％シュークローズ１１［本酵素を作用させると、
フラクトオリゴ糖含有率は４５〜５０％であるが、５０
％シュークローズ溶液に作用させると、フラクトオリゴ
糖含有率は６０％以上にも達し、高濃度基質でより有効
に７ラクトオリゴ糖を生成する特性を持っていることを
示している。この特性は酵素の固定化等の工業化におい
て非常に大きな利点となる。

７７′ 表　　３ このようにアスペルギルス・ニガーに属する菌の生産す
る特徴ある７ラクト一ス転移作用を有する酵素の特性を
より充分発現させてシュークローズより７ラクトオリゴ
糖の含有量の高い糖組成物を得るには、転移反応条件の
設定が更に非常に重要となる。本発明者らはシュークロ
ーズにこの特性をもつ酵素を作用させるときの工業的転
移反応条件について種々検討した結果、以下の条件で実
施すると従来技術よりもフラクトオリゴ糖の含有量が大
幅に上昇した転移組成物を得ることを見い出した。すな
わち、シュークローズ濃度２０〜７０％、好ましくは４
０〜６０％とし、反応温度２５〜６５℃、好ましくは４
０〜６０℃、ｐＨ４，０〜７．０とする。この条件で使
用する酵素量を従来技術より多量に使用、すなわちシュ
ークローズ１１当り３．３〜３００単位、好ましくは３
．３〜５０単位使用して転移反応を行わせると、フラク
トオリゴ糖を６０％以上含有する転移組成物が得られる
。しかも、この転移反応は２４時間以内で終了し、従来
より大巾に反応時間が短縮される利点を有する。反面、
酵素使用量が増大するが、アスペルギルス・ニガーに属
する菌の培養生産性は非常に良好であると共に菌体当り
の酵素活性が高いので、その酵素コストは本質的に低い
ものとなる。

従って、酵素使用量を増加させても、その酵素経費はフ
ラクトオリゴ糖の全製造コストには大きくは影響しない
。

転移反応終了後、加熱して酵素を失活させ、活性炭によ
り脱色し、さらにイオン交換樹脂で脱塩した後、濃縮し
て目的物を得る。転移組成物の分析は、たとえば８ｈｉ
ｍａｚｕ　ＰＮＨｇカラム（高滓製作所（株）製）を用
い、アセトニトリル：水（８０：２０（ｖ／ｙ　）　）
の溶剤系を用いた高速液体クロマトグラフィー法で行う
ことができる。

このようにして得られた転移組成物の組成は、たとえば
グルコース２４％、７ラクト一ス１％。

シュークローズ１１％、　　ＧＦ、　３４％、　ＧＦａ
　２６％。

ＧＦａ　４％であるが、それぞれの構成糖は反応条件に
より種々の値をとり得る。

フラクトオリゴ糖のＧＦ禦としては０−β−り一７ラク
ト７ラノシルー（２→１）−〇−β−７ラクト７２ノシ
ルー（２→ｌ）−α−Ｄ−グルコビア　／　シト、Ｏ−
β−Ｄ−フラクトフラノシルー（２→６）−〇−β−グ
ルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フラクトフラノ
シド、０−β−Ｄ−フラクトフラノシルー（２→６）−
〇−β−７ラクト７ラノシルー（２→１）−α−Ｄ−グ
ルコピラノシド等があり、ＧＰ、とじては０−β−Ｄ〜
７ラクトフラノシルー（２→〔１−ｏ−β−り一７ラク
ト７ラノシルー２〕、→１）−α−Ｄ−グルコヒラノシ
ド、０−β−Ｄ−フラクトフラノシルー（２→６）−０
（β−Ｄ−フラクトフラノシル−（２→２）］−］０−
α−Ｄ−グルコピラノシルー１→２）−β−Ｄ−フラク
トフラノシド等があり、ＧＦ４としては０−β−Ｄ−フ
ラクトフラノシルー（２→［１−０−β−Ｄ−フラクト
フラノシルー２〕８→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド
等があり、ＧＦｇとしては０−β−Ｄ−フラクトフラノ
シル−（２→〔１−０−β−Ｄ−フラクト７ラノシルー
２〕４→１）−α−Ｄ−グルプピラノシド等がある。

に）発明の効果 本発明によれば、シュークローズから酵素反応によって
７ラクトオリゴ糖を主成分とする糖類な効率的に製造す
ることができ、特に反応時間を大幅に短縮することがで
きる。

本発明によって得られるフラクトオリゴ糖は、難う触性
甘味料、低カロリー甘味料及び腸内ビフィズスの選択的
増殖因子として食品分野において有用であり、この物質
は目的に応じて液状、粉末状など所望の形態にすること
ができる。これらの形態のものをそのまま目的に応じて
用いることもできるし、また一般の飲食品類に希望する
量を添加して用いることもできる。

（ホ）実施例 次に、本発明の実施例を示す。

実施例１ アスペルギルス・ニガーＦ）ｉＲＭ−Ｐ　５８８６　全
三角フラスコ中で粉末ブイヨン２．０％、シュークロー
ズ５．０％、　ｃｙｒｃ　ｏ、ｓ％を含む培地３５０、
ｄに植菌し、２８℃で２０時間培養したものを種培養液
とした。

３０１ジヤー７アーメンターにシュークローズ５．０％
、酵母エキス３．６％、０ＭＣ０，５％を含む培地１５
１を入れ田６．５に調節後、１２０℃で３０分殺菌した
。次いで、この培地に上記種培養液３５０ｕｔｌを無菌
的′に植菌し、２８℃で７２時間培養した。なお、撹拌
数は２４０　ｒｐｍ、通気量は５　Ｑ　ｖｖｍである◎ 培養終了後、培養液を遠心分離してフック）−ス転移活
性を有する粗酵素菌体２．８　ｋｇを得た。この粗酵素
のフラグドーズ転移活性は１５８０単位／Ｉを有してい
た。

シュークローズ１５．０ｋｇに水１２．３１を加えてシ
ュークローズを溶解した抜用を５．５とし、上記粗酵素
菌体１６２．Ｆ（シュークローズ１１１当り１７単位）
を添加して５５℃で３時間反応させた。

次いで、１００℃で１０分間加熱して酵素反応を停止さ
せ、これを−過することにより菌体を除去した後、得ら
れたｐ液を常法により活性炭で脱色し、さらにイオン交
換樹脂で脱塩した。

このようにして得た組成物の固形分当りの糖組成は次の
通りであった。グルコース２４％、フラグドーズ１％、
シュークローズ１２％、ｉ−ケｘドース３２％、ニスト
ース２８％、１Ｆ−フラクトシルニストース３％（フラ
クトオリゴ糖含有率６３％）。

実施例２ シュークローズ１５．０ｋｇに水１２．３１を加えてシ
ュークローズを溶解した後、川を５．５として実施例１
に記載した粗酵素菌体３ｘ３．９（シュークローズ１．
Ｆ当り３３単位）を添加して５５℃で２時間反応させた
。以下、実施例１と同様に操作して得られた組成物の固
形分当りの糖組成は次の通りであった。グルコース２２
％、フラクトース１５、シュークローズ１１％、１−ケ
ストース３０％、ニスト−／Ｃ３３％、１Ｆ−フラクト
シルニストース３％（フラクトオリゴ糖含有率６６％）
。

実施例３ 実施例１で得られた粗酵素菌体３６０、９ＫＩＯｍＭ燐
酸緩衝液（Ｆ４′（５，０）　３．６１ヲ加えテ洗浄シ
た菌体を一２０℃で凍結した後、２５℃で融解する操作
を３回繰返し実施した。凍結融解菌体な２ｏｘＨｚｐｓ
分間の超音波処理を行い、更に２７℃で２４時間放置し
て菌体を自己消化させた後、遠心分離を行って沈殿部を
除き酵素抽出液３．４１を得た。この抽出液に酢酸カル
シウムを６％（”／ｖ　）になるように加え、５℃で４
時間放置後、遠心分離を行って上清３．４ノを得た。こ
の上清を限外ｐ適法（アミコン社製、フォローファイバ
ー。

ＨＩＰ　１０使用）により９２　Ｑｙまで濃縮した後、
硫安を７５％（”／ｖ　）になるように加えて生じた沈
殿物を除去した。その上清を再び限外濾過法により８３
ｍまで濃縮した。

次いで、２０ｍＭ燐酸緩衝液（田６．ｏ）で平衡化した
ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｄｅｚム−５０６９０ｊｌｊを充
てんしたカラムにこの濃縮液をチャージし、２０ｍ１ｉ
ｉ燐酸緩衝液、０、１ＭのＮａｃｚを含む２０ｍＭ燐酸
緩衝液。

０、２　Ｍ、　０、３　Ｍ、　　０、５　Ｍ、および１
．０　ＭのＮａＣｌを含む２０嘘燐酸緩衝液で順次溶出
すると、活性は０、３ＭのＭａｉｌを含む２０　ｍ％燐
酸緩衝液の分画に溶出された。次に、この活性分画を限
外−適法で濃縮して８ｄとした後、０、１　ＭのＭａｉ
ｌを含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（ＰＨ６，０）で平衡化し
たｇｅｐｈａ−ｒｏｓｅ　６１３カラＡＫ充てんして０
、１　ＭのＭａｉｌを含む２０ｍＭ燐酸緩衝液で溶出し
、活性分画を集め、この活性分画を限外−適法で濃縮し
て５ｅｐｈａｒｏｉｉｏ　６Ｂカラムでリクロマトグラ
フを行ない、ディスク電気泳動（ゲル濃度７．５％＄Ｆ
４（９，４）で単一な酵素標品１３．７ｍ９を得た。本
酵素の比活性は２８００単位／ダ蛋白であり、活性収率
は１０％であった。

シュークローズ１５ｇに水１ＯＩＬｔを加えてシューク
ローズを溶解した後、上記精製酵素６０単位（シューク
ローズ１ｇ当り４単位）を含む２０　ｍＭ燐酸緩衝液（
Ｆ４（ｓ、ｏ）ｓｍｚを添加して４０℃で１８時間反応
させた。次いで、１００℃で１０分間加熱して酵素反応
を停止させたのち常法により活性炭で脱色し、更にイオ
ン交換樹脂で脱塩した。

このようにして得た組成物の固形分当りの糖組成は次の
通りであった。グルコース２６％、フラクトース１％、
シュークローズ１１％、１−ケストース３６％、ニスト
ース２３％＋　　１Ｆ−フラクトシルニストース３％（
フラクトオリゴ糖含有率６２％）。

実施例４ シュークローズ１５．９に水１ｏＩＬｔを加えてシュー
クローズを溶解させた後、実施例３に記載した精製酵素
３００単位（シュークローズ１．ｇ当り２０単位）を含
む２０　ｍＷ燐酸緩衝液（…５．０　）　５ｍｌを添加
して４０°Ｃで３時間反応させた。以下、実施例３と同
様に操作して得られた組成物の固形分当りの糖組成は次
の通りであった。グルコース２４％、フラクトース１％
、シュークローズ１１％、１−ケストース３４％、ニス
トース２６％。

１Ｆ−フラクトシルフラクトース４％（フラクトオリゴ
糖含有率６４％）。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）アスペルギルス・ニガー起源の、シュークローズ
   に作用してそのβ−Ｄ−フラクトフラノシド結合を切断
   し、生成したフラクトシル基を糖類の１級水酸基に転移
   させる作用を有する酵素をシュークローズに作用させる
   ことを特徴とするフラクトオリゴ糖を主成分とする糖の
   製造法。
2. （２）酵素がアスペルギルス・ニガーに属する菌を炭素
   源としてシュークローズを含む培地で通気撹拌培養して
   得られた培養菌体である特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。
3. （３）アスペルギルス・ニガーがアスペルギルス・ニガ
   ーＦＥＲＭ−Ｐ５８８６菌である特許請求の範囲第２項
   記載の製造法。
4. （４）酵素がアスペルギルス・ニガーＦＥＲＭ−Ｐ５８
   ８６菌を炭素源としてシュークローズを含む培地で通気
   撹拌培養して得られた培養菌体より精製した下記の理化
   学性質を有する酵素である特許請求の範囲第１項記載の
   製造法。 ［１］作用：シュークローズ、１−ケストース、ラフィ
   ノース等のβ−Ｄ−フラクトフラノシ ド結合を有する糖類のβ−Ｄ−フラクトフ ラノシド結合を切断し、生成したフラクト シル基を糖類の末端フラクトシル基のＯ− １（水酸基）位に特異的に転移させる。シ ュークローズから多糖類を合成しない。 ［２］基質特異性：シュークローズ、１−ケストース、
   ニストース、ラフィノースによく作用 するが、ツラノース、マルトース、メレチ トースには作用しない。 ［３］至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは５．０
   〜６．０であり、４０℃、３０分間の加温条件下ではｐ
   Ｈ４．５〜１０．０で９０％以上の活性を保つ。 ［４］力価の測定法：基質濃度を１０％として、ｐＨ５
   ．０、４０℃の条件下で１分間に１マイクロモルのフラ
   グドーズの転移作用を起す酵 素力を１単位とした時の酵素力価は２５００〜３０００
   単位／ｍｇ蛋白である。 ［５］作用適温の範囲：５５℃付近に至適作用範囲があ
   る。 ［６］ｐＨ、温度による失活の条件：４０℃、３０分の
   処理条件ではｐＨ２．０で完全に失活する。 ｐＨ５．０、３０分間では８０℃で完全に失活する。 ［７］阻害剤：塩化第二水銀では失活するが、硝酸銀、
   酢酸鉛、硫酸マグネシウム、硫酸鋼、 塩化第二鉄、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、塩 化コバルト、ＥＤＴＡでは失活しない。 ［８］分子量：３４０，０００（ゲル濾過法）。
5. （５）酵素をシュークローズ１ｇ当り３．３単位以上使
   用する特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の製
   造法。
6. （６）酵素をシュークローズ濃度２０〜７０％、温度２
   ５〜６５℃およびｐＨ４．０〜７．０の条件でシューク
   ローズに作用させる特許請求の範囲第１〜５項のいずれ
   かに記載の製造法。
7. （７）オリゴ糖が１−ケストース、ニストース、１Ｆ−
   フラクトシル−ニストースおよび１Ｆ−（フラクトシル
   ）＿２−ニストースからなるものである特許請求の範囲
   第１〜６項のいずれかに記載の製造法。